Summary
小型動物での高速インビボ脳イメージングのためのコンパクトパルスレーザダイオード光音響トモグラフィ（PLD-PAT）システムが実証されています。
Abstract
インビボ小動物イメージングは、前臨床研究において重要な役割を果たす。光音響トモグラフィー（PAT）は、前臨床および臨床の両方の用途に大きな可能性を示す新興ハイブリッドイメージングモダリティです。従来の光パラメトリック発振器ベースのPAT（OPO-PAT）システムは、かさばって高価であり、高速イメージングを提供することができない。近年、PATの代替励起源として、パルスレーザダイオード（PLD）が成功裏に実証されている。パルスレーザダイオードPAT（PLD-PAT）は、光音響ファントムや生体組織の高速イメージングにも成功しています。この研究は、PLD-PATを用いたインビボ脳イメージングのための視覚化された実験プロトコルを提供する。このプロトコルには、コンパクトなPLD-PATシステム構成とその説明、脳イメージングのための動物の準備、および2D断面ラット脳画像の典型的な実験手順が含まれる。 PLD-PATシステムはコンパクトでコスト効率が良い高速で高品質な画像を提供することができます。 インビボで様々なスキャン速度で収集された脳画像が提示される。
Introduction
光音響トモグラフィ（PAT）は、臨床および前臨床試験1,2,3,4,5の両方において多くの用途を有するハイブリッド撮像モダリティである。 PATでは、ナノ秒のレーザーパルスが生体組織を照射します。組織発色団による入射光の吸収は、局部的な温度上昇をもたらし、次に音波が音波の形態で放出される。超音波検出器は、試料周辺の様々な位置で光音響信号を収集する。光音響（PA）信号は、光音響画像を生成するために様々なアルゴリズム（遅延 - 和アルゴリズムなど） 6を使用して再構成される。
このハイブリッドイメージングモダリティは、高解像度、深部組織イメージングおよび高い光吸収コントラスト7を提供し 、class = "xref"> 8。最近では、より長い波長（約1,064nm）およびリン系フタロシアニンと呼ばれる外因性造影剤の助けを借りて、鶏の乳房組織において約12cmの画像深度9が達成された。この深度感度は、共焦点蛍光顕微鏡法、2光子蛍光顕微鏡法、 10光干渉断層法、 11 等の他の光学法の深度感度よりもはるかに高い.PATは、2つ以上の波長を使用して、器官における構造的および機能的変化。多くの人間の病気について、小動物のモデルは十分に確立されている12,13,14,15。小動物の画像化のために、いくつかの様式が実証されている。これらのアプローチのうち、PAイメージングは、上記の利点のためにかなり迅速に注目を集めています。 PATは、小動物4,16,17,18の組織および器官（ すなわち、心臓、肺、肝臓、眼、脾臓、脳、皮膚、脊髄、腎臓など ）における血管造影の可能性を示している。 PATは、小動物脳画像の確立されたモダリティである。 PA波は発色団による光吸収のために生成されるので、多重波長PATは総ヘモグロビン濃度（HbT）と酸素飽和度（SO 2 ）のマッピングを可能にする19,20,21,22。脳神経血管造影は、外因性造影剤12,23,24の助けを借りて達成された。 PAモダリティは脳の健康をよりよく理解するのに役立ちます分子レベルおよび遺伝子レベルで情報を提供する。
小動物イメージングのために、Nd：YAG / OPOレーザーがPAT励起源として広く使用されている。これらのレーザーは〜10 nsの繰返し率で約5 nsの近赤外パルスをエネルギー（OPO出力ウィンドウで約100 mJ）で照射します。このようなレーザを備えたPAシステムは、高価でかさばり、レーザ光源の繰り返し率が低いため、単一素子超音波トランスデューサ（UST）を用いた低速イメージングを可能にする。そのようなPAシステムにおける典型的なA線獲得時間は、断面25当たり約5分である。このような長い測定時間を有するイメージングシステムは、全身イメージング、時間分解能イメージングなどのための生理学的パラメータを制御することが困難であるため、小動物イメージングには理想的ではない。複数の単一素子USTを採用することによって、アレイベースのUST、または高繰返し率のレーザーを使用すると、PAのイメージング速度を高めることができますシステム。サンプルの周りのすべてのPA信号を収集するために1つの単一素子USTのみを使用することにより、システムのイメージング速度が制限される。高速または高感度のイメージング技術のために、円形または半円形の幾何学配置で配置された複数の単一素子USTが実証されています。線形、半円形、円形、および容積配列などのアレイベースのUST26は、リアルタイムイメージングにうまく使用されています1 。これらのアレイベースのUSTはイメージングスピードを増加させ、測定感度を低下させるが、高価である。しかし、アレイベースのUSTを使用するPAシステムのイメージング速度は、依然としてレーザの繰り返し速度によって制限されています。
パルスレーザ技術は、高繰返し率のパルスレーザダイオード（PLD）を製造するために進歩した。 7,000フレーム/秒臨床超音波プラットフォーム27を使用してPLDでBスキャン光音響イメージングが実証された。このようなPLDは、単一要素のUST円形走査形状であっても、PATシステムである。単一要素のUSTは、アレイベースのUSTとは異なり、安価で高感度です。過去10年間で、PAイメージングの励起源として高繰返し率PLDの使用に関する研究はほとんど報告されていませんでした。ファントム28の PAイメージングのためにファイバベースの近赤外PLDが実証された。低エネルギーPLDを使用して、人間の皮膚より1mm低い深さの血管のインビボイメージングが実証された29 。 PLDベースの光学解像度光音響顕微鏡（ORPAM）が報告された。 PLDを使用して、0.43Hzのフレームレートで〜1.5cmの深さのイメージングが実証されました30 。非常に最近、PLD-PATシステムが報告され、生物組織25,31において〜3秒程度の短時間および〜2cmの画像深度で画像が提供された。この研究は、このような低コストでコンパクトなシステムが高クオ高速でも画像を表示できます。 PLD-PATシステムは、高フレームレート（7,000fps）光音響イメージング、表面血管イメージング、指関節イメージング、2cm深部組織イメージング、小動物脳イメージングなどに使用することができる。 PLDからの低パルスエネルギーパルスは、その適用をマルチスペクトルおよび深部組織イメージングに限定する。実験は、前臨床応用に使用されたのと同じPLD-PATシステムを用いて小動物に対して行われている。この研究の目的は、小型動物のインビボ 2D断面脳画像化のためのPLD-PATシステムの視覚化実験デモを提供することである。
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Protocol
すべての動物実験は、シンガポール南陽技術大学の動物実験および使用委員会（Animal Protocol Number ARF-SBS / NIE-A0263）によって承認されたガイドラインおよび規制に従って行われた。
1.システムの説明
- 図1aに示すように、PLDを円形スキャナの内部に取り付けます。 PLDをレーザードライバユニット（LDU）に接続します。
注記：PLDは〜803 nmの波長で〜136 nsのパルスを提供し、最大パルスエネルギーは約1.42 mJ、繰返し速度は最大7 kHzです。レーザ駆動部（LDU）は、温度コントローラと、可変電源と、電源（12V）と、ファンクションジェネレータとを備え、材料の表を参照してください。可変電源はレーザパワーを制御するために使用され、ファンクションジェネレータはPLDの繰り返しレートを変更するために使用されます。 - PLDレーザーのスイッチを入れます。 PLDの繰り返しレートを "7,000"に設定するHzをLDU内の関数ジェネレータを使用して実行します。可変電源の電圧を「3.1」Vに設定することにより、パルスエネルギーを1.42mJに増加させる。
- 図1aに示すように、PLD出射窓の前に光学ディフューザー（OD）を取り付けて、出力ビームを均一にします 。
注：細かいグリット（ すなわち、 1,500グリットの磨き）のディフューザーを使用してください。 - 図1aに示すように、USTホルダーに焦点を合わせたUSTをスキャン領域の中央に向けて取り付けます 。
注：USTの中心周波数は2.25 MHzで、焦点距離は1.9インチです。 - 図1aに示すように、超音波検出器をアクリルタンクの中に置きます 。 USTが完全に浸水するようにタンクを水で満たしてください。
注：水媒体は、脳（サンプル）から光音響信号をUSTに結合するために使用されます。アクリル水タンク（WT;材料表参照）はカスタム小動物イメージング用に設計されています。水タンクの設計図は図1bに示されています 。 - パルサー/レシーバーユニット（PRU; 材料表を参照）を使用して、サンプルからのPAシグナルを確認します。
注：これらの信号は、100 MS / sのサンプリングレートで12ビットのDAQカード（ 表の表を参照）でデジタル化され、コンピュータに保存されました。
ラット脳画像化のための動物の準備
注記：上記のPLD-PATシステムは、小型動物の脳を画像化するために実証された。これらの実験では、健康な雌ラット（ 表の表を参照）を使用した。
- 2mLのケタミン、1mLのキシラジン、および1mLの生理食塩水（0.2mL / 100gの用量）のカクテルを腹腔内注射することによって動物を麻酔する。
- ヘアクリッパーを使って動物の頭皮の毛皮を除去する。優しく剃毛した毛髪に脱毛クリームを塗る毛皮のさらなる枯渇のための領域。
- 綿棒で4〜5分後に塗布したクリームを除去する。
- 動物の目に人工涙軟膏を塗布し、麻酔およびレーザー照射による乾燥を防ぐ。
- ラボジャック上の呼吸用マスク（ 表の表を参照）が装備されたカスタムメイドの動物ホルダー（ 表の表を参照）を取り付けます。
- 動物をホルダー上で倒れやすい場所に置きます。イメージング中に動物の動きを避けるために、外科用テープを使用してホルダーに固定します。
- 呼吸マスクがラットの鼻と口を覆って、吸入麻酔薬を送達するようにしてください。
3. インビボラット脳画像化
- 呼吸マスクを麻酔機に接続します。麻酔装置のスイッチを入れ、0.75％イソフルランで酸素を1.0L /分供給するように設定します。
- パルスオキシメータをクランプしてください動物の生理学的状態を監視するために使用される。
- ラットの頭皮に無色の超音波ゲルの層を塗布する。ラボジャックの位置をスキャナの中心に合わせます。呼吸マスクは、イメージングウィンドウに合わせてカスタマイズされています。市販のノーズコーンの10％を切断し、手袋に接続する。
- ラボジャックの高さを手動で調整して、イメージング面がUSTの焦点にくるようにします。
- 必要に応じて、データ収集ソフトウェアのパラメータを設定します（材料表を参照）。データ収集ソフトウェアプログラムを実行して、収集（ すなわち、画像化）を開始する。
注：このプログラムは、USTを回転させてAラインPA信号を収集するために使用されます。収集されたAラインはコンピュータに保存されます。 - 撮影期間全体で動物を観察し、撮影が完了した後にPAT再構成に進む。
- データ取得が終了したら、再構成ソフトウェアプログラムを使用して、A線から断面脳画像を再構成する。
- 麻酔システムをオフにして、ステージから動物を取り出し、ケージに戻し、意識が回復するまでモニターします。
注：たとえば、USTを5秒間回転させると、PLDは35,000（= 5 x 7,000）パルスを出力し、USTは35,000のAラインを収集します。 70,000を超える信号を平均化することによって（Aライン= 35,000 / 70 = 500の平均化後）、35,000のAラインが500に低減される。 図1cは、レーザパルスおよびAライン収集の照明を示す。遅延和和逆投影アルゴリズムに基づく再構成プログラムを使用すべきである。
図1： PLD-PATシステムの回路 図 （ a ）PLD-PATの略図。 PLD：パルスレーザダイオード、CSP：サークルAM：麻酔機、M：モータ、MPU：モータプーリユニット、LDU：レーザドライバユニット、PRU：パルサ/レシーバユニット、UST：超音波トランスデューサ、WT：水タンク、PF：ポリマーフィルム、DAQ：データ取得カード。 （ b ） インビボ小動物脳画像化のための水槽の概略図、上面図（1）および断面図（2）。 A：メトリックネジ、B：アクリル環状プレート、C：シリコーンOリング、D：厚さ100μmの透明ポリエチレンカバー。このタンクはその底部に直径9cmの穴を有し、超音波で光学的に透明な100μm厚のポリエチレン膜で封止された。 （ c ）PLDおよびAラインからのレーザパルスの照射の概略図であり、5秒の連続走査時間で収集される。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Representative Results
記載されたPLD-PATシステムの能力を実証するインビボ脳イメージング結果がこのセクションに示されている。 PLD-PATシステムの高速イメージング能力を実証するために、2つの異なる健康なラットのインビボ脳イメージングを行った。 図2は、様々なスキャン速度での雌ラット（93g）の脳画像を示す。 図2aおよびbは、脳領域上の頭皮を除去する前後のラット脳の写真を示す。 PATイメージングは、非侵襲的に（ すなわち、皮膚および頭蓋骨を無傷で）行った。脳の断面からのPA信号を、USTを5秒、10秒、20秒、および30秒間循環回転させることによって収集した。 図2c〜fは、5秒、10秒、20秒、および30秒のスキャン時間で得られたラット脳のPAT再構成断面像を示す。これらの脳の画像すべてにおいて、横洞（TS）、上矢状洞（SS）、および脳静脈（CV）（枝を含む）がはっきりと見える。これらの特徴は、 図2fに示す画像上に示されている。これらの結果は、システムが高スキャン速度でも高品質のインビボ画像を提供できることを約束する。
図2： 非侵襲的なインビボの PLD-PAT画像。 93gの雌ラットの脳における脈管構造の非侵襲的PLD-PAT画像。頭皮を除去する前（ a ）および後（ b ）のラット脳の写真。 （ c ）5秒間、（ d ）10秒間、（ e ）20秒間、および（ f ）30秒間のインビボ脳画像。 SS：矢状洞、TS：横鼻洞、およびCV：脳静脈。 les / ftp_upload / 55811 / 55811fig2large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
同様のイメージング実験を別の雌ラット（95g）で行い、5秒、10秒、20秒および30秒で得られた対応する脳画像を図3に示す。
図3 ： インビボでの非侵襲性PLD-PAT画像。 95gの雌ラットの脳における脈管構造の非侵襲的PLD-PAT画像。頭皮を除去する前（ a ）および後（ b ）のラット脳の写真。 （ c ）5秒間、（ d ）10秒間、（ e ）20秒間、および（ f ）30秒間のインビボ脳画像。rce.jove.com/files/ftp_upload/55811/55811fig3large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この研究は、PLD-PATシステムを用いてラットのインビボ脳イメージングを行うためのプロトコールを提示する。このプロトコルには、イメージングシステムとそのアラインメントの詳細な説明と、ラットの脳イメージングのイラストが含まれています。既存のOPOベースのPATシステムは高価で大型であり、5〜10分で1つの断面画像を提供することができる。 PLD-PATシステムは、コンパクトで携帯性があり、低コストであり、3秒で良好な画像を提供することができる。システムの性能は、以前にファントムで研究され、従来のPATシステム25と比較された。ここでは、同じPLD-PATが、速いインビボ脳画像化について実証された。結果は、システムが5秒以内でさえ高品質のインビボ画像を提供できることを実証する。
いくつかの利点があるが、PLD-PATシステムにはいくつかの欠点がある。この研究で使用されたPLDは、単一の波長でパルスを提供するので、機能を提供することはできません多波長照明を必要とする多焦点撮像が可能になる。機能イメージングのためには、多波長照明機能を有するPLDが必要である。低エネルギーのPLDパルスはイメージングの深さを制限します。しかしながら、外因性の造影剤を使用することにより、PLD-PATシステムの画像深度を向上させることが可能である。
通常、PLDレーザビームは均一ではないので、適切な光学ディフューザをレーザウィンドウの前に使用して画像品質を改善することができる。レーザービームの中心とイメージングエリアの中心が一致するようにしてください。脳の周りでUSTをスキャンする間、USTは常にスキャンセンターに面していることを確認してください。プロトコルを実施する際には、さらに注意を払う必要があります：（a）動物の体重に応じて麻酔カクテルを投与する必要があります。 （b）麻酔薬注入は、臓器（ 例えば、膀胱、腸および腎臓）が影響を受けないように正確でなければならない。 （c）毛髪clの間動物の頭皮に傷がつかないようにする。 （d）動物の水タンクの圧力はできるだけ小さくなければならない。 （e）動物をスキャナーの下に置いている間、脳の撮像断面がUSTの中心にあることを確認する。このシステムの今後の応用には、脳腫瘍イメージング、小動物の異なる器官のイメージング、5秒未満での高速イメージング、造影剤のための生体材料の調査、および治療用途が含まれる。画質が低い場合は、トラブルシューティングが必要な場合があります。
小型動物 in vivo イメージングの レーザー安全性
皮膚の最大許容曝露（MPE）限界は、励起波長、パルス幅、曝露時間、照射面積などのいくつかのパラメータに依存する。 インビボイメージングのMPE限界は、米国国家標準s研究所（ANSI） 32 。 700〜1050nmの波長範囲では、単一パルスによって送達される皮膚のエネルギー密度は、20×10 2（λ-700）/ 1,000mJ / cm 2 （λ：励起波長（nm））未満でなければならない。 803nmのPLD波長に対して、限界は約31mJ / cm 2である 。レーザがt = 5秒間にわたって連続的に使用される場合、MPEは1.1×10 2（λ-700）/ 1000 ×t 0.25J / cm 2 （= 2.6J / cm 2 ）になる。この実験では、PLDを7,000Hzで操作した。 5秒の走査時間では、合計35,000（5×7,000）パルスがサンプルに供給されたので、パルスごとに、MPEは0.07mJ / cm 2であった 。記載されたイメージングシステムでは、PLDは1パルスあたり約1.05mJのエネルギーでパルスを送出し、レーザビームは約12.6cm 2の面積にわたって拡大された。したがって、レーザーエネルギー密度は脳領域で約0.08mJ / cm 2であった。 PATシステムのANSIレーザー安全限界は、chレーザパワーを減少させることによって、レーザビームを拡大することによって、またはパルス繰り返し率を減少させることによって、調整される。
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Disclosures
著者は、原稿に関連する金銭的関心はなく、開示する可能性のある他の利益相反はない。
Acknowledgments
この研究は、シンガポール教育省（ARC2 / 15：M4020238）とシンガポール保健省国立医学研究評議会（NMRC / OFIRG / 0005/2016：M4062012）が資金を提供するTier 2助成金によって支えられています。作者は機械ショップの助けを借りてChow Wai Hoong Bobbyに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pulsed laser diode | Quantel, France | QD-Q1910-SA-TEC | It is the excitation laser source with specifications 803 nm, 1.4 mJ per pulse, 136 ns pulse, 7 kHz maximum, dimentions : 11.0 x 6.0 x 3.6 cm, weight: ~150 gm |
| Stepper motor with gearbox | LIN Engineering (Servo Dynamics) | Motor: CO-5718-01P, Gearbox: DPL64/1, I = 10 for NEMA 23; power supply PW100-48 | To move the detector holder in a circular geometry. Torque: 2.08 N-m, Rotor inertia: 2.6 kg-cm2 |
| Ultrasonic pulser/receiver | Olympus | 5072PR | To receive, filter and ampligy the PA signal from UST. Its bandwidth is 35 MHz, and gain is ±59 dB. |
| Ultrasound Transducer | Olympus | V306-SU-NK-CF1.9IN/Q4200069 | Ultrasonic sensors used for photoacoustic detection. Central freqency 2.25 MHz, 0.5 in, Cylindrical focus 1.9 inch |
| PCIe DAQ (Data acquisition) Card | GaGe | CSE4227/ A6000610/B0E00610 | 12 bit, 100 Ms/s, 2 channels, 1 Gs on board memory, PCIe x16 interface |
| Rats | In Vivos Pte Ltd, Singapore | NTac:SD, Sprague Dawley / SD | Female, weight 100 ±10g |
| Acrylic water tank | NTU workshop | Custom-made | It contains the water that acts as an acoustic coupling medium between brain and detector |
| Circular Scanner | NTU workshop | Custom-made | Scanner is made out of Alluminum |
| Anesthetic Machine | medical plus pte ltd | Non-Rebreathing Anaesthesia machine with oxygen concentrator. | Supplies oxygen and isoflurane to animal |
| Pulse Oxymeter portable | Medtronic | PM10N with veterinary sensor | Monitors the pulse oxymetry of the animal |
| Ultrasound gel | Progress/parker acquasonic gel | PA-GEL-CLEA-5000 | Clear ultrasound gel |
| Data acqusison software | National Instruments Corporation,Austin,TX,USA) | NI LabVIEW 2015 SP1 | LabVIEW based program was developed in our laboratory for controlling the stepper motor and acquring the PA singnals from the detector |
| Data processing software | Matlab (Mathworks, Natick, MA, USA) | Matlab R2012b | Matlab code for reconstruction of PA images was developed in our lab |
| Temperature controller | LaridTech, MO,USA | MTTC1410 | It will constantly control temperature of the PLD |
| 12 V power supply | Voltcraft | PPS-11810 | To supply operating voltage for PLD |
| Variable power supply | BASETech | BT-153 | To change the laser output power |
| Funtion generator | Funktionsgenerator | FG250D | To change the repetetion rate of the PLD. It will provide TTL signal to synchronize the DAQ with the laser excitation. |
| Animal distributor | In Vivos Pte Ltd, Singapore | Animal distributor that supplies small animals for research purpose. | |
| Animal holder | NTU workshop | Custom-made | Used for holding the animal on its abdomen |
| Breathing mask | NTU workshop | Custom-made | Used along with animal holder to supply anesthesia mixture to the animal |
| Pentobarbital sodium | Valabarb | Used for euthanizing the animal after the expeirment. | |
| Optical diffuser | Thorlabs | DG10-1500 | Used to to make the laser beam homogeneous |
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