Summary
Здесь мы представляем протокол для выделения эндосимбионтов из белокрылки Bemisia tabaci посредством вскрытия и фильтрации. После амплификации образцы ДНК пригодны для последующего секвенирования и изучения взаимности между эндосимбионтами и белокрылой.
Abstract
Бактериальные симбионты формируют близкие отношения со своими хозяевами и придают преимуществам хозяевам в большинстве случаев. Геномная информация имеет решающее значение для изучения функций и эволюции бактериальных симбионтов у их хозяина. Поскольку большинство симбионтов нельзя культивировать in vitro , очень важны методы выделения достаточного количества бактерий для секвенирования генома. У белокрылки Bemisia tabaci был идентифицирован ряд эндосимбионтов и, как ожидается, будет иметь важное значение для развития и размножения вредителей с помощью множества подходов. Однако механизм, лежащий в основе ассоциаций, остается в значительной степени неизвестным. Препятствие частично связано с тем, что эндосимбионты в белокрылке, в основном сдерживаемые в бактериоцитах, трудно отделить от клеток-хозяев. Здесь мы сообщаем пошаговый протокол для идентификации, экстракции и очистки эндосимбионтов от белокрылки B. tabaci, главным образом, с помощью dissectiИ фильтрации. Образцы эндосимбионтов, полученные этим методом, хотя и представляют собой смесь разных видов эндосимбионтов, пригодны для последующего секвенирования генома и анализа возможных ролей эндосимбионтов в B. tabaci . Этот метод также может быть использован для выделения эндосимбионтов у других насекомых.
Introduction
Бактерии, формирующие интимную симбиотическую связь с относительными хозяевами, широко распространены у членистоногих 1 . Показано, что эндосимбионты влияют на аспекты хозяев, такие как метаболизм пищи, размножение, реакции на экологические стрессы 2 , 3 , 4 и т . Д. Практически на каждом этапе развития 5 . Однако механизм, лежащий в основе ассоциаций, по-прежнему остается в значительной степени неизвестным. Геномика имеет приоритет и значение при изучении потенциальных функций и ролей бактерий. Некоторая фундаментальная информация, то есть таксономический статус, функциональные гены, пути метаболизма, системы секреции, может быть выведена из последовательностей геномов, которая проливает свет на потенциальную роль симбионтов в симбиозе. С развитием высокопроизводительного секвенирования было выделено огромное количество бактериальных геномов wС различными функциями.
Эндосимбионты имеют жизненно важное значение в гемиптеранах, таких как тли 7 , клопы 8 , псиллиды 9 , коричневые кузнечики 10 и цикады 11 . Например, Buchnera в тлях , как обязательный симбионт, было продемонстрировано, что он участвует в биосинтезе незаменимых аминокислот наряду с генами из генома тли 12 . Кроме того, обнаружена транскрипционная регуляция Бухнера 13 . В psyllids Carsonella секвенируется и занимает наименьший бактериальный геном, когда-либо найденный 14 . Все эти признаки эндосимбионтов основаны и выведены из последовательностей геномов. Поскольку эти эндосимбионты нельзя культивировать in vitro , было применено несколько подходов для выделения адекватных бактерий для sequencing. В тлях эндосимбионты экстрагируют путем центрифугирования и фильтрации и подвергают дальнейшему геномному и транскриптомическому анализу 5 . В коричневых кузнечиках эндосимбионты секвенированы вместе с целым геномом 10 насекомых.
Whitefly B. tabaci - это видный комплекс, содержащий более 35 морфологически неразличимых видов (загадочные виды), среди которых два инвазивных вида вторглись во всем мире и нанесли огромный вред сельскохозяйственному производству 15 . Следует отметить, что эндосимбионты в видах B. tabaci показали важность в развитии вредителей 16 . На сегодняшний день в белокрылке идентифицированы восемь эндосимбионтов, в том числе облигатный симбионт, Candidatus Portiera aleyrodidarum и семь вторичных симбионтов Hamiltonella , Rickettsia , Arsenophonus , Cardinium , <Em> Wolbachia, Fritschea и Hemipteriphilus определены 17 , 18 .
В отличие от гемиптеранов, описанных ранее, белокрылка B. tabaci является чрезвычайно крошечным насекомым длиной всего 1 мм. Большинство эндосимбионтов ограничены бактериоцитами 19 (специализированные клетки, содержащие симбионты, которые далее образуют бактериому в B. tabaci ). Кроме того, эти эндосимбионты нельзя культивировать in vitro . Единственный способ получить эндосимбионты от B. tabaci - это вырезать бактериому. Тем не менее, есть трудности при вскрытии. Во-первых, хрупкая бактериома всегда связывается с другими тканями белокрылки, которую трудно разделить. Во-вторых, крошечный размер белокрылки ограничивает выделение достаточного количества бактерий. В-третьих, эндосимбионты группируются в бактериоме, что делает его чрезвычайно сложным для получения одного вида бактерий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Идентификация Белоснежной и Загадочной Видов
- Поддержание белых видов на хлопке Gossypium hirsutum (Malvaceae) (cv. Zhe-Mian 1973) в клетках при стандартных условиях 27 ± 1 ° C, влажности 70 ± 10% и 14-часовом свете: темном режиме 10 часов.
- Соберите отдельную взрослую белокуру и гомогенизируйте в 30 мкл буфера для лизиса (10 мМ Трис, рН 8,4, 50 мМ KCl, 0,45% [мас. / Об.] Твин-20, 0,2% [мас. / Об.] Желатина, 0,45% [об. Vol] Nonidet P 40, 60 г / мл протеиназы K).
- Инкубируйте гомогенат при 65 ° C в течение 1 часа, а затем 100 ° C в течение 10 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ. При необходимости можно увеличить время инкубации при 65 ° C. Время инкубации при 100 ° C необходимо критически контролировать для достаточной инактивации протеиназы K и предотвращения повреждения ДНК. - Проведите полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием ДНК белого цвета (полученную в разделе 1.3) на основе митохондриальных цитохромоксидазы I праймеров.
COI-F: 5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3 '
COI-R: 5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3 '- Выполните ПЦР-реакции в конечном объеме 25 мкл, содержащем 1 U ДНК-полимеразы Taq , 2,5 мкл 10x буфера, 0,2 мМ dNTP, 0,2 мМ каждого праймера и 2 мкл ДНК белого цвета.
- Используйте следующие условия процедуры ПЦР: начальная денатурация 95 ° С в течение 3 мин с последующим 35 циклами 95 ° С в течение 45 с (денатурация), 50 ° С в течение 45 с (отжиг) и 72 ° С в течение 1 мин (удлинение) и Еще 10 мин при 72 ° С для дальнейшего расширения.
- Очистите ПЦР-амплифицированный продукт с помощью набора для извлечения ДНК-геля с рекомендованным протоколом.
- Последовательность очищенных образцов ДНК с помощью системы последовательного анализа ДНК после инструкции изготовителя.
- Проанализируйте последовательности, используя базовый инструмент поиска локального выравнивания (BLAST), чтобы идентифицировать загадочные виды белых бабочек и избежать заражения других специфическихэс.
2. Идентификация и локализация эндосимбионта
- Выполните ПЦР на ДНК белокрылки (полученную на этапе 1.3) для амплификации специфических генов каждого эндосимбионта внутри белокрылки (рецепт ПЦР описан в разделе 1.4, а процедуры ПЦР и праймеры перечислены в таблице 1 ).
- Предметом амплифицированного образца к агарозному гель-электрофорезу в соответствии с ранее опубликованным протоколом 20 (1% агарозного геля, трис-ацетат-ЭДТА в качестве бегущего буфера, напряжение 5 В / см) для идентификации конкретного гена каждой бактерии.
- Восстанавливайте и упорядочивайте каждую полосу для определения видов бактерий в пределах белокрылки (см. Разделы 1.5-1.7).
- Выполните флуоресценцию in situ гибридизации (FISH) на белых бабочках для определения местоположения эндосимбионтов в соответствии с ранее опубликованным протоколом 19 .
ПРИМЕЧАНИЕ. При необходимости увеличьте концентрацию флуоресцентных зондов. 3. Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЕА) - Погрузите и закрепите белокрылки в фосфатном буфере (0,1 M, pH 7,0), содержащем 2,5% [объем / объем] глутаральдегида в течение 4 часов.
- Промывают образцы в фосфатном буфере (0,1 М, pH 7,0) три раза, каждый раз 15 мин.
- Погрузите и закрепите образцы снова в фосфатном буфере (0,1 M, pH 7,0), содержащем 1% [мас. / Об.] OsO 4 в течение 2 часов.
- Дегидратируйте образцы с помощью градуированной серии этанола (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% и 100%), по 15 минут каждый раз.
- Перенесите и погрузите образцы в 100% ацетон в течение 20 мин.
- Поместите образцы в смесь 100% ацетона и 100% смолы Spurr (1: 1) в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Перенесите образцы в смесь 100% ацетона и 100% смолы Spurr (1: 3) в течение 3 часов при комнатной температуре.
- Перенесите и погрузите образцы в 100% смолу Spurr (инкубированную при 70 ° C) в течение более 9 часов.
- Разделите образцы белых, используя микромне.
- Окрашивают ультратонкие пленки (приобретаемые в разделе 3.9) путем погружения в абсолютный уранилацетат в течение 5-10 мин с последующим погружением в 50% щелочного свинцового цитрата еще на 5-10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ. Объемы реагентов, используемые в разделе 3.1-3.10, зависят от образцов. Убедитесь, что образцы погружены в реагенты. - Наблюдайте образцы в просвечивающей электронной микроскопии (15 000X) для определения локализации, формы и размера бактерий для дальнейшего использования (см. Раздел 4.6).
- Добавьте 100 мкл 1x раствора PBS на слайд микроскопа. Возьмите 3-4 личинок из листьев хлопка и погрузите их в раствор PBS.
- Используйте тонкие энтомологические иглы под стереомикроскопом и вытащите бактерии из тела белокрылки.
- Осторожно вырежьте отверстие на одной стороне нимфы и слегка нажмите другойЧтобы выпустить бактерии.
- Установите микропогрузчик объемом 20 мкл (с передним концевым разрезом, чтобы соответствовать размеру бактериомы) на пипетке 0,5-10 мкл. Извлеките отдельную бактериому из раствора PBS в микронагрузчик.
- Вымойте бактериому, чтобы устранить загрязнение других тканей белокрылки путем пипетирования бактериомы в раствор PBS и извлечения бактериомы. Повторите три раза.
- Немедленно пипетируйте промытую бактериому в пробирку с центрифугой, содержащую 60 мкл 1x раствора PBS.
- Шприцы фильтруют собранную бактериому через мембранную мембрану размером 5 мкм (определяемую по размерам бактерий и ядро бактериоцитов в белокрылом). Повторите несколько раз, чтобы тщательно перемешать смешанную жидкость через мембрану фильтра.
ПРИМЕЧАНИЕ. Для достижения лучшего результата амплификации и секвенирования собирайте более 100 бактерий. Сначала смочите фильтрующую мембрану, используя 1x раствор PBS для уменьшения потери бактерийСвязывание с мембраной. - Усильте фильтрат (в основном содержащий эндосимбионты белокрылки), используя набор амплификации ДНК по рекомендованному протоколу с некоторой модификацией.
- Выберите рекомендуемый протокол амплификации геномной ДНК из крови или клеток и подготовьте буфер D2 для последующего эксперимента.
- Непосредственно добавить 1,5 мкл фильтрата (см. Раздел 4.6) в центрифужную пробирку, затем 1,5 мкл буфера D2 и хорошо перемешать.
- Инкубируйте на льду в течение 10 минут и добавьте 1,5 мкл стоп-раствора.
- Добавьте 15 мкл реакционного буфера и 1 мкл ДНК-полимеразы и осторожно перемешайте.
- Инкубируйте смесь при 30 ° C в течение 16 часов, затем 3 мин при 65 ° C.
- Выполните ПЦР непосредственно на амплифицированном фильтрате (при необходимости разбавите амплифицированные образцы), используя специальные праймеры, предназначенные для bacTeria для подтверждения видов бактерий (см. Раздел 2.1).
- Проведите ПЦР для подтверждения того, существует ли загрязнение генома хозяина с использованием праймеров бета-актина бла-Actin и EF1 белой бабочки в соответствии с ранее опубликованным методом 21 (рецепт ПЦР описан в разделе 1.4).
- Предметом амплифицированного фильтрата на спектрофотометр и флюорометр (в соответствии с инструкциями производителя) перед секвенированием для проверки качества образцов и соответствия образцов критериям для секвенирования.
- Предметом амплификации является секвенсор генома в соответствии с инструкциями производителя.
4. Рассеяние и очистка бактерий Белокожий
5. Усиление геномов эндосимбионта
6. Эндосимбионтная секвенирование метагеном
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В качестве примера здесь были использованы виды Ближнего Востока Малой Азии (MEAM1) комплекса B. tabaci . Хлопок для выращивания белокрылок и несколько этапов развития белых бабочек показан на рисунке 1, включая хлопковое растение, взрослой белокуру и 1 -й, 2 -й и 4 -й возрастные нимфы белокрылки (темная нимфа 3 -го возраста аналогично тому, как 4 -й возраст нимфы ). Было очевидно, что нимфа 4 -го возраста больше, чем 1 -я и 2 -я возраста нимфы ( рис. 1 ). Анализ FISH Portiera и Hamiltonella в MEAM1 показан на рисунке 2 . Эти два эндосимбионта ограничены бактериоцитами белокрылки, а также наблюдается перекрытие двух бактерий. На рисунке 3 показан электронный блок Tron microscopy images of Portiera endosymbiont из белокрылки, что указывает на то, что Portiera может потерять свою клеточную стенку.
Для секвенирования были построены две библиотеки с размерами вставки 200 bp и 2000 bp соответственно. После секвенирования две библиотеки генерировали 1626 Мб и 1,302 МБ необработанных данных, соответственно. После очистки данных о загрязнении для адаптеров и дублирования были получены 1,484 МБ и 1219 МБ чистых данных. Сборка успешно привела к полной последовательности генома для обязательного симбионта , Portiera . Кроме того, был также получен проект генома Гамильнеллы . Сборка, основанная на библиотеках 200 bp и 2000 bp, привела к возникновению 138 contigs. Согласно отношениям парного конца, 138 контигиев были дополнительно собраны в 89 лесов ( таблица 2 ).
Figimg "src =" / files / ftp_upload / 55809 / 55809fig1.jpg "/>
Рисунок 1: Обзор системы растительных насекомых, используемой в этой статье. ( A ) Белоснежки выращиваются на хлопковых заводах ( Gossypium hirsutum cv. Zhe-Mian 1793). ( B ) Взгляд взрослого белокрылки. ( C ) Несколько этапов развития возрастной нимфы в жизненном цикле белых. Красная стрелка относится к яйцу белокрылки; Черная стрелка относится к 1 -й возрастной нимфе белокрылки; Белая стрелка относится к 2 -й нимфе белокрылки; Синяя стрелка относится к 4 -й возрастной нимфе белокрылки. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Анализ FISH по Portiera , HamIltonella в 4 -й имперской нимфе MEAM1. Портира- специфический зонд (красный), конъюгированный с Cy3, использовался гамильтелласпецифический зонд (зеленый), обозначенный Cy5. Шкала шкалы = 100 мкм. ( A ) Красные сигналы гибридизации представляют Portiera в темном поле. ( B ) Зеленые сигналы гибридизации представляют собой гамильтонелла в темном поле. ( C ) Portiera и Hamiltonella сливали сигналы под темным полем. ( D ) Portiera и Hamiltonella объединяли сигналы под ярким полем. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Передача Электрон МикроScopy Изображение Portiera в Whitefly. Стрелка указывает расположение Portiera . Шкала шкалы = 1 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Целевой симбионт | Целевой ген | Последовательности праймера (5'-3 ') | ПЦР-процедуры | Рекомендации | ||
| Portiera | 16S рРНК | Por-F: TGCAAGTCGAGCGGCATCAT | 95 ° С 1 мин, 60 ° С 1 мин, 72 ° С 1 мин, 5 циклов; | 27 | ||
| Por-R: AAAGTTCCCGCCTTATGCGT | 9576; С 1 мин, 58 ° С 1 мин, 72 ° С 1 мин, 30 циклов; | |||||
| 72oC 20 мин | ||||||
| Hamiltonella | 16S рРНК | Ham-F: TGAGTAAAGTCTGGGAATCTGG | 95 ° С 1 мин, 60 ° С 1 мин, 72 ° С 1 мин, 5 циклов; | 27 | ||
| Ham-R: CCCGGGAACGTATTCACCGTAG | 95 ° С 1 мин, 58 ° С 1 мин, 72 ° С 1 мин, 30 циклов; | |||||
| 72oC 20 мин | ||||||
| риккетсия | 16S рРНК | Ric-F: GCTCAGAACGAACGCTATC | 95 ° С 2 мин; | 24 | ||
| Ric-R: GAAGGAAAGCATCTCTGC | 92 ° C 1 мин, 58 °C 1 мин, 72 ° C 90 с, 30 циклов; | |||||
| 72 ° C 5 мин. | ||||||
| Arsenophonus | 23S рРНК | Ars-F: CGTTTGATGAATTCATAGTCAAA | 95 ° С 5 мин; | 28 | ||
| Ars-R: GGTCCTCCAGTTAGTGTTACCCAAC | 95 ° С 30 с, 60,5 ° С 30 с, 72 ° С 45 с, 30 циклов; | |||||
| 72 ° C 10 мин | ||||||
| Cardinium | 16S рРНК | Автомобиль-F: TACTGTAAGAATAAGCACCGGC | 95 ° C 2 мин | 29 | ||
| Автомобиль-R: GTGGATCACTTAACGCTTTCG | 92 ° С 1 мин, 57 ° С 1 мин, 72 ° С 90 с, 30 циклов; | |||||
| 72 ° C 5 мин. | ||||||
| вольбахия | 16S рРНК | Wol-F: TTGTAGCCTGCTATGGTATAACT | 94 ° С 5 мин; | 30, 31 | ||
| Wol-R: GAATAGGTATGATTTTCATGT | 94 ° C 1 мин, 55 ° C 1 мин, 72 ° C 1 мин, 35 циклов | |||||
| Fritschea | 23S рРНК | Fri-F: GATGCCTTGGCATTGATAGGCGATGAAGGA | 95 ° С 5 мин; | 32 | ||
| Fri-R: TGGCTCATCATGCAAAAGGCA | 94 ° C 1 мин, 64 ° C 1 мин, 72 ° C 90 с, 35 циклов; | |||||
| 72 ° C 5 мин. | ||||||
| Hemipteriphilus | GroEL | OR- groEL -F: CACCWAAAATTACTAAAGATGG | 94oC 3 мин; | 18 | ||
| OR- groEL -R: TAGAARTCCATWCCKCCCATWC | 94 ° C 30 с, 52 ° C 30 с, 72 ° C 2 мин, 34 цикла; | |||||
| 72 ° C 10 мин | ||||||
Таблица 1: ПЦР-праймеры и процедуры эндосимбионтов в Whitefly.
| Portiera | Hamiltonella | |
| Номер Contig | 1 | 138 |
| Номер леса a a | 1 | 89 |
| Общая длина, bp | 358232 | 1711449 |
| N50, bp | / | 118802 |
| N90, bp | / | 16753 |
| Максимальная длина, bp | / | 390511 |
| Минимальная длина, bp | / | 503 |
| Содержание GC,% | 26,18 | 39,89 |
| A Информация, представленная ниже, основана на строительных лесах. | ||
Таблица 2: Общие характеристики Portiera и Hamiltonella Draft Геном.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Финансовая поддержка этого исследования была предоставлена Национальной ключевой программой исследований и разработок (2016YFC1200601) и Национальным научным фондом Китая (31390421).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA polymerase | Takara | R001A | including rTaq, 10×Buffer and dNTP |
| Gel DNA extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| DNA sample sequencing system | ABI | ABI-3730XL | |
| Microtome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7650 TEM | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| 20 μL microloader | Eppendorf | F2771951 | |
| Filter holder | Millipore | SX0001300 | |
| Filter membrane filter | Millipore | SMWP001300 | 5.0 μm SMWP |
| REPLI-g UltraFast Mini Kit | Qiagen | 150033 | DNA amlification kit |
| NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Genome Sequencer | Illumina | Hiseq 2000 |
References
- Buchner, P. Endosymbiosis of animals with plant microorganisms. J. Basic Microbiol. 7 (2), Interscience. New York. (1967).
- Sloan, D. B., Moran, N. A. Endosymbiotic bacteria as a source of carotenoids in whiteflies. Biol. Letters. 8 (6), 986-989 (2012).
- Stouthamer, R., Breeuwer, J. A., Hurst, G. D. Wolbachia pipientis: microbial manipulator of arthropod reproduction. Annu. Rev. Microbiol. 53, 71-102 (1999).
- Brumin, M., Kontsedalov, S., Ghanim, M. Rickettsia influences thermotolerance in the whitefly Bemisia tabaci B biotype. Insect Sci. 18 (1), 57-66 (2011).
- Hansen, A. K., Degnan, P. H. Widespread expression of conserved small RNAs in small symbiont genomes. ISME J. 8, 2490-2502 (2014).
- Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and evolution of heritable bacterial symbionts. Annu. Rev. Genet. 42, 165-190 (2008).
- Shigenobu, S., Watanabe, H., Hattori, M., Sakaki, Y., Ishikawa, H. Genome sequence of the endocellular bacterial symbiont of aphids Buchnera sp. APS. Nature. 407, 81-86 (2000).
- Nikoh, N., et al.
- Sloan, D. B., et al. Parallel histories of horizontal gene transfer facilitated extreme reduction of endosymbiont genomes in sap-feeding insects. Mol. Biol. Evol. 31 (4), 857-871 (2014).
- Xue, J., et al. Genomes of the rice pest brown planthopper and its endosymbionts reveal complex complementary contributions for host adaptation. Genome Biol. 15 (12), 521 (2014).
- Campbell, M. A., et al. Genome expansion via lineage splitting and genomereduction in the cicada endosymbiont Hodgkinia. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (33), 10192-10199 (2015).
- Wilson, A. C., et al. Genomic insight into the amino acid relations of the pea aphid, Acyrthosiphon pisum, with its symbiotic bacterium Buchnera aphidicola. Insect Mol. Biol. 19, 249-258 (2010).
- Degnan, P. H., Ochman, H., Moran, N. A. Sequence conservation and functional constraint on intergenic spacers in reduced genomes of the obligate symbiont Buchnera. PLoS Genet. 7 (9), e1002252 (2011).
- Nakabachi, A., et al. The 160-kilobase genome of the bacterial endosymbiont Carsonella. Science. 314 (5797), 267 (2006).
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annu. Rev. Entomol. 56, 1-19 (2011).
- Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
- Bing, X. L., Ruan, Y. M., Rao, Q., Wang, X. W., Liu, S. S. Diversity of secondary endosymbionts among different putative species of the whitefly Bemisia tabaci. Insect Sci. 20 (2), 194-206 (2013).
- Bing, X. L., Yang, J., Zchori-Fein, E., Wang, X. W., Liu, S. S. Characterization of a newly discovered symbiont of the whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). Appl. Environ. Microbiol. 79 (2), 569-575 (2013).
- Kliot, A., et al. Fluorescence in situ hybridizations (FISH) for the localization of viruses and endosymbiotic bacteria in plant and insect tissues. J. Vis. Exp. (84), e51030 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
- Rao, Q., et al. Genome reduction and potential metabolic complementation of the dual endosymbionts in the whitefly Bemisia tabaci. BMC Genomics. 16 (1), 226 (2015).
- Thao, L. L., Baumann, P. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).
- Zhu, D. T., et al. Sequencing and comparison of the Rickettsia genomes from the whitefly Bemisia tabaci Middle East Asia Minor I. Insect Sci. 23 (4), 531-542 (2016).
- Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (HomopteraAleyrodidae). Appl. Environ. Microbiol. 72 (5), 3646-3652 (2006).
- Zhang, C. R., et al. Differential temporal changes of primary and secondary bacterial symbionts and whitefly host fitness following antibiotic treatments. Sci. Rep. 5, 15898 (2015).
- Shan, H. W., et al. Temporal changes of symbiont density and host fitness after rifampicin treatment in a whitefly of the Bemisia tabaci species complex. Insect Sci. 23 (2), 200-214 (2016).
- Zchori-Fein, E., Brown, J. K. Diversity of prokaryotes asscociated with Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 95 (6), 711-718 (2002).
- Thao, M. L., Baumann, P. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).
- Zchori-Fein, E., Perlman, S. J. Distribution of the bacterial symbiont Cardinium in arthropods. Mol. Ecol. 13 (7), 2009-2016 (2004).
- O'Neill, S. L., Giordano, R., Colbert, A. M., Karr, T. L., Robertson, H. M. 116S rRNA phylogenetic analysis of the bacterial endosymbionts associated with cytoplasmic incompatibility in insects. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (7), 2699-2702 (1992).
- Nirgianaki, A. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47 (2), 93-101 (2003).
- Everett, K. D., Thao, M. L., Horn, M., Dyszynski, G. E., Baumann, P. Novel chlamydiae in whiteflies and scale insects: endosymbionts 'Candidatus Fritschea bemisiae' strain Falk and 'Candidatus Fritschea eriococci' strain Elm. Int. J. Syst. Evol. Micr. 55, 1581-1587 (2005).
