Summary
Her presenterer vi en protokoll for å isolere endosymbionter fra whitefly Bemisia tabaci gjennom disseksjon og filtrering. Etter amplifisering er DNA-prøvene egnet for etterfølgende sekvensering og undersøkelse av gjensidigiteten mellom endosymbionter og whitefly.
Abstract
Bakterie symbionter danner et intimt forhold til sine verter og gir i de fleste tilfeller fordeler til vertene. Genomisk informasjon er kritisk for å studere funksjonene og utviklingen av bakterielle symbionter i verten. Ettersom de fleste symbionter ikke kan dyrkes in vitro , er metoder for å isolere en tilstrekkelig mengde bakterier for genom-sekvensering svært viktige. I Whitefly Bemisia tabaci har en rekke endosymbioner blitt identifisert og antas å være av betydning for utvikling og reproduksjon av skadedyrene gjennom flere tilnærminger. Imidlertid forblir mekanismen som ligger til grunn for foreningene stort sett ukjente. Hindringen kommer delvis fra det faktum at endosymbionter i whitefly, mest forstyrret i bakteriocytter, er vanskelig å skille fra vertscellene. Her rapporterer vi en trinnvis protokoll for identifisering, ekstraksjon og rensing av endosymbionter fra whitefly B. tabaci hovedsakelig ved dissektiPå og filtrering. Endosymbiont-prøver fremstilt ved denne fremgangsmåte, selv om de fortsatt er en blanding av forskjellige endosymbiont-arter, er egnede for etterfølgende genom-sekvensering og analyse av de mulige roller av endosymbionter i B. tabaci . Denne metoden kan også brukes til å isolere endosymbioner fra andre insekter.
Introduction
Bakterier som danner et intimt symbiotisk forhold med relative verter er utbredt i leddyr 1 . Endosymbionter har blitt vist å påvirke aspekter av verter, som næringsmetabolisme, reproduksjon, respons på miljøspenninger 2 , 3 , 4 etc. , i nesten alle utviklingsstadier 5 . Imidlertid er mekanismen som ligger til grunn for foreningene fortsatt stort sett ukjent. Genomics er prioritert og viktig når man studerer de mulige funksjonene og rollene til bakterier. Enkelte grunnleggende opplysninger, det vil si den taxonomiske statusen, funksjonelle gener, metabolismeveier, sekresjonssystemer, kan utledes av genometsekvenser som skjuler lysene på symbionets mulige roller i symbiose. Med utviklingen av høy gjennomstrømningssekvensering har et stort antall bakteriegener blitt sekvensert wMed forskjellige funksjoner avslørt 6 .
Endosymbionter er av vital betydning i hemipterans, som bladlus 7 , bedbugs 8 , psyllids 9 , brown planthoppers 10 og cicadas 11 . For eksempel har Buchnera i bladlus, som obligatorisk symbiont, vist seg å være involvert i essensiell aminosyrebiosyntese, sammen med gener fra bladlusgenomet 12 . Videre er transkriptjonell regulering av Buchnera også avslørt 13 . I psyllider blir Carsonella sekvensert og rangert som det minste bakteriegenomet som noensinne er funnet 14 . Alle disse kjennetegnene for endosymbionter er basert og utledes fra genometsekvensene. Fordi disse endosymbionter ikke kan dyrkes in vitro , har flere tilnærminger blitt anvendt for å isolere tilstrekkelige bakterier for sequencing. I bladlus ekstraheres endosymbioner gjennom sentrifugering og filtrering og underkastes videre genomisk og transkriptomisk analyse 5 . I brune plantehoppere sekvenseres endosymbionter sammen med hele insektsgenomet 10 .
Whitefly B. tabaci er et artskompleks som inneholder mer enn 35 morfologisk uoppdagelige arter (kryptiske arter), blant hvilke to invasive arter har invadert over hele verden og forårsaket enorm skade på landbruksproduksjonen 15 . Av oppmerksomhet har endosymbioner innenfor B. tabaci- arter vist betydning i utviklingen av skadedyrene 16 . Til nå er det identifisert åtte endosymbionter i whiteflyen, inkludert den obligatoriske symbionten, Candidatus Portiera aleyrodidarum og syv sekundære symbionter Hamiltonella , Rickettsia , Arsenophonus , Cardinium , <Em> Wolbachia, Fritschea og Hemipteriphilus definert 17 , 18 .
I motsetning til hemipteransene beskrevet tidligere, er whitefly B. tabaci et ekstremt lite insekt med en lengde på 1 mm. De fleste endosymbionter er begrenset til bakteriocytter 19 (spesialiserte celler som inneholder symbionter, som ytterligere danner bakteriom i B. tabaci ). I tillegg kan disse endosymbionene ikke dyrkes in vitro . Den eneste måten å skaffe endosymbionter fra B. tabaci er å dissekere bakterien ut. Det er imidlertid problemer med disseksjonen. For det første kobler den skjøre bakterien alltid med andre vev av whitefly, som er vanskelig å skille fra. For det andre begrenser den lille størrelsen på whitefly isolasjonen av nok bakteriom. For det tredje, endosymbionter klynger i bakterien, noe som gjør det ekstremt komplisert å skaffe en enkelt bakterieart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hvitflykende og kryptisk artidentifikasjon
- Vedlikehold av whitefly-arten på bomull Gossypium hirsutum (Malvaceae) (cv. Zhe-Mian 1973) i bur under standardforhold på 27 ± 1 ° C, 70 ± 10% fuktighet og 14 h lys: 10 timer mørkt regime.
- Samle en individuell voksen hvitefugl og homogenisere i 30 μl lysisbuffer (10 mM Tris, pH 8,4, 50 mM KCl, 0,45% [vol / vol] Tween-20, 0,2% [vekt / vol] gelatin, 0,45% [vol / Vol. Nonidet P 40, 60 g / ml Proteinase K).
- Inkuber homogenatet ved 65 ° C i 1 time og deretter 100 ° C i 10 minutter.
MERK: Inkubasjonstiden ved 65 ° C kan økes hvis nødvendig. Inkubasjonstiden ved 100 ° C bør kontrolleres kritisk for å inaktivere proteinase K tilstrekkelig og unngå DNA-skade. - Utfør polymerasekjedereaksjon (PCR) ved hjelp av whitefly-DNA (oppnådd i avsnitt 1.3) basert på mitokondrielle cytokromoksidase I primere.
COI-F: 5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3 '
COI-R: 5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3 '- Utfør PCR-reaksjonene i et sluttvolum på 25 μl som inneholder 1 U Taq DNA-polymerase, 2,5 μl 10x buffer, 0,2 mM dNTP, 0,2 mM av hver primer og 2 μl whitefly-DNA.
- Bruk følgende PCR prosedyrer: initial denaturering 95 ° C i 3 minutter etterfulgt av 35 sykluser 95 ° C i 45 s (denaturering), 50 ° C i 45 s (annealing) og 72 ° C i 1 min (forlengelse) og Ytterligere 10 minutter ved 72 ° C for videre forlengelse.
- Rengjør det PCR-amplifiserte produktet ved hjelp av et DNA-gelekstraksjonssett med den anbefalte protokollen.
- Sekvenser de rensede DNA-prøvene med et DNA-prøve-sekvenseringssystem etter produsentens instruksjon.
- Analyser sekvensene ved hjelp av Basic Local Matching Search Tool (BLAST) for å identifisere kryptiske arter av whitefly og unngå forurensning av andre spesiellees.
2. Endosymbiont-identifikasjon og lokalisering
- Utfør PCR på whitefly-DNA (oppnådd i trinn 1.3) for å amplifisere de spesifikke genene til hver endosymbiont i whiteflyen (PCR-oppskriften er beskrevet i avsnitt 1.4, og PCR-prosedyrer og primere er oppført i tabell 1 ).
- Emball den amplifiserte prøven til agarosegelelektroforese i henhold til tidligere publisert protokoll 20 (1% agarosegel, Tris-acetat-EDTA som løpebuffer, spenning 5 V / cm) for å identifisere det spesifikke genet for hver bakterie.
- Gjenopprett og ordne hvert bånd for å bestemme bakterieartene innenfor whitefly (se avsnitt 1.5-1.7).
- Utfør fluorescens in situ hybridiseringer (FISH) på hvite fluer for å identifisere plasseringen av endosymbionter i henhold til tidligere publisert protokoll 19 .
MERK: Øk konsentrasjonen av fluorescerende prober hvis nødvendig. 3. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) - Dyp og fest hvite fluer i fosfatbuffer (0,1 M, pH 7,0) inneholdende 2,5% [vol / vol] glutaraldehyd i 4 timer.
- Vask prøvene i fosfatbuffer (0,1 M, pH 7,0) tre ganger, 15 min hver gang.
- Dyp og fest prøvene igjen i fosfatbuffer (0,1 M, pH 7,0) inneholdende 1% [vol / vol] OsO 4 i 2 timer.
- Dehydrere prøvene med en gradert serie etanol (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% og 100%), 15 minutter hver gang.
- Overfør og prøv prøvene i 100% aceton i 20 minutter.
- Plasser prøvene i blanding av 100% aceton og 100% Spurr harpiks (1: 1) i 1 time ved romtemperatur.
- Overfør prøvene til blanding av 100% aceton og 100% Spurr harpiks (1: 3) i 3 timer ved romtemperatur.
- Overfør og fordyp prøvene i 100% Spurr harpiks (inkubert ved 70 ° C) i mer enn 9 timer.
- Seksjonen whitefly prøver ved hjelp av en mikrotil meg.
- Stain de ultratynne filmene (oppnådd i avsnitt 3.9) ved nedsenkning i absolutt uranylacetat i 5-10 minutter, etterfulgt av nedsenking i 50% alkalisk blycitrat i ytterligere 5-10 minutter.
MERK: Volumene av reagenser som benyttes i avsnitt 3.1-3.10 avhenger av prøvene. Sørg for at prøvene er nedsenket i reagensene. - Følg prøver under transmisjonselektronmikroskopi (15.000X) for å bestemme lokalisering, form og størrelse av bakterier til videre bruk (se pkt. 4.6).
- Tilsett 100 μl 1x PBS-løsning på et mikroskopdia. Velg noen 3 eller 4 instar nymfer fra bomullsløv og fordyp dem inn i PBS-løsningen.
- Bruk fine entomologiske nåler under et stereomikroskop og trekk bakteriomene ut fra hvitefugllegemet.
- Klipp forsiktig et hull på den ene siden av nymfen, og trykk litt på den andreSide for å la bakteriene komme ut.
- Monter en 20 μL mikrobelastning (med den ledende enden kutt for å møte størrelsen på bakteriom) på en 0,5-10 μL pipette. Trekk den enkelte bakterien ut av PBS-oppløsningen i mikrobelasteren.
- Vask bakteriomet for å eliminere forurensningen av andre whitefly vev ved å pipettere bakteriomet i PBS løsningen og ekstrahere bakterien. Gjenta tre ganger.
- Pipett det vasket bakteriomet omgående inn i et sentrifugerør som inneholder 60 μl 1x PBS-løsning.
- Sprøytefiltrer det samlede bakteriomet gjennom en 5 μm filtermembran (bestemt av størrelser av bakterier og kjerne av bakteriocyt i whitefly). Gjenta flere ganger for å flytte den blandede væsken gjennom filtermembranen grundig.
MERK: For å oppnå et bedre resultat av forsterkning og sekvensering, samle over 100 bakteriomer. Våt filtermembranen først ved å bruke 1x PBS-løsning for å redusere tapet av bakterierBindende til membranen. - Forsterk filtratet (hovedsakelig inneholdende endosymbionter av whitefly) ved å bruke et DNA-amplifikasjonssett med den anbefalte protokollen med noen modifikasjoner.
- Velg den anbefalte protokollen for amplifisering av genomisk DNA fra blod eller celler og lag buffer D2 for påfølgende eksperiment.
- Tilsett 1,5 μL filtrat (se avsnitt 4.6) direkte til sentrifugerøret, etterfulgt av 1,5 μl av buffer D2 og bland godt.
- Inkubér på is i 10 minutter og tilsett 1,5 μL av stoppløsningen.
- Tilsett 15 μl av reaksjonsbufferen og 1 μl av DNA-polymerasen og bland forsiktig.
- Inkubér blandingen ved 30 ° C i 16 timer, etterfulgt av 3 minutter ved 65 ° C.
- Utfør PCR direkte på det forsterkede filtratet (fortynn de amplifiserte prøvene om nødvendig) ved å bruke spesifikke primere designet for bacTeria for å bekrefte bakteriearten (se avsnitt 2.1).
- Utfør PCR for å bekrefte om det er forurensning av vertsgenomet ved å bruke whitefly-gen- beta-Actin og EF1- primere i henhold til tidligere publisert metode 21 (PCR-oppskriften er beskrevet i avsnitt 1.4).
- Emne det forsterkede filtratet til et spektrofotometer og et fluorometer (i henhold til produsentens instruksjoner) før sekvensering for å teste kvaliteten på prøvene og om prøvene oppfyller kriteriene for sekvensering.
- Emne amplifisert til en genom-sequencer i henhold til produsentens instruksjoner.
4. Whitefly Bacteriome Dissection and Purification
5. Forsterkning av endosymbiont-genomene
6. Endosymbiont-metagenom-sekvensering
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mellom-Østasien Minor 1 (MEAM1) arter av B. tabaci- komplekset ble tatt som et eksempel her for beskrivelse. Bomull til oppdrett av hvalfluer og flere utviklingsstadier av hvalfluer er vist i Figur 1, inkludert en bomullsplante, voksen hvitefugl og 1 , 2 og 4 instar nymfer av hvitefugl (den tredje innfødte nymf ser på samme måte som den 4. instar nymf ). Det var tydelig at den 4. instar nymf er større enn 1 og 2 nd instar nymfer ( Figur 1 ). FISH-analyse av Portiera og Hamiltonella innenfor MEAM1 er vist i figur 2 . Disse to endosymbionene er begrenset til hvitefuglens bakteriocytter, og overlapping av de to bakteriene blir også observert. Figur 3 viser transmisjon elek Tronmikroskopi av Portiera endosymbiont av whitefly, noe som indikerer at Portiera kan miste sin cellevegg .
For sekvensering ble to biblioteker bygget, med innsatsstørrelser på henholdsvis 200 bp og 2000 bp. Etter sekvensering genererte de to bibliotekene henholdsvis 1,626 Mb og 1,302 Mb av rå data. Etter rensing av forurensningsdataene for adaptere og duplikasjoner ble det oppkalt 1,484 Mb og 1,219 Mb rene data. Samlingen resulterte vellykket i en komplett genom-sekvens for obligate symbiont, Portiera . I tillegg ble også et utkast til genom av Hamiltonella oppnådd. Samlingen basert på både 200 bp og 2000 bp biblioteker resulterte i 138 contigs. I henhold til sammenkoblede sammenhenger ble 138 kontigene samlet inn i 89 stillaser ( tabell 2 ).
Figimg "src =" / files / ftp_upload / 55809 / 55809fig1.jpg "/>
Figur 1: Oversikt over plante-insekt systemet benyttet i dette papiret. ( A ) Hvite fluer blir oppdrettet på bomullsplanter ( Gossypium hirsutum cv. Zhe-Mian 1793). ( B ) Utsikt over en voksen whitefly. ( C ) Flere utviklingsstadier av instar nymf i whitefly livssyklus. Rød pil refererer til egget av whitefly; Svart pil refererer til 1 st instar nymf av whitefly; Hvit pil refererer til den andre nymf av whitefly; Blå pil refererer til den fjerde instar nymf av whitefly. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: FISH Analyse av Portiera , HamIltonella i den 4. Instar Nymph av MEAM1. Portiera- spesifikke probe (rød) konjugert til Cy3, Hamiltonella- spesifikke probe (grønn) merket med Cy5 ble anvendt. Skalestenger = 100 μm. ( A ) De røde hybridiseringssignalene representerer Portiera under mørkt felt. ( B ) De grønne hybridiseringssignalene representerer Hamiltonella under mørkt felt. ( C ) Portiera og Hamiltonella fusjonerte signaler under mørkt felt. ( D ) Portiera og Hamiltonella fusjonerte signaler under lyse felt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Transmisjon Elektron MicroScopy Bilde av Portiera in Whitefly. Pil indikerer plasseringen av Portiera . Skalbjelke = 1 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Mål symbiont | Målgen | Primer-sekvenser (5'-3 ') | PCR prosedyrer | referanser | ||
| Portiera | 16S rRNA | Por-F: TGCAAGTCGAGCGGCATCAT | 95 ° C 1 min, 60 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, 5 sykluser; | 27 | ||
| Por-R: AAAGTTCCCGCCTTATGCGT | 9576; C 1 min, 58 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, 30 sykluser; | |||||
| 72 ° C 20 min | ||||||
| Hamiltonella | 16S rRNA | Ham-F: TGAGTAAAGTCTGGGAATCTGG | 95 ° C 1 min, 60 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, 5 sykluser; | 27 | ||
| Ham-R: CCCGGGAACGTATTCACCGTAG | 95 ° C 1 min, 58 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, 30 sykluser; | |||||
| 72 ° C 20 min | ||||||
| Rickettsia | 16S rRNA | Ric-F: GCTCAGAACGAACGCTATC | 95 ° C 2 min; | 24 | ||
| Ric-R: GAAGGAAAGCATCTCTGC | 92 ° C 1 min, 58 °C 1 min, 72 ° C 90 s, 30 sykluser; | |||||
| 72 ° C 5 min | ||||||
| Arsenophonus | 23S rRNA | Ars-F: CGTTTGATGAATTCATAGTCAAA | 95 ° C 5 min; | 28 | ||
| Ars-R: GGTCCTCCAGTTAGTGTTACCCAAC | 95 ° C 30 s, 60,5 ° C 30 s, 72 ° C 45 s, 30 sykluser; | |||||
| 72 ° C 10 min | ||||||
| Cardinium | 16S rRNA | Bil-F: TACTGTAAGAATAAGCACCGGC | 95 ° C 2 min | 29 | ||
| Bil-R: GTGGATCACTTAACGCTTTCG | 92 ° C 1 min, 57 ° C 1 min, 72 ° C 90 s, 30 sykluser; | |||||
| 72 ° C 5 min | ||||||
| Wolbachia | 16S rRNA | Wol-F: TTGTAGCCTGCTATGGTATAACT | 94 ° C 5 min; | 30, 31 | ||
| Wol-R: GAATAGGTATGATTTTCATGT | 94 ° C 1 min, 55 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, 35 sykluser | |||||
| Fritschea | 23S rRNA | Fre-F: GATGCCTTGGCATTGATAGGCGATGAAGGA | 95 ° C 5 min; | 32 | ||
| Fri-R: TGGCTCATCATGCAAAAGGCA | 94 ° C 1 min, 64 ° C 1 min, 72 ° C 90 s, 35 sykluser; | |||||
| 72 ° C 5 min | ||||||
| Hemipteriphilus | groEL | OR- groEL -F: CACCWAAAATTACTAAAGATGG | 94 ° C 3 min; | 18 | ||
| OR- groEL -R: TAGAARTCCATWCCKCCCATWC | 94 ° C 30 s, 52 ° C 30 s, 72 ° C 2 min, 34 sykluser; | |||||
| 72 ° C 10 min | ||||||
Tabell 1: PCR-primere og prosedyrer for endosymbionter i Whitefly.
| Portiera | Hamiltonella | |
| Contig nummer | 1 | 138 |
| Stillasnummer a | 1 | 89 |
| Total lengde, bp | 358232 | 1711449 |
| N50, bp | / | 118802 |
| N90, bp | / | 16753 |
| Maks lengde, bp | / | 390511 |
| Min lengde, bp | / | 503 |
| GC innhold,% | 26.18 | 39.89 |
| En informasjon som presenteres nedenfor er basert på stillas. | ||
Tabell 2: Generelle egenskaper av Portiera og Hamiltonella Draft Genome.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Finansiell støtte til denne studien ble levert av Nasjonal nøkkelforsknings- og utviklingsprogram (2016YFC1200601) og Nasjonalt naturvitenskapelig fundament i Kina (31390421).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA polymerase | Takara | R001A | including rTaq, 10×Buffer and dNTP |
| Gel DNA extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| DNA sample sequencing system | ABI | ABI-3730XL | |
| Microtome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7650 TEM | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| 20 μL microloader | Eppendorf | F2771951 | |
| Filter holder | Millipore | SX0001300 | |
| Filter membrane filter | Millipore | SMWP001300 | 5.0 μm SMWP |
| REPLI-g UltraFast Mini Kit | Qiagen | 150033 | DNA amlification kit |
| NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Genome Sequencer | Illumina | Hiseq 2000 |
References
- Buchner, P. Endosymbiosis of animals with plant microorganisms. J. Basic Microbiol. 7 (2), Interscience. New York. (1967).
- Sloan, D. B., Moran, N. A. Endosymbiotic bacteria as a source of carotenoids in whiteflies. Biol. Letters. 8 (6), 986-989 (2012).
- Stouthamer, R., Breeuwer, J. A., Hurst, G. D. Wolbachia pipientis: microbial manipulator of arthropod reproduction. Annu. Rev. Microbiol. 53, 71-102 (1999).
- Brumin, M., Kontsedalov, S., Ghanim, M. Rickettsia influences thermotolerance in the whitefly Bemisia tabaci B biotype. Insect Sci. 18 (1), 57-66 (2011).
- Hansen, A. K., Degnan, P. H. Widespread expression of conserved small RNAs in small symbiont genomes. ISME J. 8, 2490-2502 (2014).
- Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and evolution of heritable bacterial symbionts. Annu. Rev. Genet. 42, 165-190 (2008).
- Shigenobu, S., Watanabe, H., Hattori, M., Sakaki, Y., Ishikawa, H. Genome sequence of the endocellular bacterial symbiont of aphids Buchnera sp. APS. Nature. 407, 81-86 (2000).
- Nikoh, N., et al.
- Sloan, D. B., et al. Parallel histories of horizontal gene transfer facilitated extreme reduction of endosymbiont genomes in sap-feeding insects. Mol. Biol. Evol. 31 (4), 857-871 (2014).
- Xue, J., et al. Genomes of the rice pest brown planthopper and its endosymbionts reveal complex complementary contributions for host adaptation. Genome Biol. 15 (12), 521 (2014).
- Campbell, M. A., et al. Genome expansion via lineage splitting and genomereduction in the cicada endosymbiont Hodgkinia. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (33), 10192-10199 (2015).
- Wilson, A. C., et al. Genomic insight into the amino acid relations of the pea aphid, Acyrthosiphon pisum, with its symbiotic bacterium Buchnera aphidicola. Insect Mol. Biol. 19, 249-258 (2010).
- Degnan, P. H., Ochman, H., Moran, N. A. Sequence conservation and functional constraint on intergenic spacers in reduced genomes of the obligate symbiont Buchnera. PLoS Genet. 7 (9), e1002252 (2011).
- Nakabachi, A., et al. The 160-kilobase genome of the bacterial endosymbiont Carsonella. Science. 314 (5797), 267 (2006).
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annu. Rev. Entomol. 56, 1-19 (2011).
- Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
- Bing, X. L., Ruan, Y. M., Rao, Q., Wang, X. W., Liu, S. S. Diversity of secondary endosymbionts among different putative species of the whitefly Bemisia tabaci. Insect Sci. 20 (2), 194-206 (2013).
- Bing, X. L., Yang, J., Zchori-Fein, E., Wang, X. W., Liu, S. S. Characterization of a newly discovered symbiont of the whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). Appl. Environ. Microbiol. 79 (2), 569-575 (2013).
- Kliot, A., et al. Fluorescence in situ hybridizations (FISH) for the localization of viruses and endosymbiotic bacteria in plant and insect tissues. J. Vis. Exp. (84), e51030 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
- Rao, Q., et al. Genome reduction and potential metabolic complementation of the dual endosymbionts in the whitefly Bemisia tabaci. BMC Genomics. 16 (1), 226 (2015).
- Thao, L. L., Baumann, P. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).
- Zhu, D. T., et al. Sequencing and comparison of the Rickettsia genomes from the whitefly Bemisia tabaci Middle East Asia Minor I. Insect Sci. 23 (4), 531-542 (2016).
- Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (HomopteraAleyrodidae). Appl. Environ. Microbiol. 72 (5), 3646-3652 (2006).
- Zhang, C. R., et al. Differential temporal changes of primary and secondary bacterial symbionts and whitefly host fitness following antibiotic treatments. Sci. Rep. 5, 15898 (2015).
- Shan, H. W., et al. Temporal changes of symbiont density and host fitness after rifampicin treatment in a whitefly of the Bemisia tabaci species complex. Insect Sci. 23 (2), 200-214 (2016).
- Zchori-Fein, E., Brown, J. K. Diversity of prokaryotes asscociated with Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 95 (6), 711-718 (2002).
- Thao, M. L., Baumann, P. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).
- Zchori-Fein, E., Perlman, S. J. Distribution of the bacterial symbiont Cardinium in arthropods. Mol. Ecol. 13 (7), 2009-2016 (2004).
- O'Neill, S. L., Giordano, R., Colbert, A. M., Karr, T. L., Robertson, H. M. 116S rRNA phylogenetic analysis of the bacterial endosymbionts associated with cytoplasmic incompatibility in insects. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (7), 2699-2702 (1992).
- Nirgianaki, A. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47 (2), 93-101 (2003).
- Everett, K. D., Thao, M. L., Horn, M., Dyszynski, G. E., Baumann, P. Novel chlamydiae in whiteflies and scale insects: endosymbionts 'Candidatus Fritschea bemisiae' strain Falk and 'Candidatus Fritschea eriococci' strain Elm. Int. J. Syst. Evol. Micr. 55, 1581-1587 (2005).
