Summary
ويرد في المختبر الإضاءة الحيوية فحص لتحديد إيقاع circadian الخلوية في الخلايا الظهارية الثديية. ويستخدم هذا الأسلوب خلية الثدييات مراسل والبلازميدات معربا عن زعزعة استقرار لوسيفراس الخاضعة لسيطرة المروج الجينات الفترة 2 . فإنه يمكن تكييفها لأنواع الخلايا الأخرى لتقييم التأثيرات الخاصة بالجهاز على إيقاع سيركاديان.
Abstract
إيقاع سيركاديان هو عملية فسيولوجية أساسية موجودة في جميع الكائنات الحية التي تنظم العمليات البيولوجية التي تتراوح بين التعبير الجيني النوم السلوك. في الفقاريات، يسيطر إيقاع circadian مذبذب جزيئي الذي يعمل في كل من نواة suprachiasmatic (اللجنة الفرعية للتغذية؛ ووسط تنظيم ضربات القلب) والخلايا الفردية التي تضم الأنسجة الأكثر هامشية. الأهم من ذلك، واضطراب إيقاع circadian بالتعرض للضوء في الليل، وعوامل الإجهاد البيئي و/أو سميات يرتبط مع زيادة خطر الأمراض المزمنة والشيخوخة. القدرة على تحديد العوامل التي يمكن أن تخل بالساعات البيولوجية المركزية و/أو هامشية، والعوامل التي يمكن أن تمنع أو التخفيف من آثار الاضطراب الإيقاعية، آثار كبيرة على الوقاية من الأمراض المزمنة. على الرغم من أن يمكن استخدام نماذج القوارض لتحديد التعرض والعوامل التي تحفز أو الحيلولة دون تخفيف اضطراب الإيقاعية، هذه التجارب تتطلب أعدادا كبيرة من الحيوانات. في فيفو الدراسات أيضا تتطلب موارد كبيرة، والبنية التحتية، وتتطلب الباحثين على العمل طوال الليل. وبالتالي، هناك حاجة ملحة لنظام مناسب في المختبر من نوع خلية إلى الشاشة معطلات الإيقاعية البيئية والقدرة على في أنواع الخلايا من الأجهزة المختلفة والحالات المرضية. نحن شيدت موجه الذي يقود نسخ لوسيفراس زعزعة استقرار في الخلايا حقيقية النواة تحت سيطرة المروج الفترة 2 الجينات البشرية. كان ستابلي transfected هذا بناء مراسل الإيقاعية في الخلايا الظهارية الثديية البشرية، واختيرت الإيقاعية مراسل استجابة الخلايا لتطوير التحليل الإضاءة الحيوية في المختبر . نقدم هنا، بروتوكول مفصل لإنشاء والتحقق من صحة المقايسة. ونحن كذلك تقديم تفاصيل لإثبات مفهوم التجارب مما يدل على قدرة الإنزيم لدينا في المختبر أن الخص في فيفو آثار المواد الكيميائية المختلفة على مدار الساعة البيولوجية الخلوية. وتبين النتائج أن المقايسة يمكن تكييفها لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا الشاشة لكل من المواد المسببة لاختلال البيئية والقدرة على تشيموبريفينتيفي من الساعات الإيقاعية.
Introduction
على مدار الساعة الإيقاعية ينظم مجموعة واسعة نطاق من العمليات البيولوجية من التعبير الدافيء للجينات النوم السلوك في إيقاع يمكن التنبؤ بها مع تواتر من حوالي 24 h. الوبائية الدراسات تشير بقوة إلى أن اضطراب مزمن الإيقاعية إيقاع يزيد من خطر سرطان الثدي وسرطان البروستاتا في التحول والعمال، بما في ذلك الممرضات وهروب الأطقم1،،من23. هذه النتائج هي تؤكدها دراسات القوارض، مما يدل على أن التعرض للضوء المستمر، دورات الضوء في الليل، أو الخفيفة التي تحاكي زيادة اضطراب حدوث الورم ويعجل بنمو الورم4،5. استناداً إلى البيانات المستمدة من الدراسات البشرية والقوارض، صنفت الوكالة الدولية لبحوث السرطان تحول العمل كمسرطن بشري محتمل (نوع 2A) في 20106.
سابقا، أثبتنا أن جرعة وحيدة مسرطنة من مسرطن محددة الأورام الثديية، N-نيتروزو-N-ميثيلوريا (نمو)، تعطلت الإيقاعية التعبير عن الجينات الإيقاعية الكبرى (CGs) (مثلاً، الفترة 2 ، Per2) ومفتاح تلف الحمض النووي استجابة عدة تسيطر عليها الإيقاعية الجينات (ككجس)، بما في ذلك وإصلاح الجينات (التسريح) في الغدة الثديية المستهدفة (ولكن ليس في الكبد). وعلاوة على ذلك، إعادة تعيين التعبير الإيقاعية الجينات Per2 والتسريح نحو العادي بنظام تشيموبريفينتيفي الغذائية لالميثيل-سيلينوسيستيني (MSC) انخفاض حالات الإصابة بالأورام بنسبة 63 في المائة. كانت هذه النتائج الأولى لإظهار ارتباط آليا بين التسرطن الكيميائية وإيقاع circadian، تشيموبريفينشن،من78. التعرض سميات البيئية الأخرى أظهرت أن تعطيل الجينات الإيقاعية التعبير في فيفو ترتبط أيضا بزيادة خطر الإصابة بالأمراض البيئية9،10. فهم الآليات التي تربط بين انقطاع الإيقاعية سميات البيئية والمرضية قد تؤدي إلى النهج القائم على ميتشانيستيكالي للوقاية من الأمراض. بيد أن الدراسات تهدف إلى تحديد التفاعلات بين التعرض وإيقاع circadian عادة ما تتم المجراة في. نموذجي في فيفو تجربة التحقيق أثر على إيقاع circadian يتطلب أعدادا كبيرة من الحيوانات، التحكم في الأنسجة من ثلاثة على الأقل، ويجب أن يكون ثلاثة من الحيوانات المعرضة التي جمعت كل ح 3-4 على مدى فترة 24 أو 48 ساعة. تطوير نظام مصادق عليه في المختبر ويجمل في فيفو الملاحظات والآليات سوف ولذلك ليس فقط تقليل عدد الحيوانات اللازمة، ولكن أيضا كبير تخفيض تكاليف التجريبية والشرط أن ويعمل هؤلاء الباحثون بشكل مستمر على مدى فترة 24-48 h. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام نظام تم التحقق من صحتها في المختبر لفحص إنتاجية عالية للمركبات و/أو التعديلات الوراثية التي تؤثر على إيقاع circadian، أو ردها لعوامل الإجهاد البيئي أو سميات. ولذلك، يلزم المزيج الاستراتيجي من تجارب ونماذج في المختبر و في فيفو الحصول على رؤى مختلفة مع تركيز مختلفة.
في الثدييات، وتوجد مؤشرات التذبذب الإيقاعية ليس فقط في الخلايا العصبية المتخصصة للجنة الفرعية للتغذية، ولكن أيضا في أنواع الخلايا الأكثر هامشية. هذه الساعات الجزيئية مماثلة لتلك التي في خطوط الخلايا ثابتة تنتجها الخلايا الليفية والخلايا الليفية الأولية من الأجنة أو الحيوانات الكبار؛ ومع ذلك، هناك حاجة للأنسجة الخلوية النماذج الخاصة بنوع11. ونتيجة لذلك، explants الدراسات التقليدية للنشاط الحركي في فيفو، العقدة السابقين فيفو، ويستند إلى الخلية في المختبر فحوصات في الخلايا مخلدة تنتجها الخلايا الليفية تستخدم على نطاق واسع لدراسة العيوب الإيقاعية خلية مستقلة. ومع ذلك، لا توجد أدلة تشير إلى أن في المختبر تنتجها الخلايا الليفية المستندة إلى خلية تحليل يمكن إيجاز آليات الإيقاعية والردود موجودة في الخلايا من سائر الأجهزة الطرفية في فيفو. أنواع مختلفة من الخلايا يمكن أن أنماط متميزة من التعبير الجيني، والتمثيل الغذائي إكسينوبيوتيك، والتسريح، والروابط بين سمية والتعبير الجيني الإيقاعية قد يكون نوع من الخلايا المحددة و/أو التضمين بمعلمات فسيولوجية مختلفة. وبالإضافة إلى ذلك، لم يتم تقييم التذبذب الإيقاعية في الأنظمة المستندة إلى تنتجها الخلايا الليفية تماما للتصدي للسموم البيئية وعوامل الإجهاد والعوامل الوقائية التي تربط بين التعرض لآليات التنمية المرض والوقاية. وبالتالي، هناك حاجة إلى السطحية، وتم التحقق من صحتها من نوع الخلية المحددة، في المختبر فحوصات الإضاءة الحيوية لدراسة الجهاز معطلات الإيقاعية بيئية محددة. على الرغم من أن لديها مجموعة متنوعة من النماذج الخلوية على مدار الساعة (مثلاً، في الكبد، والخلايا الكيراتينيه، والخلايا الدهنية، فضلا عن خط خلية osteosarcoma) وضعت في السنوات الأخيرة12،،من1314، 15، مقايسة الموصوفة هنا هو أول نموذج ساعة الخلوية في الخلايا الظهارية في الثدي، وأول مظاهرة إيجاز في فيفو الاستجابات لعوامل الإجهاد البيئي وسميات، والمخدرات، ووكلاء تشيموبريفينتيفي.
لوسيفراس رينيلا (رلوك) ولوسيفراس اليراع هي 30-61 كاتشين أحادي البروتينات التي لا تتطلب المعالجة للنشاط الأنزيمي بوستترانسلاشونال ويمكن أن يعمل كمراسل وراثية فور ترجمتها. مجرد الركيزة يربط مع الإنزيم لوسيفراس، يولد رد الفعل البيوكيميائية حفزت ومضة من الضوء. وهكذا، لوسيفراس بنيات تستخدم على نطاق واسع كالجينات التعبير مراسل النظام في المختبر و في فيفو. إلا أن دراسات إيقاع circadian، محدودة الأداة المساعدة مراسل لوسيفراس بنصف عمر طويل نسبيا من البروتين لوسيفراس (تي1/2 = ح 3.68) بالقياس إلى الفترة (لا سيما لفترة قصيرة) لإجراء تغييرات في الجينات الإيقاعية التعبير؛ ومع ذلك، العديد من الدراسات على مر السنين استخدمت بنجاح الجين لوسيفراس في ناقلات pGL3، مما يشير إلى أنه قد لا يكون ضروريا للإبلاغ عن إيقاعات circadian، لا سيما بالنسبة للايقاعات مع فترة أطول، مثل لوسيفراس سريعة التحلل ح 24. ولذلك، بلازميد مراسل استخدام ناقلات لوسيفراس زعزعة استقرار، pGL [Luc2P/Neo]، الذي يحتوي على هبيست (تسلسل بروتين زعزعة استقرار) قد وضعت، مما يسمح لنا باستخدامه كناقل مراسل الإيقاعية لأعمالنا الحالية في المختبر المقايسة الإضاءة الحيوية. قد نصف عمر أقصر كثيرا من البروتينات المشفرة بواسطة Luc2P (تي1/2 = ح 0.84)، ومن ثم يستجيب بسرعة أكبر وقوته أكبر للتغيرات في النشاط الترانسكربتي من البرية من نوع، أنانديكاتينج التي يمكن أن تستخدم لرصد التعبير الإيقاعي من لوسيفراس وينظم المروج PER2 بدقة في الوقت الحقيقي16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تشييد PER2 "المروج مدفوعة زعزعت لوسيفراس مراسل متجه"
- الشراء مخصص الثابتة والمتنقلة [hPER2P/رلوك/بورو] ناقل يحتوي على كدنا ترميز رلوك والإنسان يفتت مروج PER2 (hPER2P، 941 bp) في الموقع بين الكيس الأول و هند الثالث في المنطقة الاستنساخ متعددة 17.
- قص الجزء مروج PER2 البشرية (hPER2P، 941 bp) الخروج من الناقل.
المخزن المؤقت لأنزيم التقييد
- ميليلتر إضافة 2.5، 10 ميليلتر (180 نغ) الثابتة والمتنقلة [hPER2P/رلوك/بورو] ناقل، وميليلتر 1 كل من إنزيمات التقييد، ساك (10 وحدة/ميليلتر) الأول و "الثالث هند" (وحدة 10/ميليلتر)، إلى الحمض النووي الريبي/النوكليوتيدات خالية/ أنبوب ميكروسينتريفوجي. إضافة الماء عالي النقاوة (10.5 ميليلتر) ما يصل إلى 25 ميليلتر والمزيج بلطف بواسطة بيبيتينج.
- إينكوباتي في 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة في كتلة تدفئة.
- تشغيل وحدة التخزين كله (25 ميليلتر) رد فعل إنزيم التقييد على 0.7% [اغروس] هلام يحتوي على 0.0001% اثيديوم بروميد (أتبر) لفصل في hPER2P من الناقل.
ملاحظة: أتبر، بروميد 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridinium (رقم التسجيل في دائرة المستخلصات الكيميائية: 1239-45-8)، سائل أحمر رائحة. هو عامل إينتيركالاتينج الذي عادة تستخدم كنيون الوسم (وصمة عار الأحماض النووية) في [اغروس] هلام التفريد وتظهر بلون برتقالي تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. المخاطر المحتملة للتأثيرات الطفور لا رجعة عنها حدثت في الحيوانات التجريبية، على الرغم من أن أيا من الوكالات التنظيمية يصنف أنه مسرطن 18. ولذلك جمعت المستخدمة [اغروس] هلام والتفريد مخزن يحتوي على أتبر كالنفايات الكيميائية الخطرة، وطلبت "روتجرز الصحة البيئية" & السلامة (ريس) لالتقاط والتخلص منها بأمان- - قص قطعة من [اغروس] هلام يحتوي على عصابة أتبر الأسفار في 941 شركة بريتيش بتروليوم، وتنقية الشظايا hPER2P من الجل مع مجموعة أدوات استخراج هلام الحمض النووي، يليه القياس الكمي على جهاز المطياف الضوئي بقياس امتصاص الكثافة (OD) في الطول الموجي نانومتر 260.
- لينيريزي 1.0 ميليلتر (1 ميكروغرام) من زعزعة استقرار اليراع لوسيفراس التعبير الموجه، pGL [Luc2P/النيو] بنفس الطريقة كما هو موضح في الخطوات 1.2.1-1.2.2. استخراج الموجه مع مجموعة أدوات تنظيف الحمض النووي تليها الكمي كما هو موضح أعلاه باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
- اضطر hPER2P إلى pGL ناقلات خطية [Luc2P/النيو].
ملاحظة: كل الشركة المصنعة ' تعليمة s، ونسبة المولى مثالية لإدراج وناقلات هي 2:1. ل 50 نانوغرام متجه، يحسب مقدار مثالية لإدراج ك 23.6 نغ مع ناقل kb صيغة، [(50 ng vector x 1.0 kb insert)/4.242] x (2/1) = 23.6 نغ إدراج]. استناداً إلى تركيزات hPER2P (7.26 نانوغرام/ميليلتر) و pGL [Luc2P/النيو] (50 نانوغرام/ميليلتر)، وحدات التخزين من 50 نانوغرام pGL [Luc2P/الأجسام القريبة من الأرض] وتحسب 23.6 نغ hPER2P 1 ميليلتر و 3.26 ميليلتر، على التوالي.- ليجاسى الحمض النووي T4 ميليلتر 2 إضافة رد فعل المخزن المؤقت (10 X) (50 مم تريس-HCl، مم 10 MgCl 2، 1 مم ATP، ومم 10 DTT)، ميليلتر 3.26 (23.6 نغ) hPER2P، 1 ميليلتر (50 نانوغرام) pGL [Luc2P/النيو]، وميليلتر 13.74 المياه تصل إلى 20 ميليلتر ، تخلط بلطف.
- إضافة 1 ميليلتر الحمض النووي T4 ليجاسى (400 وحدة/ميليلتر) وتخلط بلطف واحتضانها في 16 درجة مئوية بين عشية وضحاها في ثيرموسيكلير والبرد ثم ناقلات الواصلة على الجليد كل الشركة المصنعة ' تعليمة s-
- تحويل pGL الواصلة ناقل [hPer2P/Luc2P/النيو] إلى كيميائيا المختصة كولاي 19.
تعيين
- في حوض ماء في 42 درجة مئوية، الاحماء "سوبر مرق الأمثل" مع المتوسطة القمع (S.O.C.) كاتابوليتي (2% تريبتوني 0.5% "استخراج الخميرة"، 10 مم كلوريد الصوديوم، 2.5 ملم بوكل، 10 مم مجكل 2، 10 مم MgSO 4 والجلوكوز 20 مم) في درجة حرارة الغرفة ، الاحماء بلايت أجار بيرتاني لوريا (رطل) (التي تحتوي على 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين و 80 ميكروغرام/مل غال X 0.5 ميكرومتر إيبتج) في حاضنة 37 درجة مئوية، وذوبان الجليد في قنينة واحدة من المختصة كولاي الخلايا لكل تحويل.
- ميليلتر إضافة 6 (21 نغ) متصلة متجه أو 1 ميليلتر (30 نانوغرام) تفريغ ناقلات (المراقبة السلبية) إلى أنبوب واحد من كيميائيا المختصة كولاي (50 ميليلتر) وثم بلطف الوجه أنبوب لمزيج. تبني على الجليد للحد الأدنى 30
- الحرارة صدمة في حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة 30 ق دون المصافحة وثم العودة إلى مدت
- حدد مستعمرة كولاي تحول مع ناقل الواصلة استخدام الفرز أزرق/أبيض-
- إضافة 250 ميليلتر S.O.C. المتوسطة في تحول كولاي أنبوب واحتضان من أجل ح 1 في 37 درجة مئوية مع الهز 200 لفة في الدقيقة- نشر
- 10-50 ميليلتر من تحول كولاي على سطح لوحة أجار رطل بالتساوي. وضع اللوحة رأسا على عقب في حاضنة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: ينبغي أن فعل استنساخ كفاءة إنتاج مستعمرات عدة مئات. ينصح تصفيح مجلدين مختلفة ضمان أن يكون واحد على الأقل من لوحة اللون الأبيض أو الأزرق الكبير، واضحة، والمستعمرات متباعدة بشكل جيد. عندما تكون المستعمرات صغيرة جداً واللون لا يمكن تمييزها، باستخدام مجهر (10 X أو 50 س) مفيد. - بيك 3-6 مستعمرات بيضاء من لوحات بعصي الأسنان معقمة، والإفراج عن كل مستعمرة في أنبوب ثقافة واحدة تحتوي على 4 مل من رطل الثقافة المتوسطة مع 50 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين.
- احتضان هذه الأنابيب عند 37 درجة مئوية مع الهز 200 لفة في الدقيقة بين عشية وضحاها. استخراج الحمض النووي باستخدام 2 مل مل 4 مثقف كولاي مع بلازميد الحمض النووي استخراج ميني الإعدادية مجموعة كل الشركة المصنعة ' تعليمة s-
- التحقق وتحليل الإدراج (hPER2P، 941 bp)
- هضم بلازميد الحمض النووي مع إنزيمات التقييد وتشغيل التفريد كما هو موضح في الخطوات 1.2.1-1.2.3 لتأكيد ما إذا كان هناك إدراج.
ملاحظة: التحكم الإيجابي (hPER2P تنقيته في خطوة 1.2.4) وأدرجت مراقبة سلبية (كولاي تحول مع موجه فارغ). - تسلسل الحمض النووي بلازميد المحدد باستخدام M13 إلى الأمام والإشعال عكس M13 لتأكيد الاتجاه وتسلسل لإدراج في بلازميد 19-
ملاحظة: تم اختيار مستعمرة واحدة فقط كان إدراج مع الحجم الصحيح hPER2P في التفريد والتوجيه الصحيح والتسلسل في النتيجة التسلسل. - تحليل الجزء مروج PER2 البشرية (hPER2P, 941 bp) تسلسل العناصر التنظيمية الإيقاعية، بما في ذلك مربع ه عزر (Bmal1 ربط الموقع، CAT/CGTG)، ككاتك، مربع GC، والنسخ بدء تشغيل الموقع (كاجكج) 20-
- هضم بلازميد الحمض النووي مع إنزيمات التقييد وتشغيل التفريد كما هو موضح في الخطوات 1.2.1-1.2.3 لتأكيد ما إذا كان هناك إدراج.
- أسهب المحدد كولاي بإضافة 2 مل بقايا مثقف كولاي إلى 200 مل رطل الثقافة المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين وثم تفرخ بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع الهز 200 لفة في الدقيقة-
- "استخراج الحمض النووي" مع ماكسي بلازميد خالية من الذيفان الإعدادية المجموعة الواحدة الشركة المصنعة ' s تعليمة، وثم تحديدها كمياً عن طريق قياس التطوير التنظيمي في الطول الموجي نانومتر 260 مع جهاز المطياف الضوئي. مخزن بلازميد الحمض النووي، pGL [hPer2P/Luc2P/النيو]، في الثلاجة-80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل وقاسمه.
2. تعداء عابرة
- الشراء وثقافة الخلايا MCF10A
- شراء خط مخلدة، وتحول غير عادي الثديية طلائي خلايا بشرية (MCF10A) من تجاري البنك الخلية، التي تكون فيها الخلايا سيتوجينيتيكالي جنبا إلى جنب قصيرة تم اختبارها والمصادقة مع تكرار التحليل قبل التجميد. ذوبان الجليد، والحفاظ على كل قنينة من الخلايا المجمدة في الثقافة لمدة أقصاها 8 أسابيع.
ملاحظة: خلافا للخلايا الأخرى، هذه الخلايا بتثبيط الاتصال بمجرد أن نصل إلى التقاء ~ 70%. أنه يتطلب أن ثقافة فرعية يجري في ~ 70%- - ثقافة الخلايا مع الخلايا الظهارية الثديية النمو المتوسطة (MEGM)، التي تتضمن الثديية القاعدية الظهارة المتوسطة (ميبم) ومكملات النمو والسمية الكوليرا في حاضنة ثقافة خلية على 37 درجة مئوية ورطوبة 95% ونسبة 5% CO 2-
ملاحظة: شراء عوامل النمو جاهزة للاستخدام المنصوص عليها في "سينجليقوت" (ميدان) والحصول على السم الكوليرا بشكل منفصل. تركيزات نهائية من مكملات النمو هي 0.4% البقري النخامية والإنسولين 0.1%، الهيدروكورتيزون 0.1%، عوامل نمو البشرة البشرية 0.1%، 100 نانوغرام/مليلتر الكوليرا السمية، وسلفات مع الجنتامايسين 0.05% و 0.05% الامفوتريسين باء - فصل الخلايا في الطبق الثقافة 10 سم بالحضانة مع 10 مل التربسين/يدتا ل ~ 20 دقيقة وتحييد التربسين ثم بإضافة 10 مل التربسين تحييد الحل. جمع كافة الخلايا ذات حبيس مخزنة المحلول الملحي (حبس)- عد الخلايا مع هيموسيتوميتير تحت مجهر مقلوب
- وحساب تركيز تعليق خلية مفردة، والبذور ثم عدد معين من الخلايا حسب الحاجة. دوامة لوحات دقة للحصول توزيع المتساوي للخلايا في كل لوحة. احتضان الخلايا في خلية ثقافة الحاضنة في 37 درجة مئوية ورطوبة 95% ونسبة 5% CO 2-
ملاحظة: شراء حزمة كاشف ثقافة فرعية تحتوي على التربسين/يدتا والحل تحييد التربسين، وحبس لاستخدام-
- شراء خط مخلدة، وتحول غير عادي الثديية طلائي خلايا بشرية (MCF10A) من تجاري البنك الخلية، التي تكون فيها الخلايا سيتوجينيتيكالي جنبا إلى جنب قصيرة تم اختبارها والمصادقة مع تكرار التحليل قبل التجميد. ذوبان الجليد، والحفاظ على كل قنينة من الخلايا المجمدة في الثقافة لمدة أقصاها 8 أسابيع.
- تعداء عابرة للخلايا مع الموجه الإيقاعية التي شيدت.
- طبق مع ميجم البذور 2 × 10 5 MCF10A الخلايا بالتساوي في الثقافة 35 ملم وتنمو لالتقاء 20-30 في المائة (في اليوم التالي)-
- الحارة يصل انخفاض مصل وسائط الإعلام (مثلاً، غروب-الفنزويلية) في 37 درجة مئوية كاشف تعداء وحمام الماء في درجة حرارة الغرفة عن 30 دقيقة تمييع بلازميد الحمض النووي التي شيدت (pGL [hPer2P/Luc2P/النيو]) إلى 30 نانوغرام/ميليلتر مع إندو-السمية مجاناً المخزن المؤقت تريس يدتا (TE) وتبقى في درجة حرارة الغرفة-
- إعداد الخليط تعداء بلازميد في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل بإضافة وسائط المصل انخفاض الحارة ميليلتر 63.6 أولاً، ثم إضافة 33.4 ميليلتر (0.1 ميكروغرام) بلازميد الحمض النووي، وتخلط بلطف بيبيتينج، ثم أخيرا إضافة 3 ميليلتر من تعداء كاشف مباشرة في مركز الأنبوب دون لمس الجدار. بعد خلط بلطف بيبيتينج، تبقى في درجة حرارة الغرفة عن 30 دقيقة إسقاط الخليط بلازميد كاملة (100 ميليلتر) مباشرة على سطح مركز الوسط في اللوحة
- وثم تخلط بلطف بالهز الطبق. الثقافة الخلايا في CO 2 حاضنة لإضافية 48-72 h.
ملاحظة: من المتوقع أن تعداء كفاءة أعلى في التقاء 40-70% من هذه الخلايا بسبب إعاقة الاتصال بهم في ~ 70%. ولذلك، يعمل تعداء ابتداء من أفضل ~ 20 ٪ وتوقف في ~ التقاء 70%.
3. إنشاء "المقايسة الإضاءة الحيوية في المختبر" في الخلايا MCF10A Transfected Transiently
- تجويع الخلايا المستزرعة في التقاء ~ 70% (بعد تعداء ح 48-72) في ميبم دون عوامل النمو ل 24 h.
- علاج الخلايا مع عامل المزامنة (مثلاً، 50% الحصان المصل (HS)) في ميبم لح 1.5 في حاضنة 2 CO.
ملاحظة: لاختيار وكيل مزامنة مثالي 10 ميكرون فورسكولين، 1 نانومتر الميلاتونين، دكساميثازون 0.1 ميكرومتر، 50% HS و 100% ميدان مقارنة من حيث السعة الإيقاعية والفترة في الخلايا الإيقاعية متجه ترانسفيكتيد. تعامل الخلايا الفارغة ناقل transfected مع 100 ٪ ميدان كعنصر سلبي. - بريبريباري 20 مل تسجيل المتوسط (ل 10 أطباق الثقافة 30 ملم) بإضافة 5 مل ميجم، 15 مل ميبم وبيكربونات الصوديوم ميليلتر 150، 200 ميليلتر حبيس ولوسيفرين ميليلتر 40 الأسهم الحل (50 ملم) في أنبوب الطرد مركزي 50 مل تعقيمها.
ملاحظة: التركيزات النهائية لكل المكونات: 20% ميدان و 20 نانوغرام/مليلتر الكوليرا السمية وبيكربونات الصوديوم 0.06%، 1% البنسلين/ستربتوميسين و 10 ملم حبيس. الاحماء المعدة مسبقاً تسجيل المتوسطة وتعقيم PBS x 1 لمدة 30 دقيقة في حمام الماء 37 درجة مئوية. إضافة 100 ميكرومتر لوسيفرين فورا قبل الاستخدام. - تغسل الخلايا مع الحارة 1 × دولبيكو ' s "فوسفاتيبوفيريد المالحة" (د-برنامج تلفزيوني) 3 مرات بعد الحضانة مع عامل التزامن، ثم قم بإضافة 2 مل تسجيل المتوسطة-
- ختم الطبق بغطاء معقم فئة باستخدام الشحوم السيليكون لمنع التبخر وثم قم بتسمية فإنه على الجانب-
- مكان الطبق مختومة في المقعد داخل لومينوميتير، وقم بتشغيل الخيار لحفظ موقع الملف في المجلد (للاطلاع على التفاصيل، انظر الفرع 6)-
4. تحديد "خلايا Transfected ستابلي"
- تحسين تركيز G418 مثالي (800 ميكروغرام/مل) مع قتل منحنى مقايسة وفقا للشركة المصنعة ' تعليمة s لتحديد الخلايا ستابلي transfected.
- بعد عابر تعداء ح 48 أو 72 ح، ثقافة فرعية وبذور الخلايا مع ميجم في الأطباق أكبر مبلغ 000 5 خلايا/الطبق (100 ملم). بعد 24 ساعة علاج ثقافة في ثقافة الخلية الحاضنة (37 درجة مئوية ورطوبة 95% ونسبة 5% CO 2)، الخلايا مع 800 ميكروغرام/مل من G418 عن طريق استبدال المتوسطة القديمة بالوسيلة الجديدة التي تحتوي على 800 ميكروغرام/مل G418 كل 3-4 أيام لمدة أسبوعين.
- ثقافة فرعية الباقين على قيد الحياة ستابلي transfected المستعمرات للفقرات 1-3 مع ميجم التي تحتوي على 500µg/مل G418 للحفاظ على تعبير مستقر من hPer2P/Luc2P، وتجميد في النتروجين السائل للاستخدام في المستقبل.
- علاج 500µg/مل G418 بعد ثقافة فرعية عامة إعادة تحديد السكان ستابلي transfected الخلايا، وإذا كانت كثافة الإضاءة الحيوية في نتيجة الفحص في المختبر الإضاءة الحيوية يصبح تدريجيا أقل بعد استخدامها في العديد من الممرات.
5. العلاج بالمواد الكيميائية
- في 48 ساعة أو 72 ح تعداء بعد، تجويع الخلايا من عوامل النمو في ميبم ل 24 h.
- بعد المزامنة مع 50% HS ح 2، يعامل الخلايا مع نيتروسوميثيلوريا مم 0.25 أو 0.5 مم (نمو) 20 نانومتر EX527 أو كامبينول 1 ميكرومتر ح 1 في ميبم الذي يحتوي على 20% لميدان
- بعد الغسيل مع 1 × د-برنامج تلفزيوني، إضافة تسجيل ميكرومتر 12.5 تحتوي على المتوسط ماجستير وحدها، أو بالاشتراك مع 20 نانومتر EX527 أو كامبينول 1 ميكرومتر، للخلايا. الرصد الإضاءة الحيوية مع لومينوميتير- علاج
- MCF10A ستابلي ترانسفيكتيد/PER2-دلوك الخلايا مع نمو في 0.5 أو 1 أو 2 مم، EX527 في 40 شمال البحر الأبيض المتوسط، أو كامبينول في 2.0 ميكرون، ح 1 بعد المزامنة مع 50% HS، واحتضان ثم الخلايا في تسجيل المتوسط ميكرومتر 12.5 المحتوية على لجنة السلامة البحرية أو جرعات مختلفة (5 أو 10 أو 20 ميكرومتر) ن-أسيتيل (NAC). وضع اللوحات في لومينوميتير، سجل وحفظ الإضاءة الحيوية طريق luminometer أيام 4-8 كما هو موضح في المقطع 3.6.
ملاحظة: نمو نيتروسوريا ميثليته مركب مع خصائص مطفرة ومسببة للسرطان والتشوهات. نمو هو وكيل النيابة مباشرة الكيلاتينج وله نصف عمر قصيرة (تي 1/2 = ~ 30 دقيقة). أنها مستقرة في حالة حمضية (pH 4-5)، لكنه غير مستقر في حالة القلوية (pH 9-10)، وفي درجات حرارة تتجاوز 20 درجة مئوية. ولذلك، يمكن استخدام التبييض 10 في المائة كعامل التخميد فعال لتنظيف أسطح مقاعد البدلاء والتركيبات مختبر يحتمل أن تكون ملوثة بنمو solutiفي. حل الأسهم بقايا هو اختار الهاتفي والتخلص منها بأمان بواسطة ريس. استناداً إلى طريقة عمل للمواد الكيميائية، يمكن أن تعامل الخلايا متزامنة لأوقات أقصر قبل استزراع في تسجيل المتوسط. ويمكن أيضا علاج الخلايا في تسجيل المتوسط لفترة أطول (عدة أيام).
6. جمع البيانات وتحليلها، وعرض
ملاحظة: بقاء الخلية يحتاج إلى تحديد استخدام الأساليب القياسية (مثل فحص MTT) بعد علاج الخلايا بتركيزات نفس الأوقات نفسها أشارت إلى. جميع التركيزات المعالجة المستخدمة في فحص الإضاءة الحيوية في المختبر كانت أقل من 30% تركيز قاتلة (LC30). أجريت جميع التجارب في ثلاث نسخ، وعرضت نتائج الممثل.
- بعد ختم الطبق (الخطوة 3، 5)، تحميل الأطباق على المقاعد في لومينوميتير، التي يتم الاحتفاظ بها داخل حاضنة في 37 درجة مئوية دون ح 2 س وأول أكسيد الكربون 2، ومتصلة بكمبيوتر-
- انقر فوق " حفظ " وأدخل أسماء المجلد والملف حيث سيتم حفظ إشارة التﻷلؤ مسجل من الطبق المقابلة.
ملاحظة: هذا النظام بالكشف عن إشارة التﻷلؤ في الوقت الحقيقي من الخلايا في الطبق في المواقف الفردية. الإشارات التي يتم نقلها إلى الكمبيوتر من خلال أنابيب ضوئي 4-فوتون-عد، وحفظها والمعروضة في الكمبيوتر بواسطة برامج جمع البيانات- - تحليل الإشارات بعد التسجيل لمدة 4-7 أيام، الذي يمكن أن يتبعه تغيير متوسطة والتسجيل المستمر لأسبوع ثاني إذا لزم الأمر.
ملاحظة: للحصول على المعلمات الإيقاعية، بما في ذلك المرحلة، طول الفترة، وإيقاع السعة، والتخميد معدل، استخدمنا برمجيات التحليل لومينوميتير لتحليل البيانات الإضاءة الحيوية. - ديتريند البيانات الخام بمعدل تشغيل، وتحليل الأفضل-يناسب إلى موجه جيبية للحصول على فترة المرحلة والسعة، والتخميد معدل 21 ، 22-
- بسبب الإضاءة الحيوية عابرة عالية على العلاج والتغيير المتوسطة، استبعاد الدورة الأولى من البيانات من التحليل-
- لعرض البيانات، رسم البيانات الخام (الإضاءة الحيوية، عد/s) مع الزمن (ح أو يوم). عند الضرورة، يمكن رسم بيانات خط الأساس طرح مقارنة السعة والمرحلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الإضاءة الحيوية الإيقاعية مراسل المتجهات: التعبير يحركها مروج PER2 البشرية لزعزعة استقرار لوسيفراس البديل
تسلسل الحمض النووي يتألف من جزء bp 941 المستمدة من المروج PER2 البشرية المستخدمة لبناء ناقلات مراسل الإيقاعية، pGL [hPer2P//NeoLuc2P، وقد تم تحليل أولاً لوجود العناصر التنظيمية المعروفة لتنظيم التعبير الجيني الإيقاعية. وأظهر تحليل المعلوماتية الحيوية أن داخل هذا الجزء المروج، هناك ثلاثة مواقع الربط Bmal1 مختلفة (E-مربع) (CAT/CGTG) وهما النسخ الإيقاعية تعزيز المواقع (ككاتج) ومربعي GC وموقع بدء نسخ (الشكل 1). ومن ثم كان متوقعا هذا متجه مراسل تعكس التعبير الجيني الإيقاعية.
الأمثل لعامل التزامن
وقد استخدمت عوامل عدة مزامنة أو تؤثر على إيقاع تنتجها الخلايا الليفية الخلايا في المختبر دراسات الإضاءة الحيوية circadian المتمتعة بالحكم الذاتي. لتحديد عامل مزامنة محددة تتسم بالكفاءة والفعالية من حيث التكلفة من نوع خلية في الخلايا الظهارية الثديية، علينا مقابل 10 ميكرون فورسكولين 1 نانومتر الميلاتونين ودكساميثازون 0.1 ميكرومتر، 50% HS، ونسبة 100% مربعا في الخلايا الظهارية الثديية (MCF10A) عابر ترانسفيكتيد مع ناقل مراسل الإيقاعية. خلايا متزامنة مع 50% HS أظهر إيقاع circadian أفضل، مع 3 قمم الإيقاعية التي يسببها التﻷلؤ، مقارنة بقمم واحد أو اثنين فقط في خلايا متزامنة مع العوامل الأخرى. وباﻹضافة إلى ذلك، لمحات الإضاءة الحيوية من الخلايا متزامنة مع 50% HS أنتجت فترة مقبولة، والسعة، وقيمة أفضل احتواء أثناء تحليل البيانات (الشكل 2). وبناء على هذه النتائج، اخترنا هذه الطريقة فعالة من حيث التكلفة كعامل التزامن خلية لكل التجارب اللاحقة.
اضطراب واستعادة إيقاع circadian الخلوية بالتعرض للمواد الكيميائية
في هذا النموذج في المختبر ، الخلايا غير المعالجة، transfected عابر (مجموعة المراقبة) وأظهرت اثنين على الأقل دورات كاملة من التﻷلؤ إشارات بعد المزامنة (الشكل 3A). وأظهرت الخلايا المعرضة مطفر النيابة مباشرة، نمو، الجرعة تعتمد على حدوث اضطراب في التعبير الجيني الإيقاعية كما يتبين من الخسارة في قمم التﻷلؤ. بينما العلاج مع 0.25 مم نمو عدم إخلال إيقاع circadian الخلوية، جرعة مقدارها 0.5 مم نمو تأخر في البداية وبعد إلغاء إيقاع circadian، كما هو مبين باختفاء الذروة الثانية من التﻷلؤ في ح ~ 72 بعد العلاج. تثبيط النشاط SIRT1 مع 20 نانومتر Ex257 أو كامبينول 1 ميكرومتر وبالمثل عطلها إيقاع circadian الملطف الدورة الإيقاعية التالية (الشكل 3 ألف-1). الأهم من ذلك، إضافة للجنة السلامة البحرية (12.5 ميكرون) إلى متوسط الثقافة المستعادة نحو المرحلتين الأولى والثانية عادية للتعبير الجيني الإيقاعية في المعالجة بنمو الخلايا. ماجستير استعادة إيقاع عطلها نمو، بل أيضا منع الآثار المدمرة لمثبطات SIRT1، و Ex257، وكامبينول (الشكل 3 ألف-2).
في ستابلي transfected الخلايا، تعطلت مثبطات نمو و SIRT1 إيقاع circadian، لو على تركيزات أعلى من ذلك لوحظ في ترانسفيكتانتس عابرة (الشكل 3-1). ماجستير العلوم (12.5 ميكرون) استعادة إيقاعات circadian في الخلايا pretreated مع 1 مم نمو (الشكل 3-2). الأهم من ذلك، استعادة لجنة السلامة البحرية أيضا إيقاعات circadian في الخلايا تعامل مع مثبطات SIRT1، بما في ذلك EX257 (40 نانومتر) (الشكل 3B-3) وكامبينول (2 ميكرومتر) (الشكل 3 (ب)(4))، على التوالي.
وبالمقارنة بين الشكل 3 ألف و الشكل 3B، شدة الإضاءة الحيوية كان أعلى بكثير ولكن الإيقاع مستمرة لوقت أقصر في خلايا عابر transfected مقابل ستابلي transfected الخلايا (~ أعلى 10 مرات ومرات 2 أقصر) في العامة، حتى بعد العلاج للخلايا مع نمو أو ماجستير. وبالإضافة إلى ذلك، كان 2-fold أكثر حساسية للتعرض للمواد الكيميائية في خلايا عابر transfected الخلايا transfected ثابت بالمقارنة مع إيقاع circadian الخلوية.
الكمية التغيير تعتمد على جرعة من إيقاع circadian الخلوية بالمواد الكيميائية
وبالمثل، تعطلت الخلوية إيقاع circadian ستابلي transfected الخلايا تعامل مع 1 ملم تم استعادة نمو علاجهم في ائتلاف البرنامج الجديد بطريقة تعتمد على الجرعة (0-20 ميكرومتر) (الشكل 4A) وكما لوحظ في التغييرات التي حدثت الفترة الإيقاعية (الشكل 4B ) والمرحلة (الشكل 4).
الشكل 1: تسلسل يفتت مروج PER2 البشرية وناقلات مراسل الإيقاعية. (أ) يفتت المروج البشرية PER2 (941 bp) كان التسلسل، والتسلسل وقد تم تحليل لعناصر المروج الإيقاعية الوظيفية. ﻫ-مربع، كاكجت/كاتجتج؛ النسخ الإيقاعية تعزيز الموقع، ككاتج؛ مربع GC، كجكككك/جججكجج؛ النسخ ابتداء من الموقع (TSS): كاجكج. (ب) رسم تخطيطي لزعزعة استقرار لوسيفراس مراسل متجه، pGL [hPer2P/Luc2P/Neo]. النسخ لزعزعة استقرار لوسيفراس (دلوك) تحت السيطرة المباشرة للمروج hPER2 . مورثة مقاومة أعرب المشترك النيوميسين (الأجسام القريبة من الأرض) يسهل تحديد الخلايا المصابة ب G418. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: التزامن في المختبر الإيقاع circadian الخلوية بعوامل مختلفة التزامن. بعد 24 ساعة من الموت جوعاً، تعامل الخلايا MCF10A transfected عابر بناقل مراسل الإيقاعية مع كل عامل التزامن لح 2، متبوعاً بتسجيل الإشارات التﻷلؤ. الأزرق، 10 ميكرون فورسكولين؛ الأحمر، 1 نانومتر الميلاتونين؛ الأخضر، 0.1 ميكرومتر الديكساميتازون؛ أرجواني؛ مصل الحصان 50% (HS)؛ أزرق مخضر، 100% سينجليقوت (ميدان)؛ ناقل الأصفر، فارغة (مراقبة سلبية). المحور س، الوقت (اليوم)؛ المحور الصادي، الإضاءة الحيوية (عدد مرات/دقيقة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: ماجستير استعادة إيقاعات circadian الخلوية التي عطلها مثبطات نمو و SIRT1 في الخلايا الظهارية الثديية في المختبر. وأجريت فحوصات الإضاءة الحيوية على MCF10A/PER2-دلوك مراسل الخلايا بعد المزامنة مع 50% HS. المحور س، الوقت (ح) (وقت العلاج نمو الوظيفة)؛ المحور الصادي، الإضاءة الحيوية (عدد مرات/دقيقة). (أ) النتائج من الخلايا transfected عابر. الخلايا (1) تعامل مع 0، 0.25 أو 0.5 مم نمو 20 نانومتر EX527 أو كامبينول 1 ميكرومتر ح 1 بعد المزامنة. الأصفر: المراقبة؛ أحمر: 0.25 مم نمو؛ الأخضر: 0.5 مم نمو؛ الأزرق: 20 نانومتر EX527؛ الأصفر الأخضر: كامبينول 1µM. وتم علاج الخلايا (2) مع 12.5 ميكرون MSC وحدها، أو بالاشتراك مع 20 نانومتر EX527 أو كامبينول 1 ميكرومتر في تسجيل المتوسطة عقب التعرض إلى 0.5 مم نمو. الأصفر: المراقبة؛ أحمر: 0.25 مم نمو؛ الأخضر: 0.5 مم نمو؛ الأزرق: 0.5 مم نمو + 12.5 ميكرون لجنة السلامة البحرية؛ الأصفر الأخضر: 0.5 مم نمو + 12.5 ميكرون ماجستير + 20 نانومتر EX527؛ الأرجواني: 0.5 مم نمو 12.5 ميكرون ماجستير + + كامبينول 1 ميكرومتر. (ب) النتائج من الخلايا transfected ثابت. 3rd-ترد قممال 5 التي أظهرت اختلافات واضحة ونظيفة بين المجموعات نتيجة لذلك ممثل. (1) الخلايا تعامل مع 0، 0.5، 1.0 أو 2.0 مم نمو 40 نانومتر EX527 أو كامبينول 2 ميكرومتر ح 1 بعد المزامنة. الأصفر: المراقبة؛ الأحمر: 0.5 مم نمو؛ الأخضر: 1.0 مم نمو؛ الأزرق: 2.0 مم نمو؛ الأصفر الأخضر: 40 نانومتر EX527؛ الأرجواني: 2 ميكرومتر كامبينول. الخلايا (2) تعامل مع 12.5 ميكرون. ماجستير في تسجيل المتوسطة عقب التعرض إلى 1.0 مم نمو. الأصفر: المراقبة؛ الأحمر: 1.0 مم نمو؛ الأخضر: 1.0 مم نمو + 12.5 ميكرون MSC. خلايا (3) تعامل مع 12.5 ميكرون MSC عقب التعرض إلى 40 نانومتر EX257. الأصفر: المراقبة؛ الأحمر: 40 نانومتر EX257؛ الأخضر: 40 نانومتر EX257 + 12.5 ميكرون MSC. الخلايا (4) تعامل مع 12.5 ميكرون MSC عقب التعرض إلى 2 ميكرومتر كامبينول. الأصفر: المراقبة؛ الأحمر: 2 ميكرومتر كامبينول؛ الأخضر: 2 ميكرومتر كامبينول + 25 ميكرومتر MSC. هذه النتيجة أبلغ سابقا وهو مرخص بموجب نسخة من 2.022. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: NAC الجرعة-[دبندنتلي] استعادة إيقاع circadian الخلوية عطلها نمو. الخلايا تعامل مع 1.0 مم نمو أو التحكم بالسيارة عن ح 1 بعد المزامنة. (أ) نتيجة الممثل للإضاءة الحيوية (عدد مرات/دقيقة) مع الزمن (ح). الأصفر: المراقبة؛ الأحمر: 1.0 مم نمو؛ الأخضر: 1.0 مم نمو، 5 ميكرومتر بريدًا؛ الأزرق: 1.0 مم نمو، 10 ميكرون بريدًا؛ الأصفر الأخضر: 1.0 مم نمو، 20 ميكرومتر بريدًا. (ب) فترة (ساعات). (ج) المرحلة (ساعات). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في خلايا الثدييات، ودورية على مدار الساعة الإيقاعية ينظم حلقات التغذية المرتدة النسخي/متعدية مترابطة. هيتيروديميرس Bmal1 وأما ساعة أو Npas2 تنظيم النسخ الإيقاعية ملزمة بعناصر مربع ه في المروجين الأساسية كلية الدراسات العليا، بما في ذلك Per2 و صرخة، والعديد من ككجس4. كما أنها تتراكم في الخلية، هيتيروديميرس من كل: تعديل صرخة ونقلها إلى نواة لقمع النشاط الترانسكربتي على مدار الساعة: Bmal1 بوستترانسلاتيونالي. يسمح هذا حلقة ردود الفعل السلبية الأساسية كلية الدراسات العليا لتنظيم النسخ الخاصة بهم وإعداد التعبير الإيقاعي لكلية الدراسات العليا وككجس23. على الرغم من أن خلايا الثدييات الأكثر ساعة الإيقاعية جوهرية، يمكن مزامنة الساعات الموجودة في الخلايا الفردية بكل الشروط الجوهرية (مثل، الأكسدة المحتملة) والمؤثرات البيئية الخارجية24. يمكن مزامنة الجينات الإيقاعية التعبير في فيفو بالميلاتونين، هو هرمون تنتجه الغدة الصنوبرية في الرد على الإشارات الواردة من جهاز تنظيم ضربات القلب المركزي (SCN). اللجنة الفرعية للتغذية يدمج إشارات الضوء تؤثر على الإعراب عن ميلانوسبين المتخصصة من خلايا العقدة الشبكية حساس في الشبكية. الميلاتونين من الغدة الصنوبرية يدخل الدورة الدموية وينظم إيقاع circadian من اللجنة الفرعية للتغذية والطرفية معظم الخلايا في المختبر و في فيفو25،26. أيضا يمكن أن ينظم إيقاع circadian الإجهاد الهرمونات (مثلالكورتيزول والكاتيشولامين)،،من2728 وعوامل النمو29،30. رفع القيود عن عوامل النمو المعروف أن تترافق مع اضطراب الإيقاعية ل نمو وتمايز الخلايا31.
ناقل مراسل الإيقاعية نحن شيدت يستغل هذه الآلية السلبية ردود الفعل البيوكيميائية. حلقة ردود فعل سلبية الإيقاعية الأساسية يتكون من المنشطات النسخي، BMAL1 وعلى مدار الساعة، الذي ربط زخارف ملزم ه/E´--مربع الإيقاعية في مروج PER2 ، وريبريسورس عدد الأفراد ومذيعة، التي تنظم التعبير BMAL1 سلبيا. نظام مراسل الحالي، يسهل تفعيل الإيقاعي المروج PER2 BMAL1 وعلى مدار الساعة التعبير الإيقاعية لزعزعة استقرار لوسيفراس، تسمح تواتر الإيقاعية أكثر دقة من إشارات التﻷلؤ. ويشمل بناء بلازميد مراسل الموقع ملزم BMAL1 وإيقاع circadian تعزيز موقع، مربع GC، وموقع بدء النسخ من المروج hPER2 . الناقل يسمح لقراءات في الوقت الحقيقي لإيقاع circadian اللاإرادي الخلوية في الخلايا ترانسفيكتيد، ويمكن استخدامها لتحديد الشروط أو العوامل المحددة التي تغير هذا النمط الإيقاعية الذاتية للتعبير الجيني. ومع ذلك، عندما تكون الخلايا المزروعة في المختبر أو السابقين فيفو، التذبذب الإيقاعية بسرعة يصبح desynchronized. ولذلك من الضروري إعادة مزامنة إيقاعات قبل أي فحوصات الإيقاعية يمكن أن يؤديها في المختبر. في الخلايا الظهارية الثديية، وجدنا أن 50% HS، الميلاتونين، و 100% مربعا كانت كل منها قادرة على حمل التزامن كفاءة من إيقاع circadian في المختبر. إنتاج الديكساميتازون وفورسكولين المزامنة جزئية فقط. ستكون الاختبارات تعتمد على الجرعة اللازمة للتنمية واختيار وكلاء مزامنة جديدة في الدراسات المستقبلية. ونظرا لكفاءة منخفضة التكلفة، واستخدامها على نطاق واسع كعامل التزامن، 50% HS وجد أن عامل مزامنة فعالة التي أنتجت قوي واستنساخه الخلوية circadian الإيقاع في الخلايا الظهارية الثديية والعصبية الخلايا، كما سبق وذكرت في العديد من أنواع الخلايا وإعدادات تجريبية مختلفة24أخرى.
للتحقق من صحة النموذج في المختبر لتنظيم الإيقاعية، طلبنا التالية إذا كانت استجابة إيقاع circadian لعوامل الإجهاد البيئي في المختبر وسوف الخص الآثار لاحظنا في فيفو. سابقا، أثبتنا أن جرعة وحيدة مسرطنة لنمو تعطلت التعبير الإيقاعية من كلية الدراسات العليا الرئيسية (مثلاً، Per2) والعديد من ككجس في الغدة الثديية المستهدفة. وعلاوة على ذلك، إعادة نظام تشيموبريفينتيفي للجنة السلامة البحرية الإيقاعية التعبير عن الجينات Per2 وككجس نحو العادي. كذلك أثبتنا أن تعرض الخلايا سميات وعوامل الإجهاد يمكن أن تغير التعبير الجيني الإيقاعية من خلال آثارها على نادٍ+-تعتمد SIRT1 النشاط7،،من822. النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام في المختبر مراسل الإيقاعية المقايسة أظهرت أن التعرض لنمو تسبب في تعطيل للتعبير الجيني الإيقاعية الخلوية، وأن أكثر من المثير للاهتمام، ماجستير ليس فقط قادراً على إعادة ضبط إيقاع circadian الخلوية تعطلت بسبب نمو، ولكن أيضا إعادة ضبط إيقاع circadian عطلها مثبطات SIRT1. هذه النتائج أشارت إلى أن الفحص في المختبر يستنسخ آثار نمو على التعبير الجيني الإيقاعية ليس فقط، ولكن يورد أيضا آثار لجنة السلامة البحرية على إيقاع الإيقاعية تعطلت في فيفو عبر آليات تعتمد على SIRT1. نظام مراسل الإيقاعية في المختبر وبالتالي لديه القدرة على الكشف عن مجموعة متنوعة من سميات والضغوطات التي تغير مستويات/NADH NAD+في الخلية، بما في ذلك مثبطات مباشرة والمغيرون من الأكسدة الخلوية ركوب الدراجات فضلا عن سمية جينية العوامل التي يمكن أن تستنفد NAD+ عن طريق بولي الحمض الريبوز ADP تعتمد إصلاح32. تشير هذه النتائج إلى أن يوفر النظام مراسل في المختبر هو أداة مفيدة للشاشة لظروف الخلية والمواد الكيميائية التي يمكن أن تعطل أو استعادة الجينات الإيقاعية التنظيم في فيفو.
على الرغم من أن الفحص في المختبر يمكن إعدادها باستخدام خلايا عابر أو ستابلي transfected مع بناء مراسل، لوحظت بعض الاختلافات في الاستجابة لمعالجة المواد الكيميائية بين الخلايا transfected عابر وثابت. ستابلي transfected الخلايا كانت أكثر مقاومة للعلاج المواد الكيميائية، وبخاصة مثبطات نمو و SIRT1، من الخلايا transfected عابر. هذه الاختلافات يمكن أن تعكس اختلافات طفيفة في تنظيم المروج متجه في ترانسفيكتانتس مستقرة بسبب التأثيرات من تسلسل المحيطة بمواقع محددة من التكامل. ولذلك، اختيار ترانسفيكتانتس مستقرة بالعلاج بالمضادات الحيوية قد أيضا تحديد الحيوانات المستنسخة التي أكثر قدرة على مقاومة اضطراب الإيقاعية. وبالتالي، يجب التحقق من صحة الفرد في المختبر نماذج الخلية باستخدام ترانسفيكتانتس عابرة أو مستقرة لهم القدرة على تلخيص الردود في فيفو . تعداء مختلف أساليب حفز أيضا مستويات مختلفة من الإجهاد سمية جينية والسمية على الخلايا والنتيجة في تعرضها مختلفة للتأثيرات السمية للمواد الكيميائية. ولذلك، تجارب الاختبار والطيار سيتوتوكسيسيتي مطلوبة لاختيار شروط تعداء والعلاج. وعلى الرغم من الاختلاف في حساسيتها، النتائج الإجمالية التي تم الحصول عليها مع خلايانا مراسل الإيقاعية الظهارية الثديية للتعطيل واستعادة إيقاع circadian الخلوية بمواد كيميائية كانت متسقة وقابلة للمقارنة بين عابر transfected وستابلي transfected الخلايا، والنتائج التي لخص آثار لاحظنا في فيفو.
لتحديد إذا كان ناقل مراسل الإيقاعية يمكن أن تستخدم في أنواع الخلايا الأخرى، ستابلي تم transfected الخلايا البشرية جليوبلاستوما/astrocytoma (U-87 MG) مع هذه الموجه الإيقاعية. أظهرت النتائج الأولية باستخدام مقايسة الإضاءة الحيوية الخلوية في المختبر أن هذه الخلايا السرطانية المستمدة من العصبية بعد المزامنة، قد منتظمة وقوية خلوية circadian إيقاع مماثلة لتلك التي لوحظت في الإنسان الثديية الخلايا الظهارية. الخلايا تعامل مع IC261، مثبط معروفة من الكازين كيناز 1 δ (CK1δ) و CK1 اليورو، أظهرت فترة طويلة الإيقاعية، لكن السعة أقل ب المبلغ عنهاص الآخرين (البيانات لا تظهر)33. تشير هذه النتائج إلى أن مقايسة الإضاءة الحيوية الخلوية في المختبر وناقلات مراسل لوسيفراس الإيقاعية قابلة للتطبيق في الأخرى جهاز الخلايا المحددة، بما في ذلك الخلايا العصبية.
مراسل الخلوية وضعت هنا يمكن ولذلك استخدام النظام على نطاق واسع كفحص في المختبر لتحديد التعبير الجيني الإيقاعية في أنواع مختلفة من الخلايا بشكل عام. الإجراء التجريبي بسيطة وسريعة وآمنة. ومع ذلك، لا يمكن أن يكون هذا النظام مراسل الخلوية سهولة تكييف في الخلايا التي يصعب على ترانسفيكت، غير تقسيم الخلايا (مثلالخلايا العصبية)، أن لديهم الكفاءة تعداء المعروف منخفضة. الأساليب المستندة إلى فيروس تعداء (مثلاً، تعداء lentivirus) قد توفر حلاً كفاءة أعلى لهذه الخلايا34. ومع ذلك، الوقت والصعوبة المرتبطة بإنتاج لينتيفيرال يجعل هذا الأسلوب صعب ويستغرق وقتاً طويلاً. وعلاوة على ذلك، مختبر مستوى السلامة مناسبة اللازمة للإنتاج والاستخدام للفيروس. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام كاشفات التﻷلؤ خلية مفردة عالية الدقة لتحديد إيقاعات المستمرة، بشكل مستقل على مراحل للتعبير الجيني الإيقاعية في الخلايا غير تقسيم35.
دراسات الثدييات circadian الإيقاع في فيفو هي العمالة المكثفة، ومكلفة، بل أنها تتطلب أيضا استخدام إعداد كبيرة من الحيوانات. توافر نظم في المختبر يمكن أن تقلل من عدد الحيوانات اللازمة لاختبار الرابطات بين الإخلال بالتعبير الجيني الإيقاعية وتطور الأمراض المزمنة، بما في ذلك التسرطن والتمثيل الغذائي متلازمة. يمكن إبلاغ البيانات الكمية في معلمات الإيقاعية، بما في ذلك الفترة والسعة، والمرحلة، الجرعة و/أو تعتمد على الوقت تأثيرات المواد الكيميائية على إيقاع circadian الخلوية. على سبيل المثال، لاحظنا أن مضادات الأكسدة جرعة [دبندنتلي] يمكن استعادة NAC الفترة والمرحلة من إيقاع circadian الخلوية عطلها نمو. يمكن أيضا استخدام هذا النموذج في المختبر لفرز وتصنيف المواد المسببة لاختلال الإيقاعية البيئية والتحقيق أثر تعطل circadian الإيقاع في الأضرار بوظيفة الخلوية، وتقديم رؤى الميكانيكية لتطوير استراتيجيات التدخل للافواج في زيادة خطر سرطان الثدي والمتلازمات الأيضية، والاضطرابات العصبية، بسبب جداول عمل غير طبيعي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل بالمجتمع 2012 لعلم السموم (SOT)-كولجيت بالموليف منحة "بحوث بديلة" (M. فانغ) وبحث التعاون الدولي الصندوق من الحيوان والنبات وكالة الحجر الصحي، جمهورية كوريا (M. فانغ)، ومنح نيس P30ES005022 (H. زاربل). نود أن نشكر الدكتور تشنغ تشن (ماكغفرن كلية الطب في الجامعة تكساس مركز العلوم الصحية في هيوستن) لمناقشة مفيدة له، السيد شون خوان لمساعدته التجريبية، والسيدة كيمي ناكاتا للقراءة دليلاً لها.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector | SwitchGear Genomics | S700000 | customized vector |
| pGL4.18[Luc2P/Neo] vector | Promega | 9PIE673 | destabilized luciferase expression vector |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224041 | For subcloning |
| TOPO TA cloning kit | Invitrogen | K4500-02 | with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli |
| Sac I | New England BioLabs | R0156S | Restriction enzyme |
| Hind III-HF | New England BioLabs | R3104S | Restriction enzyme |
| CutSmart buffer | New England BioLabs | B7204S | Restriction enzyme buffer |
| DNA gel extraction kit | Qiagen | 28704 | Purify DNA fragments from agarose gel |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA clean up |
| LB Miller's modification | TEKNOVA | L8600 | For transformed E. Coli culture |
| LB Agar Plate | TEKNOVA | L1902 | For white/blue selection |
| QIAprep spin miniprep Kit | Qiagen | 27104 | For extraction of plasmide DNA |
| EndoFree plasmid maxi prep Kit | Qiagen | 12362 | For extraction of plasmide DNA |
| FuGene HD | Promega | E2311 | Transfection reagent |
| Opti-MEM reduced serum medium | Invitrogen | 31985-062 | For transfection |
| MCF10A cell line | American Type Culture Collection | CRL-10317 | Mammary Epithelial Cells |
| MEGM BulletKit | Lonza | CC-3150 | Mammary Epithelial Growth Medium |
| MEBM | Lonza | CC-3151 | Mammary Epithelial Basal Medium |
| MEGM SingleQuot Kit | Lonza | CC-4136 | Suppliments & Growth Factors |
| ReagentPack | Lonza | CC-5034 | Reagent for subculture |
| D-PBS (10X) | Sigma | D1408 | Wash cells in culture dishes |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977 | Dilute 10X D-PBS |
| Tissue culture dish (35 mm) | BD/Falcon | 353001 | cell culture dish suitable to LumiCycle |
| Silicon grease | Fisher | NC9044707 | For sealing dish with recording medium |
| Round cover glass | Harvard Bioscience | 64-1500 (CS-40R) | For sealing dish with recording medium |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Supplement for growth medium |
| G418 sulfate (Geniticin) | Invitrogen | 10131035 | Antibiotic for selection of stabliy transfected cells |
| Ampicillin | Sigma | A9393 | For colony selection |
| Forskolin | Sigma | F6886 | Synchronization agent |
| Melatonin | Sigma | M5250 | Synchronization agent |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Synchronization agent |
| Horse serum | Sigma | H1138 | Synchronization agent |
| d-Luciferin, sodium salt | Invitrogen | L2912 | Luciferase substrate |
| IC261 | Sigma | 10658 | Positive control for circadian disruptor |
| Methylnitrosourea (NMU) | Sigma | N1517 | Mammary specific carcinogen |
| Methylselenocysteine (MSC) | Sigma | M6680 | Organic selenium (chemopreventive agent) |
| EX527 | Sigma | E7034 | SIRT1 specific inhibitor |
| Cambinol | Sigma | C0494 | SIRT1 & SIRT2 inhibitor |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 8000 | Quantify nucleotide |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | N805-0200 | For molecular biology experiment |
| CO2 Incubator | NAPCO | Series 8000 DH | For cell culture at 5% CO2 at 37 °C |
| Desktop centrifuge with refrezerator | Eppendorf | 5430R | For molecular biology experiment |
| Centrifuge with swing bucket | Eppendorf | 5810 R | For cell culture |
| Inverted microscope | Nikon | 80124 | Phase contrast optional |
| Tissue culture hood | Labconco | Class II A2 | BSL-2 certified |
| LumiCycle 32 | Actimetrics | Not Available | Luminoscence detector |
References
- Akerstedt, T., et al. Night work and breast cancer in women: a Swedish cohort study. BMJ Open. 5 (4), e008127 (2015).
- Parent, M. E., El-Zein, M., Rousseau, M. C., Pintos, J., Siemiatycki, J. Night work and the risk of cancer among men. Am J Epidemiol. 176 (9), 751-759 (2012).
- Knutsson, A., et al. Breast cancer among shift workers: results of the WOLF longitudinal cohort study. Scand J Work Environ Health. 39 (2), 170-177 (2013).
- Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat Rev Cancer. 3 (5), 350-361 (2003).
- Fu, L., Kettner, N. M. The circadian clock in cancer development and therapy. Prog Mol Biol Transl Sci. 119, 221-282 (2013).
- IARC.
- Zhang, X., Zarbl, H. Chemopreventive doses of methylselenocysteine alter circadian rhythm in rat mammary tissue. Cancer Prev Res (Phila Pa). 1 (2), 119-127 (2008).
- Fang, M. Z., Zhang, X., Zarbl, H. Methylselenocysteine resets the rhythmic expression of circadian and growth-regulatory genes disrupted by nitrosomethylurea in vivo. Cancer Prev Res (Phila). 3 (5), 640-652 (2010).
- Burbulla, L. F., Kruger, R. Converging environmental and genetic pathways in the pathogenesis of Parkinson's disease. J Neurol Sci. 306 (1-2), 1-8 (2011).
- Aitlhadj, L., Avila, D. S., Benedetto, A., Aschner, M., Sturzenbaum, S. R. Environmental exposure, obesity, and Parkinson's disease: lessons from fat and old worms. Environ Health Perspect. 119 (1), 20-28 (2011).
- Nagoshi, E., Brown, S. A., Dibner, C., Kornmann, B., Schibler, U. Circadian gene expression in cultured cells. Methods Enzymol. 393, 543-557 (2005).
- Ramanathan, C., et al. Cell type-specific functions of period genes revealed by novel adipocyte and hepatocyte circadian clock models. PLoS Genet. 10 (4), e1004244 (2014).
- Sporl, F., et al. A circadian clock in HaCaT keratinocytes. J Invest Dermatol. 131 (2), 338-348 (2011).
- Zhang, E. E., et al. A genome-wide RNAi screen for modifiers of the circadian clock in human cells. Cell. 139 (1), 199-210 (2009).
- Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (15), 5339-5346 (2004).
- Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression. Biotechniques. 29 (3), (2000).
- Genomics, S. Technical Note: SwitchGear methods for gene model construction and transcription start site prediction. , (2009).
- Scientific, F. Safety Data Sheet: Ethidium bromide, 1% Solution/Molecular Biology. , (2010).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology. , Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience. New York. (1994).
- Yoo, S. H., et al. A noncanonical E-box enhancer drives mouse Period2 circadian oscillations in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2608-2613 (2005).
- Chen, Z., et al. Identification of diverse modulators of central and peripheral circadian clocks by high-throughput chemical screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 101-106 (2012).
- Fang, M., Guo, W. R., Park, Y., Kang, H. G., Zarbl, H. Enhancement of NAD+-dependent SIRT1 deacetylase activity by methylselenocysteine resets the circadian clock in carcinogen-treated mammary epithelial cells. Oncotarget. , (2015).
- Chen-Goodspeed, M., Lee, C. C. Tumor suppression and circadian function. J Biol Rhythms. 22 (4), 291-298 (2007).
- Balsalobre, A. Clock genes in mammalian peripheral tissues. Cell Tissue Res. 309 (1), 193-199 (2002).
- Jung-Hynes, B., Huang, W., Reiter, R. J., Ahmad, N. Melatonin resynchronizes dysregulated circadian rhythm circuitry in human prostate cancer cells. J Pineal Res. 49 (1), 60-68 (2010).
- von Gall, C., et al. Melatonin plays a crucial role in the regulation of rhythmic clock gene expression in the mouse pars tuberalis. Ann N Y Acad Sci. 1040, 508-511 (2005).
- Vujovic, N., Davidson, A. J., Menaker, M. Sympathetic input modulates, but does not determine, phase of peripheral circadian oscillators. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (1), R355-R360 (2008).
- Schofl, C., Becker, C., Prank, K., von zur Muhlen, A., Brabant, G. Twenty-four-hour rhythms of plasma catecholamines and their relation to cardiovascular parameters in healthy young men. Eur J Endocrinol. 137 (6), 675-683 (1997).
- Yu, H., et al. Circadian rhythm of circulating fibroblast growth factor 21 is related to diurnal changes in fatty acids in humans. Clin Chem. 57 (5), 691-700 (2011).
- Nakagawa, H., et al. Modulation of circadian rhythm of DNA synthesis in tumor cells by inhibiting platelet-derived growth factor signaling. J Pharmacol Sci. 107 (4), 401-407 (2008).
- Yang, X., Guo, M., Wan, Y. J. Deregulation of growth factor, circadian clock, and cell cycle signaling in regenerating hepatocyte RXRalpha-deficient mouse livers. Am J Pathol. 176 (2), 733-743 (2010).
- Virag, L. Structure and function of poly(ADP-ribose) polymerase-1: role in oxidative stress-related pathologies. Curr Vasc Pharmacol. 3 (3), 209-214 (2005).
- Kon, N., Sugiyama, Y., Yoshitane, H., Kameshita, I., Fukada, Y. Cell-based inhibitor screening identifies multiple protein kinases important for circadian clock oscillations. Commun Integr Biol. 8 (4), e982405 (2015).
- Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters. J Vis Exp. (67), e4234 (2012).
- Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr Biol. 14 (24), 2289-2295 (2004).
