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Genetics

In Vitro Test de bioluminescence pour caractériser le rythme circadien dans les cellules épithéliales mammaires

doi: 10.3791/55832 Published: September 28, 2017

Summary

Un test de bioluminescence in vitro afin de déterminer des rythme circadien cellulaire dans les cellules épithéliales mammaires est présenté. Cette méthode utilise des plasmides de journaliste de cellules de mammifères exprimant déstabilisé luciférase sous le contrôle du promoteur du gène de la période 2 . Il peut être adapté à d’autres types de cellules pour évaluer les effets spécifiques sur le rythme circadien.

Abstract

Le rythme circadien est un processus physiologique fondamentaux présent dans tous les organismes qui régule les processus biologiques allant de l’expression des gènes au comportement de sommeil. Chez les vertébrés, le rythme circadien est contrôlé par un oscillateur moléculaire qui fonctionne dans le noyau suprachiasmatique (YVERT ; stimulateur central) et des cellules individuelles comprenant les tissus plus périphériques. Plus important encore, la perturbation du rythme circadien par l’exposition à la lumière nuit, facteurs de stress environnementaux et/ou des substances toxiques est associée à un risque accru de maladies chroniques et le vieillissement. La capacité d’identifier les agents qui peuvent perturber les horloges biologiques centrales ou périphériques et qui peut prévenir ou atténuer les effets de désorganisation du rythme circadienne, a des implications importantes pour la prévention des maladies chroniques. Bien que les modèles de rongeurs peuvent servir à identifier les expositions et les agents qui induisent ou à prévenir ou atténuer les perturbations circadiennes, ces expériences nécessitent un grand nombre d’animaux. Des études in vivo aussi requièrent l’infrastructure et des ressources importantes et les chercheurs à travailler toute la nuit. Ainsi, il est un besoin urgent d’un type cellulaire appropriée en vitro système pour dépister les environnementales endocriniens circadiennes et exhausteurs de types de cellules de différents organes et états pathologiques. Nous avons construit un vecteur qui anime la transcription de la luciférase déstabilisé dans les cellules eucaryotes sous le contrôle du promoteur du gène humain des période 2 . Cette construction de rythme circadien journaliste était stablement transfectée dans des cellules épithéliales mammaires humaines et cellules circadienne journaliste sensible ont été sélectionnés pour développer le test de bioluminescence in vitro . Nous présentons ici un protocole détaillé afin d’établir et de valider le test. Nous fournissons plus amples détails pour preuve d’expériences de concept démontrant la capacité de notre essai in vitro à récapituler les effets in vivo de divers produits chimiques sur l’horloge biologique cellulaire. Les résultats indiquent que le test peut être adapté à une variété de types de cellules à l’écran pour les perturbateurs endocriniens environnementaux et exhausteurs chimiopréventif des horloges circadiennes.

Introduction

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L’horloge circadienne réglemente un large éventail de processus biologiques de diurne expression des gènes dormir comportement dans un rythme prévisible avec une périodicité d’environ 24 h. épidémiologique études suggèrent fortement que les perturbations chroniques du rythme circadien rythme augmente le risque de cancer du sein et cancer de la prostate dans les travailleurs de quarts, y compris les infirmières et les équipages de vol1,2,3. Ces résultats sont corroborés par des études sur les rongeurs, ce qui démontre que l’exposition aux cycles de lumière nuit ou lumière de lumière constante, qui imitent l’incidence des tumeurs au décalage augmentation et accélère la croissance de tumeur4,5. Basé sur des données issues des études humaines et rongeurs, le Centre International de recherche sur le Cancer a classé travail par quarts comme un carcinogène humain probable (Type 2 a) en 2010,6.

Auparavant, nous avons démontré qu’une dose unique de cancérogène de la tumeur mammaire spécifique comme agent cancérigène, N- nitroso-N- méthylurée (NMU), perturbé l’expression circadienne des principaux gènes circadiens (CGs) (p. ex., période 2 , Per2) et plusieurs circadienne contrôlée par gènes (NGCC), y compris les principales lésions de l’ADN réactive et réparer les gènes (DDRR) dans la glande mammaire de la cible (mais pas dans le foie). Réinitialisation de plus, l’expression circadienne des gènes Per2 et DDRR vers la normale par un régime chemopreventive de diététique L-méthyl-sélénocystéine (MSC) a réduit l’incidence de tumeur de 63 %. Ces résultats ont été les premiers à montrer un lien mécaniste entre rythme circadien, cancérogenèse chimique et chimioprévention7,8. Exposition aux autres toxiques environnementaux semblent perturber circadienne gene expression in vivo est également associée à un risque accru de maladies environnementales9,10. Comprendre les mécanismes qui lient la désorganisation circadienne de substances toxiques environnementales et la pathogenèse peut conduire à des approches mécaniste de la prévention des maladies. Toutefois, des études visant à définir les interactions entre les expositions et rythme circadien sont généralement effectués in vivo. Un typique en vivo expérience étudie que l’impact sur le rythme circadien nécessite un grand nombre d’animaux, comme le contrôlent de tissus provenant d’au moins trois et trois animaux exposés doivent être prélevés tous les 3-4 h sur une période de 24 ou 48 h. Développement d’un système validé in vitro qui récapitule en vivo observations et mécanismes serait donc non seulement de réduire le nombre d’animaux nécessaires, mais également considérablement réduire coûts expérimentales et l’exigence qui les chercheurs travaillent en permanence sur une période de 24 à 48 h. En outre, un système validé in vitro pourrait servir pour le criblage à haut débit des composés et/ou des altérations génétiques qui influent sur le rythme circadien, ou sa réponse aux facteurs de stress environnementaux ou de substances toxiques. Par conséquent, la combinaison stratégique de modèles in vitro et in vivo et expériences sont nécessaires pour obtenir différents points de vue avec une orientation différente.

Chez les mammifères, les oscillateurs circadiens existent non seulement dans les neurones spécialisés du SCN, mais aussi dans les types de cellules plus périphériques. Ces horloges moléculaires sont semblables à ceux dans les lignées cellulaires établies des fibroblastes et primaire fibroblastes d’embryons ou d’animaux adultes ; Cependant, il y a un besoin de tissu modèles cellulaires spécifiques au type11. Par conséquent, les études traditionnelles de l’activité locomotrice dans vivo, YVERT explants ex vivo, et basés sur les cellules in vitro tests dans les cellules de fibroblaste immortalisées sont largement utilisés pour étudier les cellules autonomes défauts circadiennes. Cependant, il n’y a aucune preuve indiquant qu’un dosage de cellulaire des fibroblastes in vitro peut récapituler les mécanismes circadiennes et réponses présent dans les cellules des autres organes périphériques en vivo. Différents types de cellules peuvent avoir des profils distincts de DDRR, métabolisme des xénobiotiques et l’expression des gènes, et les liens entre la toxicité et l’expression des gènes circadiens peuvent être de type cellulaire spécifique et/ou modulé par différents paramètres physiologiques. En outre, oscillateurs circadiens dans des systèmes axés sur les fibroblastes n'ont pas été dûment évalués de réponses aux substances toxiques environnementaux, les facteurs de stress et les agents préventifs qui relient les expositions à des mécanismes de prévention et de développement de la maladie. Ainsi, il y a un besoin spécifique de type cellulaire facile, validés et in vitro des épreuves bioluminescence pour étudier l’orgue spécifique environnement circadienne des perturbateurs. Bien qu’une variété de modèles d’horloge cellulaire (par exemple, dans le foie, les kératinocytes, cellules adipeuses, ainsi une lignée de cellules d’ostéosarcome) ont été développés au cours des dernières années12,13,14, 15, l’essai décrit ici est le premier modèle d’horloge cellulaire dans les cellules épithéliales mammaires et la première démonstration de récapituler en vivo réponses aux facteurs de stress environnementaux, substances toxiques, des médicaments et agents chimopréventifs.

Renilla luciférase (rLuc) et la luciférase firefly sont les protéines de monomère 30-61 kDa qui ne nécessitent pas de posttranslational de traitement à l’activité enzymatique et peuvent fonctionner comme un journaliste génétique dès sa traduction. Une fois que le substrat s’associe à l’enzyme luciférase, la réaction biochimique catalysée génère un éclair de lumière. Ainsi, les constructions de luciférase sont largement utilisées comme un gène expression journaliste système in vitro et in vivo. Toutefois, dans les études de rythme circadien, l’utilité du reporter de la luciférase est limitée par la demi-vie relativement longue de la protéine de la luciférase (T1/2 = 3,68 h) par rapport à la période (en particulier pour la courte période) pour les changements de rythme circadien gène expression ; Cependant, de nombreuses études au cours des années ont utilisé avec succès le gène de la luciférase dans le vecteur pGL3, indiquant que la luciférase rapidement dégradable n’est peut-être pas nécessaire pour la déclaration des rythmes circadiens, en particulier pour les rythmes avec une période plus longue, tels que 24h. Par conséquent, un plasmide de journaliste à l’aide de vecteur de la luciférase déstabilisé, pGL [Luc2Pcopié], qui contient des hPEST (une séquence de déstabilisation de protéine) a été développé, ce qui nous permet de l’utiliser comme un vecteur de rythme circadien reporter pour notre actuel in vitro test de bioluminescence. La protéine codée par Luc2P a une demi-vie beaucoup plus courte (T1/2 = 0,84 h) et donc, répond plus rapidement et avec une plus grande ampleur aux changements dans l’activité transcriptionnelle de type sauvage, j’aindicating qu’il peut être utilisé pour surveiller l’expression rythmique de la luciférase réglementé par le promoteur PER2 avec précision en temps réel16.

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Protocol

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1. construction du PER2 promoteur conduit de déstabilisé de Luciferase Reporter vecteur

  1. acheter un sur mesure en pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vecteur contenant l’ADNc codant pour la rLuc et l’homme Fragment de promoteur PER2 (hPER2P, 941 bp) sur le site entre le Sac j’ai et Hind III dans les multiples de la région clonage 17.
  2. Couper le fragment de promoteur PER2 humain (hPER2P, 941 bp) hors du vecteur. Tampon d’enzyme de restriction
    1. Ajouter 2,5 µL, 10 µL (180 ng) pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vecteur et 1 µL de chaque des enzymes de restriction, Sac I (10 unité/µL) et Hind III (10 unité/µL), dans un DNA/RNA/nucléotides libres tubes de microcentrifuge. Ajouter l’eau ultrapure (10,5 µL) jusqu'à 25 µL et mélanger doucement par pipetage.
    2. Incuber à 37 ° C pendant 90 min dans un bloc chauffant à.
    3. Exécuter l’intégralité du volume (25 µL) de la réaction de l’enzyme de restriction sur gel d’agarose de 0,7 % contenant 0,0001 % du bromure d’éthidium (EtBr) pour séparer le vecteur de la hPER2P.
      NOTE : Bromure d’éthidium, bromure de 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridinium (numéro d’enregistrement CAS : 1239-45-8), est un liquide inodore rouge. C’est un agent intercalant qui est couramment utilisé comme un fluorescent tag (tache acide nucléique) en gel d’agarose et visible comme une couleur orange sous la lumière ultraviolette. Les risques éventuels d’effets mutagènes irréversibles sont survenus chez des animaux de laboratoire, bien qu’aucun des organismes réglementaires il catégorisé comme un cancérogène 18. Donc, nous avons récolté agarose utilisé gel et électrophorèse tampon contenant du bromure d’éthidium parmi les déchets de risque chimique et a demandé à Rutgers Environmental Health & sécurité (REHS) pour ramasser et d’éliminer en toute sécurité.
    4. , Couper un morceau de gel d’agarose contenant une bande de fluorescence du bromure d’éthidium à 941 bp et purifier les fragments de hPER2P partir du gel avec un kit d’extraction de gel ADN, suivi de quantification sur un spectrophotomètre en mesurant la densité de l’absorption (do) à longueur d’onde de 260 nm.
  3. Linéariser 1,0 µL (1 µg) du vecteur d’expression luciférase firefly déstabilisé, pGL [Luc2P / Neo] avec la même méthode que décrite dans les étapes 1.2.1-1.2.2. Extraire le vecteur avec un kit de nettoyage ADN suivi de quantification comme décrit ci-dessus à l’aide d’un spectrophotomètre.
  4. Ligaturer le hPER2P dans la pGL vecteur linéarisé [Luc2P / Neo].
    NOTE : par le fabricant ' instruction de s, le rapport molaire idéal d’insertion et de vecteur est 2:1. Pour 50 vecteur ng, la quantité idéale de l’insert est calculée comme 23,6 ng avec un formule, vecteur de Ko [(50 ng vector x 1.0 kb insert)/4.242] x (1/2) = 23,6 ng insert]. Basé sur les concentrations de hPER2P (7,26 ng/µL) et pGL [Luc2P / Neo] (50 ng/µL), les volumes de 50 ng pGL [Luc2P / Neo] et 23,6 ng hPER2P sont calculées en 1 µL à 3,26 µL, respectivement. Réaction de
    1. Ajouter 2 µL T4 DNA ligase tampon (10 X) (Tris-HCl 50 mM, 10 mM MgCl 2, ATP 1 mM et 10 mM DTT), 3,26 µL (23,6 ng) hPER2P, 1 µL (50 ng) pGL [Luc2P / Neo], et 13.74 µL d’eau jusqu'à 20 µL , mélanger doucement.
    2. Ajouter ligase d’ADN T4 1 µL (400 unité/µL), mélanger doucement et laisser incuber à 16 ° C durant la nuit dans un thermocycleur et puis réfrigérer le vecteur ligaturé sur glace par le fabricant ' instruction de s.
  5. Transformer le pGL ligaturé vecteur [hPer2P / Luc2P / Neo] chimiquement compétent e. coli 19.
    1. Mettre le bain d’eau à 42 ° C, réchauffer de Super bouillon optimale avec support (S.O.C.) la répression catabolique (2 % Tryptone, 0,5 %, extrait de levure, 10 mM NaCl, KCl 2,5 mM, 10 mM MgCl 2, 10 mM MgSO 4 et 20 mM de glucose) à température ambiante , s’échauffer Luria-Bertani (LB) Gélose (contenant 100 µg/mL ampicilline, 80 µg/mL X-gal et 0,5 µM IPTG) dans incubateur à 37 ° C et dégel sur glace un flacon d' compétent e. coli cellules pour chaque transformation.
    2. Ajouter 6 µL (21 ng) ligaturé vecteur ou 1 µL (30 ng) vider le vecteur (témoin négatif) dans une éprouvette de chimiquement compétent e. coli (50 µL) et puis doucement retourner le tube pour mélanger. Incuber sur glace pendant 30 min.
    3. Chauffer le choc dans un bain-marie à 42 ° C pendant 30 s sans agitation et puis retour à Ice.
  6. Choisir une colonie d’e. coli transformée avec un vecteur ligaturé à l’aide de dépistage bleu/blanc.
    1. Ajouter 250 µL O.S.C. de milieu dans le transformé e. coli tube et il incuber pendant 1 heure à 37 ° C sous agitation à 200 tr/min.
    2. Répartir 10-50 µL de transformé e. coli sur la surface de la gélose LB. Mettre la plaque à l’envers dans incubateur à 37 ° C pendant la nuit.
      Remarque : Une réaction efficace de clonage devrait produire plusieurs colonies de centaines. Deux volumes différents de placage est recommandé pour s’assurer qu’au moins une plaque aura grand, clair blanc ou bleu et colonies bien espacées. Lorsque les colonies sont trop petits et la couleur ne se distingue pas, à l’aide d’un microscope (10 X ou 50 X) est utile.
    3. Pick 3-6 colonies blanches des plaques avec des bâtons de dent stérilisé et libérer chaque colonie en tube à une culture contenant 4 mL de milieu de culture LB avec de l’ampicilline 50 µg/mL.
    4. Incuber les tubes à 37 ° C sous agitation à 200 tr/min pendant la nuit. Extraire l’ADN à l’aide de 2 mL de 4 mL de la culture d’e. coli avec un plasmide DNA extraction mini préparation kit par le fabricant ' instruction s.
  7. Vérifier et analyser l’insert (hPER2P, 941 bp)
    1. digérer l’ADN de plasmide avec des enzymes de restriction et exécutez électrophorèse comme décrit dans les étapes 1.2.1-1.2.3 pour confirmer s’il y a un encart.
      Remarque : Contrôle positif (hPER2P purifié à l’étape 1.2.4) et le contrôle négatif (Escherichia coli transformé avec un vecteur vide) ont été incluses.
    2. Séquencer l’ADN de plasmide sélectionnés à l’aide de M13 forward et M13 reverse amorces pour confirmer l’orientation et la séquence de l’insert dans le plasmide 19.
      Remarque : Seule colonie qui avait un encart avec la bonne taille de hPER2P en électrophorèse et une orientation correcte et la séquence dans le résultat de séquençage a été sélectionnée.
    3. Analyser le fragment de promoteur PER2 humain (hPER2P, 941 bp) séquence pour les éléments de régulation circadiennes, y compris le motif de l’armoire (site de la liaison Bmal1, CAT/CGTG), CCAATC, boîte de GC et transcription démarrer le site (CAGCGG) 20.
  8. Amplifier la certains e. coli en ajoutant le reste 2 mL cultivé e. coli dans 200 mL LB milieu de culture contenant 50 ampicilline µg/mL et ensuite l’incubation pendant une nuit à 37 ° C sous agitation à 200 tr/min.
  9. ADN extrait avec un maxi de plasmide exempte d’endotoxine prép. kit par le fabricant ' instruction de s et ensuite de le quantifier en mesurant OD à longueur d’onde de 260 nm avec un spectrophotomètre. Aliquote et stocker l’ADN de plasmide, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo], au congélateur-80 ° C pour une utilisation future.

2. Transfection transitoire

  1. achat et de la culture de cellules MCF10A
    1. achat une immortalisées, non transformées normal mammaire épithéliale lignée cellulaire humaine (MCF10A) d’un commercial Banque de cellules, où les cellules sont cytogénétiquement testé et authentifié avec court répété en tandem analyse avant la congélation. Décongeler et maintenir chaque flacon de cellules congelées dans la culture pour un maximum de 8 semaines.
      Remarque : Contrairement aux autres cellules, ces cellules ont une inhibition de contact une fois qu’ils arrivent à la confluence d’environ 70 %. Elle exige cette sous-culture se déroule à environ 70 %.
    2. Culture des cellules avec milieu de culture de cellules épithéliales mammaires (MEGM), contenant le milieu basal épithélial mammaire (MEBM), les suppléments de croissance et la toxine cholérique dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C, humidité de 95 % et 5 % de CO 2.
      NOTE : Acheter prêt à l’emploi des facteurs de croissance fournies dans SingleQuot (SQ) et obtenir la toxine cholérique séparément. La concentration finale de suppléments de croissance est extrait pituitaire bovine de 0,4 %, 0,1 % d’insuline, hydrocortisone de 0,1 %, 0,1 % des facteurs de croissance épidermiques humains, 100 ng/mL de toxine de choléra et 0,05 % sulfate de gentamicine et 0.05 % amphotéricine B.
    3. Se dissocient les cellules de 10 cm de Petri par incubation avec 10 mL de trypsine/EDTA pour ~ 20 min et puis neutraliser la trypsine en ajoutant la trypsine 10 mL, solution de neutralisation. Recueillir toutes les cellules avec HEPES tamponnée de solution saline (HBSS).
    4. Compter les cellules avec un hémocytomètre sous un microscope inversé et calculer la concentration de la suspension cellulaire unique graine puis un certain nombre de cellules que nécessaire. Agiter les plaques soigneusement pour obtenir une répartition uniforme des cellules dans chaque assiette. Incuber les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 ° C, humidité de 95 % et 5 % de CO 2.
      Remarque : Acheter un pack de réactif de sous-culture contenant la trypsine/EDTA, solution neutralisante de la trypsine et HBSS utiliser.
  2. Transfection transitoire des cellules avec le vecteur circadiens construit.
    1. Graines 2 x 10 5 MCF10A cellules uniformément dans la culture de 35 mm plat avec MEGM et poussent à la confluence de 20 à 30 % (le lendemain).
    2. Médias sérum
    3. warm up réduites (par exemple, Opti-MEM) à 37 ° C eau bain et transfection réactif à température ambiante pendant 30 min. diluer le plasmid DNA construit (pGL [hPer2P / Luc2P / Neo]) à 30 ng/µL avec endo-toxine gratuite Tampon Tris-EDTA (TE) et gardez à température ambiante.
    4. Préparer le mélange de transfection de plasmide dans un tube de microtubes de 1,5 mL par ajout de médias de sérum réduit chaud 63,6 µL tout d’abord, puis en ajoutant 33,4 µL (0,1 µg) ADN plasmidique et mélanger doucement en pipettant également, puis enfin 3 µL de transfection réactif directement dans le centre du tube sans toucher le mur. Après le mélange doucement en pipettant également, conserver à température ambiante pendant 30 min.
    5. Déposer le mélange de plasmide entier (100 µL) directement sur la surface du centre du milieu de la plaque, puis mélanger doucement en agitant le plat. La culture des cellules dans un incubateur à CO 2 pour supplémentaire 48-72 h.
      Remarque : Il est prédit que la plus grande efficacité de transfection serait au confluent de 40 à 70 % de ces cellules en raison de leur inhibition de contact à ~ 70 %. Par conséquent, transfection fonctionne mieux à partir de ~ 20 % et s’arrêter à ~ 70 % confluent.

3. Mise en place de l’essai de Bioluminescence In Vitro dans les cellules de MCF10A à transfectées transitoirement

  1. affamer les cellules cultivées à confluence d’environ 70 % (après la transfection pendant 48 à 72 h) pour MEBM sans facteurs de croissance pendant 24 h.
  2. Traiter les cellules avec l’agent de synchronisation (par exemple, 50 % de sérum de cheval (HS)) en MEBM pour 1,5 h dans un incubateur à CO 2.
    Remarque : Pour la sélection d’un agent de synchronisation idéale, 10 µM forskoline, 1 nM mélatonine, dexaméthasone 0.1 µM, 50 % HS et 100 % SQ ont été comparées en termes d’amplitude circadienne et période dans les cellules de rythme circadien vecteur transfectée. Vecteur vide transfecté des cellules sont traitées avec 100 % SQ comme témoin négatif.
  3. Pre-prepare 20 mL support (pour 10 sur les récipients de culture de 30 mm) en ajoutant 5 mL de MEGM, 15 mL de MEBM, 150 µL de bicarbonate de sodium, 200 µL HEPES et luciférine de 40 µL de solution (50 mM) dans un tube à centrifuger 50 mL stérilisé mère.
    Remarque : Les concentrations finales de chaque composants : 20 % SQ et 20 ng/mL de toxine de choléra, bicarbonate de sodium 0,06 %, 1 % pénicilline/streptomycine et 10 mM HEPES. Faire chauffer préalablement préparés, support d’enregistrement et stérilisé 1 x PBS pendant 30 min au bain-marie à 37 ° C. Ajouter 100 luciférine µM immédiatement avant l’emploi.
  4. Laver les cellules avec chaud 1 x Dulbecco ' s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) pour 3 fois après l’incubation avec l’agent de synchronisation et puis ajouter 2 mL de support d’enregistrement.
  5. Joint le plat avec une classe de couverture stérilisé à l’aide de graisse silicone pour éviter l’évaporation et l’étiquette puis sur le côté.
  6. Placer la capsule scellée dans le siège à l’intérieur le luminomètre et activez l’option pour enregistrer l’emplacement du fichier dans le dossier (pour le détail, voir la section 6).

4. Sélection de manière stable des cellules transfectées

  1. optimiser une concentration idéale de G418 (800 µg/mL) avec un test de courbe de tuer selon le fabricant ' instruction de s pour la sélection des cellules transfectées stablement.
  2. Après transfection transitoire pendant 48 h ou 72 h, sous-culture et graines les cellules avec MEGM dans les plus grands plats à 5 000 cellules/plat (100 mm). Après 24h, la culture dans l’incubateur de culture cellulaire (37 ° C, humidité de 95 % et 5 % CO 2), traiter les cellules avec 800 µg/mL de G418 en remplaçant le milieu ancien par nouveau média contenant 800 µg/mL G418 tous les 3-4 jours pour 2 semaines.
  3. Sous-culture survivant stablement transfected colonies pour 1 à 3 passages avec MEGM contenant 500µg/mL G418 à maintenir l’expression stable d’hPer2P/Luc2P et congélation dans l’azote liquide pour une utilisation future.
  4. Traiter 500µg/mL G418 après une sous-culture générale à sélectionner à nouveau la population stablement transfectée des cellules, si l’intensité de bioluminescence dans le résultat de l’essai in vitro bioluminescence avec diminue progressivement après utilisation dans nombreux passages.

5. Traitement avec des produits chimiques

  1. à 48 h ou 72 h après la transfection, mourir de faim les cellules de facteurs de croissance dans MEBM pendant 24 h.
  2. Après la synchronisation avec 50 % HS pendant 2 h, traiter les cellules avec 0,25 ou 0,5 mM nitrosomethylurea (NMU), 20 nM EX527 ou cambinol de 1 µM dans MEBM contenant 20 % pendant 1 heure SQ.
  3. Après le lavage avec 1 x D-PBS, ajouter enregistrement moyen contenant 12,5 µM MSC, seuls ou en combinaison avec 20 nM EX527 ou cambinol de 1 µM, aux cellules. Surveillance de la bioluminescence avec le luminomètre.
  4. Traiter les MCF10A stablement transfectées / PER2-dLuc cellules avec NMU à 0,5, 1 ou 2 mM, EX527 à 40 nM, ou Cambinol à 2,0 µM, pendant 1 h après la synchronisation avec 50 % HS et puis incuber les cellules dans l’enregistrement moyen contenant 12,5 µM du SMC ou différentes doses (5, 10 ou 20 µM) de n-acétylcystéine (NAC). Placer les plaques dans le luminomètre, enregistrement et enregistrez la bioluminescence par luminomètre pour 4-8 jours tel que décrit à la section 3.6.
    NOTE : NMU est une nitrosourée méthylée composée ayant des propriétés mutagènes, tératogènes et cancérigènes. NMU est un agent alkylant action directe et a une demi-vie courte (T 1/2 = ~ 30 min). Il est stable dans des conditions acides (pH 4-5), mais instable, dans des conditions alcalines (pH 9 et 10) et à des températures au-delà de 20 ° C. Par conséquent, eau de Javel à 10 % peut être utilisé comme un agent désactivant efficace pour le nettoyage des surfaces de banc et de marchandises de laboratoire potentiellement contaminées par NMU solutisur. Solution mère reste est ramassés et éliminée en toute sécurité par REHS. Selon le mode d’action des produits chimiques, cellules synchrones peuvent être traitées pour des temps plus courts avant mise en culture dans un support d’enregistrement. Les cellules peuvent également être traitées dans le support d’enregistrement pendant une longue période (plusieurs jours).

6. Collecte de données, analyse et présentation

Remarque : la viabilité cellulaire doit être déterminée à l’aide de méthodes standard (par exemple, le test MTT) après traitement des cellules aux mêmes concentrations pour les mêmes délais indiqués. Toutes les concentrations de traitement utilisées dans le test de bioluminescence in vitro étaient inférieures à la concentration létale de 30 % (LC30). Toutes les expériences ont été menées en trois exemplaires et ont été présentés les résultats représentatifs.

  1. Après avoir scellé le plat (étape 3.5), charger la vaisselle sur les sièges dans le luminomètre, qui est conservé à l’intérieur d’un incubateur à 37 ° C sans H 2 O et CO 2 et connecté à un ordinateur.
  2. Click " enregistrer " et entrez le nom du dossier et le dossier où sera enregistré le signal enregistré luminescence de la capsule correspondante.
    Remarque : Le système détecte le signal de luminescence en temps réel à partir des cellules dans le plat à différentes positions. Les signaux sont transférées vers l’ordinateur par le biais de comptage de photons-4 tubes photomultiplicateurs et enregistrés et affichés par le logiciel de collecte de données dans l’ordinateur.
  3. Analyser les signaux après avoir enregistré pendant 4 à 7 jours, ce qui pourrait être suivie de changement médiatique et d’enregistrement continu pour une deuxième semaine si nécessaire.
    Remarque : Pour obtenir les paramètres circadiennes, y compris la phase, la longueur de la période, amplitude de rythme et d’amortissement taux, nous avons utilisé le logiciel d’analyse luminomètre pour analyser les données de bioluminescence.
  4. Detrend données brutes avec une moyenne en cours d’exécution et d’analyser le meilleur-s’adapte à une sinusoïde pour obtenir la période, phase, amplitude et amortissement taux 21 , 22.
  5. En raison de la bioluminescence transitoire haute sur le traitement et le changement moyen, exclure le premier cycle de données analyse.
  6. Pour la présentation des données, tracer des données brutes (bioluminescence, comte/s) contre la montre (h ou journée). Lorsque cela est nécessaire, soustraite à la base de données peuvent être tracées à comparer l’amplitude et la phase.

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Representative Results

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Vecteur de journaliste circadienne bioluminescence : PER2 pilotée par le promoteur l’expression humaine de la variante de la luciférase déstabilisé

La séquence d’ADN contenant un fragment de bp 941 dérivé du promoteur PER2 humain utilisé pour construire le vecteur journaliste circadienne, pGL [hPer2P/Luc2Pcopié, a été tout d’abord analysé la présence d’éléments régulateurs connus pour réguler expression des gènes circadiens. Analyse bioinformatique a montré que dans ce fragment de promoteur, il y a trois différents sites de liaison de Bmal1 (E-box) (CAT/CGTG), deux sites de renforcement de transcription circadienne (CCAATG), deux boîtes de GC et un site d’initiation de transcription (Figure 1). D'où il s’attendait à ce vecteur de journaliste pour refléter l’expression des gènes circadiens.

Optimisation de l’agent de synchronisation

Plusieurs agents ont été utilisés pour synchroniser ou d’influer sur le rythme circadien autonome de cellules fibroblastes pour des études in vitro bioluminescence. Pour sélectionner un agent de synchronisation spécifique de type cellulaire efficace et rentable dans les cellules épithéliales mammaires, nous avons comparé les 10 µM forskoline, 1 nM mélatonine, dexaméthasone 0.1 µM, 50 % HS et 100 % SQ dans les cellules épithéliales mammaires (MCF10A) transfectées de manière transitoire avec le vecteur de la journaliste circadienne. Cellules synchronisés avec 50 % HS a montré le meilleur rythme circadien, avec 3 sommets du rythme circadien induit par luminescence, par rapport à un ou deux pics dans les cellules synchronisés avec d’autres agents. En outre, les profils de la bioluminescence des cellules synchronisés avec 50 % HS produit délai acceptable, l’amplitude et la valeur ajustée au cours de l’analyse de données (Figure 2). Se fondant sur ces constatations, nous avons choisi cette méthode rentable comme l’agent de synchronisation de cellule pour toutes les expériences ultérieures.

Perturbation et restauration du cellulaire rythme circadien de l’exposition aux produits chimiques

Ce modèle in vitro , les cellules transfectées transitoirement non traitées (groupe témoin) a montré au moins deux cycles complets de la luminescence de signalisation après la synchronisation (Figure 3 a). Les cellules exposées à l’action directe mutagène, NMU, ont montré une perturbation dose-dépendante de l’expression des gènes circadiens comme en témoigne la perte des pics de luminescence. Alors que le traitement avec 0,25 mM NMU ne pas perturber le rythme circadien cellulaire, une dose de 0,5 mM NMU au départ retardé et plus tard supprimé rythme circadien, comme en témoigne la disparition du deuxième pic de luminescence au post-traitement ~ 72 h. Inhibition de l’activité de SIRT1 avec 20 nM Ex257 ou 1 µM cambinol perturbée de même rythme circadien par amortissement du cycle circadien suivant (Figure 3 a-1). Ce qui est important, l’ajout de MSC (12,5 µM) au milieu de culture restauré vers normales premier et second cycles circadiens d’expression de gène dans les cellules traitées NMU. MSC non seulement rétabli le rythme perturbé par NMU, mais aussi les effets perturbateurs de SIRT1 inhibiteurs, Ex257 et cambinol (Figure 3 a-2).

Dans les cellules transfectées de façon stable, NMU tant SIRT1 inhibiteurs perturbé le rythme circadien, mais à des concentrations supérieures à celle observée chez les transfectants transitoire (Figure 3 b-1). MSC (12,5 µM) restauré les rythmes circadiens dans les cellules pré-traitées avec 1 mM NMU (Figure 3 b-2). Plus important encore, MSC a également restauré les rythmes circadiens dans les cellules traitées avec des inhibiteurs de SIRT1, y compris EX257 (40 nM) (Figure 3 b-3) et cambinol (2 µM) (Figure 3 b(4)), respectivement.

Comparaison entre les figures 3 a et 3 b de la Figure, l’intensité de la bioluminescence était beaucoup plus élevée, mais le rythme a été maintenu pour une durée plus courte dans les cellules transfectées transitoirement vs stablement transfected des cellules (~ 10 fois supérieure, 2 fois plus courte) en en général, même après un traitement des cellules avec NMU ou MSC. En outre, le rythme circadien cellulaire était 2 fois plus sensible à l’exposition aux substances chimiques dans les cellules transfectées transitoirement par rapport aux cellules transfectées de façon stable.

Changement quantitatif de dose-dépendante du cellulaire rythme circadien par des produits chimiques

De même, le rythme circadien cellulaire perturbé les cellules transfectées de façon stable traités avec 1 mM NMU fut restaurée par le traitement de la NAC de manière dose-dépendante (0-20 µM) (Figure 4 a) tel qu’observé dans les changements de la période circadienne (Figure 4 b ) et phase (Figure 4).

Figure 1
Figure 1 : Séquence du fragment du promoteur PER2 humains et le vecteur de journaliste circadienne. (A) humaine PER2 fragment de promoteur (941 bp) a été séquencé, et la séquence a été analysée pour les éléments du promoteur circadienne fonctionnelle. E-box, CACGTT / CATGTG ; rythme circadienne transcription améliorer le site, CCAATG ; Boîte de GC, CGCCCC / GGGGCGGG ; transcription à partir de site (TSS) : CAGCGG. Schéma de principe (B) du vecteur de rapporteur luciférase déstabilisé, pGL [hPer2P/Luc2Pcopié]. La transcription de la luciférase déstabilisé (dLuc) est sous le contrôle direct du promoteur hPER2 . Un gène de résistance exprimée conjointement néomycine (Neo) facilite la sélection des cellules infectées par G418. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : synchronisation de in vitro circadien cellulaire par des agents de synchronisation différents. Après la famine de 24h, MCF10A les cellules transfectées de manière transitoire par vecteur circadienne journaliste ont été traités avec chaque agent de synchronisation pendant 2 h, puis en enregistrant le signal de la luminescence. Bleu, 10 µM forskoline ; rouge, la 1 mélatonine nM ; vert, 0.1 dexaméthasone µM ; violet ; 50 % de sérum de cheval (HS) ; Teal, 100 % SingleQuot (SQ) ; vector jaune, vide (témoin négatif). Axe des abscisses, temps (jour) ; Axe des ordonnées, bioluminescence (comte/min). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.


Figure 3 : MSC restauré les rythmes circadiens cellulaires perturbées par des inhibiteurs NMU et SIRT1 dans les cellules épithéliales mammaires in vitro. Analyses de bioluminescence ont été effectuées sur MCF10A / journalistePER2-dLuc cellules après synchronisation avec 50 % HS. Axe des abscisses, temps (h) (temps de traitement post-NMU) ; Axe des ordonnées, bioluminescence (comte/min). (A) résultats des cellules transfectées transitoirement. (1) cellules ont été traitées avec 0, 0,25 ou 0,5 mM NMU, 20 nM EX527 ou 1 µM cambinol pendant 1 h après la synchronisation. Jaune : contrôle ; rouge : 0,25 mM NMU ; vert : 0,5 mM NMU ; bleu : 20 nM EX527 ; vert jaune : cambinol 1µM. (2) les cellules ont été traitées avec 12,5 µM MSC seul ou en combinaison avec 20 nM EX527 ou cambinol de 1 µM dans l’enregistrement moyenne après une exposition à 0,5 mM NMU. Jaune : Contrôle ; rouge : 0,25 mM NMU ; vert : 0,5 mM NMU ; bleu : 0,5 mM NMU + 12,5 µM MSC ; vert jaune : 0,5 mM NMU + 12,5 µM MSC + 20 nM EX527 ; Violet : 0,5 mM NMU + 12,5 µM MSC + cambinol 1 µM. (B) résultats des cellules transfectées de façon stable. Le 3rd- 5 pics deth qui a montré des différences entre les groupes propres et claires sont présentés comme un résultat représentatif. (1) cellules ont été traitées avec 0, 0,5, 1,0 ou 2,0 mM NMU, 40 nM EX527 ou cambinol de 2 µM pendant 1 h après la synchronisation. Jaune : Contrôle ; rouge : 0,5 mM NMU ; vert : 1,0 mM NMU ; bleu : 2,0 mM NMU ; vert jaune : 40 nM EX527 ; Violet : 2 µM cambinol. (2) cellules ont été traitées avec 12,5 µM MSC en moyenne après une exposition à 1,0 mM NMU d’enregistrement. Jaune : Contrôle ; rouge : 1,0 mM NMU ; vert : 1,0 mM NMU + 12,5 µM MSC. (3) cellules ont été traitées par suit de MSC 12,5 µM exposition à 40 nM EX257. Jaune : Contrôle ; rouge : 40 nM EX257 ; vert : 40 nM EX257 + 12,5 µM MSC. (4) cellules ont été traitées par suit de MSC 12,5 µM exposition à 2 µM cambinol. Jaune : Contrôle ; rouge : 2 µM cambinol ; vert : 2 µM cambinol + 25 µM MSC. Ce résultat a été signalé précédemment et est sous licence CC par 2.022. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : restauré du CNA manière dose-dépendante du rythme circadien cellulaire perturbé par NMU. Cellules ont été traitées avec 1,0 mM NMU ou la maîtrise du véhicule pendant 1 h après la synchronisation. (A) résultat représentatif de la bioluminescence (comte/min) contre la montre (h). Jaune : Contrôle ; rouge : 1,0 mM NMU ; vert : 1,0 mM NMU, 5 µM du CNA ; bleu : 1,0 mM NMU, 10 µM du CNA ; vert jaune : 1,0 mM NMU, 20 µM du CNA. (B) durée (heures). (C) Phase (heures). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

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Dans les cellules de mammifères, périodicité de l’horloge circadienne est régulée par des boucles de rétroaction transcriptionnelle/translationnelle interconnectés. Hétérodimères de Bmal1 et horloge ou Npas2 réglementer circadienne transcription en se liant à des éléments d’armoire dans les promoteurs de base CGs, y compris nombreux NGCC4 Per2 et cri. Comme ils s’accumulent dans la cellule, hétérodimères de par : cri sont sera modifié et transportés vers le noyau pour réprimer l’activité transcriptionnelle horloge : Bmal1. Cette boucle de rétroaction négative permet de base CGs à réglementer leur propre transcription et mettre en place l’expression rythmique de CGs et le NGCC23. Bien que les cellules de mammifères plus ont une horloge circadienne intrinsèque, les horloges dans des cellules individuelles peuvent être synchronisés par les deux conditions intrinsèques (par exemple, le potentiel d’oxydoréduction) et stimuli de l’environnement externe24. Circadien gene expression in vivo peuvent être synchronisées de mélatonine, une hormone produite par la glande pinéale en réponse aux signaux reçus du stimulateur central (SCN). Le RCS intègre les signaux de lumière empiétant sur spécialisés exprimant le melanospin des cellules ganglionnaires rétiniennes photosensible de la rétine. Mélatonine, libérée de la glande pinéale entre dans la circulation et régule le rythme circadien de la SCN et périphérique de la plupart des cellules in vitro et in vivo25,26. Rythme circadien peut également être réglé par stress hormones (p. ex., cortisol et catécholamines)27,28 et facteurs de croissance29,30. Déréglementation des facteurs de croissance est connue pour être associé avec une interruption circadienne des cellules de croissance et la différenciation31.

Le vecteur de rythme circadien journaliste que nous avons construit exploite ce mécanisme négatif de rétroaction biochimiques. La boucle de contre-réaction circadienne core se compose de transcriptionnelles activateurs, BMAL1 et horloge, qui se lient aux circadiennes motifs de liaison E´/armoire PER2 promoteur et répresseurs PERs et CRYs, qui régulent négativement l’expression de BMAL1. Dans le système actuel de journaliste, l’activation rythmique du promoteur PER2 par BMAL1 et horloge facilite l’expression rythme circadienne de la luciférase déstabilisé, ce qui permet une périodicité circadienne plus précise des signaux de luminescence. La construction d’un plasmide de journaliste comprend l’accepteur BMAL1, le site amélioration du rythme circadien, boîte de GC et le site de début de transcription du promoteur hPER2 . Le vecteur permet l’affichage en temps réel pour cellulaire autonome rythme circadien dans les cellules transfectées et peut être utilisé pour identifier des conditions ou des agents spécifiques qui modifient ce modèle circadien endogène de l’expression génique. Toutefois, lorsque les cellules sont cultivées in vitro ou ex vivo, leurs oscillateurs circadiens rapidement devient désynchronisées. Il est donc nécessaire de resynchroniser leurs rythmes avant n’importe quel rythme circadiens essais peuvent être effectués in vitro. Dans les cellules épithéliales mammaires, nous avons constaté que 50 % HS, mélatonine et 100 % SQ étaient chacun capable d’induire une synchronisation efficace du rythme circadien in vitro. Dexaméthasone et la forskoline produisent uniquement une synchronisation partielle. Dose-dépendante des tests seraient nécessaires pour le développement et la sélection de nouveaux agents de synchronisation dans de futures études. Compte tenu de l’efficacité à faible coût et son utilisation large comme l’agent de synchronisation, 50 % HS s’est avéré pour être un agent de synchronisation efficace qui produit robuste et reproductible cellulaire rythme circadien dans les cellules épithéliales mammaires et neuronaux de cellules, comme précédemment signalé dans d’autres types de cellules et les différents paramètres expérimentaux24.

Pour valider le modèle in vitro de régulation circadienne, nous avons ensuite demandé que si la réponse du rythme circadien aux facteurs de stress environnementaux in vitro serait récapituler les effets nous avons observé in vivo. Auparavant, nous avons démontré qu’une dose unique de cancérogène de NMU perturbé l’expression circadienne des CGs majeurs (p. ex., Per2) et plusieurs NGCC dans la glande mammaire de la cible. En outre, un régime chemopreventive du SMC réinitialise l’expression circadienne des gènes Per2 et NGCC vers la normale. Nous avons démontré plus loin que l’exposition des cellules à des substances toxiques et de facteurs de stress peuvent modifier l’expression des gènes circadiens par leurs effets sur le NAD+-dépendant SIRT1 activité7,8,22. Les résultats obtenus avec le test journaliste circadienne in vitro ont montré que l’exposition à NMU provoqué la désintégration de l’expression génique circadienne cellulaire, et que plus intéressant encore, MSC est non seulement en mesure de réinitialiser le rythme circadien cellulaire perturbée par NMU, mais également de réinitialiser le rythme circadien, perturbé par les inhibiteurs de SIRT1. Ces résultats indiquent que le test in vitro non seulement reproduit les effets de NMU sur l’expression des gènes circadiens, mais également reproduit les effets du SMC sur le rythme circadien perturbé in vivo par l’intermédiaire de mécanismes dépendant de SIRT1. Le système de rythme circadien journaliste in vitro a donc le potentiel pour détecter une variété de substances toxiques et de facteurs de stress qui modifient les niveaux de NAD+/NADH dans la cellule, y compris les inhibiteurs directs et modulateurs d’oxydoréduction cellulaire cyclisme ainsi que génotoxique les agents qui peuvent épuiser NAD+ via Poly ADP-ribose ADN dépendante de réparation32. Ces résultats suggèrent que le système in vitro fournit un outil utile à l’écran pour les conditions de la cellule et des agents chimiques qui peuvent perturber ou restaurer les gènes circadiens règlement in vivo.

Bien que l’essai in vitro peut être configuré à l’aide de cellules transitoirement ou stablement transfectés avec la construction de la journaliste, certaines différences ont été observées dans la réponse au traitement des produits chimiques entre les cellules transfectées transitoirement et stablement. Les cellules transfectées de façon stable étaient plus résistants au traitement des produits chimiques, en particulier les inhibiteurs NMU et SIRT1, que les cellules transfectées transitoirement. Ces différences pourraient refléter des différences subtiles dans le règlement du promoteur vector dans transfectants stables en raison de l’influence des séquences autour des sites spécifiques d’intégration. Par conséquent, sélection de transfectants stables par un traitement antibiotique peut également choisir de clones qui résistent mieux aux perturbations circadiennes. Ainsi, individuels en vitro modèles cellulaires à l’aide de transfectants stables passagère ou sans importance doivent être validés pour leur capacité à récapituler dans vivo réponses. Méthodes de transfection différentes induisent également différents niveaux de stress génotoxique et toxicité sur les cellules et résultat dans leur sensibilité différente aux effets toxiques des produits chimiques. Expériences de test et pilote de cytotoxicité sont donc nécessaires pour la sélection des conditions de traitement et de transfection. Malgré la différence de leur sensibilité, les résultats globaux obtenus avec nos cellules journaliste circadienne épithéliales mammaires de perturbation et de restauration du cellulaire rythme circadien par les produits chimiques étaient cohérentes et comparables entre transitoirement des cellules transfectées et stablement transfectées, ainsi que les résultats récapitulaient les effets que nous avons observé in vivo.

Pour déterminer si le vecteur de rythme circadien journaliste pourrait être utilisé dans d’autres types de cellules, cellules de glioblastome humain/astrocytome (U-87 MG) ont été stablement transfectées avec le vecteur de ce rythme circadien. Les résultats préliminaires, le test de bioluminescence cellulaire in vitro ont montré qu’après la synchronisation, ces cellules neuronales dérivées de tumeurs ont un régulière et fort cellulaire rythme circadien comparable à celle observée chez l’homme mammaire cellules épithéliales. Les cellules traitées avec IC261, un inhibiteur bien connu de la caséine kinase 1 δ (CK1δ) et CK1 ε, a montré une longue période circadienne, mais plus faible amplitude comme b déclaréy autres (données non présentées)33. Ces résultats indiquent que le rythme circadien journaliste vector et in vitro bioluminescence cellulaire de luciferase sont applicables dans les autres cellules spécifiques de l’organe, y compris les cellules nerveuses.

Le système cellulaire journaliste développé ici pourrait donc servir largement un dosage in vitro pour la détermination de l’expression des gènes circadiens dans différents types de cellules en général. La procédure expérimentale est simple, rapide et sécuritaire. Cependant, ce système cellulaire ne peut pas être facilement adapté dans les cellules qui sont difficiles à transfecter, non de Division des cellules (par exemple, les cellules neuronales), car ils ont des rendements de transfection notoirement faible. Méthodes de transfection de base de virus (p. ex., transfection de lentivirus) peuvent offrir une solution de rendement plus élevée pour ces cellules34. Cependant, le temps et les difficultés associées à la production des gènes rend cette méthode longue et difficile. En outre, un laboratoire de niveau de sécurité adéquat est nécessaire pour la production et l’utilisation du virus. En outre, détecteurs de luminescence de cellule unique haute résolution pourraient servir pour la détermination des rythmes persistants, phases indépendamment de l’expression des gènes circadiens en divisant les cellules35.

Études des rythme circadien chez les mammifères in vivo sont non seulement du travail intensif et coûteux, mais ils nécessitent aussi l’utilisation d’un grand nombre d’animaux. La disponibilité des systèmes d’in vitro pourrait réduire sensiblement le nombre d’animaux requis pour tester les associations entre la perturbation de l’expression génique de rythme circadien et le développement des maladies chroniques, y compris de la cancérogenèse et métabolique syndrome. Données quantitatives sur les paramètres circadiennes, y compris la période, amplitude et phase, peuvent informer dose - et/ou des effets temporels des produits chimiques sur cellulaire de rythme circadien. Par exemple, nous avons observé cet antioxydant que NAC peut restaurer manière dose-dépendante de la période et la phase des cellulaire rythme circadien perturbée par NMU. Le modèle in vitro pourrait également servir d’écran et de classer environnementales endocriniens circadiennes et d’étudier l’impact du perturbé rythme circadien sur l’altération de la fonction cellulaire, fournissant des perspicacités mécanistes pour le développement de stratégies d’intervention pour les cohortes à un risque accru de cancer du sein, syndromes métaboliques et troubles neurophysiologiques, en raison des horaires de travail anormales.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la société de toxicologie du 2012 (SOT)-Colgate Palmolive Grant pour la recherche alternative (M. Fang) et la recherche de collaboration internationale fonds de Animal and Plant quarantaine Agency, République de Corée (M. Fang), et accorde le du NIEHS P30ES005022 (H. Zarbl). Nous tenons à remercier le Dr Zheng Chen (McGovern Medical School de l’Université du Texas Health Science Center à Houston) pour son exposé utile, M. Juan de Shao-An pour son aide expérimentale et Mme Kimi Nakata pour sa relecture.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector SwitchGear Genomics S700000 customized vector
pGL4.18[Luc2P/Neo] vector Promega 9PIE673 destabilized luciferase expression vector
T4 DNA ligase Invitrogen 15224041 For subcloning
TOPO TA cloning kit Invitrogen K4500-02 with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli
Sac I New England BioLabs R0156S Restriction enzyme
Hind III-HF New England BioLabs R3104S Restriction enzyme
CutSmart buffer New England BioLabs B7204S Restriction enzyme buffer
DNA gel extraction kit Qiagen 28704 Purify DNA fragments from agarose gel
PCR Purification Kit Qiagen 28104 DNA clean up
LB Miller's modification TEKNOVA L8600 For transformed E. Coli culture
LB Agar Plate TEKNOVA L1902 For white/blue selection
QIAprep spin miniprep Kit Qiagen 27104 For extraction of plasmide DNA
EndoFree plasmid maxi prep Kit Qiagen 12362 For extraction of plasmide DNA
FuGene HD Promega E2311 Transfection reagent
Opti-MEM reduced serum medium Invitrogen 31985-062 For transfection
MCF10A cell line American Type Culture Collection CRL-10317 Mammary Epithelial Cells
MEGM BulletKit Lonza CC-3150 Mammary Epithelial Growth Medium
MEBM Lonza CC-3151 Mammary Epithelial Basal Medium
MEGM SingleQuot Kit Lonza CC-4136 Suppliments & Growth Factors
ReagentPack Lonza CC-5034 Reagent for subculture
D-PBS (10X) Sigma D1408 Wash cells in culture dishes
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977 Dilute 10X D-PBS
Tissue culture dish (35 mm) BD/Falcon 353001 cell culture dish suitable to LumiCycle
Silicon grease Fisher NC9044707 For sealing dish with recording medium
Round cover glass Harvard Bioscience 64-1500 (CS-40R) For sealing dish with recording medium
Cholera toxin Sigma C8052 Supplement for growth medium
G418 sulfate (Geniticin) Invitrogen 10131035 Antibiotic for selection of stabliy transfected cells
Ampicillin Sigma A9393 For colony selection
Forskolin Sigma F6886 Synchronization agent
Melatonin Sigma M5250 Synchronization agent
Dexamethasone Sigma D4902 Synchronization agent
Horse serum Sigma H1138 Synchronization agent
d-Luciferin, sodium salt Invitrogen L2912 Luciferase substrate
IC261 Sigma 10658 Positive control for circadian disruptor
Methylnitrosourea (NMU) Sigma N1517 Mammary specific carcinogen
Methylselenocysteine (MSC) Sigma M6680 Organic selenium (chemopreventive agent)
EX527 Sigma E7034 SIRT1 specific inhibitor
Cambinol Sigma C0494 SIRT1 & SIRT2 inhibitor
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 8000 Quantify nucleotide
GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems N805-0200 For molecular biology experiment
CO2 Incubator NAPCO Series 8000 DH For cell culture at 5% CO2 at 37 °C
Desktop centrifuge with refrezerator Eppendorf 5430R For molecular biology experiment
Centrifuge with swing bucket Eppendorf 5810 R For cell culture
Inverted microscope Nikon 80124 Phase contrast optional
Tissue culture hood Labconco Class II A2 BSL-2 certified
LumiCycle 32 Actimetrics Not Available Luminoscence detector

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Akerstedt, T., et al. Night work and breast cancer in women: a Swedish cohort study. BMJ Open. 5, (4), e008127 (2015).
  2. Parent, M. E., El-Zein, M., Rousseau, M. C., Pintos, J., Siemiatycki, J. Night work and the risk of cancer among men. Am J Epidemiol. 176, (9), 751-759 (2012).
  3. Knutsson, A., et al. Breast cancer among shift workers: results of the WOLF longitudinal cohort study. Scand J Work Environ Health. 39, (2), 170-177 (2013).
  4. Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat Rev Cancer. 3, (5), 350-361 (2003).
  5. Fu, L., Kettner, N. M. The circadian clock in cancer development and therapy. Prog Mol Biol Transl Sci. 119, 221-282 (2013).
  6. IARC. Painting, Firefighting, and Shiftwork. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 98, 563-764 (2010).
  7. Zhang, X., Zarbl, H. Chemopreventive doses of methylselenocysteine alter circadian rhythm in rat mammary tissue. Cancer Prev Res (Phila Pa). 1, (2), 119-127 (2008).
  8. Fang, M. Z., Zhang, X., Zarbl, H. Methylselenocysteine resets the rhythmic expression of circadian and growth-regulatory genes disrupted by nitrosomethylurea in vivo. Cancer Prev Res (Phila). 3, (5), 640-652 (2010).
  9. Burbulla, L. F., Kruger, R. Converging environmental and genetic pathways in the pathogenesis of Parkinson's disease. J Neurol Sci. 306, (1-2), 1-8 (2011).
  10. Aitlhadj, L., Avila, D. S., Benedetto, A., Aschner, M., Sturzenbaum, S. R. Environmental exposure, obesity, and Parkinson's disease: lessons from fat and old worms. Environ Health Perspect. 119, (1), 20-28 (2011).
  11. Nagoshi, E., Brown, S. A., Dibner, C., Kornmann, B., Schibler, U. Circadian gene expression in cultured cells. Methods Enzymol. 393, 543-557 (2005).
  12. Ramanathan, C., et al. Cell type-specific functions of period genes revealed by novel adipocyte and hepatocyte circadian clock models. PLoS Genet. 10, (4), e1004244 (2014).
  13. Sporl, F., et al. A circadian clock in HaCaT keratinocytes. J Invest Dermatol. 131, (2), 338-348 (2011).
  14. Zhang, E. E., et al. A genome-wide RNAi screen for modifiers of the circadian clock in human cells. Cell. 139, (1), 199-210 (2009).
  15. Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (15), 5339-5346 (2004).
  16. Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression. Biotechniques. 29, (3), (2000).
  17. Genomics, S. Technical Note: SwitchGear methods for gene model construction and transcription start site prediction. (2009).
  18. Scientific, F. Safety Data Sheet: Ethidium bromide, 1% Solution/Molecular Biology. (2010).
  19. Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience. New York. (1994).
  20. Yoo, S. H., et al. A noncanonical E-box enhancer drives mouse Period2 circadian oscillations in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, (7), 2608-2613 (2005).
  21. Chen, Z., et al. Identification of diverse modulators of central and peripheral circadian clocks by high-throughput chemical screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (1), 101-106 (2012).
  22. Fang, M., Guo, W. R., Park, Y., Kang, H. G., Zarbl, H. Enhancement of NAD+-dependent SIRT1 deacetylase activity by methylselenocysteine resets the circadian clock in carcinogen-treated mammary epithelial cells. Oncotarget. (2015).
  23. Chen-Goodspeed, M., Lee, C. C. Tumor suppression and circadian function. J Biol Rhythms. 22, (4), 291-298 (2007).
  24. Balsalobre, A. Clock genes in mammalian peripheral tissues. Cell Tissue Res. 309, (1), 193-199 (2002).
  25. Jung-Hynes, B., Huang, W., Reiter, R. J., Ahmad, N. Melatonin resynchronizes dysregulated circadian rhythm circuitry in human prostate cancer cells. J Pineal Res. 49, (1), 60-68 (2010).
  26. von Gall, C., et al. Melatonin plays a crucial role in the regulation of rhythmic clock gene expression in the mouse pars tuberalis. Ann N Y Acad Sci. 1040, 508-511 (2005).
  27. Vujovic, N., Davidson, A. J., Menaker, M. Sympathetic input modulates, but does not determine, phase of peripheral circadian oscillators. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295, (1), R355-R360 (2008).
  28. Schofl, C., Becker, C., Prank, K., von zur Muhlen, A., Brabant, G. Twenty-four-hour rhythms of plasma catecholamines and their relation to cardiovascular parameters in healthy young men. Eur J Endocrinol. 137, (6), 675-683 (1997).
  29. Yu, H., et al. Circadian rhythm of circulating fibroblast growth factor 21 is related to diurnal changes in fatty acids in humans. Clin Chem. 57, (5), 691-700 (2011).
  30. Nakagawa, H., et al. Modulation of circadian rhythm of DNA synthesis in tumor cells by inhibiting platelet-derived growth factor signaling. J Pharmacol Sci. 107, (4), 401-407 (2008).
  31. Yang, X., Guo, M., Wan, Y. J. Deregulation of growth factor, circadian clock, and cell cycle signaling in regenerating hepatocyte RXRalpha-deficient mouse livers. Am J Pathol. 176, (2), 733-743 (2010).
  32. Virag, L. Structure and function of poly(ADP-ribose) polymerase-1: role in oxidative stress-related pathologies. Curr Vasc Pharmacol. 3, (3), 209-214 (2005).
  33. Kon, N., Sugiyama, Y., Yoshitane, H., Kameshita, I., Fukada, Y. Cell-based inhibitor screening identifies multiple protein kinases important for circadian clock oscillations. Commun Integr Biol. 8, (4), e982405 (2015).
  34. Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters. J Vis Exp. (67), e4234 (2012).
  35. Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr Biol. 14, (24), 2289-2295 (2004).
<em>In Vitro</em> Test de bioluminescence pour caractériser le rythme circadien dans les cellules épithéliales mammaires
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Fang, M., Kang, H. G., Park, Y., Estrella, B., Zarbl, H. In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e55832, doi:10.3791/55832 (2017).More

Fang, M., Kang, H. G., Park, Y., Estrella, B., Zarbl, H. In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e55832, doi:10.3791/55832 (2017).

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