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Genetics

इन विट्रो Bioluminescence परख स्तन उपकला कोशिकाओं में Circadian ताल की विशेषता के लिए

doi: 10.3791/55832 Published: September 28, 2017

Summary

एक इन विट्रो bioluminescence परख स्तन उपकला कोशिकाओं में सेलुलर circadian ताल का निर्धारण करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है । इस विधि स्तनधारी सेल रिपोर्टर का उपयोग करता है के नियंत्रण के तहत अस्थिर luciferase व्यक्त plasmids अवधि 2 जीन प्रमोटर । यह circadian ताल पर अंग विशेष प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए अन्य कोशिका प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Abstract

circadian ताल एक मौलिक शारीरिक सभी जीवों कि जीन अभिव्यक्ति से सोने के व्यवहार को लेकर प्रक्रियाओं को नियंत्रित करता है में मौजूद प्रक्रिया है । रीढ़ में, circadian ताल दोनों suprachiasmatic नाभिक में कार्य करता है कि एक आणविक थरथरानवाला द्वारा नियंत्रित किया जाता है (SCN; सेंट्रल पेसमेकर) और व्यक्तिगत कोशिकाओं सबसे परिधीय ऊतकों को शामिल. इससे भी महत्वपूर्ण बात, प्रकाश के लिए जोखिम से circadian ताल के विघटन-रात में, पर्यावरण तनाव और/या विषालु पुराने रोगों और उंर बढ़ने का खतरा बढ़ के साथ जुड़ा हुआ है । एजेंटों है कि केंद्रीय और/या परिधीय जैविक घड़ियों को बाधित कर सकते है की पहचान करने की क्षमता है, और एजेंटों है कि रोकने या circadian व्यवधान के प्रभाव को कम कर सकते हैं, पुराने रोगों की रोकथाम के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ है । हालांकि कुतर मॉडलों के लिए जोखिम और एजेंटों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रेरित या रोकने/circadian व्यवधान, इन प्रयोगों पशुओं की बड़ी संख्या की आवश्यकता है । vivo में अध्ययन भी महत्वपूर्ण संसाधनों और बुनियादी सुविधाओं की आवश्यकता है, और शोधकर्ताओं को पूरी रात काम करने की आवश्यकता है । इस प्रकार, वहां एक सेल प्रकार इन विट्रो प्रणाली के लिए उचित विभिंन अंगों और रोग राज्यों से कोशिका प्रकार में पर्यावरण circadian विघटनकारी और बढ़ाने के लिए स्क्रीन के लिए एक तत्काल जरूरत है । हम एक वेक्टर है कि मानव अवधि 2 जीन प्रमोटर के नियंत्रण में युकेरियोटिक कोशिकाओं में अस्थिर luciferase के ड्राइव प्रतिलेखन का निर्माण किया । इस circadian रिपोर्टर का निर्माण छुरा मानव स्तन उपकला कोशिकाओं में transfected था, और circadian उत्तरदायी रिपोर्टर कोशिकाओं को विकसित करने के लिए चयनित किया गया था इन विट्रो bioluminescence परख. यहां, हम स्थापित करने और परख सत्यापित करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हम आगे अवधारणा के सबूत के लिए विवरण प्रदान प्रयोगों हमारे इन विट्रो परख की क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए सेलुलर जैविक घड़ी पर विभिंन रसायनों के vivo में प्रभाव दोहराऊंगा । परिणाम संकेत मिलता है कि परख सेल प्रकार की एक किस्म के लिए दोनों पर्यावरणीय अवरोधकों और circadian घड़ियों के chemopreventive बढ़ाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Introduction

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circadian घड़ी जीन की प्रतिदिन अभिव्यक्ति से जैविक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला को विनियमित करने के लिए लगभग 24 एच महामारी विज्ञान के अध्ययन के एक आवधिक के साथ एक उंमीद के मुताबिक लय में व्यवहार नींद दृढ़ता से सुझाव है कि circadian की पुरानी व्यवधान ताल नर्स और उड़ान कैमरों1,2,3सहित पाली श्रमिकों में स्तन और प्रोस्टेट कैंसर का खतरा बढ़ जाता है । इन निष्कर्षों को कुतर अध्ययनों से पुष्टि कर रहे हैं, लगातार प्रकाश, प्रकाश में है कि जोखिम का प्रदर्शन-रात, या प्रकाश चक्र कि जेट अंतराल वृद्धि ट्यूमर घटना की नकल और ट्यूमर विकास में तेजी4,5। दोनों मानव और कुतर अध्ययन के आंकड़ों के आधार पर, कैंसर वर्गीकृत शिफ्ट पर अनुसंधान के लिए अंतरराष्ट्रीय एजेंसी-२०१०6में एक संभावित मानव यलो (प्रकार 2a) के रूप में काम करते हैं ।

इससे पहले, हमने दिखाया है कि स्तन ट्यूमर विशिष्ट यलो, एन-nitroso-एन-methylurea (NMU) की एक एकल यलो खुराक, प्रमुख circadian जीन (सीजीएस) की circadian अभिव्यक्ति बाधित (जैसे, अवधि 2 , Per2) और कई circadian नियंत्रित जीन (CCGs), प्रमुख डीएनए नुकसान उत्तरदायी और (DDRR) लक्ष्य स्तन ग्रंथि में जीन (लेकिन जिगर में नहीं) की मरंमत सहित । इसके अलावा, आहार एल-मिथाइल-selenocysteine (MSC) के एक chemopreventive आहार द्वारा सामांय के प्रति दोनों Per2 और DDRR जीन की circadian अभिव्यक्ति को रीसेट ६३% द्वारा ट्यूमर की घटनाओं में कमी । ये निष्कर्ष सबसे पहले circadian ताल, केमिकल कैंसरजनन और chemoprevention7,8के बीच एक यंत्रवत लिंक दिखा रहे थे । vivo में circadian जीन अभिव्यक्ति को बाधित करने के लिए दिखाया गया अन्य पर्यावरणीय विषालु के लिए एक्सपोजर भी पर्यावरण रोगों के बढ़ा जोखिम के साथ9,10जुड़े हैं. तंत्र है कि पर्यावरण विषालु और रोगजनन द्वारा circadian व्यवधान लिंक को समझना mechanistically के लिए नेतृत्व कर सकते है रोग की रोकथाम के लिए दृष्टिकोण पर आधारित है । हालांकि, जोखिम और circadian लय के बीच बातचीत को परिभाषित करने के उद्देश्य से अध्ययन आमतौर पर vivo में प्रदर्शन कर रहे हैं । vivo में एक ठेठ circadian ताल पर प्रभाव की जांच प्रयोग में पशुओं की बड़ी संख्या की आवश्यकता है, के रूप में कम से तीन नियंत्रण और तीन उजागर पशुओं से ऊतकों को एकत्र किया जाना चाहिए हर 3-4 एच पर एक 24 या ४८ ज अवधि । इन विट्रो प्रणाली में एक मांय का विकास है कि vivo टिप्पणियों और तंत्र में recapitulates इसलिए न केवल आवश्यक पशुओं की संख्या में कमी होगी, लेकिन यह भी नाटकीय रूप से प्रयोगात्मक लागत को कम करने और आवश्यकता है कि शोधकर्ताओं ने एक 24-48 ज अवधि में लगातार काम करते हैं । इसके अलावा, एक मांय इन विट्रो प्रणाली यौगिकों और/या आनुवंशिक परिवर्तन के उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि circadian ताल, या पर्यावरणीय तनाव या विषालु के लिए अपनी प्रतिक्रिया को प्रभावित । इसलिए, रणनीतिक संयोजन में इन विट्रो और vivo में मॉडल और प्रयोगों अलग ध्यान केंद्रित करने के साथ विभिन्न अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं ।

स्तनधारियों में, circadian थरथरानवाला न केवल SCN के विशेष ंयूरॉंस में मौजूद है, लेकिन यह भी सबसे परिधीय कोशिका प्रकार में । इन आणविक घड़ियों स्थापित fibroblast सेल लाइनों में उन लोगों के लिए और भ्रूण या वयस्क पशुओं से प्राथमिक fibroblasts में समान हैं; हालांकि, वहां ऊतक प्रकार विशिष्ट सेलुलर मॉडल11के लिए एक की जरूरत है । नतीजतन, vivo मेंहरकत गतिविधि के पारंपरिक अध्ययन, SCN explants पूर्व vivo, और सेल आधारित इन विट्रो परख में अमर fibroblast कोशिकाओं में व्यापक रूप से सेल-स्वायत्त circadian दोषों का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है. हालांकि, वहां कोई संकेत है कि एक इन विट्रो fibroblast सेल आधारित परख दोहराऊंगा कर सकते है circadian तंत्र और प्रतिक्रियाओं vivo मेंअंय परिधीय अंगों की कोशिकाओं में मौजूद सबूत है । विभिन्न प्रकार के सेल जीन अभिव्यक्ति, xenobiotic चयापचय, और DDRR के विशिष्ट पैटर्न हो सकता है, और विषाक्तता और circadian जीन अभिव्यक्ति के बीच संबंध सेल प्रकार विशिष्ट और/या अलग शारीरिक मापदंडों द्वारा संग्राहक हो सकता है । इसके अलावा, fibroblast-आधारित प्रणालियों में circadian oscillators पर्यावरणीय विषालु, तनाव और निवारक एजेंटों के लिए प्रतिक्रियाओं के लिए पूरी तरह से मूल्यांकन नहीं किया गया है कि रोग के विकास और रोकथाम के तंत्र के लिए जोखिम लिंक । इस प्रकार, वहाँ सतही के लिए एक की जरूरत है, मान्य सेल प्रकार विशिष्ट, इन विट्रो bioluminescence परख अंग विशिष्ट पर्यावरणीय circadian व्यवधानों का अध्ययन करने के लिए. हालांकि सेलुलर घड़ी मॉडल की एक किस्म (जैसे, जिगर, keratinocytes, और वसा कोशिकाओं में, साथ ही एक ऑस्टियो सेल लाइन) हाल के वर्षों में विकसित किया गया है12,13,14, 15, परख यहां वर्णित स्तन उपकला कोशिकाओं में पहली सेलुलर घड़ी मॉडल है, और पहली प्रदर्शन दोहराऊंगा करने के लिए vivo में पर्यावरण तनाव, विषालु, ड्रग्स, और chemopreventive एजेंटों के लिए प्रतिक्रियाओं ।

Renilla luciferase (rLuc) और जुगनू luciferase हैं 30-61 केडीए monomeric प्रोटीन कि posttranslational गतिविधि के लिए एंजाइमी प्रोसेसिंग की आवश्यकता नहीं है और एक आनुवंशिक रिपोर्टर के रूप में तुरंत अनुवाद पर कार्य कर सकते हैं । एक बार luciferase एंजाइम के साथ सब्सट्रेट एसोसिएट्स, जैव रासायनिक प्रतिक्रिया catalyzed प्रकाश की एक फ्लैश उत्पन्न करता है. इस प्रकार, luciferase constructs व्यापक रूप से इन विट्रो में एक जीन अभिव्यक्ति रिपोर्टर प्रणाली और vivo मेंके रूप में प्रयोग किया जाता है । हालांकि, circadian ताल अध्ययन में, luciferase रिपोर्टर की उपयोगिता अपेक्षाकृत लंबे luciferase प्रोटीन (टी1/2 = ३.६८ एच) की अवधि (विशेष रूप से छोटी अवधि के लिए) सापेक्ष circadian जीन में परिवर्तन के लिए जीवन द्वारा सीमित है अभिव्यक्ति; हालांकि, वर्षों में कई अध्ययनों को सफलतापूर्वक pGL3 वेक्टर में luciferase जीन का इस्तेमाल किया है, यह दर्शाता है कि तेजी से क्षरण luciferase circadian लय रिपोर्टिंग के लिए आवश्यक नहीं हो सकता है, विशेष रूप से एक लंबी अवधि के साथ लय के लिए, जैसे 24 एच. इसलिए, एक रिपोर्टर प्लाज्मिड अस्थिर luciferase वेक्टर का उपयोग कर, pGL [Luc2P/Neo], कि hPEST शामिल है (एक प्रोटीन स्थिरीकरण अनुक्रम) विकसित किया गया है, हम इसे एक circadian रिपोर्टर के रूप में उपयोग करने के लिए हमारे वर्तमान के लिए वेक्टर की अनुमति इन विट्रो bioluminescence परख । Luc2P द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन एक बहुत कम आधा जीवन (T1/2 = ०.८४ ज) है और इसलिए, और अधिक जल्दी से और अधिक से अधिक भयावहता के साथ जवाब transcriptional गतिविधि में जंगली प्रकार से परिवर्तन, मैंndicating है कि यह सही वास्तविक समय16में PER2 प्रमोटर द्वारा विनियमित luciferase की लयबद्ध अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Protocol

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< p class = "jove_title" > 1. PER2 प्रवर्तक संचालित अस्थिर Luciferase रिपोर्टर वेक्टर

  1. एक स्वनिर्धारित pLS खरीद [ hPER2P / rLuc /Puro] वेक्टर जिसमें सीडीएनए एंकोडिंग rLuc और मानव PER2 प्रवर्तक अंश (hPER2P, ९४१ bp) के बीच स्थल पर सैक I और हिंद में मल्टीपल क्लोनिंग क्षेत्र < सुप वर्ग = "xref" > १७ .
  2. मानव PER2 प्रवर्तक अंश (hPER2P, ९४१ bp) को वेक्टर से बाहर काटें ।
    1. Add २.५ & #181; l प्रतिबन्ध एंजाइम बफर, १० & #181; l (१८० एनजी) pLS [ hPER2P / rLuc /Puro] वेक्टर, और 1 & #181; l प्रत्येक प्रतिबंध एंजाइमों, सैक I (10 यूनिट/& #181; l) और हिंद III (10 यूनिट/& #181; l), में एक डीएनए/आरएनए/न्यूक्लियोटाइड-मुक्त microcentrifuge ट्यूब. जोड़ ultrapure पानी (१०.५ & #181; l) तक 25 & #181; l और मिश्रण धीरे से pipetting.
    2. में ३७ & #176; ग के लिए ९० मिनट एक हीटिंग ब्लॉक में ।
    3. चलाने के पूरे खंड (25 & #181; L) ०.७% agarose जेल पर प्रतिबंध एंजाइम प्रतिक्रिया के ०.०००१% ethidium ब्रोमाइड (EtBr) युक्त hPER2P वेक्टर से अलग करने के लिए.
      नोट: EtBr, 3, 8-diamino-1-एथिल-6-phenylphenantridinium ब्रोमाइड (कैस पंजीकरण संख्या: 1239-45-8), एक सुगंधित लाल तरल है । यह एक intercalating एजेंट है कि सामांयतः एक फ्लोरोसेंट टैग के रूप में प्रयोग किया जाता है (न्यूक्लिक एसिड दाग) agarose जेल ट्रो में और यूवी प्रकाश के तहत एक नारंगी रंग के रूप में दिखाई । अपरिवर्तनीय mutagenic प्रभाव के संभावित खतरों प्रयोगात्मक पशुओं में हुई है, हालांकि नियामक एजेंसियों में से कोई भी इसे एक के रूप में वर्गीकृत एक यलो < सुप वर्ग = "xref" > 18 . इसलिए, हम agarose जेल और ट्रो बफर रासायनिक खतरा अपशिष्ट के रूप में EtBr युक्त इस्तेमाल किया एकत्र, और अनुरोध Rutgers पर्यावरण स्वास्थ्य & #38; सुरक्षा (REHS) लेने के लिए और सुरक्षित रूप से निपटाने के लिए ।
    4. ९४१ बीपी पर एक EtBr प्रतिदीप्ति बैंड युक्त agarose जेल का एक टुकड़ा काट, और एक डीएनए जेल निष्कर्षण किट के साथ जेल से hPER2P टुकड़ों को शुद्ध, ठहराव द्वारा एक spectrophotometer पर २६० एनएम तरंग दैर्ध्य में अवशोषण घनत्व (आयुध डिपो) को मापने के द्वारा पीछा किया ।
  3. Linearize १.० & #181; L (1 & #181; छ) के अस्थिर जुगनू luciferase अभिव्यक्ति वेक्टर, pGL [ Luc2P /Neo] चरणों में वर्णित समान विधि के साथ 1.2.1-1.2.2 । वेक्टर के साथ एक डीएनए क्लीन-अप किट के रूप में एक spectrophotometer का उपयोग कर ऊपर वर्णित के रूप में ठहराव द्वारा निकालें ।
  4. Ligate में hPER2P को रैखिक वेक्टर pGL [ Luc2P /Neo] में
    नोट: प्रति निर्माता & #39; s अनुदेश, सम्मिलित करें और वेक्टर के आदर्श दाढ़ अनुपात 2:1 है. के लिए ५० एनजी वेक्टर, डालने के आदर्श राशि २३.६ एक सूत्र के साथ एनजी के रूप में गणना की है, [(५० वेक्टर एक्स १.० केबी डालने)/4.242 kb वेक्टर] x (2/1) = २३.६ एनजी डालने] । hPER2P की सांद्रता के आधार पर (७.२६ एनजी/& #181; L) और pGL [ Luc2P /Neo] (५० एनजी/& #181; l), के खंड ५० एनजी pGL [ Luc2P /Neo] और २३.६ एनजी hPER2P 1 & #181 के रूप में गणना कर रहे हैं; l और ३.२६ & #181; l, क्रमशः ।
    1. Add 2 & #181; L टी-4 डीएनए ligase रिएक्शन बफर (10x) (५० mM Tris-HCl, 10 एमएम MgCl 2 , 1 एमएम एटीपी, व 10 एमएम डीटीटी), ३.२६ & #181; l (२३.६ एनजी) hPER2P, 1 & #181; l (५० एनजी) pGL [ Luc2P /Neo], व १३.७४ & #181; l जल 20 & #181 तक; l , धीरे से मिलाएं.
    2. Add 1 & #181; l टी-4 डीएनए ligase (४०० इकाई/& #181; l), मिश्रण धीरे और मशीन पर 16 & #176; सी एक thermocycler में रात भर, और फिर ठंडा निर्माता प्रति बर्फ पर ligated वेक्टर & #39; s अनुदेश.
  5. रूपांतर ligated वेक्टर pGL [ hPer2P / Luc2P /Neo] को रासायनिक सक्षम ई. कोलाई < सुप वर्ग = "xref" > १९ .
    1. ४२ & #176 पर जल स्नान सेट; सी, catabolite दमन के साथ सुपर इष्टतम शोरबा गर्म (S.O.C.) मध्यम (2% Tryptone, ०.५% खमीर निकालने, 10 मिमी NaCl, २.५ मिमी KCl, 10 मिमी MgCl 2 , 10 मिमी MgSO 4 , और 20 मिमी ग्लूकोज) कमरे के तापमान पर , वार्म अप Luria-Bertani (LB) आगर प्लेट (युक्त १०० & #181; g/ml एम्पीसिलीन, ८० & #181; g/मब X-gal, र ०.५ & #181; M IPTG) in ३७ & #176; सी मशीनर, और बर्फ पर गल एक सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं के प्रत्येक परिवर्तक के लिए एक शीशी ।
    2. Add 6 & #181; l (21 एनजी) ligated वेक्टर या 1 & #181; l (30 एनजी) खाली वेक्टर (नकारात्मक नियंत्रण) को रासायनिक रूप से सक्षम ई. कोलाई की एक ट्यूब (५० & #181; l) और फिर धीरे से मिश्रण करने के लिए ट्यूब फ्लिप । 30 min.
    3. के लिए बर्फ पर मशीन
    4. हीट शॉक इन a ४२ & #176; सी जल स्नान 30 एस के लिए मिलाते हुए बिना और फिर बर्फ की वापसी.
  6. एक ई. कोलाई कॉलोनी का चयन एक ligated के साथ बदल नीले/
    1. Add २५० & #181; L S.O.C. माध्यम में रूपांतरित ई. कोलाई ट्यूब और यह 1 ज के लिए मशीन पर ३७ & #176; सी के साथ मिलाकर २०० rpm पर.
    2. स्प्रेड 10-50 & #181; एल के रूपांतरित ई. कोलाई की सतह पर पौंड आगर प्लेट समान रूप से. ३७ & #176 में प्लेट उल्टा रखो; सी मशीन रात भर.
      नोट: एक कुशल क्लोनिंग प्रतिक्रिया कई सौ कालोनियों का उत्पादन करना चाहिए । दो अलग संस्करणों चढ़ाना यह सुनिश्चित करने के लिए सिफारिश की है कि कम से कम एक थाली बड़ा, स्पष्ट सफेद या नीला रंग, और अच्छी तरह से स्थान कालोनियों होगा । जब कालोनियों बहुत छोटे होते है और रंग भेद नहीं है, एक खुर्दबीन (10x या 50X) का उपयोग करने में सहायक है ।
    3. उठाओ 3-6 निष्फल दांत छड़ें के साथ प्लेटों से सफेद कालोनियों, और एक संस्कृति ट्यूब में प्रत्येक कॉलोनी रिलीज ५० & #181 के साथ पौंड संस्कृति के माध्यम से 4 मिलीलीटर युक्त; g/mL एम्पीसिलीन.
    4. ३७ & #176 पर ट्यूबों, २०० rpm को रात भर में मिलाते के साथ सी मशीन । एक प्लाज्मिड डीएनए निष्कर्षण मिनी निर्माता & #39; s अनुदेश के अनुसार प्रस्तुत किट के साथ 4 मिलीलीटर कल्चरल ई. कोलाई के 2 मिलीलीटर का उपयोग कर डीएनए निकालें.
  7. सत्यापित करें और विश्लेषण डालें (hPER2P, ९४१ bp)
    1. प्रतिबंध एंजाइमों के साथ प्लाज्मिड डीएनए डाइजेस्ट और चलाने ट्रो चरणों में वर्णित के रूप में 1.2.1-1.2.3 अगर वहाँ एक डालने की पुष्टि करने के लिए.
      नोट: सकारात्मक नियंत्रण (hPER2P कदम 1.2.4 पर शुद्ध) और नकारात्मक नियंत्रण ( ई. कोलाई एक खाली सदिश के साथ तब्दील ) शामिल थे ।
    2. अनुक्रम चयनित प्लाज्मिड डीएनए M13 आगे और M13 रिवर्स प्राइमर का उपयोग करने के लिए अभिविंयास और प्लाज्मिड में डालने के अनुक्रम की पुष्टि करें < सुप वर्ग = "xref" > १९ .
      नोट: ट्रो और सही ओरिएंटेशन और अनुक्रम में sequencing परिणाम में hPER2P का सही आकार के साथ एक सम्मिलित था जो केवल एक कॉलोनी चयनित किया गया था ।
    3. श्लेष मानव PER2 प्रवर्तक अंश (hPER2P, ९४१ bp) circadian विनियामक तत्वों के लिए अनुक्रम, जिसमें ई-बॉक्स आकृति (Bmal1 बाइंडिंग साइट, CAT/CGTG), CCAATC, GC बॉक्स, और प्रतिलेखन प्रारंभ साइट (CAGCGG) < सुप वर्ग = "xref" > 20 .
  8. बढ़ाना चयनित ई. कोलाई में बचे हुए 2 एमएल कल्चरल ई. कोलाई को जोड़कर २०० मिलीलीटर पौंड संस्कृति के माध्यम से ५० & #181; g/एमएल एम्पीसिलीन और फिर यह रात भर की मशीन ३७ & #176 पर मिलाते हुए के साथ २०० rpm पर.
  9. निकालें डीएनए के साथ एक endotoxin मुक्त प्लाज्मिड मैक्सी तैयारी किट प्रति निर्माता & #39; s अनुदेश, और फिर एक spectrophotometer के साथ २६० एनएम तरंग दैर्ध्य पर आयुध डिपो को मापने के द्वारा इसे बढ़ाता है । Aliquot और प्लाज्मिड डीएनए की दुकान, pGL [hPer2P/Luc2P/नव], at-८० & #176; C फ्रीजर भविष्य के उपयोग के लिए.
< p class = "jove_title" > 2. क्षणिक अभिकर्मक

  1. खरीद और संस्कृति MCF10A कोशिकाओं
    1. खरीद एक अमर, गैर रूपांतरित सामांय मानव स्तन उपकला कोशिका लाइन (MCF10A) एक वाणिज्यिक सेल बैंक से, जहां कोशिकाओं cytogenetically परीक्षण और ठंड से पहले लघु मिलकर दोहराने विश्लेषण के साथ प्रमाणीकृत । गल और एक अधिकतम 8 सप्ताह के लिए संस्कृति में जमे हुए कोशिकाओं के प्रत्येक शीशी बनाए रखें ।
      नोट: अन्य कोशिकाओं के विपरीत, इन कोशिकाओं को संपर्क संकोच एक बार वे ~ ७०% संगम करने के लिए मिलता है. यह आवश्यकता है कि उपसंस्कृति ~ ७०% पर आयोजित किया जाता है ।
    2. संस्कृति स्तन उपकला कोशिका विकास मध्यम (MEGM), स्तन उपकला बेसल मध्यम (MEBM), विकास की खुराक, और हैजा विष के साथ एक सेल संस्कृति मशीन में ३७ & #176; C, ९५% आर्द्रता, और 5% सह के साथ कोशिकाओं 2 .
      नोट: SingleQuot (वर्ग) में उपलब्ध कराए गए तैयार-टू-उपयोग वृद्धि कारकों की खरीद करें और हैजे के विष को अलग से प्राप्त करे. विकास की खुराक के अंतिम सांद्रता ०.४% गोजातीय पिट्यूटरी निकालें, ०.१% इंसुलिन, ०.१% hydrocortisone, ०.१% मानव एपिडर्मल वृद्धि कारक हैं, १०० एनजी/एमएल हैजा विष, और ०.०५% गेन्तमयसीं सल्फेट और ०.०५% amphotericin B.
    3. अलग 10 मिलीलीटर trypsin/EDTA के साथ 10-सेमी संस्कृति डिश में कोशिकाओं ~ 20 मिनट के लिए और फिर 10 मिलीलीटर trypsin बेअसर समाधान जोड़कर trypsin बेअसर । HEPES बफ़र्ड खारा समाधान (HBSS) के साथ सभी कोशिकाओं को इकट्ठा.
    4. एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत एक hemocytometer के साथ कोशिकाओं की गणना और एक सेल निलंबन की एकाग्रता की गणना, और फिर बीज की जरूरत के रूप में कोशिकाओं की एक निश्चित संख्या । प्रत्येक प्लेट में कोशिकाओं का एक भी वितरण प्राप्त करने के लिए अच्छी तरह से घूमता प्लेटें । सेल संस्कृति मशीन में ३७ & #176 में कोशिकाओं की मशीन; सी, ९५% आर्द्रता, और 5% कं 2 .
      नोट: trypsin/EDTA, trypsin बेअसर समाधान, और HBSS का उपयोग करने के लिए युक्त एक उपसंस्कृति एजेंट पैक खरीद ।
  2. अभिकर्मक के साथ कोशिकाओं का क्षणिक circadian का निर्माण किया.
    1. सीड 2 x 10 5 MCF10A के साथ ३५ mm कल्चरल डिश में समान रूप से MEGM और 20-30% संगम (अगले दिन) तक बढे ।
    2. कम सीरम मीडिया को गर्म ( उदा. , Opti-मेम) मे ३७ & #176; सी वॉटर बाथ और अभिकर्मक रिएजेंट 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर. पतला प्लाज्मिड डीएनए होटवार (pGL [ hPer2P / Luc2P /Neo]) से 30 एनजी/& #181; L के साथ इंडो-विष मुक्त Tris-EDTA (TE) बफर और कमरे के तापमान पर रखें.
    3. एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में प्लाज्मिड अभिकर्मक मिश्रण को जोड़कर तैयार करते हैं ६३.६ & #181; l उष्ण घटा सीरम मीडिया पहले, फिर जोड़ने ३३.४ & #181; l (०.१ & #181; g) प्लाज्मिड डीएनए, और pipetting द्वारा धीरे से मिश्रण, और फिर अंत में जोड़ 3 & #181; l of अभिकर्मक सीधे ट्यूब के केंद्र में दीवार को छूने के बिना एजेंट । pipetting द्वारा धीरे मिश्रण के बाद, 30 min.
    4. के लिए कमरे के तापमान पर रखें
    5. छोड़ पूरे प्लाज्मिड मिश्रण (१०० & #181; L) सीधे प्लेट में मध्यम की सतह पर और फिर मिश्रण पकवान मिलाकर धीरे से । संस्कृति एक सह 2 मशीन में अतिरिक्त 48-72 एच
      के लिए कोशिकाओं नोट: यह भविष्यवाणी की है कि उच्चतम अभिकर्मक दक्षता में अपने संपर्क निषेध के कारण इन कोशिकाओं के 40-70% संगम पर होगा ~ ७०% । इसलिए, अभिकर्मक काम करता है सबसे अच्छा पर शुरू ~ 20% और पर रोक ~ ७०% संगम ।
< p class = "jove_title" > 3. इन विट्रो में की स्थापना Bioluminescence परख क्षणिक में Transfected MCF10A कोशिकाओं

  1. में संस्कृतिक कोशिकाओं को भूखा ~ ७०% संगम (48-72 ज के लिए अभिकर्मक के बाद) MEBM में 24 ज.
  2. के लिए विकास कारकों के बिना
  3. MEBM में एक सह 2 मशीन में १.५ एच के लिए तुल्यकालन एजेंट ( जैसे , ५०% हार्स सीरम (एच एस)) के साथ कोशिकाओं का इलाज ।
    नोट: एक आदर्श सिंक्रनाइज़ेशन एजेंट के चयन के लिए, 10 & #181; m forskolin, 1 एनएम मेलाटोनिन, ०.१ & #181; m डेक्समेतएसॉनी, ५०% HS, और १००% वर्ग circadian आयाम और circadian वेक्टर transfected कोशिकाओं में अवधि के संदर्भ में तुलना की गई । खाली वेक्टर transfected कोशिकाओं १००% वर्ग के साथ एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इलाज कर रहे हैं ।
  4. पूर्व तैयार 20 मिलीलीटर रिकॉर्डिंग मध्यम (10 के लिए 30 मिमी संस्कृति व्यंजन) MEGM के 5 मिलीलीटर जोड़कर, 15 मिलीलीटर की MEBM, १५० & #181; l सोडियम बिकारबोनिट, २०० & #181; l HEPES, व ४० & #181; l luciferin स्टॉक समाधान (५० मिमी) में एक ५० मिलीलीटर निष्फल केंद्रापसारक ट्यूब.
    नोट: प्रत्येक घटक के अंतिम सांद्रता: 20% वर्ग और 20 एनजी/एमएल हैजा विष, ०.०६% सोडियम बिकारबोनिट, 1% पेनिसिलिन/streptomycin, और 10 मिमी HEPES. पूर्व तैयार रिकॉर्डिंग मध्यम गर्म और ३७ & #176 में 30 मिनट के लिए 1x पंजाबियों निष्फल; सी जल स्नान । Add १०० & #181; मी luciferin तुरंत प्रयोग करने से पहले.
  5. गर्म 1x Dulbecco & #39 के साथ कोशिकाओं को धो; एस फॉस्फेट-बफर खारा (डी-पंजाब) तुल्यकालन एजेंट के साथ मशीन के बाद 3 बार के लिए, और फिर 2 मिलीलीटर रिकॉर्डिंग मध्यम जोड़ें ।
  6. एक निष्फल कवर सिलिकॉन तेल का उपयोग करने के लिए वाष्पीकरण को रोकने के वर्ग के साथ पकवान सील और फिर यह पक्ष पर लेबल ।
  7. luminometer अंदर सीट में सील पकवान जगह है, और फ़ोल्डर में फ़ाइल स्थान को बचाने के लिए विकल्प पर बारी (विस्तार के लिए, अनुभाग 6 देखें) ।
< p class = "jove_title" > 4. छुरा Transfected कोशिकाओं का चयन

  1. एक आदर्श G418 एकाग्रता का अनुकूलन (८०० & #181; जी/एमएल) एक मार वक्र परख के साथ के अनुसार निर्माता & #39; एस छुरा Transfected कोशिकाओं के चयन के लिए अनुदेश ।
  2. के बाद क्षणिक अभिकर्मक के लिए ४८ ज या ७२ ज, उपसंस्कृति और बीज MEGM के साथ कोशिकाओं में बड़े बर्तन में ५,००० कोशिकाओं/डिश (१००-mm) । सेल संस्कृति मशीन में 24 ज संस्कृति के बाद (३७ & #176; C, ९५% आर्द्रता, और 5% कं 2 ), कोशिकाओं का इलाज ८०० & #181; g/ml के साथ नए माध्यम से पुराने माध्यम को बदलकर ८०० & #181; g/ml G418 2 सप्ताह के लिए हर 3-4 दिन.
  3. उपसंस्कृति जीवित छुरा transfected MEGM युक्त ५०० & #181; g/एमएल G418 के स्थिर अभिव्यक्ति बनाए रखने के लिए hPer2P के साथ 1-3 मार्ग के लिए कालोनियों, और भविष्य के उपयोग के लिए तरल नाइट्रोजन में फ्रीज । Luc2P
  4. इलाज ५०० & #181; छ/एमएल G418 सामान्य उपसंस्कृति के बाद फिर से कोशिकाओं की छुरा transfected जनसंख्या का चयन करने के लिए, यदि इन विट्रो परख में bioluminescence के परिणाम में bioluminescence तीव्रता कई मार्ग में उपयोग के बाद उत्तरोत्तर कम हो जाता है ।
< p class = "jove_title" > 5. रसायनों के साथ उपचार

  1. पर ४८ h या ७२ h पद-अभिकर्मक, MEBM में वृद्धि कारकों से 24 ज.
  2. के लिए कोशिकाओं को भूखा 2 ज के लिए ५०% HS के साथ तुल्यकालन के बाद
  3. , ०.२५ mm या ०.५ mm nitrosomethylurea (NMU), 20 एनएम EX527, या 1 & #181 के साथ कोशिकाओं का इलाज, cambinol में 1 ज के लिए एम MEBM 20% वर्ग
  4. युक्त
  5. 1x डी-पंजाबियों के साथ धुलाई के बाद, रिकॉर्डिंग मध्यम युक्त १२.५ & #181; एम एमएससी अकेले, या संयोजन में 20 एनएम EX527 या 1 & #181; एम cambinol, कोशिकाओं के लिए । luminometer.
  6. के साथ bioluminescence की निगरानी
  7. का इलाज छुरा transfected MCF10A/ PER2 - dLuc कोशिकाओं के साथ NMU पर ०.५, 1, या 2 मिमी, EX527 पर ४० एनएम, या Cambinol पर २.० & #181; m, के लिए 1 h के साथ सिंक्रनाइज़ेशन के बाद ५०% HS, और उसके बाद रिकॉर्डिंग मध्यम में कक्षों की मशीन १२.५ & #181; एमएससी के एम या अलग खुराक (5, 10, या 20 & #181; M) n-असेटयलस्यस्थेने (एनएसी) के. luminometer में प्लेटें रखें, रिकॉर्ड करें और bioluminescence को luminometer द्वारा 4-8 दिनों के लिए अनुभाग ३.६ में बताए गए अनुसार सहेजें ।
    नोट: NMU mutagenic, यलो, और टेराटोजेनिक प्रॉपर्टीज के साथ एक मिथाइलयुक्त nitrosourea यौगिक है । NMU एक प्रत्यक्ष अभिनय alkylating एजेंट है और एक छोटी आधा जीवन है (T 1/2 = ~ 30 मिनट) । यह अंलीय हालत (पीएच 4-5) पर स्थिर है, लेकिन क्षारीय हालत (पीएच 9-10) और तापमान पर अस्थिर से परे 20 & #176; सी. इसलिए, 10% पर ब्लीच पीठ सतहों और प्रयोगशाला संभावित NMU soluti द्वारा दूषित माल की सफाई के लिए एक कुशल निष्क्रिय एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकतापर. बचे हुए स्टॉक समाधान उठाया है और सुरक्षित रूप से REHS द्वारा का निपटारा । रसायनों की कार्रवाई की विधा के आधार पर, सिंक्रनाइज़ कोशिकाओं को छोटे समय के लिए रिकॉर्डिंग मध्यम में संवर्धन से पहले इलाज किया जा सकता है । कोशिकाओं को भी रिकॉर्डिंग माध्यम में एक लंबे समय (कई दिनों) के लिए इलाज किया जा सकता है ।
< p class = "jove_title" > 6. डेटा संग्रह, विश्लेषण और प्रस्तुति

< p class = "jove_content" > नोट: सेल व्यवहार्यता मानक तरीकों ( जैसे, MTT परख) एक ही समय के लिए एक ही सांद्रता पर कोशिकाओं के उपचार के बाद का उपयोग कर निर्धारित किया जाना चाहिए संकेत दिया । सभी उपचार इन विट्रो bioluminescence परख में में इस्तेमाल किया सांद्रता 30% घातक एकाग्रता (LC30) से कम थे । तपसिल में सभी प्रयोग किए गए और प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत किए गए.

  1. डिश सील करने के बाद (चरण ३.५), luminometer में सीटों पर बर्तन लोड, जो एक मशीन के अंदर रखा है ३७ & #176; C बिना एच 2 ओ और सह 2 , और एक कंप्यूटर से जुड़ा.
  2. & #34; save & #34; और फ़ोल्डर और फ़ाइल के लिए नाम दर्ज करें जहां संगत डिश से रिकॉर्डेड luminescence सिग्नल सहेजे जाएंगे ।
    नोट: सिस्टम व्यक्तिगत स्थिति में पकवान में कोशिकाओं से वास्तविक समय में luminescence संकेत का पता लगाता है । संकेत 4-फोटॉन गिनती photomultiplier ट्यूबों के माध्यम से कंप्यूटर को हस्तांतरित कर रहे हैं, और बचाया और डेटा संग्रह सॉफ्टवेयर द्वारा कंप्यूटर में प्रदर्शित किया ।
  3. 4-7 दिनों के लिए रिकॉर्डिंग के बाद संकेतों का विश्लेषण, जो मध्यम परिवर्तन और एक दूसरे सप्ताह के लिए निरंतर रिकॉर्डिंग के बाद यदि आवश्यक हो सकता है ।
    नोट: चरण, अवधि लंबाई, लय आयाम, और गलन दर सहित circadian पैरामीटर, प्राप्त करने के लिए, हमने bioluminescence डेटा का विश्लेषण करने के लिए luminometer विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया.
  4. एक चल औसत के साथ कच्चे डेटा की प्रवृत्ति, और विश्लेषण अवधि, चरण, आयाम, और गलन दर प्राप्त करने के लिए एक साइन लहर के लिए सबसे अच्छा फिट बैठता है < सुप क्लास = "xref" > 21 , < सुप class = "xref" > 22 .
  5. उपचार और मध्यम परिवर्तन पर उच्च क्षणिक bioluminescence के कारण, विश्लेषण से डेटा के पहले चक्र को शामिल न करें.
  6. डेटा प्रस्तुति के लिए
  7. , raw डेटा प्लॉट (bioluminescence, count/s) समय के विरुद्ध (h या दिन) । जब आवश्यक हो, आधारभूत-घटाया डेटा आयाम और चरण की तुलना करने के लिए प्लॉट किया जा सकता है ।

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Representative Results

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Circadian bioluminescence रिपोर्टर वेक्टर: मानव PER2 प्रवर्तक-अस्थिर luciferase संस्करण की अभिव्यक्ति संचालित

डीएनए अनुक्रम मानव PER2 circadian रिपोर्टर वेक्टर, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया प्रवर्तक से व्युत्पंन एक ९४१ बीपी टुकड़ा शामिल, पहले विनियमित करने के लिए जाना जाता विनियामक तत्वों की उपस्थिति के लिए विश्लेषण किया गया था circadian जीन एक्सप्रेशन. Bioinformatics विश्लेषण से पता चला कि इस प्रमोटर टुकड़ा के भीतर, वहां तीन अलग Bmal1 बाध्यकारी साइटों रहे है (ई बॉक्स) (बिल्ली/CGTG), दो circadian प्रतिलिपि बढ़ाने साइटों (CCAATG), दो जीसी बक्से, और एक प्रतिलेखन प्रारंभ साइट (चित्र 1) । इसलिए इस रिपोर्टर वेक्टर circadian जीन अभिव्यक्ति को प्रतिबिंबित प्रत्याशित था ।

सिंक्रनाइज़ेशन एजेंट का ऑप्टिमाइज़ेशन

कई एजेंटों को सिंक्रनाइज़ या fibroblast कोशिकाओं के स्वायत्त circadian लय को प्रभावित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है इन विट्रो bioluminescence अध्ययन. स्तन उपकला कोशिकाओं में एक कुशल और लागत प्रभावी सेल-प्रकार विशिष्ट तुल्यकालन एजेंट का चयन करने के लिए, हम की तुलना में 10 µ एम forskolin, 1 एनएम मेलाटोनिन, ०.१ µ एम डेक्समेतएसॉनी, ५०% एच एस, और १००% वर्ग में स्तन उपकला कोशिकाओं (MCF10A) क्षणिक transfected circadian रिपोर्टर वेक्टर के साथ । ५०% HS के साथ सिंक्रनाइज़ किए गए कक्षों में अंय एजेंट्स के साथ सिंक्रनाइज़ किए गए कक्षों में केवल एक या दो चोटियों की तुलना में circadian प्रेरित luminescence की 3 चोटियों के साथ, सर्वश्रेष्ठ circadian लय दिखाई गई । इसके अतिरिक्त, ५०% HS के साथ सिंक्रनाइज़ किए गए कक्षों की bioluminescence प्रोफ़ाइलों को डेटा विश्लेषण (चित्र 2) के दौरान स्वीकार्य अवधि, आयाम, और श्रेष्ठ-फ़िट मान का उत्पादन किया गया । इन निष्कर्षों के आधार पर, हम सभी अनुवर्ती प्रयोगों के लिए सेल सिंक्रनाइज़ेशन एजेंट के रूप में इस लागत प्रभावी विधि का चयन किया ।

व्यवधान और रासायनिक जोखिम द्वारा सेलुलर circadian ताल की बहाली

इस में इन विट्रो मॉडल, अनुपचारित, क्षणिक transfected कोशिकाओं (नियंत्रण समूह) तुल्यकालन के बाद luminescence संकेतन के कम से दो पूरा चक्र दिखाया (चित्रा 3) । प्रत्यक्ष अभिनय mutagen, NMU को उजागर कोशिकाओं, circadian जीन अभिव्यक्ति की एक खुराक पर निर्भर व्यवधान के रूप में luminescence चोटियों के नुकसान से प्रतिबिंबित दिखाया । जबकि ०.२५ mm NMU के साथ उपचार सेलुलर circadian ताल, ०.५ mM NMU की एक खुराक शुरू में देरी और बाद में circadian लय को बाधित नहीं किया था, के रूप में ~ ७२ एच के बाद उपचार में luminescence की दूसरी चोटी के गायब होने से संकेत दिया । 20 एनएम Ex257 या 1 µ मीटर cambinol के साथ SIRT1 गतिविधि के निषेध इसी तरह बाद circadian चक्र (चित्रा 3-1) भीगा द्वारा circadian लय बाधित । महत्वपूर्ण बात यह है कि संस्कृति माध्यम को एमएससी (१२.५ µ एम) के अतिरिक्त NMU-उपचारित कोशिकाओं में circadian जीन अभिव्यक्ति की सामान्य प्रथम और द्वितीय चक्र की दिशा में लौटी. एमएससी न केवल NMU द्वारा बाधित लय बहाल, लेकिन यह भी SIRT1 अवरोधकों, Ex257 और cambinol (चित्रा 3-2) के विघटनकारी प्रभाव को रोका ।

छुरा transfected कोशिकाओं में, दोनों NMU और SIRT1 अवरोधकों circadian लय बाधित है, हालांकि अधिक सांद्रता कि क्षणिक transfectants में मनाया (चित्र 3 बी-1) । एमएससी (१२.५ µ मीटर) बहाल कोशिकाओं में circadian लय 1 मिमी NMU (चित्र 3 बी-2) के साथ इलाज किया । अधिक महत्वपूर्ण बात, एमएससी भी SIRT1 अवरोधकों के साथ इलाज किया कोशिकाओं में circadian लय बहाल, EX257 सहित (४० एनएम) (चित्र3बी) और cambinol (2 µ m) (आंकड़ा 3 बी(4)), क्रमशः ।

चित्रा 3 ए और चित्र बीके बीच की तुलना में, bioluminescence तीव्रता बहुत अधिक था लेकिन लय क्षणिक transfected कोशिकाओं में एक छोटे समय के लिए निरंतर था छुरा transfected कोशिकाओं बनाम (~ 10 गुना अधिक, 2 बार कम) सामान्य, NMU या एमएससी के साथ कोशिकाओं के उपचार के बाद भी. इसके अलावा, सेलुलर circadian लय 2 गुना अधिक छुरा transfected कोशिकाओं की तुलना में क्षणिक transfected कोशिकाओं में रसायनों के संपर्क के प्रति संवेदनशील था ।

मात्रात्मक खुराक-रसायनों द्वारा सेलुलर circadian ताल के आश्रित परिवर्तन

इसी तरह, 1 मिमी NMU के साथ इलाज किया छुरा transfected कोशिकाओं के बाधित सेलुलर circadian ताल एक खुराक पर निर्भर तरीके से एनएसी के उपचार द्वारा बहाल किया गया था (0-20 µ एम) (चित्रा 4a) के रूप में circadian अवधि के परिवर्तन में मनाया (चित्रा 4B ) और चरण (चित्र 4c).

Figure 1
चित्रा 1: मानव PER2 प्रमोटर टुकड़ा और circadian रिपोर्टर वेक्टर का अनुक्रम । (A) मानव PER2 प्रवर्तक अंश (९४१ bp) अनुक्रम किया गया था, और अनुक्रम कार्यात्मक circadian प्रवर्तक के तत्वों के लिए विश्लेषण किया गया था । E-box, CACGTT/CATGTG; circadian प्रतिलेखन तंदुरुस्त साइट, CCAATG; GC box, CGCCCC/GGGGCGGG; प्रतिलिपि शुरू साइट (TSS): CAGCGG । () अस्थिर luciferase रिपोर्टर वेक्टर के योजनाबद्ध आरेख, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo] । विस्थिर luciferase (dLuc) की प्रतिलेखना hPER2 प्रवर्तक के प्रत्यक्ष नियंत्रण में है । एक सह व्यक्त निओमायसिन प्रतिरोध जीन (नव) G418 द्वारा संक्रमित कोशिकाओं के चयन की सुविधा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: का सिंक्रनाइज़ेशन में इन विट्रो सेलुलर circadian ताल से भिंन सिंक्रनाइज़ेशन एजेंट । 24 एच भुखमरी के बाद, MCF10A कोशिकाओं क्षणिक circadian रिपोर्टर वेक्टर द्वारा transfected 2 एच के लिए प्रत्येक तुल्यकालन एजेंट के साथ इलाज किया गया, luminescence संकेत रिकॉर्डिंग के बाद । नीला, 10 µ m forskolin; लाल, 1 एनएम मेलाटोनिन; हरे, ०.१ µ m डेक्समेतएसॉनी; बैंगनी; ५०% हार्स सीरम (एच एस); चैती, १००% SingleQuot (वर्ग); पीला, खाली वेक्टर (नकारात्मक नियंत्रण) । X-अक्ष, समय (दिन); Y-अक्ष, bioluminescence (गणना/ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: एमएससी बहाल सेलुलर circadian लय NMU और SIRT1 अवरोधकों में स्तन उपकला कोशिकाओं में द्वारा बाधित इन विट्रो. Bioluminescence परख ५०% HS के साथ तुल्यकालन के बाद MCF10A/PER2-dLuc रिपोर्टर कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया गया । X-अक्ष, समय (h) (पद-NMU उपचार समय); Y-अक्ष, bioluminescence (गणना/ () क्षणिक transfected कोशिकाओं से परिणाम. (1) कक्षों का इलाज 0, ०.२५ या ०.५ mM NMU, 20 एनएम EX527, या 1 µ m cambinol के लिए 1 एच निंनलिखित तुल्यकालन के साथ किया गया । पीला: नियंत्रण; लाल: ०.२५ mM NMU; ग्रीन: ०.५ mM NMU; नीला: 20 एनएम EX527; पीला हरा: 1 µ m cambinol. (2) कोशिकाओं १२.५ µ एम एमएससी अकेले, या के साथ संयोजन में इलाज किया गया 20 एनएम EX527 या 1 µ एम cambinol रिकॉर्डिंग मध्यम में ०.५ mM NMU के लिए जोखिम के बाद । पीला: नियंत्रण; लाल: ०.२५ mM NMU; ग्रीन: ०.५ mM NMU; नीला: ०.५ मिमी NMU + १२.५ µ एम एमएससी; पीला हरा: ०.५ मिमी NMU + १२.५ µ एम एमएससी + 20 एनएम EX527; बैंगनी: ०.५ mM NMU + १२.५ µ m एमएससी + 1 µ m cambinol. (B) छुरा transfected कोशिकाओं से परिणाम । 3rd-5वें चोटियों जो साफ और समूहों के बीच स्पष्ट मतभेद दिखाया एक प्रतिनिधि परिणाम के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । (1) कक्षों में सिंक्रनाइज़ेशन के बाद 0, ०.५, १.० या २.० mM NMU, ४० एनएम EX527, या 2 µ m cambinol के साथ 1 h का इलाज किया गया । पीला: नियंत्रण; लाल: ०.५ mM NMU; ग्रीन: १.० mM NMU; नीला: २.० mM NMU; पीला हरा: ४० एनएम EX527; पर्पल: २ µ मी cambinol. (2) कोशिकाओं १२.५ µ एम एमएससी के साथ इलाज किया गया रिकॉर्डिंग मध्यम में १.० mM NMU के लिए जोखिम के बाद । पीला: नियंत्रण; लाल: १.० mM NMU; ग्रीन: १.० मिमी NMU + १२.५ µ एम एमएससी । (3) कोशिकाओं १२.५ µ एम एमएससी के साथ इलाज किया गया ४० एनएम EX257 के लिए निंनलिखित जोखिम । पीला: नियंत्रण; लाल: ४० एनएम EX257; ग्रीन: ४० एनएम EX257 + १२.५ µ एम एमएससी । (4) कोशिकाओं 2 µ एम cambinol के लिए जोखिम के बाद १२.५ µ एम एमएससी के साथ इलाज किया गया । पीला: नियंत्रण; लाल: २ µ मी cambinol; हरा: 2 µ m cambinol + 25 µ एम एमएससी । यह परिणाम पहले बताया गया था और के अंतर्गत लाइसेंस प्राप्त है सीसी द्वारा २.०22कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: एनएसी खुराक-आश्रित सेलुलर circadian लय NMU द्वारा बाधित बहाल । कोशिकाओं तुल्यकालन के बाद 1 ज के लिए १.० mM NMU या वाहन नियंत्रण के साथ इलाज किया गया । (A) bioluminescence का प्रतिनिधि परिणाम (गणना/मिनट) समय के खिलाफ (एच) । पीला: नियंत्रण; लाल: १.० mM NMU; ग्रीन: १.० mM NMU, 5 µ मी एनएसी; नीला: १.० mM NMU, 10 µ मी एनएसी; येलो ग्रीन: १.० एमएम NMU, 20 µ मी एनएसी. (B) अवधि (घंटे) । (C) चरण (घंटे) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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स्तनधारी कोशिकाओं में, circadian घड़ी की आवधिक परस्पर transcriptional/शोधों प्रतिक्रिया छोरों द्वारा विनियमित है । । Bmal1 और या तो घड़ी या Npas2 के Heterodimers कोर सीजीएस के प्रवर्तकों में ई-बॉक्स तत्वों को बाध्यकारी द्वारा circadian प्रतिलेखन को विनियमित, Per2 और रोना, और कई CCGs4सहित । के रूप में वे सेल में जमा, प्रति के heterodimers: रोना पोस्ट अनुवाद कर रहे है संशोधित और नाभिक के लिए ले जाया घड़ी दमन: Bmal1 transcriptional गतिविधि । इस नकारात्मक प्रतिक्रिया पाश कोर सीजीएस अपने प्रतिलेखन को विनियमित करने के लिए और सीजीएस और CCGs के लयबद्ध अभिव्यक्ति की स्थापना की अनुमति देता है23. हालांकि अधिकांश स्तनधारी कोशिकाओं एक आंतरिक circadian घड़ी है, व्यक्तिगत कोशिकाओं में घड़ियों दोनों आंतरिक स्थितियों (जैसे, redox क्षमता) और बाहरी पर्यावरण उत्तेजनाओं24से सिंक्रनाइज़ किया जा सकता है । Circadian जीन एक्सप्रेशन vivo में मेलाटोनिन, सेंट्रल पेसमेकर (SCN) से प्राप्त संकेतों के जवाब में चीटीदार ग्रंथि द्वारा उत्पादित हार्मोन से सिंक्रनाइज़ किया जा सकता है । SCN रेटिना में विशेष melanospin-व्यक्त सहज रेटिना नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं पर प्रकाश pinging से संकेतों को एकीकृत करता है. मेलाटोनिन चीटीदार ग्रंथि से जारी संचलन में प्रवेश करती है और इन विट्रो में और vivo25,26 मेंSCN और सबसे परिधीय कोशिकाओं के circadian लय को नियंत्रित करता है । Circadian ताल भी तनाव हार्मोन द्वारा विनियमित किया जा सकता है (जैसे, कोर्टिसोल और catecholamines)27,28 और विकास कारकों29,30। विकास कारकों के विनियमन के लिए सेल विकास और भेदभाव31के circadian व्यवधान के साथ जुड़े होने के लिए जाना जाता है ।

circadian रिपोर्टर वेक्टर हम का निर्माण इस नकारात्मक जैव रासायनिक प्रतिक्रिया तंत्र कारनामे । कोर circadian नकारात्मक प्रतिक्रिया पाश transcriptional उत्प्रेरक, BMAL1 और घड़ी है, जो circadian ई/ई ´-बॉक्स में PER2 प्रमोटर, और दमन PERs और CRYs है, जो नकारात्मक BMAL1 अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए बाध्य के होते हैं । वर्तमान रिपोर्टर प्रणाली में, BMAL1 और घड़ी द्वारा PER2 प्रमोटर की लयबद्ध सक्रियण अस्थिर luciferase की circadian अभिव्यक्ति की सुविधा, circadian संकेतों की एक और अधिक सटीक luminescence आवधिकता के लिए अनुमति देता है । एक रिपोर्टर प्लाज्मिड के निर्माण BMAL1 बंधन साइट, circadian ताल बढ़ाने साइट, जीसी बॉक्स, और प्रतिलेखन hPER2 प्रमोटर की साइट शुरू शामिल हैं । वेक्टर transfected कोशिकाओं में सेलुलर स्वायत्त circadian लय के लिए वास्तविक समय readout के लिए अनुमति देता है और शर्तों या विशिष्ट एजेंटों कि जीन अभिव्यक्ति के इस अंतर्जात circadian पैटर्न में परिवर्तन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, जब कोशिकाओं इन विट्रो या विवो पूर्व, उनके circadian oscillators जल्दी से सिंक्रनाइज़ हो जाते हैं । इसलिए किसी भी circadian परख से पहले अपनी लय फिर से सिंक्रनाइज़ करने के लिए आवश्यक है इन विट्रो मेंकिया जा सकता है । स्तन उपकला कोशिकाओं में, हमने पाया कि ५०% एच एस, मेलाटोनिन, और १००% वर्ग प्रत्येक इन विट्रो मेंcircadian ताल के कुशल तुल्यकालन प्रेरित करने में सक्षम थे । डेक्समेतएसॉनी और forskolin केवल आंशिक तुल्यकालन का उत्पादन किया । खुराक पर निर्भर परीक्षण विकास और भविष्य के अध्ययन में नए तुल्यकालन एजेंटों के चयन के लिए आवश्यक होगा । कम लागत, दक्षता और तुल्यकालन एजेंट के रूप में इसके व्यापक उपयोग को देखते हुए, ५०% HS एक प्रभावी तुल्यकालन एजेंट है कि स्तन उपकला कोशिकाओं और तंत्रिका कोशिकाओं में मजबूत और प्रतिलिपि सेलुलर circadian लय का उत्पादन किया, जैसा कि पहले पाया गया कई अन्य सेल प्रकार और विभिन्न प्रायोगिक सेटिंग्स24में रिपोर्ट.

circadian विनियमन के इन विट्रो मॉडल को मान्य करने के लिए, हम अगले अगर circadian लय की प्रतिक्रिया इन विट्रो में पर्यावरण तनाव के लिए प्रभाव हम vivo मेंमनाया दोहराऊंगा होगा पूछा. पहले, हम का प्रदर्शन किया है कि NMU के एक एकल यलो खुराक प्रमुख सीजीएस के circadian अभिव्यक्ति बाधित (जैसे, Per2) और लक्ष्य स्तन ग्रंथि में कई CCGs. इसके अलावा, एमएससी के एक chemopreventive आहार सामांय की ओर दोनों Per2 और CCGs जीन की circadian अभिव्यक्ति रीसेट । हम आगे का प्रदर्शन किया है कि विषालु और तनाव के लिए कोशिकाओं के प्रदर्शन णड पर उनके प्रभाव के माध्यम से circadian जीन अभिव्यक्ति बदल सकते हैं+-निर्भर SIRT1 गतिविधि7,8,22. इन विट्रो circadian रिपोर्टर परख का उपयोग कर प्राप्त परिणामों से पता चला कि NMU के लिए जोखिम सेलुलर circadian जीन अभिव्यक्ति के विघटन का कारण बना है, और है कि अधिक दिलचस्प है, एमएससी ही सेलुलर circadian लय रीसेट करने में सक्षम नहीं है द्वारा बाधित NMU, लेकिन यह भी SIRT1 अवरोधकों द्वारा बाधित circadian लय रीसेट. इन परिणामों ने संकेत दिया कि इन विट्रो परख न केवल circadian जीन अभिव्यक्ति पर NMU के प्रभाव reproduces, लेकिन यह भी SIRT1-निर्भर तंत्र के माध्यम से vivo में बाधित circadian ताल पर एमएससी के प्रभाव reproduces । इन विट्रो circadian रिपोर्टर प्रणाली इस प्रकार विषालु और तनाव की एक किस्म का पता लगाने की क्षमता है कि सेल में णड+/NADH स्तर, प्रत्यक्ष अवरोधकों और सेलुलर redox सायक्लिंग के साथ ही genotoxic के मॉडुलन सहित बदल एजेंटों कि पाली ADP-ribose निर्भर डीएनए मरंमत३२के माध्यम से णड+ चूस सकते हैं । ये परिणाम सुझाव देते हैं कि इन विट्रो रिपोर्टर सिस्टम सेल स्थितियों और रासायनिक एजेंटों कि vivo मेंcircadian जीन विनियमन बाधित या बहाल कर सकते हैं के लिए स्क्रीन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है.

हालांकि इन विट्रो परख में सेट किया जा सकता है कोशिकाओं का उपयोग क्षणिक या छुरा transfected रिपोर्टर के निर्माण के साथ, कुछ मतभेदों को क्षणिक और छुरा transfected कोशिकाओं के बीच रसायनों के उपचार के जवाब में उल्लेख किया गया । छुरा transfected कोशिकाओं को और अधिक रसायनों के उपचार के लिए प्रतिरोधी थे, विशेष रूप से NMU और SIRT1 अवरोधकों, क्षणिक transfected कोशिकाओं की तुलना में । इन मतभेदों को स्थिर transfectants में वेक्टर प्रमोटर के विनियमन में सूक्ष्म मतभेदों को प्रतिबिंबित सकता है विशिष्ट एकीकरण साइटों आसपास के दृश्यों से प्रभाव के कारण । इसलिए, एंटीबायोटिक उपचार द्वारा स्थिर transfectants के चयन भी क्लोन है कि अधिक circadian व्यवधान के लिए प्रतिरोधी रहे है का चयन कर सकते हैं । इस प्रकार, व्यक्ति इन विट्रो सेल मॉडल परिवर्तनीय या स्थिर transfectants का उपयोग कर vivo प्रतिक्रियाओं में दोहराऊंगा करने की क्षमता के लिए मान्य किया जाना चाहिए । अलग अभिकर्मक तरीके भी कोशिकाओं पर genotoxic तनाव और विषाक्तता के स्तर को प्रेरित और रसायनों के विषाक्त प्रभाव को अपने अलग संवेदनशीलता में परिणाम. इसलिए अभिकर्मक और उपचार की स्थिति के चयन के लिए cytotoxicity टेस्ट और प्रायोगिक प्रयोगों की आवश्यकता होती है । उनकी संवेदनशीलता में अंतर होने के बावजूद, समग्र रसायन व्यवधान और सेलुलर circadian ताल की बहाली के लिए हमारे स्तन उपकला circadian रिपोर्टर कोशिकाओं के साथ प्राप्त के अनुरूप थे और क्षणिक के बीच तुलनीय transfected और छुरा transfected कोशिकाओं, और परिणाम recapitulated प्रभाव हम vivo मेंमनाया ।

यदि circadian रिपोर्टर वेक्टर अंय प्रकार के सेल में इस्तेमाल किया जा सकता है निर्धारित करने के लिए, मानव ग्लियोब्लास्टोमा/तारिकाकोशिकार्बुद कोशिकाओं (U-८७ मिलीग्राम) इस circadian वेक्टर के साथ छुरा transfected थे । प्रारंभिक इन विट्रो सेलुलर bioluminescence परख का उपयोग कर परिणाम से पता चला है कि तुल्यकालन के बाद, इन तंत्रिका व्युत्पंन ट्यूमर कोशिकाओं एक नियमित और मजबूत सेलुलर circadian है कि मानव स्तन में मनाया लय तुलनीय उपकला कोशिकाओं. कोशिकाओं IC261, कैसिइन कळेनासे 1 δ (CK1δ) और CK1 ε के एक प्रसिद्ध अवरोधक के साथ इलाज किया, एक लंबे समय तक circadian अवधि दिखाया, लेकिन कम आयाम के रूप में रिपोर्ट बीy अंय (डेटा नहीं दिखाया गया है)३३। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि circadian luciferase रिपोर्टर वेक्टर और इन विट्रो में सेलुलर bioluminescence परख अन्य अंग विशिष्ट कोशिकाओं में लागू होते हैं, तंत्रिका कोशिकाओं सहित.

सेलुलर रिपोर्टर प्रणाली यहां इसलिए मोटे तौर पर इस्तेमाल किया जा सकता है एक इन विट्रो परख के रूप में सामांय में विभिंन प्रकार के सेल में circadian जीन अभिव्यक्ति के निर्धारण के लिए । प्रयोगात्मक प्रक्रिया सरल, तेज, और सुरक्षित है । हालांकि, इस सेलुलर रिपोर्टर प्रणाली आसानी से कोशिकाओं है कि transfect के लिए मुश्किल हैं में अनुकूलित नहीं किया जा सकता, गैर-विभाजित कोशिकाओं (जैसे, न्यूरॉन्स कोशिकाओं), क्योंकि वे बेहद कम अभिकर्मक क्षमता है. वायरस-आधारित अभिकर्मक विधियां (उदा., lentivirus अभिकर्मक) इन कक्षों के लिए एक उच्च दक्षता समाधान प्रदान कर सकती है३४। हालांकि, समय और lentiviral उत्पादन के साथ जुड़े कठिनाई इस विधि बनाता है मुश्किल और समय लगता है । इसके अलावा, एक उचित सुरक्षा स्तर प्रयोगशाला के उत्पादन और वायरस के उपयोग के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, उच्च संकल्प एकल सेल luminescence डिटेक्टरों गैर में circadian जीन अभिव्यक्ति की लगातार, स्वतंत्र रूप से चरणबद्ध लय के निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है-विभाजित कोशिकाओं३५

vivo में स्तनधारी circadian ताल के अध्ययन केवल श्रम गहन नहीं हैं, और महंगा है, लेकिन वे भी पशुओं की बड़ी संख्या के उपयोग की आवश्यकता है । इन विट्रो प्रणालियों की उपलब्धता काफी circadian जीन अभिव्यक्ति के विघटन के बीच संघों का परीक्षण करने के लिए आवश्यक पशुओं की संख्या को कम कर सकता है और कैंसरजनन और चयापचय सहित पुराने रोगों के विकास सिंड्रोम. अवधि, आयाम, और चरण सहित circadian मापदंडों पर मात्रात्मक डेटा, सेलुलर circadian ताल पर खुराक-और/या रसायनों के समय पर निर्भर प्रभाव को सूचित कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, हमने देखा है कि एंटीऑक्सीडेंट एनएसी खुराक-निर्भर कर सकते है अवधि और सेलुलर circadian ताल NMU द्वारा बाधित की चरण बहाल । इन विट्रो मॉडल भी स्क्रीन और पर्यावरण circadian अवरोधकों वर्गीकृत करने के लिए और सेलुलर समारोह की हानि पर बाधित circadian ताल के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के विकास के लिए यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान स्तन कैंसर के लिए बढ़ा जोखिम पर साथियों के लिए हस्तक्षेप रणनीतियों, चयापचय सिंड्रोम, और neurophysiological विकारों, असामान्य कार्य कार्यक्रम की वजह से.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम २०१२ सोसायटी ऑफ विषविज्ञान (मदोन्मत्त) द्वारा समर्थित किया गया था-Alterative अनुसंधान के लिए कोलगेट पामोलिव ग्रांट (एम. फेंग) और पशु और संयंत्र संगरोध एजेंसी, कोरिया गणराज्य (एम. फेंग) से अंतरराष्ट्रीय सहयोग अनुसंधान निधि, और NIEHS अनुदान P30ES005022 (H. Zarbl) । हम Dr. झेंग चेन (ह्यूस्टन में टेक्सास स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र के विश्वविद्यालय में McGovern मेडिकल स्कूल) अपने उपयोगी चर्चा के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, श्री शाओ-अपने प्रयोगात्मक सहायता के लिए एक जुआन, और सुश्री किमी नकटा उसे सबूत पढ़ने के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector SwitchGear Genomics S700000 customized vector
pGL4.18[Luc2P/Neo] vector Promega 9PIE673 destabilized luciferase expression vector
T4 DNA ligase Invitrogen 15224041 For subcloning
TOPO TA cloning kit Invitrogen K4500-02 with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli
Sac I New England BioLabs R0156S Restriction enzyme
Hind III-HF New England BioLabs R3104S Restriction enzyme
CutSmart buffer New England BioLabs B7204S Restriction enzyme buffer
DNA gel extraction kit Qiagen 28704 Purify DNA fragments from agarose gel
PCR Purification Kit Qiagen 28104 DNA clean up
LB Miller's modification TEKNOVA L8600 For transformed E. Coli culture
LB Agar Plate TEKNOVA L1902 For white/blue selection
QIAprep spin miniprep Kit Qiagen 27104 For extraction of plasmide DNA
EndoFree plasmid maxi prep Kit Qiagen 12362 For extraction of plasmide DNA
FuGene HD Promega E2311 Transfection reagent
Opti-MEM reduced serum medium Invitrogen 31985-062 For transfection
MCF10A cell line American Type Culture Collection CRL-10317 Mammary Epithelial Cells
MEGM BulletKit Lonza CC-3150 Mammary Epithelial Growth Medium
MEBM Lonza CC-3151 Mammary Epithelial Basal Medium
MEGM SingleQuot Kit Lonza CC-4136 Suppliments & Growth Factors
ReagentPack Lonza CC-5034 Reagent for subculture
D-PBS (10X) Sigma D1408 Wash cells in culture dishes
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977 Dilute 10X D-PBS
Tissue culture dish (35 mm) BD/Falcon 353001 cell culture dish suitable to LumiCycle
Silicon grease Fisher NC9044707 For sealing dish with recording medium
Round cover glass Harvard Bioscience 64-1500 (CS-40R) For sealing dish with recording medium
Cholera toxin Sigma C8052 Supplement for growth medium
G418 sulfate (Geniticin) Invitrogen 10131035 Antibiotic for selection of stabliy transfected cells
Ampicillin Sigma A9393 For colony selection
Forskolin Sigma F6886 Synchronization agent
Melatonin Sigma M5250 Synchronization agent
Dexamethasone Sigma D4902 Synchronization agent
Horse serum Sigma H1138 Synchronization agent
d-Luciferin, sodium salt Invitrogen L2912 Luciferase substrate
IC261 Sigma 10658 Positive control for circadian disruptor
Methylnitrosourea (NMU) Sigma N1517 Mammary specific carcinogen
Methylselenocysteine (MSC) Sigma M6680 Organic selenium (chemopreventive agent)
EX527 Sigma E7034 SIRT1 specific inhibitor
Cambinol Sigma C0494 SIRT1 & SIRT2 inhibitor
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 8000 Quantify nucleotide
GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems N805-0200 For molecular biology experiment
CO2 Incubator NAPCO Series 8000 DH For cell culture at 5% CO2 at 37 °C
Desktop centrifuge with refrezerator Eppendorf 5430R For molecular biology experiment
Centrifuge with swing bucket Eppendorf 5810 R For cell culture
Inverted microscope Nikon 80124 Phase contrast optional
Tissue culture hood Labconco Class II A2 BSL-2 certified
LumiCycle 32 Actimetrics Not Available Luminoscence detector

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References

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इन <em>विट्रो</em> Bioluminescence परख स्तन उपकला कोशिकाओं में Circadian ताल की विशेषता के लिए
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Fang, M., Kang, H. G., Park, Y., Estrella, B., Zarbl, H. In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e55832, doi:10.3791/55832 (2017).More

Fang, M., Kang, H. G., Park, Y., Estrella, B., Zarbl, H. In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e55832, doi:10.3791/55832 (2017).

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