Intranasal levering af terapeutiske stamceller til glioblastom i en musemodel

Summary

Stamceller er lovende terapeutiske bærere til at behandle hjernetumorer på grund af deres indre tumor tropisme. Ikke-invasiv intranasal stamcelleudlevering omgår blodhjernebarrieren og viser stærkt potentiale for klinisk oversættelse. Denne artikel opsummerer de grundlæggende principper for intranasal stamcelle levering i en musemodel af gliom.

Abstract

Den egentlige tropisme mod hjernens maligniteter gør stamceller som lovende bærere af terapeutiske midler mod maligne tumorer. Levering af terapeutiske stamceller via den intranasale vej er en nyligt opdaget alternativ strategi med stærkt potentiale for klinisk oversættelse på grund af dets ikke-invasive karakter sammenlignet med intrakraniel implantation eller levering via systemiske veje. Manglen på blodhjernebarriere styrker yderligere det terapeutiske potentiale hos stamceller, der gennemgår intranasal hjerneindgang. Denne artikel opsummerer de væsentlige teknikker, der anvendes i vores undersøgelser, og beskriver de grundlæggende principper for intranasal strategi for stamcelletilførsel ved hjælp af en musemodel af intrakraniale gliomentraler. Vi demonstrerer de optimerede procedurer, der genererer konsistente og reproducerbare resultater med specifikke forudbestemte eksperimentelle parametre og tilbyder retningslinjer for strømlinet arbejdsstrøm, der sikrer effektiv eksekvering og pålidelig eksperimentNtal udfald. Artiklen er designet til at fungere som en basislinje til yderligere eksperimentel tilpasning baseret på hypotese, stamceller eller tumorspecifikationer.

Introduction

Lav toksicitet, lav immunogenicitet og indre hjernetumor tropisme af humane stamceller er attraktive træk ved levering af terapeutiske vehikler ¹ . Nye stamceller-baserede terapier til maligne hjernetumorer er lovende innovationer udviklet i de senere år, og den intranasale tilpasning af denne terapeutiske strategi er et spring mod klinisk oversættelse, idet ikke-invasiv og gentagen administration dramatisk kan reducere barrieren for patientapplikationer og Kan være tilpasningsberettigede til outpatienttjenester uden generel anæstesi eller langvarig patientbehandling i forbindelse med invasive kirurgiske procedurer ^{1 , 2 , 3 , 4} .

Vi og andre har ført til den intranasale vej for stamcelleudlevering til hjernetumorer og har lagt jorden til at arbejde for nogle af de grundlæggende principperAf translationel forskning ved anvendelse af muse xenograft-modeller ^{2 , 3 , 4} samt undersøgelse af migration af stamceller in vivo via magnetisk resonansbilleddannelse (MRI) reagensbærere ² . Gennem disse pilotundersøgelser har vi samlet stor erfaring og fået indsigt i, hvordan man bedst kan opbygge en robust præklinisk evalueringsstrategi ved brug af veletablerede patenterede xenograft (PDX) musemodeller af malignt gliom, samtidig med at undersøgelsesresolutionen opretholdes for at undersøge Nyanserede mekaniske detaljer af de sofistikerede biologiske fænomener af den intranasale hjerneindtrængning af terapeutiske stamceller leveret til næsehulen. Her beskriver vi principperne for en standardiseret driftsprotokol for at demonstrere den aktuelle tilstand af eksperimentelle undersøgelser ved anvendelse af en veletableret human neural stamcellelinje HB1.F3.CD ⁵ 6 ^{, 7 , 8} , som let kan modificeres til at tilpasse sig specifikke tumormodeller eller strategier ved anvendelse af humane stamceller som terapeutiske bærere.

Protocol

Alle dyreprocedurer skal godkendes af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) eller tilsvarende. Hvis der er nogen usikkerhed om de specifikke procedurer, der er beskrevet heri, skal du ikke fortsætte. Afklare med institutionens IACUC og et udpeget veterinærmedlem.

1. Sikring af dyrkning af dyrkede celler og følge principper for aseptiske teknikker

1. Følg standard god laboratoriepraksis i alle cellekulturprocedurer og IACUC-krav til celleprøvning og patogenfri statusbekræftelse forud for administration til mus ^{9 , 10} .
2. Følg NIH-kravet til celleautentificering for at sikre reproducerbart resultat ¹¹ .
3. Følg etablerede aseptiske teknikker til små dyrkirurgi beskrevet i dette manuskript ⁴ .

2. Fremstilling af gliomaceller til <Em> In vivo-eksperiment ^{2 , 4}

1. Kulturgliomaceller (GBM43, GBM6 og U87MG) i serumholdigt (10% føtalt bovint serum i Dulbecco's Modified Eagle's medium [DMEM]) eller serumfrit medium (Neurobasal medium med tilskud B27, N2, heparin, epidermal vækstfaktor [ EGF], basisk fibroblastvækstfaktor [bFGF], antibiotika og L-glutamin ¹² ) i en befugtet CO ₂ -cellekultur-inkubator.
   1. Test alle cellelinjer via det muscle clear panel, der køres fra kommercielle tjenesteudbydere.
2. Saml vedhæftende celler ved at fjerne kulturmedium. Inkuber med 0,05% trypsin i 5 minutter ved stuetemperatur (1 ml trypsin til T25 kolbe, 2 ml for T75 kolbe, skala tilsvarende for dyrkningskolber med større overfladeareal) og vask derefter celler med Ca ²⁺ og Mg ²⁺ frit fosfat Pufret saltvand (PBS).
   1. Tryk påKolben for at fjerne cellerne og straks neutralisere med et overskud af serumholdigt medium (8 - 9 ml). Brug derefter serologiske pipetter til at aspirere cellesuspensionen i centrifugerør.
   2. Centrifugesuspension ved 400 xg i 5 minutter. Vask cellen mindst to gange med 10 ml PBS ved gentagen centrifugering.
   3. Indsamle gliomaceller dyrket som tumorkugler i serumfrit medium via centrifugering (samme hastighed og varighed som ovenfor); Dissocierer cellepellet ved inkubation i 1 - 2 ml celleopløsningsopløsning ved 37 ° C i 5 minutter, før der vaskes to gange med 10 ml PBS ved centrifugering (400 x 5 x 5 min).
   4. Gendann glioma i steril saltopløsning i en koncentration på 50.000 - 200.000 celler pr. 2,5 μL igen. Celle tal, der anvendes til injektion i musens hjerne, afhænger af den etablerede væksthastighed for hver gliomacellinje. Her bruger 25.000 og 100.000 for henholdsvis GBM43 og GBM6 patient-afledte tumorceller.
   5. Forbered dobbelt mængden af ​​neceSsary celle nummer til implantation for at tage højde for tab af en brøkdel under proceduren. Overfør injicerbar cellesuspension til et sterilt mikrocentrifugerør og læg rør på is. Hold celler på is i maks. 2 timer under operationer, forbered nyt batch, hvis der udføres forlængede operationer.

3. Intrakranial Implantation til at skabe Xenograft Mouse Modeller ( Figur 1A ) ^{2 , 4 , 13}

1. Før operationens dag steriliseres alle kirurgiske værktøjer i en autoklav og tilbereder alt præ- og postkirurgisk dyreplejemateriale pr. IACUC-godkendt protokol. Sterilisere den stereotaxiske ramme og perifert udstyr for at sikre intraoperative aseptiske tilstande, hvilket minimerer komplikationer.
2. Organiser operationsområdet for at minimere rod og mulighed for kontaminering.
3. Kjole i passende personlig beskyttelsesudstyrMent (PPE) pr. IACUC-krav.
4. Opsætning af passende postoperativt opsvingskammer. Sørg for at anæstetika og analgetika er tilberedt frisk ved hjælp af uventede reagenser. Opsæt passende kropsvarme vedligeholdelsesinstrumenter pr. IACUC godkendt protokol.
5. For at etablere humane patient-afledte gliomacellexenotater til testning af intranasal afgivelse af humane NSC'er, skal der anvendes immunforstøvede musetyper som nu / nu athymisk mus af ethvert køn ved ca. 6 uger.
6. Bedøve dyret baseret på kropsvægt ved hjælp af de godkendte reagenser, enten via en intraperitoneal (ip) injektion af en blanding af ketamin (50-100 mg / kg, konsulter institutionel IACUC for godkendt dosisområde) og xylazin (5-10 mg / Kg; konsulter institutionel IACUC for godkendt dosisområde) i 200-250 μL steril saltvand eller via 4-5% isofluranbedøvelse ved hjælp af en inhalationsanordning.
   1. Sørg for, at dyret har nået det kirurgiske bedøvelsesplan bY tå klemmer før hud indsnit. Påfør rigelig steril oftalmisk gel for at sikre fugtigheden af ​​hornhinden hos dyret.
7. Steriliser kraniet ved hjælp af gentagne og vekslende cirkulære kludder af betadin og isopropylalkohol pr. Pritchett-Corning et al. ¹⁴ .
8. Tilfør præ-incisions analgesien ved sc-indsprøjtning af Buprenex (0,05 - 2 mg / kg) inden indsnit med brug af kirurgisk blad.
9. Brug steriliseret bomuldsspids applikator for at hjælpe hæmostat under udsættelse af kraniet; Brug 3% hydrogenperoxid for at lette afklaringen af ​​tilfældig blødning.
10. Brug en batteridrevet håndholdt elektrisk kuglepenboring (mindre end 1 mm i bredden) for at skabe et burrhul ved 2 mm lateralt, enten til venstre eller højre, til midterlinjen og 2 mm bag Bregma (positionskoordinaterne kan tilpasses baseret På tumormodellen beregnet til en bestemt undersøgelse).
11. Monter dyret til den stereotaxiske ramme til den passendeE hovedposition, således at den indsatte Hamilton mikrosprøjte er vinkelret på overfladen af ​​kraniet omkring burrhullet. Pas på at sikre, at dyrets bedøvelsesplan er i god stand ved tåen. Overhold respirationshastigheden for at sikre, at dyret ikke er under smerterspænding i de følgende trin.
    * Vi lægger ikke vægt på in-ear-barplaceringer fordi:
    1. Vi har forborret burrhullet til at positionere nålen, og derfor er præcise kranietkoordinater unødvendige;
    2. Mus øre kanaler er skrøbelige, og den præcise in-ear placering af øre barer kræver mere involveret træning, der ikke er relevant for vores formål. Risikoen for skade på murine ørekanaler opvejer fordelene ved en præcis placering;
    3. Cheek support er meget nemmere at udføre og i stand til at opnå de samme niveauer af musens hovedstabilitet og balance under positionering. Det er en ekstra fordel for flere tidsfølsomme operationer at sikreRettidig afslutning med god celle levedygtighed.
12. Brug de stereotaxiske rammeknapper til at placere den flade spidsmikrospray til burrhullet, og sænk det langsomt til 3 mm under dura-overfladen. Træk 0,5 mm tilbage for at opretholde nålens spids ved 2,5 mm under dura.
13. Injicer 2,5 μl preloaded gliomaceller i løbet af 1 min. Lad nålen opretholde sin position i endnu 1-2 minutter før langsomt i løbet af 1 min. At trække nålen ud af hjernen og sørge for at minimere celleflowet. Påfør steril knoglevoks for at undgå ekstrakraniel tumorudvækst.
14. Luk såret ved hjælp af rustfrit stål sårklip (7 mm). Lever en subkutan (sc) injektion af 1 ml steril lacteret Ringer's opløsning (forvarmet til 37 ° C), og læg dyret i et genopretningskammer, der er halvvejs på en varmepude.
15. Returner dyrene til det ventilerede rack, når de genvinder mobilitet, og følg rutinemæssig efterpleje for at sikre smootH opsving.

4. In vivo bioluminescensbilleddannelse (BLI) af tumorvækst ( figur 1B ) ¹⁵

BEMÆRK: De patient-afledte gliomaceller er modificeret til at udtrykke firefly luciferase. Dette giver os mulighed for at følge tumorprogression efter intrakraniel implantation.

1. Giv dyr en ip-indsprøjtning af D-luciferin, kaliumsaltet (150 mg / kg) 10 min forud for billedbehandlingstiden.
2. Anbring straks dyr i et oxygeneret isofluran induktionskammer godkendt af IACUC.
3. Placer dyr i det opvarmede (37 ° C) billedkammer for at indfange BLI-signalet ved hjælp af softwareindstillinger (for detaljer, se producentens instruktioner).

5. Hele hjernebestråling ( figur 1C ) ^{2 , 4 , 13}

4 .

1. Brug en ip-indsprøjtning af en ketamin- og xylazinblanding (henholdsvis 50-100 mg / kg og 5-10 mg / kg. Hør institutionel IACUC for godkendt dosisområde) med subkirurgisk bedøvelsesplan for moderat at fremkalde anæstesi hos mus.
2. Brug en prøvebakke til at placere musene inde i kammeret mellem blyafskærmningsblokke, hvilket gør det muligt for eksponering alene til strålingsbanen ( figur 2 ).
3. Giv mus med positiv BLI-bekræftelse på tumorvækst (normalt på dag 7-8 efter gliomacelleimplantation) en daglig dosis på 2 Gy bestråling i 5 på hinanden følgende dage. Udfør BLI-vurdering af tumor efter den sidste bestrålingsdosis.

6. Genetisk modifikation af humane neurale stamceller (NSC'er; FigurE 3A) ⁴

1. Vedligeholdelse af humane NSC'er (klon HB1.F3.CD) ^{6 , 7} i DMEM-medium med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin i en befugtet 37 ° C inkubator under 95% rumluft og 5% CO ₂ ( ^N NSC'er).
2. Udfør genetisk overekspression af kemotaxiske receptorer, såsom CXC-motivkemokinreceptoren 4 (CXCR4), i hNSC'er ved transduktion med lentivirus kodende for human CXCR4.
   1. Når NSC'er er tæt på 75-80% konfluens, tilsættes CXCR4 lentivirus til dyrkningsmediet sammen med polybrene (8 μg / ml) og inkuberes i 8 timer eller natten over.
   2. Udskift virusholdigt medium med frisk medium indeholdende blasticidin ved 4 μg / ml til positivt udvalg af transducerede celler.
   3. Validere niveauet af CXCR4-ekspression i modificerede hNSC'er ( ^CXCR4 NSC'er) via flowcytometri ved anvendelse af anti-CXCR4-antistof og matchende isotypeantistof og viEn kvantitativ RT-PCR under anvendelse af et par primere, der amplificerer CXCR4 og glyceraldehyd-3-phosphat dehydrogenase (GAPDH) cDNA'er ⁴ .
   4. Generere vektorkontrol NSC'er ( ^VC NSC'er) ved anvendelse af den samme strategi med RFP, der erstatter CXCR4-genet, og verificere via mikroskopi eller flowcytometri på grund af tilstedeværelsen af ​​RFP-fluorescens.

7. Hypoksisk forkonditionering af humane NSC'er ( Figur 3A ) ⁴

1. Pladekulturerede NSC'er i T75-kulturflasker som beskrevet ovenfor, indtil 90% konfluens er nået.
2. Placer cellekulturflasker inde i et befugtet CO ₂ kammer / inkubator med vedligeholdte 1% O ₂ niveauer i 24 timer via N ₂ gasforsyning styret af en automatiseret indbygget flowmåler. Disse celler betegnes som ^H NSC'er. Kontrol ^N NSC'er er beskrevet i trin 7.1.

8. Indlæsning af HuMand NSC'er med oncolytisk virus ( figur 3B -3H ) ⁵

1. 8.1.Infect ^N NSC'er, ^H NSC'er, ^VC NSC'er og ^CXCR4 NSC'er med 50 betingede replikative adenovirus (CRAd) -S-pk7 virale partikler / celle ^{4 , 16} .
2. 8.2. Efter 2 timers inkubation ved stuetemperatur med periodisk tapping vaskes cellerne tre gange med medier for at fjerne ubundne virale partikler og suspendere celler i steril saltvand til injektion.
   FORSIGTIG: Udfør alle virusrelaterede in vitro cellekulturprocedurer i faciliteter med passende biosikkerhedsniveaubetegnelse, såsom BSL2. Passende personlige værnemidler skal bæres af forskere, der håndterer den oncolytiske virus pr. Retningslinje ^{4 , 16 for} institutionelle dyr.

9. Indlæsning af stamceller med mikroN-størrelse paramagnetiske jernoxider (MPIO'er) til in vivo- sporing via magnetisk resonansbilleddannelse (MRI; figur 3B -3H ) ²

1. Til mærkning af stamceller tilføjes MPIO'er til stamcellekulturer ved ~ 80% konfluens, i nærværelse af transfektionsreagens til inkubation natten over. Effektiviteten af ​​stamcelle-mærkning (NSC ⁴ eller MSC ² ) med MPIO'er (flash rødt konjugeret) bestemmes af flowcytometri.
2. For at visualisere stamcelle migration og fordeling i hjernen hos glioma-bærende dyr, erhverve både multi-skive høj opløsning T2 vægtet hurtig opkøb med afslapning Enhancement spin echo billeder og multi-skive T1 vægtet hurtig lavvinkel shot (FLASH) gradient ekkosekvenser til Evaluere strukturen via både hjerne ² koronale og aksiale planer.

10. Intranasal levering af terapeutiske NSC'er ( Figur 3D ) ^{2 , 4}

1. Kultur og indsamle NSC'er ( ^N NSC'er, ^H NSC'er, ^VC NSC'er og ^CXCR4 NSC'er) i henhold til protokollen beskrevet i afsnit 3.
   FORSIGTIG: Alle dyreprocedurer, der involverer OV-belastede NSC'er, skal udføres i anlæg med den relevante biosikkerhedsniveaubetegnelse, såsom BL2- eller BSL2-faciliteter.
2. Bedøve mus via ip-indsprøjtning af en ketamin og xylazinblanding ifølge trin 3.6.
3. Placer mus på en ren drapering opad med en varmepude under for at opretholde kropstemperaturen. Juster en polstret pude lavet af rullepapir med bånd til at sikre næseborens stående vinkel, når den placeres under musens hoved.
   BEMÆRK: Hyaluronidase-forbehandling (totalt 100 U som fire gentagne inokuleringer med 5 min intervaller, 3 μl i hver næsebor) i nasal ePithelium blev beskrevet tidligere ^{2 , 17} .
4. Brug en mikropipette, dispensere 2 μL NSC suspension til hver næsebor i musen. Visuelt bekræft aspirationen af ​​dråben, før du flytter til den næste mus. Det samlede antal leverede celler kan bestemmes af brugeren; Brug 62.500-125.000 celler / μL, således at 0,5-1 millioner celler kan leveres i 4 x 2 μL doser.
5. Brug en timer til at sikre 5 min intervaller mellem hver celle suspension administration, op til 4 gange.
6. Tillad dyr at genvinde mobilitet i et genopretningskammer, med den liggende stilling fastholdt hele vejen igennem.

11. Overlevelsesanalyse ( figur 3E )

1. Indtast data om overlevelsesvarighed for dyr i statistisk software og udfør statistiske sammenligninger ved hjælp af log-rank-testen med følgende signifikante betegnelser: * p < 0,05, ** p <0.01, *** p <0,001.

12. Vævssamling og histologi / Immunocytokemi Verifikation af intranasal stamcellens hjerneindgang ^{2 , 4}

1. I slutningen af ​​undersøgelsen euthaniserer mus via de IACUC-godkendte protokoller. En standardpraksis bruger et flowhastighedskontrolleret CO ₂ -kammer til at ofre dyrene som den primære eutanasi-strategi fulgt af ekssanguering ved perfusionsfiksering.
2. Straks efter at være ofret, udfør en intrakardrisk perfusion med PBS på dyret for at sikre eliminering af blodrester fra blodkar og bevarelse af væv til efterfølgende histologisk analyse.
3. Placer det CO ₂ -udøvede dyr på toppen af ​​en absorberende pude i den bageste position, fortsæt med en laparotomi for at udsætte membranmuskel, der er dissekeret sammen med ribbeholderen, for at udsætte hjertet.
4. Efter maKonge et kig på højre atrium ved hjælp af et par disseksionssaks, accelerere ekssanguinationen med en 3-5 ml PBS injektion via venstre ventrikel ved apexen. Injicer iskold 4% paraformaldehyd (PFA) i omsætning ved hjælp af en sprøjte; Perifere muskelspasmer giver visuel bekræftelse på, at der ikke er nogen større blokering i kredsløbet, der ville forhindre korrekt vævsfiksering.
5. Kirurgisk fjerner hovedet af slagtekroppen og opbevares i et 50 ml centrifugerør i 4% PFA ved 4 ° C natten over. Ændre opløsningen til 30% saccharose den følgende dag inden hjernevævsdissektion yderligere 24 timer senere.
6. Embed hjernevævet i OCT-forbindelsen og flashfrys på isopentan på tøris. Udfør kryokosektion af den resulterende vævsblok for at generere 10-20 μm vævssektioner til histologi og immuncytokemi applikationer.

Representative Results

Både hypoxisk forbehandling ( Figur 4A ) ⁴ og CXCR4-overekspression ( figur 4B og 4C ) ⁴ opregner signifikant cellemembran-tilstedeværelsen af ​​CXCR4-receptorer som demonstreret ved flowcytometri. Tumor tropismen demonstreret af NSC'er (blå pile), er vist i tumorvæv histologi (rød cirkel). Tilstedeværelsen af ​​MPIO-mærkede ( Figur 4D ) stamceller i tumoren bekræftes via prussian blå farvning ( Figur 4E ). ⁴

En vævsanalyse indikerer, at strålebestråling ( Figur 2 ) inducerer reduktion i tumorvolumen såvel som SDF-1 opregulering i tumor og omgivende væv ( fig. 5A og 5B )4, som bekræfter hypotesen om, at CXCR4 receptor upreguleret ekspression i NSC'er kan lette tumor tropisme efter XRT.

Overlevelsesanalyse indikerer, at selvom bestråling (XRT) alene er gavnlig for overlevelse af tumorbærende dyr ( figur 6A ) ⁴ , kan yderligere fordele opnås ved anvendelse af ^H NSC'er, der er ladet med OV over ^N NSC'er, der er lastet med OV i forbindelse med XRT 6B ) ⁴ . Betydelige overlevelsesfordele kan også ses med genetisk manipulerede ^CXCR4 NSC'er i samme kontekstmæssige terapeutiske regime ( Figur 6C ) ⁴ .

Vævsanalyse bekræfter, at både ^H NSC'er og ^CXCR4 NSC'er signifikant forbedrede den tumor-målrettede tilførsel af OV'er, som det fremgår af staInd for et viralt hexonprotein ( fig. 7A og 7B ) ⁴ .

Figur 1: Skematisk flowdiagram af de generelle dyreprocedurer involveret. ( A ) Tumormodeller skabes via xenograft af patientafledte gliomaceller. ( B ) Tumorvækst overvåges via BLI. ( C ) Behandlingsbehandling til hovedbeskyttelse leveres som beskrevet i fremgangsmåde 6. ( D ) Supine- og hovedtippestilling bevares under den terapeutiske intranasale stamcelleudlevering som beskrevet i fremgangsmåde 11. ( E ) Efterbehandling af overlevelsesovervågning, lille dyr Billeddannelse og histologisk analyse af væv om nødvendigt følges op. Klik her for at seEn større version af denne figur.

Figur 2: Opstilling af dyr til bestråling. Anæstetiserede mus er anbragt mellem blyafskærmninger inde i prøvebakken, hvilket tillader kun bestråling af hovedet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Et flowdiagram for generelle stamcelleforberedelsesprocedurer involveret forud for intranasal levering. ( AC ) Hypoksisk forbehandling eller genetiske modifikationer af stamceller til overudtrykning af CXCR4. ( BD ) Vaskning, enzymatisk dissociation, celleindsamling og tællingstrin er prDannet til efterfølgende indlæsning af stamceller med terapeutisk eller diagnostisk last. ( E ) Terapeutiske reagenser, såsom oncolytiske vira eller diagnostiske sporstoffer, såsom MPIO-partikler, kan læsses i opsamlede stamceller i passende koncentrationer med periodisk omrystning og forsigtig omrøring ( F ). ( GI ) De ladede stamceller kan derefter vaskes og tælles til intranasal levering til mus. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Analyse af stamcellemodifikationer for CXCR4 Expression og MPIO Loading. ( AC ) Flowcytometri kan køres for at verificere fænotypiske modifikationer af stamceller som følge af hypoxisk forbehandling eller genetiskingeniørarbejde. (Detaljer kan findes i Dey et al. ⁴ ) ( DE ) Påvisningen af ​​succesfuld MPIO-belastning af stamceller og in vivo- resultater kan opnås via henholdsvis flowcytometri og prussian blå farvning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Den hypotese, som bestråling faciliterer SDF-1 (grønne signaler) Opregulering i gliom og omgivende væv er bekræftet Via histopatologi og immunocytokemi af vævssektioner. Bestråling øger SDF-1-ekspression i GBM43 xenograft. Analysen af ​​H & E-farvning og immuncytokemi af hjernevævssektioner fra kontrol og bestrålede mus demonstrereAtes reducerede tumorbyrden, men forøgede SDF-1-niveauer på tumorstedene efter XRT-behandling. ( A ) SDF-1-ekspression (grøn) er stærkt lokaliseret på tumorstedet (hvide bokse) efter XRT. ( B ) Densitometri-kvantificering af synsfelterne viser en fire gange stigning i SDF-1-ekspression i XRT-behandlede dyr i sammenligning med kontroldyr (n = 3 eksperimenter, *** p <0,001, Students t-test). Detaljer kan findes i Dey et al. ⁴ Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Overlevelsesfordele ved modificerede NSC'er blev observeret (Detaljer kan findes i Dey et al. ⁴ ). ( A ) Konteksten af ​​terapeutiske fordele ved XRT blev etableret (*** p <0,001, log-rank test). ( B ) Hypoksisk forbehandling af stamceller ladet med OV øger dyreoverlevelse (* p <0,05). C. CXCR4 genetisk forbedring forbedrer yderligere overlevelse af dyr (** p = 0,0013). Detaljer kan findes i Dey et al. ⁴ Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 7: Bekræftelse af OV-levering af Hypoxia- eller CXCR4-forstærkede NCS'er til Braintumor Xenografts opnås via Viral Hexon Protein Detection ved Immunocytochemistry (Green Dots) af Vævssektioner fra Hjerner af Mus Behandlet med Enten ^H A ) eller ^CXCR4 NSC'er ( B ), *** p <0,001 t test. Detaljer kan findes i Dey et al. ⁴ Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Selvom den intranasale rute for lægemiddelafgivelse er blevet udforsket bredt for små molekyler, nanomedicin og proteinforbindelser ens ¹⁸ , er anvendelsen af ​​terapeutiske stamceller til intranasal hjernetumor-målretning meget ny i spektret af hjernetumorterapeutik under udvikling ^{2 , 3 , 4} . Der er involveret egentlige kompleksiteter med hensyn til betegnelsen af ​​stamceller i næsehulen, og molekylære detaljer forbliver uklare. Stamcellernes størrelse og deres fordelingsmekanismer langs kraniale nerver varierer dramatisk fra dem, der ikke er cellebiologiske eller små molekyler, og vi er for tiden involveret i detaljerede mekaniske undersøgelser, der involverer adfærd af terapeutiske stamceller i nasepithelia. Molekylære interaktioner, der involverer stamcelleoverfladecytokinreceptor ekspressionsprofiler såvel som ekstracellulær matrix(ECM) adhæsionsmolekyler, såsom integrin, er under undersøgelse for at kaste lys på undergrunden af ​​intranasal hjerneindgang af stamceller. De kritiske trin inden for den nuværende protokol er multifold: 1) Korrekt etablering af den intrakraniale gliomentransplantat, som variationer i tumorlokation og vækstmønstre kan påvirke den kemotakse, som NSC'er er afhængige af til migration mod tumor; 2) Korrekt forberedelse af NSC'erne og deres sundhedsstatus og fænotyper, der påvirker den kemotaksiske migrationsadfærd; 3) Tilstrækkelig forberedelse af næseskaviteten med hyaluronidase, hvilket har vist sig at forbedre stamceller migration fra næsehulen i hjernen ¹⁷ ; Og 4) Korrekt rygtilpasning af mus under intranasal stamcelleudlevering for at forhindre celletab uden for næseborene, og dyrene efter NSC-afhjælpning. MRI ² eller radiotracer-baserede billeddannelsesteknikker ¹³ hos levende dyr kunne anvendes til th E realtids vurdering af in vivo stamcelle migration efter intranasal levering.

For en præklinisk undersøgelse ved anvendelse af dyremodeller er der begrænsninger for at forudsige det terapeutiske resultat i oversættelsen til kliniske humane patientstudier. Der er signifikante forskelle i de kraniale nerveafslutningsfordelingsmønstre mellem gnavere og mennesker ^{19 , 20} ; Derfor bør strategier for at styre terapeutiske stamceller til at distribuere langs nervebindende netværk, der er mere relevante for menneskers hjerneindgang via den intranasale rute, være fokus for fremtidig forskning. Disse detaljer er nøgler til en vellykket klinisk oversættelsesindsats, og de her beskrevne principper er afgørende for at etablere grundlaget for yderligere diversificering af forskningsparametre designet til at skelne molekylære signaler og de funktionelle og anatomiske forskelle mellem musemodeller og menneskelige applikationsspecifikke.

Ent "> I denne pilot demonstration af de grundlæggende principper for brug af mus PDX modeller af humant gliom viser vi potentialet for diversificerede strategier til at forøge tumor-tropisme af hNSC'er via hypoxisk prækonditionering og genetisk forbedring i kemotropisme, der fremmer CXCR4 receptor ekspression til mål tumor- Associerede cytokiner. Betydningen af ​​denne omfattende beskrivelse af intranasal terapeutisk stamcelle-afleveringsteknik er tydelig, da det er den første trin-for-trin-protokol, der beskriver en alternativ terapeutisk stamcelleudleveringsstrategi til centralnervesystemet (CNS) uden invasive fremgangsmåder typisk Kræves for CNS-sygdomme. Vi tilstræber at bringe en robust eksperimentel terapeutisk platform til forkant med udviklingsmedicin til maligne hjernetumorer, således at større mekaniske detaljer kan komme ud fra brede forskningsundersøgelser i det videnskabelige samfund. Fremtidige udvidede applikationer til behandling af CNS-lidelser i bred Kompleksitet og mekanisk mangfoldighed kan bE udforskes af forskere på de respektive områder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotaxic frame	Kopf Instruments	Model 900
Hypoxic Cell Culture Incubator	ThermoFisher Scientific	VIOS 160i
Cell culture supplies (Plastics)	ThermoFisher Scientific	Varies	Replaceable with any source
Legend Micro 21R Refrigerated Microcentrifuge	ThermoFisher Scientific	75002490	Replaceable with any source
Bench centrifuge Sorvall ST16R	ThermoFisher Scientific	75004240	Replaceable with any source
Micro syringe 702N 25 µl (22S/2"/2)	Hamilton Company	80400	Flat tip
Sample Tray for Irradiator	Best Theratronics	A13826	To set up mice protection with lead shield
Leica DMi8 Microscope	Leica Microsystem		Custom setup
Leica CM1860 UV cryostat	Leica Microsystem		Custom setup
Exel International Insulin Syringe	ThermoFisher Scientific	14-841-31
Corning Phosphate Buffer Saline	Corning Cellgro/ThermoFisher	21-031-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning Cellgro/ThermoFisher	11965-084
Trypsin 0.05%	Corning Cellgro/ThermoFisher	25300054
Hyaluronidase from bovine testes	MilliporeSigma	H3506