Summary
De presenterade protokoll beskrivs hur du utför en hemagglutination hämning analys för att kvantifiera influensa-specifik antikropp titrar från serumprover av influensa vaccin mottagare. Första analysen avgör optimal virusantigen koncentrationer av hemagglutination. Den andra analysen kvantifierar influensa-specifik antikropp titrar av hemagglutination hämning.
Abstract
Antikroppsnivåerna var används ofta som surrogatmarkörer för serologiska skydd mot influensa och andra patogener. Detaljerad kunskap om produktion av antikroppar före och efter vaccination krävs att förstå vaccin-inducerad immunitet. Denna artikel beskriver en pålitlig punkt-för-punkt-protokoll för att avgöra influensa-specifik antikropp titrar. Det första protokollet beskriver en metod för att ange de antigen belopp som krävs för hemagglutination, som standardiserar halterna för senare användning i det andra protokollet (hemagglutination assay, HA assay). Det andra protokollet beskriver kvantifiering av influensa-specifik antikropp titrar mot olika virusstammar med hjälp av en seriell utspädning av humant serum eller cell cellkulturer (hemagglutination hämning analys, HI assay).
Tillämpas exempelvis visar vi antikroppssvaret av en hälsosam kohort, som mottog en trivalent inaktiverat influensavaccin. Dessutom visas korsreaktivitet mellan de olika influensavirus och metoder för att minimera korsreaktivitet med olika typer av djurs röda blodkroppar (RBC) förklaras. Diskussionen belyser fördelar och nackdelar med de presenteras analyserna och hur fastställandet av influensa-specifik antikropp titrar kan förbättra förståelsen av vaccinrelaterade immunitet.
Introduction
Infektion med influensavirus är förknippat med betydande morbiditet, mortalitet och höga sjukvårdskostnader1,2,3,4. Särskilt löper äldre, nyfödda, gravida och patienter med kroniska sjukdomar risk för svårare kliniska resultat. Vaccination mot cirkulerande influensa virusstammar är därför den primära åtgärden för att minska sjukdomsbördan i dessa högriskgrupper. Ökningen av enskilda immunsvaret efter vaccination, t.ex., influensa-specifika antikroppar ovan en skyddande tröskel, minskar den individuella risken av infektion och i allmänhet sannolikheten för virusöverföring inom en befolkning 5. en detaljerad förståelse av det vaccin-inducerad humorala immunsvaret i olika populationer och i olika åldersgrupper är en nyckelfaktor att besvara viktiga kliniska frågor6,7,8 , 9, såsom: Varför har vissa äldre patienter infektioner trots tidigare vaccination? Vad är en ”bra” och ”tillräcklig” vaccin-inducerad skydd? Hur ofta ska ett vaccin tillämpas en immunsupprimerade patienten att nå skyddande titrar? Vad är den mest effektiva dosen? Vad är effekten av en roman adjuvant på efter vaccination antikroppsnivåerna var? Mätning av vaccinet-specifik antikroppsproduktion kan hjälpa svara på dessa viktiga frågor och förbättra vaccination utfall.
Kvantifiering av virus-specifika antikropp titrar kan utföras med olika immunologiska metoder. Detta inkluderar fasta fasen10 eller pärla-baserade ELISA11 -analyser, HI assay12och neutraliserande analyser13. ELISA-baserade metoder kan screening av relativt stora mängder serumprover mot olika antigener. Också, patogen-immunglobulin (Ig) M och IgG kan separat utforskas. Även om egenskaperna hos ett antigen, t exden linjära aminosyrasekvens eller virusliknande partiklar kan påverka bindningen av antikroppar, spektrumet av potentiella epitoper är mycket bred och ger ingen information om huruvida en antikropp svar har funktionell betydelse.
Däremot de neutralization assay bestämmer potentialen av antikroppar funktionellt hämma infektionen av celler och därför speglar neutralizationen potentiella. Men denna metod är mycket arbetsintensivt, kräver odling av cellinjer och levande virus, och därför, det är tidskrävande, dyra, och kräver särskild utrustning.
Denna artikel beskriver en stegvisa Världshälsoorganisationen WHO-baserade HI protokoll12 för att kvantifiera influensa-specifik antikropp titrar. Hemagglutination är en karakteristisk effekt av vissa virus som leder till agglutinationen av erytrocyter. Hämning av denna effekt med patientsera tillåter mätning av hämmande antikroppar, vilket återspeglar en neutraliserande effekt.
Vi har ändrat arbetsflödet av WHO-protokollet att tillåta en mer effektiv hantering av flera prover samtidigt och därmed minska tid som krävs. Det första protokollet beskriver bestämningen av ett särskilt influensa antigen agglutination potential. Så bestäms den rätta influensa antigen koncentrationen för det andra protokollet. Denna del bör upprepas med varje ny virusantigen, liksom varje batch av blod.
Det andra protokollet beskriver bestämningen av influensa-specifik antikropp titrar. De presenterade protokoll är optimerade för utredning av influensavirus och humant serumprover men, det kan också tillämpas för mus serumprover eller cell-cellkulturer från stimuleras immuna celler, t.ex., virus-specifika B-celler. Resultaten kan bestämmas som absolut uppmätta titrar. I många vaccin studier visas de geometriska titrarna och 95% konfidensintervallet för varje särskild population. För tolkning, seroprotektion eller serokonversion är ofta används för att beskriva känsligheten för en befolkning till vissa virus. Seroprotektion definieras som en titer ≥1: 40 och serokonversion som en mer än 4-faldig titer öka med prestation av seroprotektion antikroppnivåer mellan två tidpunkter (de flesta vanligen används före vaccination och 30 dagar efter vaccination).
Båda protokollen är lätt att använda och de kan anpassas till ett brett spektrum av frågeställningar. I synnerhet, de kan användas för att fastställa tillförlitligt och snabbt de antikropp titrarna mot olika andra virus med kapacitet för hemagglutination, såsom mässling, polyomaviruses, påssjuka eller röda hund14,15,16 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De studie protokoll godkändes genom den lokala etikprövningsnämnden (www.EKNZ.ch) och skriftligt informerat samtycke erhölls från alla deltagare.
1. serum samling
- Samla serumprover från människor vid tidpunkter av intresse. För denna studie samlat vi sera dagar 0 (tid för vaccination mot säsongsinfluensa), + 7, + 30, + 60 och + 180 efter vaccination.
- För att få serumet, Centrifugera provet rören vid 1200 x g under 10 minuter vid rumstemperatur (20-25 ° C).
Obs: Icke-centrifugeras blodprov ska förvaras vid 4 ° C, och längre än 24 h. - Alikvot serumet in olika tuber (cryo-flaskor) och frysa vid-80 ° C fram till användning.
- Utföra efterföljande analyserna batch-wise, inklusive alla-tidpunkter för en person att minska variationen inom en patient.
2. beredning av antigener
FÖRSIKTIGHET: Fem olika antigener som används (se Tabell för material). Förbereda antigener i ett laboratorium som biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2).
- Enligt tillverkarens anvisningar, rekonstruera det totala innehållet i en lyofiliserad influensa antigen ampull med 1,0 mL destillerat vatten och låt det upplösta antigenen stå i minst 5 min i rumstemperatur innan du fortsätter.
- Alikvotens antigen lösningen på 1,5 mL rör och frysa vid-80 ° C tills vidare användning.
3. beredning av kolera filtratet
Obs: Kolera filtratet används som en receptor som förstör enzymet (RDE) enligt WHO protokoll12. Detta tar bort medfödda hämmare från serumet som skulle störa den assay17.
- Bered det frystorkade RDE enligt tillverkarens anvisningar.
- Lagra RDE lösningen i en 15 mL tub vid 4 ° C tills vidare användning.
4. HA Assay
Obs: För att säkerställa att HI analyserna är jämförbara mellan flera plattor, samma mängd viruspartiklar måste användas för varje platta. HA analysen (kallas även HA titrering) utförs för att kvantifiera viruspartiklarna som är nödvändiga för hemagglutination, och registreras i HA enheter. En ”enhet” av hemagglutination är en operativ enhet som är beroende av vilken metod som används för HA titrering och är inte ett mått på ett absolut belopp av virus. Således definieras en HA enhet som mängden virus behövs agglutinerar en lika stor volym av en standardiserad RBC suspension. Enligt WHO är är mängden standard används för HI-analysen 4 HA enheter per 25 µL. En illustration av principen HA analysens se figur 1.
Figur 1 : Principen om hemagglutination och hemagglutination hämning. Ingen hemagglutination uppstår i en negativ kontroll situation utan virus och antikroppar (vänster kolumn) och erytrocyter hemagglutinate endast i närvaro av influensavirus (mellersta kolumnen). Men kan när hemagglutinin av influensavirus är blockerad av virus-specifika antikroppar då ingen hemagglutination förekomma (högra kolumnen). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Obs: De röda blodkropparna som används är beroende av vilken typ av influensavirus i analysen (tabell 1). Ytterligare, för olika typer av 96 brunnar micro titer plattor, inkubationstiden samt utseendet på icke-mikrokolonnen cellerna skiljer sig (tabell 2).
| Influensa-antigen | A/California/7/09 (H1N1) | A/Switzerland/9715293/2013 (H3N2) | A/Texas/50/2012 (H3N2) | B/Brisbane/60/08 | B/Massachusetts/02/2012 | ||
| RBC arter | Kyckling | Marsvin | Marsvin | Turkiet | Turkiet | ||
Tabell 1: influensa antigener och motsvarande arter av röda blodkroppar. Enligt tillverkarens anvisningar (NIBSC).
| RBC arter | Kyckling | Turkiet | Marsvin | Mänskliga typ O |
| Koncentrationen av röda blodkroppar (v/v) | 0,75% | 0,75% | 1% | 1% |
| Typ av mikrotiterplattan | V botten | V botten | U botten | U botten |
| Inkubationstiden, RT | 30 min | 30 min | 1 timme | 1 timme |
| Utseende av icke-mikrokolonnen celler | Knappen * | Knappen * | Halo | Halo |
Tabell 2: Assay förhållanden med olika arter av röda blodkroppar. Enligt WHO-protokollet. (* flödar när man vippar).
-
Beredning av RBC suspensionen
- Späd den RBC stamlösning (10%, v/v; utom mänskliga typ O) (se Tabell för material) med fosfat buffrad saltlösning (PBS) för att göra ordentlig koncentrationerna för fågelinfluensa och däggdjur röda blodkroppar av 0,75% och 1%, respektive.
Figur 2 : Plåt design HA analysens. HA titreringen utförs i dubbletter. Ingen antigen lades till kontroll raderna. Se även figur 4 för bestämning av den bästa antigen koncentrationen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
-
Beredning av 96 brunnar Micro Titer plattan
Obs: Se figur 2 en översikt över den platta designen.- Tillsätt 25 µL av PBS brunnar 1 till 12 av varje begagnad rad 96 brunnar micro titer platta med hjälp av en flerkanalspipett (figur 2). Använd den V-formade mikro titer plattan när du arbetar med aviär röda blodkroppar, som kyckling och kalkon. Använd U-formad micro titer plattan när du arbetar med däggdjur röda blodkroppar, som marsvin och mänskliga typ O (tabell 2).
- Tillsätt 25 µL influensa antigen i den första brunnen antigen-rader, som är ordnade i dubbletter. Ingen antigen tillsätts kontroll raderna. Kontroll raderna bör inte visar en hemagglutination effekt och fungera som negativa kontroller (figur 2).
- Utföra en seriell 2-faldig utspädning genom att överföra 25 µL från den första brunnen antigen-rader till successiva brunnar med hjälp av en flerkanalspipett. Blanda varje utspädningssteg genom pipettering upp och ner försiktigt 10 gånger.
- Kassera den slutliga 25 µL av de sista brunnarna.
- Tillsätt 25 µL av PBS brunnar 1 till 12 av varje begagnad rad med hjälp av en flerkanalspipett, för att nå en total volym på 50 µL per brunn.
- Tillsätt 50 µL av RBC suspensionen till varje används väl med hjälp av en flerkanalspipett.
- Knacka plattan noggrant 10 gånger på alla fyra sidor för att blanda.
- Täck tallriken med lock och inkubera vid rumstemperatur i lämplig mängd tid beroende på den RBC arter används (se tabell 2). Flytta inte plattan medan ruvning.
Figur 3 : Agglutination mönster av fågelinfluensa och däggdjur röda blodkroppar. V-formade mikro titer plattor används när du arbetar med aviär röda blodkroppar. Utläsningen utförs i en lutande plattan position, och icke-mikrokolonnen röda blodkropparna börjar köra ner bildar en tår-liknande form. U-formad mikrotiter plattor används när du arbetar med däggdjur röda blodkroppar. Utläsningen utförs sedan i en icke-lutad position, och icke-mikrokolonnen röda blodkropparna bildar en liten Gloria. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
-
Läsa på plattan
Obs: Utslaget är något annorlunda när du använder aviär RBC: er jämfört med däggdjur röda blodkroppar, på grund av olika formade mikro titer brunnarna (figur 3).- Avläsning av aviär röda blodkroppar
- Luta plattan 90° för 25 s.
Obs: Luta plattan är avgörande för differentiering av aviär mönster, eftersom alla tre olika typer av agglutination mönster (helt mikrokolonnen, delvis mikrokolonnen och icke-mikrokolonnen) visas som en knapp när inte lutar. - Markera resultaten omedelbart, medan plattan är fortfarande i en lutande ställning, på en utskriven ordning med plattan med 96 brunnar. Agglutination mönster av de aviära RBC: er visas i figur 3.
- Luta plattan 90° för 25 s.
- Avläsning av däggdjur röda blodkroppar
- Markera resultat på ett utskrivet system över plattan med 96 brunnar, utan att luta plattan (vågrät position på bänken).
Obs: När hemagglutination uppstår agglutinated cellerna inte nöja sig till botten, medan icke-mikrokolonnen celler visas som en Gloria på botten av brunnen. Halo delvis agglutinated celler är mindre intensiv och har en större diameter (figur 3).
- Markera resultat på ett utskrivet system över plattan med 96 brunnar, utan att luta plattan (vågrät position på bänken).
- Bestämning av 4 HA enheter.
Obs: HA titrering slutpunkten är sista brunnen där komplett hemagglutination uppstår. Detta innehåller väl 1 HA enhet av virus. På grund av de 2-faldig utspädningarna av antigenet, två brunnar före slutpunkten HA titrering är den brunn som innehåller 4 HA enheter av virus (figur 4).
- Avläsning av aviär röda blodkroppar
Figur 4 : Uppläsningen HA titreringen med aviär röda blodkropparna att fastställa antikroppnivåns på 4 HA enheter. Det optimala antigen belopp som krävs för hemagglutination mäts genom hemagglutination analysen (antigen titrering assay). Sista brunnen där komplett hemagglutination uppstår är slutpunkten HA titrering och innehåller 1 HA enhet. På grund av de 2-faldig utspädningarna av antigenet, två brunnar före HA titrering slutpunkten, motsvarar titern 4 HA enheter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
5. Hej Assay
Obs: Arbete-flödet av protokollet har optimerats för att möjliggöra en effektivare hantering av flera prov samtidigt, med hjälp av PCR tube ränder och en thermo apparat (se nedan).
-
Beredning av proverna som Serum
Obs: Förbereda serumprover i BSL-2 laboratorium.- Tina de frysta serumprov för varje tidpunkt varje persons (se steg 1.2) vid rumstemperatur.
- Lägga till en alikvot av 10 µL av varje tinade serumprov i en tub med en PCR-röret remsa (10-rör i en remsa).
Obs: Den stora fördelen med hjälp av PCR-röret remsor är att en flerkanalspipett kan användas för följande steg i HI-analysen; Detta sparar mycket tid när du testar en stor mängd serumprover och när utför upprepade åtgärder av samma prov för antikroppsnivåerna var mot olika virusstammar. - Lagra de aliquoted serumprover i PCR-röret remsor vid-80 ° C fram till användning.
- En dag innan HI analysen utförs, Tina de serum prov alikvoter av intresse vid rumstemperatur.
- Tillsätt 10 µL av lämplig anti serum till en tom PCR-röret.
Obs: för att tjäna som en positiv kontroll, anti serum mot ett specifikt virus måste matcha används viruset. Den positiva kontrollen tillåter standardisering av plattan prestanda över flera plattor. - Lägga till 30 µL av kolera filtratet lösning till varje alikvot som serum och anti serum (3 volymer av kolera filtratet till 1 volymdel serum) med hjälp av en flerkanalspipett.
- Hålla PCR-rören i en PCR 96 brunnar rack eller en tom tip-ruta och virvel för 5 s.
- Inkubera proverna över natten vid 37 ° C med hjälp av en termo-apparat.
- Inkubera proverna vid 56 ° C i 30 min att inaktivera kolera filtratet med hjälp av en termo-apparat.
Obs: Beroende på den thermo apparat, detta steg kan programmeras till att ytterligare automatisera processen. - Hålla PCR-rören i en PCR 96 brunnar rack eller en tom tip-ruta och virvel för 5 s.
- Lagra proverna vid 4 ° C i kylskåpet tills användning för HI-analysen.
Figur 5 : Plåt design och arbetsflöde HI analysens. Fem punkter av två personer kan mätas på en tallrik. I HI-titern varierar från 8 till 1 024. Ett anti serum används antigenet fungerade som positiv kontroll och en återtitrering utfördes för att kontrollera om antigen utspädning motsvarar 4 HA enheter. Seriell utspädning av serumprovet visas 2 individuella vaccinerade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
-
Hej assay
Obs: En illustration av principen om HI analysen se figur 1. Beroende på viruset används olika arter av röda blodkroppar för analysen (tabell 1). Olika arter av röda blodkroppar används i olika typer av 96 brunnar och inkubationstiden samt utseendet på icke-mikrokolonnen cellerna skiljer sig (tabell 2). För HI analysen tillsätts 4 HA enheter av virus eller antigen 2-faldig utspädning serien av proverna.-
Beredning av antigen
- Beräkna volymen av antigen lösning behövs beroende på antalet 96 brunnar används (25 µL antigen per väl × 96 = 2 400 µL antigen per plattan med 96 brunnar, tillsätt 100 µL per platta extra på grund av användningen av en reservoar för flerkanalspipett; totalt 2,5 mL antige n per platta).
Obs: om du mäter 100 serumprover sedan 10 plattor är exempelvis behövs (10 prover per platta): 2,5 mL x 10 = 25 mL av antigenet lösning behövs totalt. - Förbereda korrekt spädning av 4 HA enheter för den beräknade volymen med PBS.
Obs: 4 HA enheter bestäms för HA analysen. För lämplig mängd antigen, dela den beräknade volymen av titern motsvarar 4 HA enheter. Exempelvis 4 HA enheter motsvarar en utspädning om 1/64, och vi behövde 15 000 µL antigen lösning behövs: 15.000/64 = 234,4 µL av upplöst frystorkade influensa antigenet läggs.
- Beräkna volymen av antigen lösning behövs beroende på antalet 96 brunnar används (25 µL antigen per väl × 96 = 2 400 µL antigen per plattan med 96 brunnar, tillsätt 100 µL per platta extra på grund av användningen av en reservoar för flerkanalspipett; totalt 2,5 mL antige n per platta).
-
Beredning av RBC suspensionen
- Beräkna volymen av RBC suspension behövs enligt antalet 96 brunnar micro titer plattor används (50 µL RBC suspension per väl × 96 = 4 800 µL RBC suspension per plattan med 96 brunnar; tillsätt 200 µL per platta extra på grund av användningen av en reservoar för flerkanalspipett) .
- Späd den RBC stamlösning (normalt 10%, v/v; utom mänskliga typ O) med PBS att göra ordentlig koncentrationerna för fågelinfluensa och däggdjur röda blodkroppar av 0,75% och 1%, respektive.
-
Beredning av 96 brunnar micro titer plattan
- Etikett 96 brunnar micro titer plattorna (prov-ID, positiv kontroll och återtitrering). Kontrollera noga med plattan orientering i figur 5 .
- Tillsätt 25 µL av PBS till varje brunn utom till den första brunnen på raden ”Återtirering” (figur 5, 12: te raden) med hjälp av en flerkanalspipett.
Obs: En återtitrering utfördes för att kontrollera om används antigen utspädning motsvarar 4 HA enheter. Ett antigen titer 4 HA enheter indikeras om hemagglutination uppstår i de första tre brunnarna på raden ”Återtirering”, men inte i fjärde väl. - Tillsätt 50 µL beredda antigen lösningen (beskrivs i 5.2.1) i den första brunnen på raden ”Återtirering” (12: e raden).
- Tillsätt 25 µL av de RDE-behandlade serumprover till de första brunnarna i raderna 1 till 10 på varje platta, med hjälp av en flerkanalspipett.
- Tillsätt 25 µL av lämplig anti serumet till den första brunnen av 11th raden som positiv kontroll.
- Utför 2-faldig seriespädningar genom att överföra 25 µL från den första brunnen av varje rad (1-12) till successiva brunnar med hjälp av en flerkanalspipett. Blanda genom pipettering upp och ner 10 - 15 gånger för varje utspädningssteg. Samma tips kan användas för varje utspädningssteg per prov.
- Kassera den slutliga 25 µL av de sista brunnarna.
- Tillsätt 25 µL antigen lösningen med hjälp av en flerkanalspipett till varje brunn av raderna 1 till 11 (serumprover och anti serum). Samma tips kan användas om de inte röra brunnarna.
- Tillsätt 25 µL av PBS istället för antigen till varje brunn på raden ”Återtirering” (12: e raden).
- Knacka plattan noggrant 10 gånger på alla fyra sidor för att blanda.
- Täck tallriken med lock och odla i rumstemperatur i 30 min. Flytta inte plattan medan ruvning.
- Tillsätt 50 µL av den RBC suspensionen till varje brunn.
- Knacka plattan noggrant 10 gånger på alla 4 sidor att blanda.
- Täck tallriken med lock och inkubera vid rumstemperatur i lämplig mängd tid beroende på den RBC arter används (se tabell 2). Flytta inte plattan medan ruvning.
-
Läsa på plattan
Obs: HI titern är det reciproka värdet av den sista utspädningen (anti-) serum som helt hämmar hemagglutination. Det är viktigt att överväga att RDE-behandlade sera var redan utspädd 1:4 och efter den seriella utspädningssteg, sera i första brunnarna är utspädd 1:8, vilket motsvarar en HI-titer av 8.- Avläsning av aviär röda blodkroppar
- Luta plattan 90° för 25 s.
Obs: Luta plattan är avgörande för differentiering av aviär mönster, eftersom alla tre olika typer av agglutination mönster (helt mikrokolonnen, delvis mikrokolonnen och icke-mikrokolonnen) visas som en knapp när inte lutar. - Markera resultaten omedelbart, medan plattan är fortfarande i en lutande ställning, på en utskriven ordning med plattan med 96 brunnar. Agglutination mönster av aviär RBC: er visas i figur 3.
- Luta plattan 90° för 25 s.
- Avläsning av däggdjur röda blodkroppar
- Markera resultat på ett utskrivet system över plattan med 96 brunnar, utan att luta plattan.
Obs: När hemagglutination uppstår agglutinated cellerna inte nöja sig medan icke-mikrokolonnen celler visas som en Gloria på botten av brunnen. Halo delvis agglutinated celler är mindre intensiv och har en större diameter (figur 3). - Bestämma HI av varje prov och överföra den till en dator-baserad tabell (figur 6)
- Obs: Delvis mikrokolonnen brunnar fastställdes som en lägre titer. Till exempel om ett serumprov helt hämmar hemagglutination upp till 4: e väl (1: 64 utspädning) och den 5: e väl (1.128 spädning) är delvis mikrokolonnen, då den HI-titern är inställd på den lägre titern 64 för den slutliga analysen (figur 6, 4: e raden).
- Markera resultat på ett utskrivet system över plattan med 96 brunnar, utan att luta plattan.
- Avläsning av aviär röda blodkroppar
-
Beredning av antigen
Figur 6 : Uppläsningen HI analysens med aviär RBC. Före och efter vaccination inducerad influensa-specifik antikroppsreaktion bestäms av HI-analysen. I det här exemplet har person en högre HI-titrar än person två. Båda personerna visar ett antikroppssvar efter vaccination; 180 dagar efter vaccination är de antikropp titrarna av båda personer minskade igen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Före och efter vaccination induced antikroppsreaktion mot influensa A H3N2
Vaccin-inducerad antikroppssvaret bedömdes i 26 friska frivilliga som fick ett inaktiverat trivalent subenhet influensavaccin innehållande influensa A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 och B/Massachusetts/02/2012 före 2014 / säsongen 2015 influensa. Figur 6 visar ett representativt exempel på 2 vaccinerade. Intressant, under särskilt influensa säsong, A/H3N2/Texas/2012 inte cirkulerar, och i stället säsongen ingår något annorlunda viral stammen: A/H3N2/Schweiz/2013. Den virala hemagglutinin A/H3N2/Texas/2012 och A/H3N2/Schweiz/2013 visar 97% sekvens identitet och skiljer sig i endast elva aminosyror (se tabell 4), vars position är markerade i figur 7.
Figur 7 : Hemagglutinin jämförelse av A/H3N2 influensastammar. Vi jämförde hemagglutinin av viral stammar A/Texas/50/2012 och A/Switzerland/9715293/2013. Eftersom det finns ingen hemagglutinin kristallen strukturerar dessa stammar, använde vi kristallstrukturen i den mycket liknande hemagglutinin influensa stam A/Victoria/361/201118, som visar 98% sekvens identitet med Texas stam och 95% sekvens identitet med Schweiz stam. Aminosyrapositioner där de Texas och Schweiz stammarna variera markeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Vi observerade en korsa-reactive immunsvar för viral stammar A/H3N2/Schweiz/2013 och A/H3N2/Texas/2012. Hej var titrarna mot influensa A/H3N2/Schweiz/2013 betydligt lägre i form av geometriska titrar och inducerad seroprotektion (figur 8A) i jämförelse med influensa A/H3N2/Texas/2012 (figur 8B).
Figur 8 : Geometriskt medelvärde antikropp-titrar av friska donatorer. De geometriska medelvärdet antikropp-titrarna (GMT) av 25 friska donatorer före och efter vaccination bestäms med två olika antigener. De genomsnittliga titrarna av A/H3N2/Schweiz/2013 (A) och A/H3N2/Texas/2012 (B) visas. Ett immunsvar på grund av vaccinationen kan observeras som ökar titrar efter vaccinationen (d7-d60), jämfört med GMT före vaccineringen (d0). 180 dagar efter vaccinationen, minska GMT igen. Notera når bara A/H3N2/Texas/2012 (som var i vaccinet) skyddande titrar. Staplarna visar geometriska titrar, och morrhår tyder 95% konfidensintervallen. Den streckade linjen visar seroprotektion tröskeln. % Seroskyddade människor (titer > 1:40) visas i grafen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Efter vaccination ökade var antikropp-titrarna mot A/H3N2/Texas/2012 i de flesta ämnen; även om A/H3N2/Schweiz/2013 stammen inte var närvarande i vaccinet, ökat titern mot A/H3N2/Schweiz/2013 i vissa ämnen samt. Figur 9 visar sambandet mellan båda titrar över alla tidpunkter med en R2 i 0.745 för en linjär regressionsmodell. Som man skulle förvänta sig, var induktion av antikroppssvaret mot A/H3N2/Schweiz/2013 mindre potent.
Figur 9 : Korsreaktion mellan A/H3N2 influensastammar. De A/H3N2/Texas titrarna av varje individuell och tid punkt plottas mot de motsvarande A/H3N2/Schweiz-titrarna. En linjär regressionsmodell visar en R2 i 0.745. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Hemagglutination potentiella baseras på vilken typ av blod som används
Den virala hemagglutinin visar olika arter-beroende potential att hemagglutinate erytrocyter. Denna artspecifikt effekt påverkar också hemagglutination hämning analysen. För att förbättra uppmätta anti-virala titrar specificitet, vi utvärderat den bästa lämpade typ av erytrocyter för fem virala antigener (influensa B/Brisbane/60/2008 och B/Massachusetts/02/2012, influensa A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 och A / H3N2/Switzerland/2013) att uppnå den maximala hemagglutination, men också den lägsta korsreaktivitet. Vi använde positiva kontrollsera från Institutet för biologiska standarder och kontroll (NIBSC) mot varje antigen för att utföra dessa analyser.
För influensa B, kunde vi konstatera att B/Massachusetts/02/2012 inducerad antikroppssvaret inte ger skydd mot B/Brisbane/60/2008. Däremot visade antikroppar mot B/Brisbane/60/2008 korsreaktivitet mot B/Massachusetts/02/2012 på en 4-faldig lägre titer över olika erytrocyter (se tabell 3). Av intresse, marsvin blod inte ordentligt hemagglutinate med influensa B. Turkiet blod gjorde bäst i visar potential att hemagglutinate och de högsta titrarna med relativt låg korsreaktivitet förutom den tidigare nämnda A/H3N2/Texas och / Schweiz stammar.
| Turkiet | Marsvin | Kyckling | Mänskliga typ O | |
| B/Brisbane | 1024 | - | 1024 | 1024 |
| B/Massachusetts | 1024 | 384 | 768 | 1024 |
| A/H3N2/Schweiz | 1024 | 1024 | - | 1024 |
| A/H3N2/Texas | 1024 | 1024 | 512 | 1024 |
| A/H1N1/Kalifornien | 1024 | 1024 | 768 | 768 |
Tabell 3: Positiv kontroll titrarna mot respektive influensa HA antigen mellan olika arter.
| Nej | A/H3N2/Texas/2012 stam | A/H3N2/Schweiz/2013 stam | Ställning |
| 1 | Asparagin (N) | Alaninaminotransferas (A) | 128 |
| 2 | Alaninaminotransferas (A) | Serine (S) | 138 |
| 3 | Isoleucin (I) | Arginine (R) | 140 |
| 4 | Arginine (R) | Glycin (G) | 142 |
| 5 | Asparagin (N) | Serine (S) | 145 |
| 6 | Fenylalanin (F) | Serine (S) | 159 |
| 7 | Glycin (G) | Valin (V) | 186 |
| 8 | Proline (P) | Serine (S) | 198 |
| 9 | Serine (S) | Fenylalanin (F) | 219 |
| 10 | Asparagin (N) | Aspartat (D) | 225 |
| 11 * | Lysin (K) | Arginine (R) | 326 |
| * inte visas i kristallstrukturen i figur 8, eftersom hemagglutinin var kapade på rester 325. | |||
Tabell 4: Förteckning över olika aminosyror av hemagglutinin mellan stammar A/H3N2/Texas/2012 och A/H3N2/Schweiz/2013
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kvantifiering av före och efter vaccination influensa virus specifik antikropp titrar är ett viktigt verktyg som är nödvändiga för vaccinet studier. Baserat på åtgärderna som surrogat för skydd mot virusinfektion, såsom seroprotektion (> 1:40) eller serokonversion (4-faldig titer ökning), vaccination strategier kan vara optimerade9. Med hjälp av de medföljande protokoll kan bestämma: a hemagglutination potential ett virus, och (ii) antikropp titrar för ett virus av intresse.
Ändring och felsökning:
Detta protokoll baseras på WHO standard12. Vi ändrade protokollet med hjälp av PCR-röret remsor för serum preparat (se steg 5). Denna ändring som bidragit till att avsevärt minska arbetsbelastningen och öka genomflödet i analysen. Vidare, vi minskade antigen med en fjärdedel i antigen titrering steg, vilket är kostnadseffektivt övertid. En lägre mängd serum (10 µL) kan användas för RDE behandling, som hjälper speciellt när provet är begränsad (t.ex., mus sera). De återtitrering och positiv kontroll ingår i antikropp mätning plattan att fungera som en god intern kontroll och övervaka åldrandet av erytrocyter.
Dessutom har vi använt olika erytrocyt koncentrationer än de i WHO standard12 ställa in den optimala storleken av erytrocyt koagel för en bra visuell avläsning. För att garantera detta föreslår vi att kontrollera erytrocyt koncentrationen före analysen. Även om, vi inte har optimerat denna del i våra protokoll, skulle metoder såsom absorbansen mätning med OD eller cell inventering kunna användas.
Om RDE inte är helt inaktiverat, kan röda blodkropparna desialylated och omvänd HA-positiva brunnar när hemagglutination mäts vid rumstemperatur. Även om vi observerade aldrig detta problem, i detta fall föreslår vi utför HI vid 4 ° C, eftersom RDE aktivitet är betydligt lägre vid 4 ° C. Dock är utför HI analysen vid 4 ° C långsammare.
Begränsningar av tekniken:
Några kritiska aspekter av HI analysen innefatta följande punkter: intressant, hemagglutination är starkt beroende av den särskilda typ av erytrocyt (t.ex., Turkiet eller marsvin RBC). Den optimala typ av blod bör testas innan en viss virusstam utvärderas och samma typ av blod bör användas i hela analysen. Även om induktion av korsreaktivitet mellan virus kan generera en immunologisk fördel när det gäller en något ny virus19,20, kan detta orsaka vissa problem från en diagnostisk synpunkt på grund av låg specificitet. Därför bör arg reactivity mellan liknande virus noggrant tas upp och diskuteras i studier. Genom att välja erytrocyter från en specifik art, kan beloppet av korsreaktivitet sänkas något.
Betydelse med avseende på befintliga metoder:
HI är en väletablerad guldmyntfoten metod ger mycket reproducerbara och tillförlitliga resultat. Andra tekniker såsom ELISA kan upptäcka icke-neutraliserande antikroppar, medan HI endast detekterar antikroppar som binder till HA stam slingan och därmed korrelerar med neutralisering.
Kritiska steg i protokollet:
De viktigaste stegen inkluderar serum behandling med RDE att inaktivera ospecifik hämmare och bindande att HA viruset. Ett annat viktigt steg är att kontrollera för hemolys av erytrocyterna när de åldras över tiden.
Framtida tillämpningar:
Protokollet kan användas för andra virus med hemagglutination potentiella. Även om vi har bara visat resultat på Humansera prover här, kan analysen också användas att mäta antikropp titrar i mus sera eller i cellkultur supernatant med stimuleras B-celler (inga data anges). Sammanfattningsvis tillåter HI en snabb och reproducerbar bedömning av vaccininducerade antikropp titrar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
A.E. stöddes av ett forskningsanslag från programmet ”SNSF Ambizione Poäng” (PZ00P3_154709), ”Forschungsfond, Förderung strategischer Projekte” universitetar av Basel, Stiftungsinfektionskrankheiten Basel och Bangeter Rhyner Stiftung. Larsson fick stöd av ett bidrag på det tekniska universitetet i Graz, Österrike. J.L. erkänner stöd av ett iPhD stipendium för initiativet SystemsX.ch i system biologi program (9th ring).
Acknowledgments
ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 ml Disposable Multichannel Pipette Reservoirs | Integra | 4312 | |
| 8-well PCR tubes | Brand GMBH | 781332 | For serum aliquots |
| 96-well microtiter plate, U-shaped | TPP | 92097 | For HI assay when using mammalian RBCs |
| 96-well microtiter plate, V-shaped | Corning Costar | 3897 | For HI assay when using avian RBCs |
| Aqua ad iniect. Steril | Bichsel AG | 1000004 | For preparing influenza antigen and cholera filtrate solutions |
| Chicken RBC (10%) | Cedarlane | CLC8800 | 10% suspension of chicken red blood cells in Alsever's solution |
| Cholera filtrate | Sigma-Aldrich | C8772 | Used as receptor destroying enzyme (RDE) |
| Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | For diluting the serum samples, RBCs and antigens |
| Eppendorf Multichannel pipette, 12-channel, 10-100 µl | Sigma-Aldrich | Z683949 | |
| Eppendorf Multichannel pipette, 8-channel, 10-100 µl | Sigma-Aldrich | Z683930 | |
| Guinea Pig RBC (10%) | Cedarlane | CLC1800 | 10% suspension of guinea pig red blood cells in Alsever's solution |
| Influenza Anti-A/California/7/09 HA serum | NIBSC | 14/134 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-A/Switzerland/9715293/2013-like HA serum | NIBSC | 14/272 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-A/Texas/50/2012-Like HA Serum | NIBSC | 13/178 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-B/Brisbane/60/2008-HA serum | NIBSC | 13/254 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-B/Massachusetts/02/2012 HA serum | NIBSC | 13/182 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza antigen A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) | NIBSC | 12/168 | Inactivated, partially purified A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) virus (ca. 46µgHA/ml) |
| Influenza antigen A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) | NIBSC | 14/254 | Inactivated, partially purified A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) virus (ca. 55µgHA/ml) |
| Influenza antigen A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) | NIBSC | 13/112 | Inactivated, partially purified A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) virus (ca. 74µgHA/ml) |
| Influenza antigen B/Brisbane/60/2008 | NIBSC | 13/234 | Inactivated, partially purified B/Brisbane/60/2008 virus (ca. 42µgHA/ml) |
| Influenza antigen B/Massachusetts/02/2012 | NIBSC | 13/134 | Inactivated, partially purified B/Massachusetts/02/2012 virus (ca. 35µgHA/ml) |
| Serum-Tubes | S-Monovette, Sardstedt | 01.1601.100 | For serum extraction with clotting activator |
| Single Donor Human RBC, Type 0 | Innovative Research | IPLA-WB3 | Suspension of single donor human red blood cells in Alsever's solution (ca. 26%) |
| Turkey RBC (10%) | Cedarlane | CLC1180 | 10% suspension of turkey red blood cells in Alsever's solution |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco |
References
- Prevention and control of seasonal influenza with vaccines. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices--United States, 2013-2014. MMWR Recomm Rep. 62, Centers for Disease, C. & Prevention. RR-07 1-43 (2013).
- Dominguez-Cherit, G., et al. Critically Ill patients with 2009 influenza A(H1N1) in Mexico. JAMA. 302 (17), 1880-1887 (2009).
- Fox, B. D., et al. Pandemic influenza (H1N1): impact on lung transplant recipients and candidates. J Heart Lung Transplant. 29 (9), 1034-1038 (2010).
- Piercy, J., Miles, A., Krankheiten, S. B. fG. S. V., Values, M. The Economic Impact of Influenza in Switzerland: Interpandemic Situation. , Swiss Federal Office of Public Health, Division of Epidemiology and Infectious Diseases, Section of Viral Diseases and Sentinel Systems. (2003).
- Barclay, V. C., et al. Positive network assortativity of influenza vaccination at a high school: implications for outbreak risk and herd immunity. PLoS One. 9 (2), 87042 (2014).
- Baluch, A., et al. Randomized controlled trial of high-dose intradermal versus standard-dose intramuscular influenza vaccine in organ transplant recipients. Am J Transplant. 13 (4), 1026-1033 (2013).
- Haralambieva, I. H., et al. The Impact of Immunosenescence on Humoral Immune Response Variation after Influenza A/H1N1 Vaccination in Older Subjects. PLoS One. 10 (3), 0122282 (2015).
- Egli, A., et al. Vaccine adjuvants--understanding molecular mechanisms to improve vaccines. Swiss Med Wkly. 144, 13940 (2014).
- O'Shea, D., Widmer, L. A., Stelling, J., Egli, A. Changing face of vaccination in immunocompromised hosts. Curr Infect Dis Rep. 16 (9), 420 (2014).
- Meulemans, G., Carlier, M. C., Gonze, M., Petit, P. Comparison of hemagglutination-inhibition, agar gel precipitin, and enzyme-linked immunosorbent assay for measuring antibodies against influenza viruses in chickens. Avian Dis. 31 (3), 560-563 (1987).
- Martins, T. B. Development of internal controls for the Luminex instrument as part of a multiplex seven-analyte viral respiratory antibody profile. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (1), 41-45 (2002).
- Webster, R., Cox, N., Stöhr, K. WHO Animal Influenza Manual. WHO/CDS/CSR/NCS. 2002.5, 1-99 (2002).
- Mittelholzer, C. M., et al. Human cell lines used in a micro neutralization test for measuring influenza-neutralizing antibodies. Scand J Immunol. 63 (4), 257-263 (2006).
- Hamilton, R. S., Gravell, M., Major, E. O. Comparison of antibody titers determined by hemagglutination inhibition and enzyme immunoassay for JC virus and BK virus. J Clin Microbiol. 38 (1), 105-109 (2000).
- Kumakura, S., et al. Comparison of hemagglutination inhibition assay and enzyme immunoassay for determination of mumps and rubella immune status in health care personnel. J Clin Lab Anal. 27 (5), 418-421 (2013).
- Ogundiji, O. T., Okonko, I. O., Adu, F. D. Determination of measles hemagglutination inhibiting antibody levels among school children in Ibadan, Nigeria. J Immunoassay Immunochem. 34 (2), 208-217 (2013).
- Cwach, K. T., Sandbulte, H. R., Klonoski, J. M., Huber, V. C. Contribution of murine innate serum inhibitors toward interference within influenza virus immune assay. Influenza Other Respir Viruses. 6 (2), 127-135 (2012).
- Lee, P. S., et al. Receptor mimicry by antibody F045-092 facilitates universal binding to the H3 subtype of influenza virus. Nat Commun. 5, 3614 (2014).
- Blumel, B., et al. Age-related prevalence of cross-reactive antibodies against influenza A(H3N2) variant virus, Germany, 2003 to 2010. Euro Surveill. 20 (32), 16-24 (2015).
- Reber, A. J., et al. Seasonal Influenza Vaccination of Children Induces Humoral and Cell-Mediated Immunity Beyond the Current Season: Cross-reactivity with Past and Future Strains. J Infect Dis. , (2016).
