Summary
Мы исполняли односторонних сонной артерии окклюзии на послеродовой день CD 7-10-1 мыши щенков для создания неонатальная гипоксически ишемического (HI) модели и изучается воздействие Привет черепно-мозговой травмы. Мы изучили нейроповеденческие функции в этих мышей, по сравнению с неоперированных обычных мышей.
Abstract
Мы выступали односторонних сонной артерии окклюзии на мышах CD-1 для создания неонатальная гипоксически ишемического (HI) модели и исследованы эффекты неонатального Привет черепно-мозговой травмы, изучая нейроповеденческие функции в этих мышей, по сравнению с неоперированных (т.е., нормальный) мышах. В ходе исследования Райс-Vannucci метод был использован для побудить неонатальной HI повреждения головного мозга в постнатальном день 7-10 (P7-10) мышах. Перешнуровка односторонних сонной артерии и воздействия гипоксии (8% O2 и 92% N2 90 мин) на щенков была выполнена операция HI. Через неделю после операции, поврежденные мозги были оценены с нагим глазом через полупрозрачный череп и были разделены на подгруппы, основанный на отсутствие (Группа «не корковых вред») или наличие (Группа «корковых вред») коры головного мозга травмы, такие поражения в правом полушарии. На неделе 6, следующие нейроповеденческих испытания были проведены оценки когнитивных и двигательных функций: пассивный расторжения (ПЭТ), лестница задачи ходьба испытания и испытания на прочность сцепления. Эти поведенческие тесты полезны в определении последствий черепно-мозговой травмы новорожденных Привет и используются в других моделях мыши нейродегенеративных заболеваний. В этом исследовании новорожденных мышей травмы мозга Привет показал мотор дефициты, которые соответствуют повреждения правого полушария. Результаты поведенческих тестирования имеют отношение к дефицит наблюдается у человека новорожденных Привет пациентов, как церебральный паралич или неонатальной инсульт пациентов. В этом исследовании модель мыши черепно-мозговой травмы новорожденных HI была создана и показал разной степени моторного дефицита и когнитивные нарушения, по сравнению с неоперированных мышей. Эта работа предоставляет основные сведения о модели мыши HI. МРТ изображения демонстрируют разные фенотипы, разделенных мотор и когнитивных тестов в зависимости от тяжести повреждения головного мозга.
Introduction
Черепно-мозговой травмы новорожденных Привет происходит во время раннего детства (примерно двух пациентов на 1000 детей)1,2,3,4,5. Важное значение имеют исследования относительно неонатальной Привет черепно-мозговой травмы, и с использованием установленных неонатальной Привет мозга травмы мыши модели могут облегчить в vivo доклинические исследования на Привет черепно-мозговой травмы.
Традиционные модели HI используются на6взрослых крыс. Для модели новорожденным Райс-Vannucci метод обычно используется P7 крысы7,8. Однако, так как крыс и мышей несколько иной9,10, даже если они оба грызунов, мы провели модифицированный метод риса-Vannucci на CD-1 щенков P7-10, основанный на предыдущих исследований, которые показали, что P7-10 является период с изображением незрелые олигодендроциты, соответствующий термин человека P011,12. Новорожденных модель мыши Привет устанавливается через оба перевязка сонной артерии, односторонние и облучения мышей к гипоксии с 8% кислорода в P7-10 щенков.
Мышей подвергали процедуре показан различной степени поражения мозга в области задне правого полушария. Для определения когнитивных и двигательных дефицита, нейроповеденческих оценок на основе ПЭТ, были исполнены лестницы пешком испытания и испытания на прочность сцепления. Были проанализированы различия между неоперированных (то есть, нормальный) и HI мышей. Эта работа представляет основную информацию о мышиной модели HI. МРТ изображения демонстрируют разные фенотипы, разделенных в зависимости от тяжести повреждения мозга с помощью мотора и когнитивных тестов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные были размещены в стандартные клетке (27 × 22,5 × 14 см3) в объекте аккредитованных в ассоциации оценки и аккредитации лабораторных исследований на животных (AAALAC) и питания и воды ad libitum под чередуя 12-h Светлый/темный циклов. Авторы следовали правилам защиты животных, и экспериментальной процедуры были одобрены институциональный уход животных и использование Комитета из Йонсейского университета колледж медицины (IACUC № 2010-0252; 2013-0220).
1. мышь модель неонатальной Привет черепно-мозговой травмы
- Анестезировать щенков с изофлюрановая.
- Уложите обезболивающим поле щенков (менее 5) и закройте крышку.
- Включите обезболивающим системы для примерно 15 мин; Отрегулируйте газ и изофлюрановая, с использованием таблицы Топ анестезия машины. Отрегулируйте расходомера кислорода до 1,5 Л/мин Отрегулируйте изофлюрановая испарителя до 3-5% для индукции анестезии.
- После 15 минут Отрегулируйте изофлюрановая испаритель для 1-2% для поддержания анестезии.
- Заложить полностью наркотизированных щенка под микроскопом диссекции (живот, стоящих перед исследователем) и закрепите его с лентой.
- Сделайте ~0.7-mm разрез в области шеи, стерилизованные ножницами.
- Тщательно удалите жировой ткани с помощью стерильный пинцет и разоблачить одностороннее право сонной артерии.
- Перевязать одностороннее право сонной артерии с рассасывающиеся шовные 5-0.
- Шов надрез в шею с 5-0 швом.
- Место каждого щенка в теплой гипоксических камере 37 ° C на 1 ч для восстановления. Не закрывайте крышку камеры.
- 1 час после операции, когда щенки полностью проснулся, закройте крышку камеры гипоксии и снизить уровень газа для создания гипоксических условий (8% O2 и 92% N2).
- После 90 минут гипоксии возвращение детенышей в их клетках.
- Через неделю после травмы мозга Привет, повторите шаг 1.
- После анестезии сделать надрез в коже головы с стерилизованные ножницы, щипцы для выявления поражений мозга в области задне правого полушария.
Примечание: Эта процедура вызывает гипоксии у детенышей. Наличие и степень повреждения мозга у всех мышей визуально оценивается с нагим глазом через полупрозрачный череп. Как определяется размер и объем обесцвечивание (т.е., поражением мозга), щенков делятся на группы. Если есть нет видимых повреждений коры головного мозга, мышь классифицируется в группе «без коры головного мозга травмы». Если есть видимые повреждения коры головного мозга (т.е., поражения в правом полушарии), мышь классифицируется в группе «корковых вреда». Поскольку классификация мышей в группы делается через одну неделю после операции, группировки могут быть изменены, когда морфологии мозга образцов четко определены во время жертвоприношения1,2,3, 4.
- После анестезии сделать надрез в коже головы с стерилизованные ножницы, щипцы для выявления поражений мозга в области задне правого полушария.
Рисунок 1: Моделирование неонатальной HI черепно-мозговой травмы у мышей.
(A) 7 дневных мыши щенок прооперировали, и лигируют одностороннее право сонной артерии. (B) щенки были помещены в гипоксических камеру для 90 минут с 8% O2 и N 92%2. (C, D и E) Мозги с новорожденным Привет травмы показали различные степени тяжести повреждения и были разбиты, основанные на степени повреждения. На неделе 14 мозги были получены, и поражения были визуализированы. (C) изображения мозга, классифицируются как «не корковых вреда». Оба (D) и (E) были разделены на группы «корковых вреда». (F, G и H) Представитель МРТ (c), (D) и (E) мышах, соответственно. (F повреждения в гиппокампе, обозначается желтой стрелкой, и поражения в правом полушарии также указаны с желтой стрелки (G и H). Масштаб баров = 1 мм пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
2. новорожденных поведенческие тесты
Примечание: Здесь, поведенческие тесты были выполнены в возрасте 6 недель.
-
Пассивный избежания задачи.
Примечание: Для оценки функции памяти, основанные на обучение и недопущение отрицательной стимул, двухкамерные шаг через ПЭТ должны быть проведены13,14,,1516.- Поместите мышь в отсеке светлые окна Трансфер оргстекла (41,5 × 21 × 35 см3) аппарата ПЭТ.
- После 30 s, открыть дверцу гильотинные и записывать время задержки для мыши для перемещения в темный отсек (до 300 s).
- Закройте дверцу Гильотина, когда все четыре конечности мыши полностью внутри темно отсека.
- Администрировать электрические ног шок (0,5 мА) для 2 s и возвращение мыши в своей клетке.
- Замените мышь в отсеке яркий 24 ч после шока электрические ног.
- Откройте дверь 10 s гильотинные после того, как мышь полностью помещается в отсеке яркие и записывать время задержки для мыши для перемещения в темный отсек (до 300 s).
-
Пешеходные тест лестница.
Примечание: Пешком задача ступеньки лестницы позволяет дискриминацию между тонкие нарушения двигательной функции путем комбинирования качественного и количественного анализа квалифицированных пешком17,18.- Включите видеокамеру.
- Место мыши на панели Пуск по лестнице и сразу же начать запись.
- Запись видео, сосредоточив внимание на мыши конечностей.
- Остановите запись, когда указатель мыши касается последней группы по лестнице. Повторите поездку туда и обратно в четыре раза.
- Анализ записи видео и вручную подсчитать количество слипов каждого передних конечностей, следующим образом:
- Играть, запись видео на компьютер с медленной скоростью (0.1 x) и рассчитывать шаги вручную.
-
Испытания на прочность сцепления.
Примечание: Испытания на прочность на сжатие выполняется с помощью сцепление сила метр, который включает в себя двухтактный тензодатчика.- Прикрепите аппарат прочность сцепления на акриловые панели.
- Поместите мышь на акриловые панели и удерживайте его хвост.
- Перемещение руки, держа хвост так, что мышь может достигать и Ручка металлическая проволока аппарата.
- Разрешить несколько судебных разбирательств до тех пор, пока мышь ручки треугольный кусок металлической проволоки (2 мм в диаметре); Пиковое усилие автоматически регистрируется в граммах аппаратом.
Примечание: Используйте средней максимальной силы трех судебных процессов для анализа19,,2021.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Все данные выражаются как среднее ± Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM). Сравнение переменных между двумя группами был проведен с использованием независимой или паре t-тест на программного обеспечения статистики SPSS. P-значение < 0,05 считался статистически значимой.
Мозги с новорожденным Привет травмы показал разной степени тяжести повреждения и были распределены соответственно (Рисунок 1 c- E). Мозги были получены на неделе 14, и поражения были визуализированы. Рисунок 1 c показывает мозга, классифицируются как «не корковых травмы» мозга, Рисунок 1 d показывает классифицируются как мягкий травмы мозга, а Рисунок 1E серьезно поврежден мозг. Мягкая (D) и (E) тяжелые травмы были разделены на группы «корковых вреда». После операции Привет, 13-week-old мышей были образы с помощью МРТ, и результаты (Рисунок 1F-H) представитель изображения (C), (D) и (E) травм, соответственно. Несмотря на то, что не было никаких существенных поражений на морфологии мозга, изображения МРТ показало гиппокампа травмы (Рисунок 1F). Повреждение гиппокампа (Рисунок 1F, обозначается желтой стрелкой) слегка проявляется в мозге, мягко потерпевшего. В сильно поврежденных мозга мышь потеряла большую часть правого полушария (Рисунок 1 g и H, обозначается желтой стрелкой).
Поскольку мозг с Привет травмы показало гиппокампа травмы (Рисунок 1F-H), мышей с Привет травмы выставлены памяти, дефицит по сравнению с обычной мыши. ПЭТ производительность является тесно связанной с гиппокампа ущерб13,,1516,19. Рисунок 2 показывает, что мышей с Привет травмы более познавательные дефициты, чем нормальные мыши13, оцененной в ПЭТ (нормальный n = 10; Привет n = 9). Было отмечено статистически значимой разницы между базовой и тест памяти 24-h в обычных мышей, как показано на рисунке 2А (*p = 0,003, основанные на паре t-тест). Рисунок 2B показывает изменения в когнитивной функции в HI травмы мышей по сравнению с нормальным мышей (Дельта (Δ) является различие между базовым и тест 24-h)13.
Потому что только правого полушария был поврежден, новорожденных мышей травмы мозга Привет показал гемиплегическая двигательные функции. Разница в процентах скользит на поперечной перекладины лестницы относительно общее количество шагов, предпринятых каждой передних конечностей была использована для сравнения обычных мышей с новорожденным Привет мозга травмы мышей17,19. Рисунок 3 показывает, что уровень скольжения контралатеральной передних конечностей в мышах травмы мозга Привет был значительно выше, чем в обычных мышей (нормальный n = 19; Привет n = 18; *p = 0,010, основанные на независимых t-тест)22, но никакой разницы было отмечено в ипсилатеральные Передняя конечность(p = 0.798, основанные на независимых t-тест).
Кроме того так как прочность сцепления включает моторной коры головного мозга, нормального и корковые травмы групп показали различия в захват власти. Хотя результаты от прочности сжатия теста показали никакой разницы между нормальной и не корковых травмы мышей (Рисунок 4а; нормальной n = 4; не корковых травмы n = 12), график показывает, что сила сцепления контралатеральной передних конечностей была значительно слабее в корковых травмы мышей, чем в обычных мышей (Рисунок 4б; нормальной n = 4; корковых травмы n = 36; *p = 0,036, основанные на независимых t-тест)21,,22-23.
Рисунок 2: ПЭТ новорожденных Привет черепно-мозговой травмой и обычных мышей.
(A время задержки в отсеке яркие был измеряется и сравнивается между неонатальной Привет черепно-мозговой травмой и обычных мышей (n = 9, n = 10, соответственно). (B измерения на данный момент электронной ударной считался базовой, и долговременной памяти оценивалась 24 ч после поражения электрическим током. Дельта (Δ) 24-h задержка была разница между функцией, оценивается в 24 ч и в базовых. p< 0,05; все данные выражаются как среднее ± SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Передняя конечность скорость скольжения в лестнице пешком тест.
Ставки скольжения контралатеральной и ипсилатеральные передних конечностей были оценены между нормальной и HI мозга травмы мышей (n = 19 и n = 18, соответственно). p< 0,05; все данные выражаются как среднее ± SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Ручка испытание на прочность в неонатальной Привет черепно-мозговой травмой и обычных мышей.
Сила сцепления контралатеральной передних конечностей была оцениваются и сопоставляются между нормальной, не корковых травмы (A) и (B) корковых травмы мышей (n = 4, n = 12, n = 36). * p< 0,05; все данные выражаются как среднее ± SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании мы индуцированной Привет черепно-мозговой травмы новорожденных мышей P7-10 CD-1 и определили поражения мозга с соответствующими когнитивных и двигательных дефицита. Во время этой процедуры важнейшее окклюзии одностороннее право сонной артерии. В этот шаг артерии можно было повреждено и войной. Большинство щенков, которые пережили разрыв артерии умер. И наоборот если исследователи лигируют другой Вена крови вместо одностороннее право сонной артерии, был лишь слегка поврежден мозг щенка, и без существенных фенотипом могут наблюдаться24.
В этом исследовании, из-за различий в мышей и объема поражения, мозги были разбиты на несколько групп (Рисунок 1 C-H). Несколько мышей с мягко потерпевшего мозги были повреждения только в гиппокампе, а не в кортикальной региона (Рисунок 1F)13. И наоборот несколько мышей с сильно поврежденных мозги, которые потеряли большую часть правого полушария и коре были серьезно повреждены (Рисунок 1 g и H). Таким образом исследователи должны определить размер поражения одной недели после процедуры19,25. Так как мозги были оценены с использованием МРТ, определение объема и размера поражения был более надежным. Поэтому мы рекомендуем, что исследователи оценить мозги, МРТ, хотя возможна также визуального осмотра невооруженным глазом.
Церебральный паралич обычно происходит в раннем детстве, с заболеваемости примерно двух пациентов на 1000 детей5. Так как новорожденных модель мыши Привет может быть представителем модель ДЦП или неонатальной инсульт4,11,26, базовой информации из этого исследования может использоваться в доклинических исследованиях по ДЦП или новорожденных инсульта.
Нейроповеденческих оценки полезны для идентификации фенотипов когнитивных и двигательных дефицита13. Нейроповеденческих оценок, в этом исследовании также приспосабливаются и часто используются для других нейродегенеративных заболеваний, таких как Хантингтон, Паркинсона и так далее. Исследователи должны осознавать, что, во время ПЭТ, субъектов получить поражение электрическим током. Таким образом ПЭТ должно выполняться Последнее, поэтому поражения электрическим током не влияет на другие поведенческие оценки.
Для дальнейшего исследования исследователи должны учиться Шам действует группа по сравнению с группой HI. Для определенного элемента управления группы исследователи могут сделать надрез на шее и закрыть разрез без каких-либо перевязки артерии. Чтобы имитировать операцию Привет, этих щенков следует положить в гипоксических камеру, но без гипоксии, за такое же количество времени как группы HI до возвращения в их клетках.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют не конкурирующие интересы.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантов от Национальный исследовательский фонд (СР 2014R1A2A1A11052042; 2015M3A9B4067068), Министерство науки и технологии, Республика Корея, корейский здравоохранения технологии R & D проекта (HI16C1012), Министерство здравоохранения и Благосостояние, Республика Корея и программа помощи исследований факультета «Dongwha» Йонсейского университета колледжа медицины (6-2016-0126).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hypoxic chamber | Jeung Do Bio & Plant Co | Experimental Builder | |
| PAT apparatus | Jeung Do Bio & Plant Co | Experimental Builder | |
| The ladder rung walking | Jeung Do Bio & Plant Co | Experimental Builder | |
| SDI Grip Strength System | San Diego Instruments Inc. | ||
| Grip-Strength Meter | Ugo Basile | 47200 | |
| Harvard Apparatus Fluovac anesthetizing system | Harvard Apparatus | ||
| Anesthetizing box | acryl box | ||
| I-Fran Liquid (Isofluorane) | Hana Pharm. Co., Ltd. | General Anesthetics ( isoflurane 100ml) | |
| CD-1 mice | Orient Co., Ltd. | ||
| Blue Nylon Mono Non-Absorbbable suture 5-0 50cm | Ailee Co., Ltd. | NB 521 | |
| IBM SPSS Statistics | IBM | Ver. 23 |
References
- Yager, J. Y. Animal models of hypoxic-ischemic brain damage in the newborn. Semin Pediatr Neurol. 11 (1), 31-46 (2004).
- Vannucci, R. C., et al. Rat model of perinatal hypoxic-ischemic brain damage. J Neurosci Res. 55 (2), 158-163 (1999).
- Im, S. H., et al. Induction of striatal neurogenesis enhances functional recovery in an adult animal model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Neuroscience. 169 (1), 259-268 (2010).
- Clowry, G. J., Basuodan, R., Chan, F. What are the Best Animal Models for Testing Early Intervention in Cerebral Palsy? Front Neurol. 5 (258), 1-17 (2014).
- Colver, A., Fairhurst, C., Pharoah, P. O. Cerebral palsy. Lancet. 383 (9924), 1240-1249 (2014).
- Levine, S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am J Pathol. 36, 1-17 (1960).
- Rice 3rd, J. E., Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Ann Neurol. 9 (2), 131-141 (1981).
- Lafemina, M. J., Sheldon, R. A., Ferriero, D. M. Acute hypoxia-ischemia results in hydrogen peroxide accumulation in neonatal but not adult mouse brain. Pediatr Res. 59 (5), 680-683 (2006).
- Brazel, C. Y., Rosti 3rd, R. T., Boyce, S., Rothstein, R. P., Levison, S. W. Perinatal hypoxia/ischemia damages and depletes progenitors from the mouse subventricular zone. Dev Neurosci. 26 (2-4), 266-274 (2004).
- Buono, K. D., et al. Mechanisms of mouse neural precursor expansion after neonatal hypoxia-ischemia. J Neurosci. 35 (23), 8855-8865 (2015).
- Rumajogee, P., Bregman, T., Miller, S. P., Yager, J. Y., Fehlings, M. G. Rodent Hypoxia-Ischemia Models for Cerebral Palsy Research: A Systematic Review. Front Neurol. 7 (57), 1-20 (2016).
- Hagberg, H., Peebles, D., Mallard, C. Models of white matter injury: comparison of infectious, hypoxic-ischemic, and excitotoxic insults. Ment Retard Dev Disabil Res Rev. 8 (1), 30-38 (2002).
- Wi, S., Yu, J. H., Kim, M., Cho, S. R. In Vivo Expression of Reprogramming Factors Increases Hippocampal Neurogenesis and Synaptic Plasticity in Chronic Hypoxic-Ischemic Brain Injury. Neural Plast. 2016 (2580837), 1-11 (2016).
- Lu, Y., Christian, K., Lu, B. BDNF: a key regulator for protein synthesis-dependent LTP and long-term memory? Neurobiol Learn Mem. 89 (3), 312-323 (2008).
- Manabe, T., et al. Facilitation of long-term potentiation and memory in mice lacking nociceptin receptors. Nature. 394 (6693), 577-581 (1998).
- Alonso, M., et al. BDNF-triggered events in the rat hippocampus are required for both short- and long-term memory formation. Hippocampus. 12 (4), 551-560 (2002).
- Seo, J. H., et al. In Situ Pluripotency Factor Expression Promotes Functional Recovery From Cerebral Ischemia. Mol Ther. 24 (9), 1538-1549 (2016).
- Kim, M. S., et al. Environmental enrichment enhances synaptic plasticity by internalization of striatal dopamine transporters. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (12), 2122-2133 (2015).
- Lee, M. Y., et al. Alteration of synaptic activity-regulating genes underlying functional improvement by long-term exposure to an enriched environment in the adult brain. Neurorehabil Neural Repair. 27 (6), 561-574 (2013).
- Rha, D. W., et al. Effects of constraint-induced movement therapy on neurogenesis and functional recovery after early hypoxic-ischemic injury in mice. Dev Med Child Neurol. 53 (4), 327-333 (2011).
- Chong, H. J., Cho, S. R., Jeong, E., Kim, S. J. Finger exercise with keyboard playing in adults with cerebral palsy: A preliminary study. J Exerc Rehabil. 9 (4), 420-425 (2013).
- Chong, H. J., Cho, S. R., Kim, S. J. Hand rehabilitation using MIDI keyboard playing in adolescents with brain damage: a preliminary study. NeuroRehabilitation. 34 (1), 147-155 (2014).
- Seo, J. H., Yu, J. H., Suh, H., Kim, M. S., Cho, S. R. Fibroblast growth factor-2 induced by enriched environment enhances angiogenesis and motor function in chronic hypoxic-ischemic brain injury. PLoS One. 8 (9), e74405 (2013).
- Washington, P. M., et al. The effect of injury severity on behavior: a phenotypic study of cognitive and emotional deficits after mild, moderate, and severe controlled cortical impact injury in mice. J Neurotrauma. 29 (13), 2283-2296 (2012).
- Cho, S. R., et al. Astroglial Activation by an Enriched Environment after Transplantation of Mesenchymal Stem Cells Enhances Angiogenesis after Hypoxic-Ischemic Brain Injury. Int J Mol Sci. 17 (9), 1-15 (2016).
- Tsuji, M., et al. A novel reproducible model of neonatal stroke in mice: comparison with a hypoxia-ischemia model. Exp Neurol. 247, 218-225 (2013).
