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Genetics

In Vitro Ensaio de bioluminescência para caracterizar o ritmo circadiano em células epiteliais mamárias

doi: 10.3791/55832 Published: September 28, 2017

Summary

Um ensaio de bioluminescência em vitro para determinar celular ritmo circadiano em células epiteliais mamárias é apresentado. Este método utiliza plasmídeos de repórter de pilha mamífera expressando desestabilizado luciferase sob o controle do promotor do gene de período 2 . Ele pode ser adaptado para outros tipos de células para avaliar efeitos de órgãos específicos no ritmo circadiano.

Abstract

O ritmo circadiano é um fundamental processo fisiológico presente em todos os organismos que regula os processos biológicos, variando de expressão gênica de comportamento de dormir. Nos vertebrados, ritmo circadiano é controlado por um oscilador molecular que funciona no núcleo supraquiasmático (SCN; marcapasso central) e composto por tecidos mais periféricos de células individuais. Mais importante ainda, perturbação do ritmo circadiano pela exposição à luz durante a noite, estressores ambientais e/ou substâncias tóxicas é associada com aumento do risco de doenças crônicas e envelhecimento. A capacidade de identificar os agentes que podem prejudicar a centrais e/ou periféricos relógios biológicos e agentes que podem prevenir ou atenuar os efeitos da perturbação circadiano, tem implicações significativas para a prevenção de doenças crônicas. Embora modelos de roedores podem ser usados para identificar riscos e agentes que induzem ou impedem/atenuar perturbações circadiana, estas experiências exigem um grande número de animais. Estudos in vivo também necessitam de infra-estrutura e recursos significativos e exigem que os investigadores a trabalhar a noite toda. Assim, há uma necessidade urgente de um tipo de célula adequado em vitro sistema de tela para os disruptores circadianos ambientais e realçadores em tipos de células de diferentes órgãos e Estados de doença. Nós construímos um vetor que impulsiona a transcrição da luciferase desestabilizado em células eucarióticas, sob o controle do promotor gene período 2 humano. Essa construção circadian repórter foi estàvel transfected em células epiteliais mamárias humanas, e células circadian repórter responsivos foram Selecionadodas para desenvolver o ensaio de bioluminescência em vitro . Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para estabelecer e validar o ensaio. Nós fornecemos mais detalhes para a prova de experimentos de conceito, demonstrando a capacidade do nosso ensaio em vitro de recapitular na vivo efeitos de vários produtos químicos sobre o celular relógio biológico. Os resultados indicam que o ensaio pode ser adaptado a uma variedade de tipos de células para a tela para ambos os disruptores ambientais e quimiopreventivo potenciadores de relógios circadianos.

Introduction

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O relógio circadiano regula uma ampla gama de processos biológicos de diurna expressão de genes para dormir o comportamento em um ritmo previsível com uma periodicidade de aproximadamente 24 h. epidemiológico estudos sugerem fortemente que perturbação crônica de circadiano ritmo aumenta o risco de cancro da mama e da próstata em trabalhadores de turno, incluindo enfermeiros e tripulações de voo a1,2,3. Esses achados são corroborados por estudos de roedores, demonstrando que a exposição aos ciclos de luz durante a noite, ou luz luz constante, que imitam a incidência de tumor de jet-lag aumento e acelera o crescimento de tumor4,5. Com base em dados de estudos humanos e roedores, a Agência Internacional para pesquisa sobre câncer classificados trabalho por turnos como um provável carcinogênico humano (tipo 2A) em 20106.

Anteriormente, temos demonstrado que uma dose única de cancerígena de carcinógeno específico tumor mamário, N- nitroso-N- methylurea (NMU), interrompeu a expressão circadiana dos principais genes circadianos (CGs) (por exemplo, período 2 , Per2) e vários circadian controlado por genes (CCGs), incluindo danos ao DNA responsivo-chave e reparar os genes (DDRR) na glândula mamária alvo (mas não no fígado). Além disso, redefinindo a expressão circadiana dos genes tanto Per2 e DDRR no sentido normal por um regime quimiopreventivo de dietético L-metil-selenocisteína (MSC) reduziu a incidência de tumor em 63%. Estas conclusões foram os primeiros a mostrar um link mecanicista entre ritmo circadiano, carcinogênese química e Quimioprevenção7,8. Riscos em relação a outros tóxicos ambientais mostrados interromper genética circadian expressão na vivo também estão associados com risco aumentado de doenças ambientais9,10. Compreender os mecanismos que vinculam circadian interrupção por tóxicos ambientais e patogênese pode originar abordagens mecanicamente para a prevenção de doenças. No entanto, estudos destinados a definir as interacções entre as exposições e ritmo circadiano geralmente são realizadas in vivo. Um típico na vivo experimento a investigar que o impacto sobre o ritmo circadiano requer um grande número de animais, como os tecidos de pelo menos três controlam e três animais expostos devem ser coletados a cada 3-4 h durante um período de 24 ou 48 h. Desenvolvimento de um sistema validado em vitro que recapitula as observações na vivo e mecanismos que, por conseguinte, não só reduzir o número de animais necessários, mas também dramaticamente reduzir custos experimentais e a exigência que pesquisadores trabalham continuamente ao longo de um período de 24-48 h. Além disso, um sistema validado em vitro poderia ser usado para o rastreio de alta taxa de transferência de compostos e/ou alteração genética que afetam o ritmo circadiano, ou sua resposta a estressores ambientais ou substâncias tóxicas. Portanto, a combinação estratégica de modelos in vitro e in vivo e experiências são necessárias para obter insights diferentes com foco diferente.

Nos mamíferos, osciladores circadianos existem não só nos neurônios especializados do SCN, mas também em tipos de células mais periféricos. Estes pulsos de disparo moleculares são similares em linhas de células de fibroblastos estabelecida e em fibroblastos primários de embriões ou animais adultos; no entanto, há uma necessidade de tecido celular modelos específicos do tipo11. Consequentemente, estudos tradicionais da atividade locomotora em vivo, SCN explants ex vivoe ensaios baseados em células em vitro em células de fibroblastos imortalizado são amplamente utilizados para estudar a célula autónomos defeitos circadianos. No entanto, não há provas indicando que um em vitro fibroblasto baseada em célula ensaio pode recapitular circadianos mecanismos e respostas presentes em células de outros órgãos periféricos na vivo. Diferentes tipos de células podem ter padrões distintos de expressão gênica, metabolismo e DDRR, e as ligações entre a toxicidade e a expressão genética circadian podem ser o tipo de célula específica e/ou modulada por diferentes parâmetros fisiológicos. Além disso, osciladores circadianos em sistemas baseados em fibroblasto não foram totalmente avaliados para respostas a tóxicos ambientais, estressores e agentes preventivos que ligam as exposições aos mecanismos de desenvolvimento de doenças e prevenção. Assim, há uma necessidade de facile, validado-tipo de células específicas, em vitro bioluminescência ensaios para estudar órgão específico ambiental circadian os disruptores. Apesar de ter uma variedade de modelos de relógio celular (por exemplo, no fígado, queratinócitos e as células de gordura, bem como uma linha de celular de osteossarcoma) foram desenvolvidas nos últimos anos12,13,14, 15, o ensaio descrito aqui é o primeiro modelo de relógio celular em células epiteliais da mama e a primeira demonstração de recapitular na vivo respostas a estressores ambientais, substâncias tóxicas, drogas e agentes quimiopreventivo.

Renilla luciferase (rLuc) e a luciferase de vaga-lume são 30-61 kDa proteínas monoméricas que não exigem posttranslational de processamento para a atividade enzimática e podem funcionar como um repórter genética imediatamente após a tradução. Uma vez que o substrato associa-se com a enzima luciferase, a reação bioquímica catalisada gera um flash de luz. Assim, a luciferase construções são amplamente utilizadas como um gene expressão repórter sistema em vitro e in vivo. No entanto, em estudos de ritmo circadiano, o utilitário do repórter do luciferase é limitado pelo relativamente longo Half-Life da proteína luciferase (T1/2 = h 3,68) relativamente ao período (especialmente para o período curto) para que as alterações no gene circadian expressão; no entanto, numerosos estudos ao longo dos anos usaram com sucesso o gene da luciferase no vetor pGL3, indicando que a luciferase rapidamente degradável pode não ser necessário para relatórios dos ritmos circadianos, especialmente para os ritmos com um período mais longo, tais como 24 h. Portanto, um repórter do usando vetor de luciferase desestabilizado, pGL [Luc2P/Neo], que contém hPEST (uma sequência de desestabilização da proteína) foi desenvolvido, permitindo-nos usá-lo como um vetor de repórter circadiano para nosso atual in vitro ensaio de bioluminescência. A proteína codificada pelo Luc2P tem uma meia-vida mais curta (T1/2 = 0,84 h) e, portanto, responde mais rapidamente e com uma maior amplitude a alterações na atividade transcricional do selvagem-tipo, eundicating que pode ser usado para monitorar a expressão rítmica da luciferase regulado pelo promotor PER2 com precisão em tempo real16.

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Protocol

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1. construção de PER2 promotor Driven desestabilizado Luciferase Reporter Vector

  1. comprar um personalizado pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vector que contém a codificação rLuc e humanos de cDNA Fragmento de promotor PER2 (hPER2P, 941 bp) no site entre Sac I e Hind III em clonagem múltiplos região 17.
  2. Cortar o fragmento de promotor PER2 humano (hPER2P, 941 bp) fora do vetor.
    1. Adicionar 2,5 µ l de buffer de enzima de restrição, 10 µ l (180 ng) pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vector e 1 μL de cada das enzimas de restrição, Sac I (unidade 10 / µ l) e Hind III (10 unidade / µ l), em um DNA/RNA/nucleotídeo livre tubo de microcentrifugadora. Adicionar água ultrapura (10.5 µ l) até 25 µ l e misture suavemente pipetando.
    2. Incubar a 37 ° C por 90 min em um bloco de aquecimento.
    3. Executar todo o volume (25 µ l) da reação de enzima de restrição em gel de agarose 0.7% contendo brometo de etídio (EtBr) para separar a hPER2P do vetor 0,0001%.
      Nota: EtBr, brometo de 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridinium (número de registo CAS: 1239-45-8), é um líquido inodoro e vermelho. É um agente intercalante que é comumente usado como um fluorescente tag (mancha de ácido nucleico) em eletroforese em gel de agarose e visível como uma cor laranja sob luz UV. Possíveis riscos de efeitos mutagénicos irreversíveis tenham ocorrido em animais experimentais, embora nenhuma das agências reguladoras é Categorizado como um carcinógeno 18. Portanto, nós coletados solução tampão de gel e eletroforese de agarose usado com EtBr como resíduos de risco químico e requisitado a saúde ambiental de Rutgers & segurança (REHS) para buscar e eliminar com segurança.
    4. Corte um pedaço de gel de agarose contendo uma banda de fluorescência de EtBr em 941 bp e purificar os fragmentos hPER2P do gel com um kit de extração de gel de DNA, seguido de quantificação em um espectrofotômetro, medindo a densidade de absorção (OD) no comprimento de onda de 260 nm.
  3. Linearizar 1.0 µ l (1 µ g) do vetor de expressão luciferase de vaga-lume desestabilizado, pGL [Luc2P / Neo] com o mesmo método como é descrito nas etapas 1.2.1-1.2.2. Extraia o vetor com um kit de limpeza de DNA seguido de quantificação, como descrito acima usando um spectrophotometer.
  4. Ligate a hPER2P para o vetor tornado linear pGL [Luc2P / Neo].
    Nota: pelo fabricante ' s instrução, a relação molar ideal de inserção e o vetor é 2:1. Para 50 vector ng, a quantidade ideal de inserção é calculada como 23,6 ng com um fórmula, [(50 ng vector x 1.0 kb insert)/4,242 kb vetor] x (1/2) = 23,6 ng inserir]. Baseia-se as concentrações de hPER2P (7,26 ng / µ l) e pGL [Luc2P / Neo] (50 ng / µ l), os volumes de 50 ng pGL [Luc2P / Neo] e 23,6 ng hPER2P são calculados como 1 µ l e 3,26 µ l, respectivamente. Reação de
    1. Adicionar 2 µ l T4 DNA ligase buffer (10 X) (50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl 2, ATP de 1 mM e 10 mM DTT), 3,26 µ l (23,6 ng) hPER2P, 1 µ l (50 ng) pGL [Luc2P / Neo], e até 20 µ l de água de 13.74 µ l , misture suavemente.
    2. Adicionar 1 µ l T4 DNA ligase (400 unidade / µ l), misture delicadamente e incubar a 16 ° C durante a noite em um thermocycler e depois relaxar o vetor ligado no gelo pelo fabricante ' instrução de s.
  5. Transformar o pGL ligados vetor [hPer2P / Luc2P / Neo] para quimicamente competentes de Escherichia coli 19.
    1. Definir o banho-maria a 42 ° C, ideal caldo Super aquecimento com meio de repressão (S.O.C) catabolite (2% triptona, 0,5% de extracto de levedura, 10 mM de NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 10mm MgSO 4 e glicose de 20 mM) à temperatura ambiente , aquecer a placa de ágar Luria-Bertani (LB) (contendo 100 µ g/mL ampicilina, 80 µ g/mL X-galão e 0,5 µM IPTG) incubadora de 37 ° C e descongelar no gelo, um frasco de competentes de Escherichia coli células para cada transformação.
    2. Adicionar 6 µ l (21 ng) ligados a vetor ou 1 µ l (30 ng) vazio vector (controle negativo) para um tubo de quimicamente competentes de Escherichia coli (50 µ l) e em seguida, virar suavemente o tubo para misturar. Incubar no gelo por 30 min.
    3. Calor choque em um banho de água de 42 ° C por 30 s sem tremer e em seguida retorno ao Ice.
  6. Selecione uma colônia de e. coli transformada com um vetor ligado usando azul/branco triagem.
    1. Médio de S.O.C Adicionar 250 µ l no transformado Escherichia coli tubo e incube-lo durante 1 h a 37 ° C com agitação a 200 rpm.
    2. Espalhar 10-50 µ l de transformada de Escherichia coli na superfície da placa de ágar LB uniformemente. Colocar a placa de cabeça para baixo na incubadora de 37 ° C durante a noite.
      Nota: Uma reação eficiente de clonagem deve produzir várias centenas de colónias. Chapeamento de dois diferentes volumes é recomendado para assegurar que tenha pelo menos uma placa grande, clara branca ou azul cor e colônias bem espaçadas. Quando as colônias são muito pequenas e a cor não é distinguível, usar um microscópio (10 X ou 50x) é útil.
    3. Escolher 3-6 colônias brancas das placas com palitos de dente esterilizado e liberar cada colônia no tubo de uma cultura contendo 4 mL de meio de cultura LB com ampicilina 50 de µ g/mL.
    4. Incubar os tubos a 37 ° C com agitação durante a noite a 200 rpm. Extrair o DNA usando 2 mL a 4 ml cultivadas Escherichia coli com um plasmídeo DNA extração mini prep kit pelo fabricante ' instrução de s.
  7. Verificar e analisar a inserção (hPER2P, 941 bp)
    1. digerir o ADN do plasmídeo com enzimas de restrição e executar eletroforese, conforme descrito em etapas 1.2.1-1.2.3 para confirmar se há uma inserção.
      Nota: Controle positivo (hPER2P purificado no passo 1.2.4) e o controlo negativo (e. coli transformada com um vetor vazio) foram incluídos.
    2. Sequenciar o DNA de plasmídeo selecionado usando M13 para a frente e M13 reversos primers para confirmar a orientação e a sequência de inserção em plasmídeo 19.
      Nota: Apenas uma colônia que tinha um encarte com o tamanho correto do hPER2P em eletroforese e orientação correta e sequência no resultado sequenciamento foi selecionada.
    3. Analisar o fragmento de promotor PER2 humano (hPER2P, 941 bp) sequência para os elementos normativos circadianos, incluindo E-caixa do motivo (sítio de ligação Bmal1, CAT/CGTG), CCAATC, caixa de GC e transcrição iniciar o site (CAGCGG) 20.
  8. Amplificar o selecionado Escherichia coli, adicionando o restante 2 mL cultivadas Escherichia coli em meio de cultura LB de 200 mL contendo 50 ampicilina µ g/mL e em seguida, incubando-lo durante a noite a 37 ° C, com agitação a 200 rpm.
  9. Extrair DNA com um maxi livre de endotoxinas plasmídeo prepara kit o fabricante ' instrução de s e em seguida quantificá-lo medindo OD no comprimento de onda de 260 nm com um espectrofotômetro. Alíquota e loja do Plasmídeo, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo], no congelador-80 ° C para uso futuro.

2. Transfection transiente

  1. compra e cultura de células de MCF10A
    1. compra uma linha imortalizado, não-transformadas normal humano mamária célula epitelial (MCF10A) de um comercial banco de células, onde as células são cromossómico testado e autenticado com tandem curto repetir a análise antes do congelamento. Descongelar e manter cada frasco de células congeladas em cultura para um máximo de 8 semanas.
      Nota: Ao contrário de outras células, estas células têm contato inibição quando chegarem ao ~ 70% confluência. Requer que subcultura é conduzida em ~ 70%.
    2. Cultura de células com meio de cultura de células epiteliais mamárias (MEGM), contendo meio basal epitelial mamário (MEBM), suplementos de crescimento e toxina da cólera em uma incubadora de cultura celular em 37 ° C, umidade de 95% e 5% de CO 2.
      Nota: Compra de fatores de crescimento de ready-to-use fornecidos em SingleQuot (SQ) e obter a toxina da cólera separadamente. As concentrações finais dos suplementos de crescimento são 0,4% bovina extrato pituitário, insulina 0,1%, 0,1% hidrocortisona, fatores de crescimento epidérmico humano de 0,1%, toxina da cólera 100 ng/mL e 0,05% de sulfato de gentamicina e 0.05% anfotericina B.
    3. Dissociar as células em placa de cultura de 10 cm por incubação com 10 mL de tripsina/EDTA para ~ 20 min e depois neutralizar a tripsina adicionando tripsina 10 mL solução de neutralização. Recolher todas as células com HEPES buffer solução salina (HBSS).
    4. Contar as células com um hemocytometer sob um microscópio invertido e calcular a concentração da suspensão única célula e então propagar um certo número de células, conforme necessário. Agite as placas cuidadosamente, para se obter uma distribuição uniforme de células em cada prato. Incubar as células na incubadora de cultura celular em 37 ° C, umidade de 95% e 5% de CO 2.
      Nota: Compre um pack de reagente de subcultura contendo tripsina/EDTA, solução neutralizadora de tripsina e HBSS usar.
  2. Transfection transiente de células com o vetor circadian construído.
    1. Semente 2 x 10 5 MCF10A células uniformemente na cultura de 35 mm prato com MEGM e crescer a confluência de 20-30% (dia seguinte).
    2. Mídia de soro
    3. quente até o reduzido (por exemplo, Opti-MEM) em 37 ° C água banho e transfecção reagente em temperatura ambiente por 30 min. diluir o plasmídeo construído (pGL [hPer2P / Luc2P / Neo]) a 30 ng / µ l com endo-toxina livre Tampão Tris-EDTA (TE) e mantenha em temperatura ambiente.
    4. Preparar a mistura de transfeccao Plasmideo em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL adicionando 63,6 mídia de µ l soro reduzida quente primeiro e, em seguida, adicionando 33,4 µ l (0.1 µ g) plasmídeo e misture suavemente pipetagem, e finalmente adicionando 3 µ l do transfection reagente diretamente para o centro do tubo sem tocar a parede. Após a mistura suavemente pipetando, manter em temperatura ambiente por 30 min.
    5. Deixar a mistura inteira do plasmídeo (100 µ l) diretamente sobre a superfície do centro do meio da placa e em seguida misture delicadamente agitando o prato. Cultura de células numa incubadora de CO 2 para adicionais 48-72 h
      Nota: Prevê-se que a mais alta eficiência de transfeccao seria na confluência de 40-70% dessas células devido à sua inibição de contato no ~ 70%. Portanto, transfecção funciona melhor começando com ~ 20% e pare na ~ 70% confluência.

3. Estabelecimento de bioluminescência ensaio In Vitro em células MCF10A de Transfected transitoriamente

  1. de fome as células cultivadas na confluência de ~ 70% (depois de Transfeccao para 48-72 h) em MEBM sem fatores de crescimento por 24 h.
  2. Tratar as células com o agente de sincronização (por exemplo, 50% de soro de cavalo (HS)) em MEBM para 1,5 h numa incubadora de CO 2.
    Nota: Para a seleção de um agente de sincronização ideal, 10 µM forskolin, 1 nM melatonina, dexametasona 0,1 µM, 50% HS e 100% SQ foram comparados em termos de amplitude circadiano e período nas células circadian vector transfectada. Células vazias vector transfectada são tratadas com 100% SQ como controlo negativo.
  3. Meio de pre-prepare 20 mL gravação (para 10 dos pratos 30mm cultura) pela adição de 5 mL de MEGM, 15 mL de MEBM, 150 µ l de bicarbonato de sódio, 200 µ l de HEPES e Luciferina de 40 µ l de solução (50 mM) em um tubo de centrífuga de 50 mL esterilizado ações.
    Nota: As concentrações finais de cada componentes: 20% SQ e toxina da cólera 20 ng/mL, 0,06% de bicarbonato de sódio, 1% penicilina/estreptomicina e 10 mM HEPES. Aquece pré-preparadas gravação médio e esterilizados 1X PBS por 30 min em banho-maria a 37 ° C. Adicionar 100 luciferina µM imediatamente antes do uso.
  4. Lavar as células com quente 1 x Dulbecco ' s Phosphate-Buffered salina (D-PBS) por 3 vezes após a incubação com o agente de sincronização e em seguida, adicione 2 mL de meio de gravação.
  5. Selar o prato com uma classe de tampa esterilizado usando graxa de silicone para evitar a evaporação e nomeie-o do lado.
  6. Colocar a cápsula selada no assento dentro do luminómetro e ative a opção para salvar o local do arquivo na pasta (para detalhes, consulte a seção 6).

4. Seleção de células estàvel Transfected

  1. otimizar uma concentração ideal de G418 (800 µ g/mL) com um ensaio de curva de matar de acordo com o fabricante ' instrução de s para a seleção das células transfectadas estàvel.
  2. Depois de transfecção transiente para 48 h ou 72 h, subcultura e semente as células com MEGM em pratos maiores de 5.000 células/prato (100 mm). Após 24 h cultura na incubadora de cultura celular (37 ° C, umidade de 95% e 5% CO 2), tratar as células com 800 µ g/mL de G418, substituindo o antigo médio com novo meio contendo 800 µ g/mL G418 cada 3-4 dias por 2 semanas.
  3. Subcultura o sobrevivente estàvel transfected colônias para 1-3 passagens com MEGM com 500µg/mL G418 para manter a expressão estável de hPer2P/Luc2P e congelamento em nitrogênio líquido para uso futuro.
  4. Tratar G418 de 500µg/mL após a subcultura geral para re-selecionar estàvel transfectada população de células, se a intensidade de bioluminescência no resultado do ensaio de bioluminescência em vitro torna-se progressivamente menor após o uso em muitas passagens.

5. Tratamento com produtos químicos

  1. em 48 h ou 72 h após transfeccao, morrer de fome as células de fatores de crescimento em MEBM por 24 h.
  2. Após a sincronização com 50% HS por 2 h, tratar as células com nitrosomethylurea 0,5 mM ou 0,25 mM (NMU), 20 nM EX527 ou cambinol de 1 µM por 1h em MEBM contendo 20% sq.
  3. Após a lavagem com 1 x D-PBS, adicionar gravação médio contendo 12,5 µM MSC sozinho ou em combinação com 20 nM EX527 ou cambinol de 1 µM, para as células. Acompanhamento a bioluminescência com o luminómetro.
  4. Tratar o estàvel transfectadas MCF10A / PER2-dLuc células com NMU em 0,5, 1 ou 2 mM, EX527 em 40 nM, ou Cambinol em 2,0 µM, por 1h após a sincronização com 50% HS e em seguida Incube as celulas em gravação médio contendo µM 12.5 da MSC ou (5, 10 ou 20 µM) de diferentes doses de n-acetilcisteína (NAC). Colocar as placas no luminómetro, registro e salvar a bioluminescência pelo luminómetro durante 4 a 8 dias, conforme descrito na seção 3.6.
    Nota: NMU é uma composto com propriedades mutagênicos, carcinogênicas e teratogênicos de Nitrosoureia metilada. NMU é um Agente alquilante acção directa e tem uma curta meia-vida (T 1/2 = ~ 30 min). É estável em condições ácidas (pH 4-5), mas instável em condições alcalinas (pH 9-10) e a temperaturas além de 20 ° C. Portanto, lixívia a 10% pode ser usada como um agente de desativação eficiente para limpeza de superfícies de bancada e utensílios de laboratório potencialmente contaminados por NMU comunicantesno. Solução-mãe de sobra é captado e eliminada com segurança por REHS. Dependendo do modo de ação dos produtos químicos, células sincronizadas podem ser tratadas por tempos mais curtos antes de cultivo em meio de gravação. As células também podem ser tratadas em meio de gravação por mais tempo (vários dias).

6. Coleta de dados, análise e apresentação

Nota: viabilidade celular precisa ser determinado usando métodos padrão (por exemplo, ensaio de MTT) após o tratamento de células nas mesmas concentrações para os mesmos tempos indicados. Todas as concentrações de tratamento utilizadas no ensaio em vitro bioluminescência foram inferiores a 30% de concentração letal (LC30). Todos os experimentos foram conduzidos em triplicado e foram apresentados resultados representativos.

  1. Após a selagem do prato (passo 3.5), carregar os pratos para os assentos no luminómetro, que é mantido dentro de uma incubadora a 37 ° C, sem H 2 O e CO 2 e conectado a um computador.
  2. Clique " salvar " e insira os nomes para a pasta e o arquivo onde será salvo o sinal gravado luminescência do prato correspondente.
    Nota: O sistema detecta o sinal de luminescência em tempo real das células no prato em posições individuais. Os sinais são transferidos para o computador através de 4 fóton-contagem de tubos fotomultiplicadores e salvos e exibidos no computador pelo software de coleta de dados.
  3. Analisar os sinais depois de gravar durante 4-7 dias, que pode ser seguido por mudança média e gravação contínua para uma segunda semana, se necessário.
    Nota: Para obter parâmetros circadianos, incluindo a fase, duração do período, amplitude de ritmo e amortecimento taxa, usamos o software de análise do luminómetro para analisar os dados de bioluminescência.
  4. Detrend dados brutos com uma média de execução e analisar a melhor se adapta a uma onda de seno de período, fase, amplitude e amortecimento taxa 21 , 22.
  5. Devido a alta transitória bioluminescência sobre tratamento e mudança média, exclui o primeiro ciclo de dados análise.
  6. Para apresentação de dados, plotar dados brutos (bioluminescência, contagem/s) contra o tempo (h ou dia). Quando necessário, subtraído de linha de base de dados podem ser plotados para comparar a amplitude e fase.

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Representative Results

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Vetor de repórter Circadian bioluminescência: PER2 humana orientada por promotor expressão variante desestabilizado luciferase

A sequência de DNA, que inclui um fragmento de bp 941 derivado o promotor PER2 humano, usado para construir o vetor de repórter circadiano, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo, primeiro foi analisada a presença de elementos reguladores conhecidos para regular expressão de genes circadianos. Bioinformática-análise mostrou que dentro deste fragmento de promotor, existem três sites diferentes de ligação de Bmal1 (E-box) (CAT/CGTG), dois locais de aumentação circadiano da transcrição (CCAATG), duas caixas de GC e um site de início de transcrição (Figura 1). Portanto, esse vetor de repórter foi antecipada para refletir a expressão genética circadian.

Otimização de agente de sincronização

Vários agentes têm sido utilizados para sincronizar ou afetar o ritmo circadiano autónomo de células de fibroblastos para estudos de bioluminescência em vitro . Para seleccionar um agente de sincronização específicas eficiente e cost-effective-tipo de célula em células epiteliais mamárias, comparamos 10 µM forskolin, 1 nM melatonina, dexametasona 0,1 µM, 50% HS e 100% SQ em células epiteliais mamárias (MCF10A) transitoriamente transfectadas com o vetor de repórter circadiano. Células sincronizado com 50% HS mostrou o melhor ritmo circadiano, com 3 picos de circadiano induzida por luminescência, em comparação com apenas um ou dois picos em células sincronizado com outros agentes. Além disso, os perfis de bioluminescência de células sincronizados com 50% HS produzido período aceitável, amplitude e valor de ajuste durante a análise de dados (Figura 2). Com base nesses resultados, nós selecionamos este método de baixo custo como o agente de sincronização de celulares para todas as experiências subsequentes.

Interrupção e restauração de celular ritmo circadiano por exposições químicas

Este modelo in vitro , células transfectadas transitoriamente, sem tratamento (grupo controle) mostraram pelo menos dois ciclos completos de luminescência sinalização após a sincronização (Figura 3A). Células expostas ao acção directa mutagénico, NMU, mostraram uma interrupção de dose-dependente da expressão genética circadian como refletido pela perda dos picos de luminescência. Enquanto o tratamento com 0,25 mM NMU não perturbar o ritmo circadiano celular, uma dose de 0,5 mM NMU inicialmente atrasado e mais tarde aboliu o ritmo circadiano, conforme indicado pelo desaparecimento do segundo pico de luminescência no pós-tratamento ~ 72 h. Inibição da atividade de SIRT1 com 20 nM Ex257 ou cambinol de 1 µM similarmente perturbado ritmo circadiano por umedecer o ciclo circadiano subsequente (Figura 3A-1). Importante, a adição de MSC (12,5 µM) para o meio de cultura restaurado no sentido normais primeiros e segundo ciclos circadianos da expressão do gene nas células NMU-tratados. MSC não só restaurou o ritmo interrompido por NMU, mas também evitar os efeitos pertubadores da SIRT1 inibidores, Ex257 e cambinol (Figura 3A-2).

Em células transfectadas estàvel, ambos NMU e SIRT1 inibidores interrompeu o ritmo circadiano, embora a umas concentrações mais elevadas do que o observado em transfectants transitória (Figura 3B-1). MSC (12,5 µM) restaurado ritmos circadianos nas células pré-tratados com 1mm NMU (Figura 3B-2). Mais importante, a MSC restaurado também ritmos circadianos nas células tratadas com inibidores SIRT1, incluindo EX257 (40 nM) (Figura 3B-3) e cambinol (2 µM) (Figura 3B(4)), respectivamente.

Na comparação entre a Figura 3A e Figura 3B, a intensidade de bioluminescência era muito maior, mas o ritmo foi sustentado por um tempo mais curto em células transfectadas transitoriamente vs estàvel transfected células (~ 10 vezes maior, 2 vezes mais curto) em geral, mesmo após o tratamento das células com NMU ou MSC. Além disso, o ritmo circadiano celular foi 2 dobras mais sensível à exposição a substâncias químicas em células transfectadas transitoriamente em comparação com as células transfectadas estàvel.

Mudança de dose-dependente quantitativa de celular ritmo circadiano por produtos químicos

Da mesma forma, o ritmo circadiano celular rompido das células transfectadas estàvel tratados com 1mm NMU foi restaurado pelo tratamento do NAC de forma dose-dependente (0-20 µM) (Figura 4A) como observado nas mudanças do período circadiano (Figura 4B ) e fase (Figura 4).

Figure 1
Figura 1: Sequência de fragmento de promotor PER2 humano e o vetor de repórter circadian. (A) fragmento de promotor humana PER2 (941 bp) foi sequenciado, e a sequência foi analisada para os elementos do promotor circadian funcional. E-caixa, CACGTT / CATGTG; Circadian transcrição reforço local, CCAATG; Caixa de GC, CGCCCC / GGGGCGGG; transcrição iniciar site (TSS): CAGCGG. (B) diagrama esquemático do vetor de repórter do luciferase desestabilizado, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo]. A transcrição de luciferase desestabilizado (dLuc) está sob o controle direto do promotor hPER2 . Um gene de resistência co expressa neomicina (Neo) facilita a seleção de células infectadas por G418. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: sincronização de em vitro celular ritmo circadiano pelos agentes de sincronização diferente. Depois da fome de 24 h, MCF10A células transfectadas transitoriamente pelo vetor circadian repórter foram tratadas com cada agente de sincronização para 2 h, seguido de gravação de sinal de luminescência. Azul, 10 µM forskolin; vermelho, 1 melatonina nM; verde, 0.1 dexametasona µM; roxo; 50% de soro de cavalo (HS); verde-azulado, 100% SingleQuot (SQ); amarelo, vazio vector (controle negativo). Eixo x, tempo (dias); Eixo y, bioluminescência (contagem/min). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


Figura 3: MSC restaurado celulares ritmos circadianos perturbados pela NMU e SIRT1 inibidores nas células epiteliais mamárias in vitro. Bioluminescência ensaios foram realizados na MCF10A /PER2-dLuc repórter células após a sincronização com 50% HS. Eixo x, hora (h) (tempo de tratamento pós-NMU); Eixo y, bioluminescência (contagem/min). (A) resultados de células transfectadas transitoriamente. (1) as células foram tratadas com 0, 0,25 ou 0,5 mM NMU, 20 nM EX527 ou cambinol de 1 µM por 1h após a sincronização. Amarelo: controle; vermelho: 0,25 mM NMU; verde: 0,5 mM NMU; azul: 20 nM EX527; amarelo verde: cambinol de 1 µm. (2) as células foram tratadas com 12,5 µM MSC sozinho ou em combinação com 20 nM EX527 ou cambinol de 1 µM em exposição seguinte média de 0,5 mM NMU de gravação. Amarelo: Controle; vermelho: 0,25 mM NMU; verde: 0,5 mM NMU; azul: 0.5 mM NMU + 12,5 µM MSC; amarelo verde: 0,5 mM NMU + 12,5 µM MSC + 20 nM EX527; roxo: 0.5 mM NMU + 12,5 µM MSC + cambinol de 1 µM. (B) resultados de células transfectadas estàvel. O 3rd- 5 picos deth que mostrou limpas e claras as diferenças entre os grupos são apresentados como um resultado representativo. (1) as células foram tratadas com 0, 0,5, 1,0 ou 2,0 mM NMU, 40 nM EX527 ou cambinol de 2 µM por 1h após a sincronização. Amarelo: Controle; vermelho: 0.5 mM NMU; verde: 1,0 mM NMU; azul: 2,0 mM NMU; amarelo verde: 40 nM EX527; roxo: 2 µM cambinol. (2) as células foram tratadas com 12,5 µM MSC na gravação de média exposição seguinte a 1,0 mM NMU. Amarelo: Controle; vermelho: 1,0 mM NMU; verde: 1,0 mM NMU + 12,5 µM MSC. (3) as células foram tratadas com seguinte de MSC 12,5 µM exposição de 40 nM EX257. Amarelo: Controle; vermelho: 40 nM EX257; verde: 40 nM EX257 + 12,5 µM MSC. (4) as células foram tratadas com seguinte de MSC 12,5 µM exposição a 2 µM cambinol. Amarelo: Controle; vermelho: 2 µM cambinol; verde: 2 µM cambinol + 25 µM, MSC. Este resultado foi relatado anteriormente e está licenciado sob a CC BY 2.022. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: NAC dose-dependente restaurado o celular ritmo circadiano interrompido por NMU. As células foram tratadas com 1,0 mM NMU ou o controle do veículo por 1h após a sincronização. (A) resultado representativo da bioluminescência (contagem/min) contra o tempo (h). Amarelo: Controle; vermelho: 1,0 mM NMU; verde: 1,0 mM NMU, 5 µM (CNA). azul: 1,0 mM NMU, 10 µM (CNA). amarelo verde: 1,0 mM NMU, 20 µM NAC. (B) período (horas). (C) fase (horas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Em células de mamíferos, periodicidade do relógio circadiano é regulada por loops de feedback transcriptional/translacional interconectadas. Heterodímeros de Bmal1 e o relógio ou o Npas2 regular circadian transcrição por ligação aos promotores do núcleo CGs, incluindo Per2 e chorare numerosos CCGs4elementos E-caixa. Como eles se acumulam na célula, heterodímeros de por: Cry post-translationally são modificados e transportados para o núcleo para reprimir a atividade transcricional de relógio: Bmal1. Este ciclo de feedback negativo permite núcleo CGs para regular sua própria transcrição e configurar a expressão rítmica da CGs e CCGs23. Embora as células mais mamíferas têm um relógio circadiano intrínseco, os relógios em células individuais podem ser sincronizados por ambas as condições intrínsecas (por exemplo, potencial redox) e estímulos ambientais externos24. Circadian gene expressão na vivo pode ser sincronizado por melatonina, um hormônio produzido pela glândula pineal em resposta a sinais recebidos do pacemaker central (SCN). O SCN integra os sinais de luz que incidem na especializada melanospin-expressando as células ganglionares da retina sensível à luz na retina. Melatonina liberada da glândula pineal entra a circulação e regula o ritmo circadiano do SCN e periférico a maioria das células in vitro e in vivode25,26. Ritmo circadiano também pode ser regulado por estresse hormônios (por exemplo, cortisol e catecolaminas)27,28 e fatores de crescimento29,30. Desregulamentação de fatores de crescimento é conhecida por ser associados rompimento circadiano de31, de crescimento e diferenciação celular.

O vetor de repórter circadian construímos explora este mecanismo de feedback negativo de bioquímicos. O loop de circadiano feedback negativo do núcleo é composto por ativadores transcricionais, BMAL1 e relógio, que se ligam aos motivos de vinculação E/E´-caixa circadianos em PER2 promotor e repressores PERs e CRYs, que regulam negativamente a expressão BMAL1. No actual sistema de repórter, a ativação rítmica do promotor PER2 por BMAL1 e relógio facilita a expressão circadiana da luciferase desestabilizado, permitindo uma periodicidade circadiana mais precisa de sinais de luminescência. A construção de um plasmídeo do repórter inclui o sítio de ligação do BMAL1, o site de aumentação do ritmo circadiano, caixa de GC e o site de início de transcrição do promotor hPER2 . O vetor permite a leitura em tempo real para celular ritmo circadiano autonômica, em células transfectadas e pode ser usado para identificar as condições ou agentes específicos que alterar este padrão circadiano endógeno de expressão gênica. No entanto, quando as células são cultivadas em vitro ou ex vivo, seus osciladores circadianos rapidamente se tornar dessincronizados. Portanto, é necessário sincronizar novamente seus ritmos antes de qualquer circadianos ensaios podem ser realizados em vitro. Nas células epiteliais mamárias, descobrimos que 50% HS, melatonina e 100% SQ foram cada um capaz de induzir a sincronização eficiente de ritmo circadiano em vitro. Dexametasona e forskolina produziram apenas sincronização parcial. Testes de dose-dependente seria necessários para o desenvolvimento e seleção de novos agentes sincronizando em estudos futuros. Dado a baixo custo, eficiência e sua ampla utilização como o agente de sincronização, 50% HS foi encontrado para ser um agente de sincronização eficaz que produziu robusto e reprodutível celular ritmo circadiano em células epiteliais mamárias e neural células, como anteriormente relatado em muitos outros tipos de células e diferentes configurações experimentais24.

Para validar o modelo em vitro de regulamento circadiano, em seguida perguntamos se a resposta do ritmo circadiano de estressores ambientais em vitro que recapitular os efeitos que observamos em vivo. Anteriormente, temos demonstrado que uma dose única de cancerígena de NMU interrompeu a expressão circadiana da CGs principais (por exemplo, Per2) e vários CCGs na glândula mamária de alvo. Além disso, um regime quimiopreventivo de MSC redefinir a expressão circadiana dos genes tanto Per2 e CCGs no sentido normal. Temos ainda mais demonstrado que a exposição a substâncias tóxicas das células e estressores podem alterar a expressão genética circadian através dos seus efeitos na NAD+-dependente SIRT1 atividade7,8,22. Os resultados obtidos usando o ensaio circadian repórter em vitro mostraram que a exposição a NMU causaram uma perturbação da expressão genética circadian celular, e que é mais interessante, MSC não é somente capaz de redefinir o ritmo circadiano celular perturbada por NMU, mas também redefinir o ritmo circadiano interrompido pelos inibidores SIRT1. Estes resultados indicaram que o ensaio in vitro não só reproduz os efeitos de NMU na expressão genética circadian, mas também reproduz os efeitos da MSC sobre o ritmo circadiano interrompido na vivo via mecanismos SIRT1-dependente. O sistema circadiano repórter in vitro , portanto, tem o potencial para detectar uma variedade de substâncias tóxicas e estressores que alteram os níveis de NAD+/NADH na célula, incluindo inibidores diretos e moduladores de redox celular ciclismo bem como genotóxicos agentes que podem esgotar NAD+ através de poli ADP-ribose DNA dependente reparar32. Estes resultados sugerem que o sistema de repórter em vitro fornece uma ferramenta útil para a tela para condições de célula e agentes químicos que podem perturbar ou restaurar genética circadian Regulamento na vivo.

Embora o ensaio em vitro pode ser configurado utilizando células transitoriamente ou estàvel transfectadas com construção de repórter, algumas diferenças foram anotadas na resposta ao tratamento de produtos químicos entre as células transfectadas transitoriamente e estàvel. As células transfectadas estàvel foram mais resistentes ao tratamento de produtos químicos, particularmente inibidores NMU e SIRT1, do que células transfectadas transitoriamente. Estas diferenças poderiam refletir diferenças sutis no Regulamento do promotor vector em transfectants estável devido às influências de sequências em torno de sites específicos de integração. Portanto, seleção de transfectants estável pelo tratamento com antibióticos pode também selecionar clones que são mais resistentes à ruptura circadiana. Assim, individuais em vitro modelos celular usando transfectants transitória ou estável devem ser validados pela sua habilidade para recapitular respostas na vivo . Métodos diferentes do transfection também induzem níveis variados de estresse genotóxico e toxicidade em células e o resultado de sua diferente susceptibilidade aos efeitos tóxicos de substâncias químicas. Portanto, citotoxicidade teste e piloto experimentos são necessários para a seleção das condições do transfection e tratamento. Apesar da diferença de sua sensibilidade, os resultados globais obtidos com nossas células mamárias epiteliais circadian repórter para interrupção e restauração de celular ritmo circadiano por produtos químicos foram coerentes e comparáveis entre transitoriamente células transfectadas e estàvel transfectadas e os resultados recapitulada os efeitos que observamos em vivo.

Para determinar se o vetor de repórter circadiano pode ser usado em outros tipos de células, células de glioblastoma humano/astrocitoma (U-87 MG) foram estàvel transfected com esse vetor circadiano. Os resultados preliminares usando o ensaio de bioluminescência celular em vitro mostram que, após a sincronização, estas células de tumor derivado de neural tem um regular e forte celular ritmo circadiano comparável àquela observada em humanos mamária células epiteliais. As células tratadocom com IC261, um conhecido inibidor de quinase de caseína 1 δ (CK1δ) e CK1 ε, apareceu um prolongado período circadiano, mas baixa amplitude como relatado by outros (dados não mostrados)33. Estes resultados indicam que a luciferase circadian repórter vector e in vitro bioluminescência celular ensaio são aplicáveis em outras células específicas do órgão, incluindo células neurais.

O sistema celular repórter desenvolvido aqui podia ser utilizado amplamente como um ensaio em vitro para determinação da expressão gênica circadiano em diferentes tipos de células em geral. O procedimento experimental é simples, rápido e seguro. No entanto, este sistema de repórter celular não pode ser facilmente adaptado em células que são difíceis de transfect, não-dividindo as células (por exemplo, células neuronais), desde que eles têm eficiências de transfeccao notoriamente baixo. Métodos baseados em vírus de transfeccao (por exemplo, do transfection lentivirus) podem oferecer uma solução de eficiência mais elevada para estas células34. No entanto, o tempo e a dificuldade associada à produção de Lentivirus torna este método difícil e demorado. Além disso, um laboratório de nível de segurança adequado é necessário para a produção e uso do vírus. Além disso, detectores de luminescência de célula única de alta resolução poderiam ser usados para a determinação de persistentes, de forma independente em fases ritmos circadianos da expressão do gene em não dividir células35.

Estudos de mamíferos ritmo circadiano na vivo são não só do trabalho intensivo e caro, mas eles também exigem o uso de um grande número de animais. A disponibilidade dos sistemas em vitro pode reduzir significativamente o número de animais necessários para testar as associações entre a interrupção da expressão genética circadian e o desenvolvimento de doenças crônicas, incluindo carcinogênese e metabólica Síndrome. Dados quantitativos sobre parâmetros circadianos, incluindo o período, amplitude e fase, podem informar a dose e / ou dependentes de tempo efeitos químicos no celular de ritmo circadiano. Por exemplo, observamos que antioxidante que NAC dose-dependente pode restaurar o período e fase de celular ritmo circadiano interrompido por NMU. O modelo in vitro também pode ser usado para tela e classificar os disruptores circadianos ambientais e para investigar o impacto da perturbação ritmo circadiano sobre o comprometimento da função celular, proporcionar insights mecanicistas para o desenvolvimento de estratégias de intervenção para coortes em risco aumentado de câncer de mama, síndromes metabólicas e distúrbios neurofisiológicos, devido a horários de trabalho anormais.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pela sociedade 2012 de toxicologia (SOT)-Colgate Palmolive Grant para pesquisa Alterative (M. Fang) e a pesquisa de colaboração internacional fundo de Animal e planta agência de quarentena, República da Coreia (M. Fang), e conceder as NIEHS P30ES005022 (H. Zarbl). Gostaríamos de agradecer o Dr. Zheng Chen (McGovern escola médica da Universidade do Texas Health Science Center em Houston) para sua discussão útil, Sr. Juan de Shao-An por sua assistência experimental e a Sra. Kimi Nakata para a leitura de prova.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector SwitchGear Genomics S700000 customized vector
pGL4.18[Luc2P/Neo] vector Promega 9PIE673 destabilized luciferase expression vector
T4 DNA ligase Invitrogen 15224041 For subcloning
TOPO TA cloning kit Invitrogen K4500-02 with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli
Sac I New England BioLabs R0156S Restriction enzyme
Hind III-HF New England BioLabs R3104S Restriction enzyme
CutSmart buffer New England BioLabs B7204S Restriction enzyme buffer
DNA gel extraction kit Qiagen 28704 Purify DNA fragments from agarose gel
PCR Purification Kit Qiagen 28104 DNA clean up
LB Miller's modification TEKNOVA L8600 For transformed E. Coli culture
LB Agar Plate TEKNOVA L1902 For white/blue selection
QIAprep spin miniprep Kit Qiagen 27104 For extraction of plasmide DNA
EndoFree plasmid maxi prep Kit Qiagen 12362 For extraction of plasmide DNA
FuGene HD Promega E2311 Transfection reagent
Opti-MEM reduced serum medium Invitrogen 31985-062 For transfection
MCF10A cell line American Type Culture Collection CRL-10317 Mammary Epithelial Cells
MEGM BulletKit Lonza CC-3150 Mammary Epithelial Growth Medium
MEBM Lonza CC-3151 Mammary Epithelial Basal Medium
MEGM SingleQuot Kit Lonza CC-4136 Suppliments & Growth Factors
ReagentPack Lonza CC-5034 Reagent for subculture
D-PBS (10X) Sigma D1408 Wash cells in culture dishes
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977 Dilute 10X D-PBS
Tissue culture dish (35 mm) BD/Falcon 353001 cell culture dish suitable to LumiCycle
Silicon grease Fisher NC9044707 For sealing dish with recording medium
Round cover glass Harvard Bioscience 64-1500 (CS-40R) For sealing dish with recording medium
Cholera toxin Sigma C8052 Supplement for growth medium
G418 sulfate (Geniticin) Invitrogen 10131035 Antibiotic for selection of stabliy transfected cells
Ampicillin Sigma A9393 For colony selection
Forskolin Sigma F6886 Synchronization agent
Melatonin Sigma M5250 Synchronization agent
Dexamethasone Sigma D4902 Synchronization agent
Horse serum Sigma H1138 Synchronization agent
d-Luciferin, sodium salt Invitrogen L2912 Luciferase substrate
IC261 Sigma 10658 Positive control for circadian disruptor
Methylnitrosourea (NMU) Sigma N1517 Mammary specific carcinogen
Methylselenocysteine (MSC) Sigma M6680 Organic selenium (chemopreventive agent)
EX527 Sigma E7034 SIRT1 specific inhibitor
Cambinol Sigma C0494 SIRT1 & SIRT2 inhibitor
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 8000 Quantify nucleotide
GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems N805-0200 For molecular biology experiment
CO2 Incubator NAPCO Series 8000 DH For cell culture at 5% CO2 at 37 °C
Desktop centrifuge with refrezerator Eppendorf 5430R For molecular biology experiment
Centrifuge with swing bucket Eppendorf 5810 R For cell culture
Inverted microscope Nikon 80124 Phase contrast optional
Tissue culture hood Labconco Class II A2 BSL-2 certified
LumiCycle 32 Actimetrics Not Available Luminoscence detector

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<em>In Vitro</em> Ensaio de bioluminescência para caracterizar o ritmo circadiano em células epiteliais mamárias
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Fang, M., Kang, H. G., Park, Y., Estrella, B., Zarbl, H. In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e55832, doi:10.3791/55832 (2017).More

Fang, M., Kang, H. G., Park, Y., Estrella, B., Zarbl, H. In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e55832, doi:10.3791/55832 (2017).

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