Summary
Ici, nous présentons un protocole pour isoler les endosymbionts de la mouche blanche Bemisia tabaci par dissection et filtration. Après l'amplification, les échantillons d'ADN conviennent pour le séquençage ultérieur et l'étude du mutualisme entre les endosymbionts et la mouche blanche.
Abstract
Les symbiotes bactériens forment une relation intime avec leurs hôtes et confèrent des avantages aux hôtes dans la plupart des cas. L'information génomique est essentielle pour étudier les fonctions et l'évolution des symbiotes bactériens dans leur hôte. Comme la plupart des symbiotes ne peuvent pas être cultivés in vitro , les méthodes pour isoler une quantité adéquate de bactéries pour le séquençage du génome sont très importantes. Dans la mouche blanche Bemisia tabaci , un certain nombre d'endosymbionts ont été identifiés et sont prévus pour être importants dans le développement et la reproduction des ravageurs par de multiples approches. Cependant, le mécanisme qui sous-tend les associations reste largement inconnu. L'obstacle provient en partie du fait que les endosymbionts de la mouche blanche, principalement retenus dans les bactériocytes, sont difficiles à séparer des cellules hôtes. Nous rapportons ici un protocole étape par étape pour l'identification, l'extraction et la purification des endosymbionts de la mouche blanche B. tabaci principalement par dissectiEt la filtration. Les échantillons d'endosymbiont préparés par cette méthode, bien qu'étant encore un mélange de différentes espèces d'endosymbiont, conviennent pour le séquençage ultérieur du génome et l'analyse des rôles possibles des endosymbionts dans B. tabaci . Cette méthode peut également être utilisée pour isoler les endosymbionts d'autres insectes.
Introduction
Les bactéries formant une relation symbiotique intime avec des hôtes relatifs sont répandues dans les arthropodes 1 . Les endosymbionts ont été démontrés pour affecter les aspects des hôtes, tels que le métabolisme nutritionnel, la reproduction, les réponses aux contraintes environnementales 2 , 3 , 4 , etc. , dans presque tous les stades de développement 5 . Cependant, le mécanisme qui sous-tend les associations reste encore largement inconnu. La génomique est une priorité et une importance pour l'étude des fonctions et des rôles potentiels des bactéries. Certaines informations fondamentales, c'est-à-dire l'état taxonomique, les gènes fonctionnels, les voies du métabolisme, les systèmes de sécrétion, peuvent être déduites des séquences génomiques, ce qui permet de faire apparaître les effets potentiels des symbioses en symbiose. Avec le développement du séquençage à haut débit, un grand nombre de génomes bactériens ont été séquencés wDes fonctions diverses ont été révélées 6 .
Les endosymbionts revêtent une importance vitale dans les hémiptères, tels que les pucerons 7 , les punaises 8 , les psyllides 9 , les planthoppers marrons 10 et les cigales 11 . Par exemple, Buchnera dans les pucerons, en tant que symbiont obligé, a été démontré être impliqué dans la biosynthèse des acides aminés essentiels, ainsi que les gènes du génome du phosphore 12 . En outre, la régulation transcriptionnelle de Buchnera est également révélée 13 . Dans les psyllides, Carsonella est séquencée et classé le plus petit génome bactérien jamais trouvé 14 . Toutes ces caractéristiques des endosymbionts sont basées et déduites des séquences génomiques. Étant donné que ces endosymbionts ne peuvent pas être cultivés in vitro , plusieurs approches ont été appliquées pour isoler des bactéries adéquates pour seqUencing. Dans les pucerons, les endosymbionts sont extraits par centrifugation et filtration et soumis à d'autres analyses génomiques et transcriptomiques 5 . Chez les planthoppers marrons, les endosymbionts sont séquencés avec l'ensemble du génome de l'insecte 10 .
Whitefly B. tabaci est un complexe d'espèces contenant plus de 35 espèces morphologiquement indiscernables (espèces cryptiques), dont deux espèces envahissantes ont envahi dans le monde entier et ont causé d'énormes dommages à la production agricole 15 . Il est à noter que les endosymbionts dans les espèces B. tabaci ont montré de l'importance dans le développement des ravageurs 16 . À ce jour, huit endosymbionts ont été identifiés dans la mouche blanche, y compris le symbiont obligatoire , Candidatus Portiera aleyrodidarum et sept symbionts secondaires Hamiltonella , Rickettsia , Arsenophonus , Cardinium , <Em> Wolbachia, Fritschea et Hemipteriphilus ont défini 17 , 18 .
Contrairement aux hémiptères décrits précédemment, la mouche blanche B. tabaci est un insecte extrêmement minuscule d'une longueur de seulement 1 mm. La plupart des endosymbionts sont confinés aux bactériocytes 19 (cellules spécialisées contenant des symbiotes, qui forment encore une bactérie à B. tabaci ). En outre, ces endosymbionts ne peuvent pas être cultivés in vitro . La seule façon d'obtenir des endosymbionts de B. tabaci consiste à disséquer la bactériométrie. Cependant, il y a des difficultés dans la dissection. Tout d'abord, la bactériule fragile se lie toujours avec d'autres tissus de la mouche blanche, ce qui est difficile à séparer. Deuxièmement, la petite taille de la mouche blanche limite l'isolement de suffisamment de bactériome. Troisièmement, les endosymbionts se regroupent dans la bactériome, ce qui rend extrêmement compliqué l'acquisition d'une seule espèce de bactérie.
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Protocol
1. Élevage de la mouche blanche et identification des espèces Cryptiques
- Maintenir les espèces de mouches blanches sur le coton Gossypium hirsutum (Malvaceae) (cv. Zhe-Mian 1973) dans des cages dans des conditions standard de 27 ± 1 ° C, 70 ± 10% d'humidité et 14 h de lumière: 10 h de régime sombre.
- Recueillir une mouche blanche adulte individuelle et homogénéiser dans 30 μL de tampon de lyse (10 mM Tris, pH 8,4, 50 mM KCl, 0,45% [wt / vol] Tween-20, 0,2% [wt / vol] de gélatine, 0,45% [vol / Vol] Nonidet P 40, 60 g / mL de protéinase K).
- Incuber l'homogénat à 65 ° C pendant 1 h puis 100 ° C pendant 10 min.
NOTE: Le temps d'incubation à 65 ° C peut être augmenté si nécessaire. Le temps d'incubation à 100 ° C doit être contrôlé de manière critique pour inactiver suffisamment la protéinase K et éviter les dommages causés par l'ADN. - Effectuer la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) en utilisant l'ADN de la mouche blanche (acquise dans la section 1.3) à base d'amorces mitochondriales de la cytochrome oxydase I.
COI-F: 5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3 '
COI-R: 5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3 '- Effectuer les réactions de PCR dans un volume final de 25 μL contenant 1 U de Taq DNA polymerase, 2,5 μL de tampon 10x, 0,2 mM de dNTP, 0,2 mM de chaque amorce et 2 μL d'ADN de la mouche blanche.
- Utiliser les conditions de procédure de PCR suivantes: dénaturation initiale 95 ° C pendant 3 minutes suivie de 35 cycles de 95 ° C pendant 45 s (dénaturation), 50 ° C pendant 45 s (recuit) et 72 ° C pendant 1 min (extension) et 10 minutes supplémentaires à 72 ° C pour une extension supplémentaire.
- Nettoyez le produit amplifié par PCR en utilisant un kit d'extraction de gel d'ADN avec le protocole recommandé.
- Séquence des échantillons d'ADN purifiés avec un système de séquençage d'échantillons d'ADN suivant les instructions du fabricant.
- Analyser les séquences en utilisant l'outil de recherche d'alignement local de base (BLAST) pour identifier les espèces cryptiques de la mouche blanche et éviter la contamination d'autres spécimensEs.
2. Endosymbiont Identification et Localisation
- Effectuer la PCR sur l'ADN de la mouche blanche (acquise à l'étape 1.3) pour amplifier les gènes spécifiques de chaque endosymbiont dans la mouche blanche (la recette PCR est décrite dans la section 1.4, et les procédures de PCR et les amorces sont listées dans le tableau 1 ).
- Soumettre l'échantillon amplifié à l'électrophorèse sur gel d'agarose conformément au protocole 20 précédemment publié (gel d'agarose à 1%, Tris-acétate-EDTA comme tampon courant, tension 5 V / cm) pour identifier le gène spécifique de chaque bactérie.
- Récupérer et séquencer chaque bande pour déterminer les espèces bactériennes au sein de la mouche blanche (voir les sections 1.5-1.7).
- Effectuer des hybridations in situ fluorescence (FISH) sur les mouches blanches pour identifier la localisation des endosymbionts selon le protocole précédemment publié 19 .
REMARQUE: Augmenter la concentration des sondes fluorescentes si nécessaire. 3. Microscopie électronique de transmission (TEM) - Immerger et corriger les mouches blanches dans du tampon phosphate (0,1 M, pH 7,0) contenant 2,5% [vol / vol] glutaraldéhyde pendant 4 h.
- Laver les échantillons dans du tampon phosphate (0,1 M, pH 7,0) trois fois, 15 minutes à chaque fois.
- Immerger et réparer les échantillons à nouveau dans du tampon phosphate (0,1 M, pH 7,0) contenant 1% [wt / vol] OsO 4 pendant 2 h.
- Déshydratez les échantillons par une série d'éthanol graduée (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% et 100%), 15 minutes à chaque fois.
- Transférer et immerger les échantillons dans 100% d'acétone pendant 20 min.
- Placez les échantillons dans un mélange de 100% d'acétone et 100% de résine Spurr (1: 1) pendant 1 h à température ambiante.
- Transférer les échantillons dans un mélange de 100% d'acétone et 100% de résine Spur (1: 3) pendant 3 h à température ambiante.
- Transférer et immerger les échantillons dans une résine 100% Spurr (incubée à 70 ° C) pendant plus de 9 h.
- Sectionz les échantillons de mouche blanche en utilisant un micropour moi.
- Tachez les films ultra-minces (acquis dans la section 3.9) par immersion dans de l'acétate d'uranyle absolu pendant 5 à 10 min, suivie d'une immersion dans du citrate de plomb alcalin à 50% pendant encore 5 à 10 min.
REMARQUE: Les volumes de réactifs utilisés dans la section 3.1-3.10 dépendent des échantillons. Assurez-vous que les échantillons sont immergés dans les réactifs. - Observez les échantillons sous microscopie électronique à transmission (15 000 X) pour déterminer la localisation, la forme et la taille des bactéries pour une utilisation ultérieure (voir la section 4.6).
- Ajouter 100 μL de 1x solution de PBS sur une lame de microscope. Choisissez des nymphes au 3ème ou 4ème stade des feuilles de coton et immergez-les dans la solution PBS.
- Utilisez des aiguilles entomologiques fines sous un stéréomicroscope et retirez les bactériomes du corps de la mouche blanche.
- Coupez délicatement un trou d'un côté de la nymphe et appuyez légèrement sur l'autreCôté pour laisser sortir les bactériomes.
- Montez un microchargeur de 20 μL (avec la coupe finale pour atteindre la taille de la bactériome) sur une pipette de 0,5 à 10 μl. Extraire le bactériome individuel de la solution PBS dans le micro-chargeur.
- Lavez la bactériome pour éliminer la contamination d'autres mouchoirs blancs en pipetant la bactériome dans la solution PBS et en extrayant le bactériome. Répétez trois fois.
- Immédiatement, pipeter la bactériome lavée dans un tube de centrifugation contenant 60 μL de solution 1x PBS.
- Filtre à la seringue de la bactériome assemblée à travers une membrane filtrante de 5 μm (déterminée par des tailles de bactéries et le noyau de bactériocytes dans la mouche blanche). Répétez plusieurs fois pour déplacer complètement le liquide mélangé à travers la membrane filtrante.
REMARQUE: Pour obtenir un meilleur résultat de l'amplification et du séquençage, assembler plus de 100 bactériomes. Mouillez la membrane filtrante d'abord en utilisant une solution 1x PBS pour diminuer la perte de bactériesLiaison à la membrane. - Amplifier le filtrat (contenant principalement des endosymbionts de la mouche blanche) en utilisant un kit d'amplification d'ADN par le protocole recommandé avec une certaine modification.
- Choisissez le protocole recommandé d'amplification de l'ADN génomique du sang ou des cellules et préparez le tampon D2 pour une expérience ultérieure.
- Ajoutez directement 1,5 μl de filtrat (voir section 4.6) au tube de centrifugation, puis 1,5 μL de Buffer D2 et bien mélanger.
- Incuber sur de la glace pendant 10 min et ajouter 1,5 μL de solution d'arrêt.
- Ajouter 15 μL du tampon de réaction et 1 μL de l'ADN polymérase et mélanger doucement.
- Incuber le mélange à 30 ° C pendant 16 h, suivi de 3 min à 65 ° C.
- Effectuer la PCR directement sur le filtrat amplifié (diluer les échantillons amplifiés si nécessaire) en utilisant des amorces spécifiques conçues pour le bacPour confirmer les espèces de bactéries (voir la section 2.1).
- Effectuer la PCR pour confirmer s'il existe une contamination du génome de l'hôte en utilisant les amorces de bêta-Actine et EF1 de la mouche blanche selon la méthode 21 précédemment publiée (la recette de PCR est décrite dans la section 1.4).
- Soumettre le filtrat amplifié à un spectrophotomètre et un fluorimètre (selon les instructions du fabricant) avant le séquençage pour tester la qualité des échantillons et si les échantillons répondent aux critères de séquençage.
- Suivez l'amplification à un séquenceur génome selon les instructions du fabricant.
4. Dissection et purification des bactéries blanches
5. Amplification des génomes d'endosymbionte
6. Endosymbiont Metagenome Sequencing
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Representative Results
Les espèces du Moyen-Orient Asie Mineur 1 (MEAM1) du complexe B. tabaci ont été retenues comme exemple ici pour la description. Le coton pour l'élevage des mouches blanches et plusieurs stades de développement des mouches blanches sont représentés sur la figure 1, y compris une plante de coton, une mouche blanche adulte et les nymphes 1ème , 2ème et 4ème instar de la mouche blanche (la nymphe du 3ème stade ressemble de façon similaire à la nymphe du 4ème stade ). Il était évident que la nymphe du 4ème stade est plus grande que les nymphes du 1er et 2ème stade ( Figure 1 ). L'analyse FISH de Portiera et Hamiltonella dans MEAM1 est illustrée à la Figure 2 . Ces deux endosymbionts sont confinés aux bactériocytes de la mouche blanche, et le chevauchement des deux bactéries est également observé. La figure 3 montre l'émission elec Images de microscopie tron du Portiera endosymbiont de la mouche blanche, ce qui indique que Portiera peut perdre sa paroi cellulaire.
Pour le séquençage, deux bibliothèques ont été construites, avec des inserts de 200 pb et 2 000 pb, respectivement. Après le séquençage, les deux bibliothèques ont généré 1,626 Mb et 1 302 Mo de données brutes, respectivement. Après avoir nettoyé les données de contamination pour les adaptateurs et les doublons, 1 484 Mo et 1 210 Mo de données propres ont été acquis. L'assemblage a abouti à une séquence complète du génome pour le symbiont obligé, Portiera . En outre, un projet de génome de Hamiltonella a également été obtenu. L'assemblage basé sur les bibliothèques de 200 pb et de 2 000 pb a entraîné 138 contigs. Selon les relations de couple-fin, les 138 contigs ont été assemblés en 89 échafaudages ( tableau 2 ).
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Figure 1: Aperçu du système d'insectes végétaux utilisé dans ce document. ( A ) Les blanches sont élevées sur des cotonnades ( Gossypium hirsutum cv. Zhe-Mian 1793). ( B ) Vue d'une mouche blanche adulte. ( C ) Plusieurs étapes de développement de la nymphe au stade dans le cycle de vie de la mouche blanche. La flèche rouge se réfère à l'œuf de la mouche blanche; La flèche noire se réfère à la 1ère niche de mouches blanches; La flèche blanche se réfère à la 2 ème nymphe de la mouche blanche; La flèche bleue se réfère à la nymphe 4ème stade de la mouche blanche. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Analyse FISH de Portiera , HamIltonella dans la 4ème nymphone Instar de MEAM1. La sonde spécifique de Portiera (rouge) conjuguée à Cy3, une sonde spécifique de Hamiltonella (verte) marquée par Cy5 a été utilisée. Barres d'échelle = 100 μm. ( A ) Les signaux d'hybridation rouge représentent le Portiera sous un champ sombre. ( B ) Les signaux d'hybridation verts représentent la Hamiltonella sous un champ sombre. ( C ) Portiera et Hamiltonella ont fusionné les signaux dans un champ sombre. ( D ) Portiera et Hamiltonella ont fusionné les signaux sous un champ lumineux. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Transmission Electron MicroScopy Image de Portiera in Whitefly. Arrow indique l'emplacement de Portiera . Barre d'échelle = 1 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Target symbiont | Gène cible | Les séquences d'amorces (5'-3 ') | Procédures de PCR | Les références | ||
| Portiera | ARNr 16S | Por-F: TGCAAGTCGAGCGGCATCAT | 95 ° C 1 min, 60 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, 5 cycles; | 27 | ||
| Por-R: AAAGTTCCCGCCTTATGCGT | 9576; C 1 min, 58 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, 30 cycles; | |||||
| 72 ° C 20 min | ||||||
| Hamiltonella | ARNr 16S | Ham-F: TGAGTAAAGTCTGGGAATCTGG | 95 ° C 1 min, 60 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, 5 cycles; | 27 | ||
| Ham-R: CCCGGGAACGTATTCACCGTAG | 95 ° C 1 min, 58 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, 30 cycles; | |||||
| 72 ° C 20 min | ||||||
| Rickettsia | ARNr 16S | Ric-F: GCTCAGAACGAACGCTATC | 95 ° C 2 min; | 24 | ||
| Ric-R: GAAGGAAAGCATCTCTGC | 92 ° C 1 min, 58 °C 1 min, 72 ° C 90 s, 30 cycles; | |||||
| 72 ° C 5 min | ||||||
| Arsénophonus | 23S ARNr | Ars-F: CGTTTGATGAATTCATAGTCAAA | 95 ° C 5 min; | 28 | ||
| Ars-R: GGTCCTCCAGTTAGTGTTACCCAAC | 95 ° C 30 s, 60,5 ° C 30 s, 72 ° C 45 s, 30 cycles; | |||||
| 72 ° C 10 min | ||||||
| Cardinium | ARNr 16S | Car-F: TACTGTAAGAATAAGCACCGGC | 95 ° C 2 min | 29 | ||
| Car-R: GTGGATCACTTAACGCTTTCG | 92 ° C 1 min, 57 ° C 1 min, 72 ° C 90 s, 30 cycles; | |||||
| 72 ° C 5 min | ||||||
| Wolbachia | ARNr 16S | Wol-F: TTGTAGCCTGCTATGGTATAACT | 94 ° C 5 min; | 30, 31 | ||
| Wol-R: GAATAGGTATGATTTTCATGT | 94 ° C 1 min, 55 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, 35 cycles | |||||
| Fritschea | 23S ARNr | Fri-F: GATGCCTTGGCATTGATAGGCGATGAAGGA | 95 ° C 5 min; | 32 | ||
| Fri-R: TGGCTCATCATGCAAAAGGCA | 94 ° C 1 min, 64 ° C 1 min, 72 ° C 90 s, 35 cycles; | |||||
| 72 ° C 5 min | ||||||
| Hemipteriphilus | GroEL | OR- groEL -F: CACCWAAAATTACTAAAGATGG | 94 ° C 3 min; | 18 | ||
| OR- groEL -R: TAGAARTCCATWCCKCCCATWC | 94 ° C 30 s, 52 ° C 30 s, 72 ° C 2 min, 34 cycles; | |||||
| 72 ° C 10 min | ||||||
Tableau 1: Amorces et procédures de PCR des endosymbionts dans la mouche blanche.
| Portiera | Hamiltonella | |
| Numéro Contig | 1 | 138 |
| Numéro d'échafaudage a | 1 | 89 |
| Longueur totale, pb | 358 232 | 1,711,449 |
| N50, pb | / | 118 802 |
| N90, pb | / | 16 753 |
| Longueur maximale, pb | / | 390 511 |
| Longueur minimale, bp | / | 503 |
| Contenu GC,% | 26.18 | 39,89 |
| Une information présentée ci-dessous est basée sur des échafaudages. | ||
Tableau 2: Caractéristiques générales de Portiera et Hamiltonella Draft Genome.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
L'appui financier de cette étude a été fourni par le Programme national de recherche et de développement clés (2016YFC1200601) et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31390421).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA polymerase | Takara | R001A | including rTaq, 10×Buffer and dNTP |
| Gel DNA extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| DNA sample sequencing system | ABI | ABI-3730XL | |
| Microtome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7650 TEM | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| 20 μL microloader | Eppendorf | F2771951 | |
| Filter holder | Millipore | SX0001300 | |
| Filter membrane filter | Millipore | SMWP001300 | 5.0 μm SMWP |
| REPLI-g UltraFast Mini Kit | Qiagen | 150033 | DNA amlification kit |
| NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Genome Sequencer | Illumina | Hiseq 2000 |
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