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Biochemistry

단백질 영화 적외선 전기 화학 [NiFe] Hydrogenase에 의해 H2 산화의 연구에 대 한 설명

doi: 10.3791/55858 Published: December 4, 2017
* These authors contributed equally

Summary

여기, 우리 기술, 단백질 영화 적외선 전기 화학, 탄소 전극에 직접 전기 통제 시선 공부 고정된 산화 단백질을 수 있는 설명 합니다. 단일 단백질 시료의 적외선 스펙트럼 적용된 잠재력의 범위는 다양 한 솔루션 조건 아래에 기록할 수 있습니다.

Abstract

단백질 내 센터 화학 산화 환 원 정밀 하 게 제어를 제공 하는 산화 환 원 단백질 요구 방법의 이해. 있는 단백질은 움직일 전극 표면에 전극 대체 생리 전자 기증자 또는 수락자, 그런 단백질 필름 전기 화학의 기술을 다양 한 다른의 산화 환 원 반응으로 기능 통찰력 제공 단백질입니다. 전체 화학 이해 전기 제어를 추가 구조 및 기계적 통찰력을 추가할 수 있는 다른 기술로 결합 될 필요 합니다. 여기 기술, 단백질 영화 적외선 전기 화학, 산화 환 원 단백질의 적외선 분 광 샘플링 단백질 영화 전기 화학을 결합 하 여 설명 합니다. 기술은 높은 표면적 카본 블랙 전극에 움직일 산화 단백질을 다중 반사 감쇠 총 반사율 기하학을 사용 합니다. 흐름의 셀이 전극의 결합 솔루션 pH 또는 용 질 농도를 측정 하는 동안 변경 될 수 있습니다. 이것은 특히 강력한 산화 환 원 효소, 촉매 급속 한 회전율을 지속 수 있으며 촉매 메커니즘에 긴 중간 종의 분 광 관측을 허용 하는 전극에서 제어 해결. 회전율 (H2 산화)와 비-매출 조건에서 대장균 hydrogenase 1에 실험 기술을 설명합니다.

Introduction

단백질 기능 연구에 핵심 과제 중 vivo에서 또는 사용 하 여 그들의 생리 적 역할을 수행 하는 단백질의 직접 관찰 절연 단백질 샘플을 허용 하는 현장에서 방법의 개발을 포함 한다. 이 단백질 기능 동시에 측정 하는 동안 컨트롤 또는 트리거링 실험 절차와 평가 될 모두 반응성을 허용 하는 결합 된 기술의 사용 프로세스의 통합 및 개별 화학 단계 필요 합니다. 산화 단백질의 경우이 종종 동일한 정확 하 게 적용 된 잠재력을 제어 하지만 화학적으로 특정에 민감한 분 광 기술로 직접 아무 화학 정보를 제공 하는 전기 화학 기법을 결합 하 변경 연관 단백질 기능입니다. 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry는 다양 한 분 광 기술 및 전기 제어의 수준을 포함 하는 결합 된 전기 및 분 광 방법의 범위에 대 한 일반적인 용어입니다. 이 작은 분자를 사용 하 여 전자 전송, UV-표시,4,5 와 결합을 포함 하 여 중재를 연구에 이용 되 고 많은 단백질 인공, 수용 성 전자 기증자와 수락자로 전자를 교환할 수 있습니다. , 6 , 7 자석 원형이 색 성8 및 적외선5,,910,11,12,13,14 (IR) spectroscopies입니다. 제한 된 수의 경우 단백질과 전극 unmediated, 보급 통제 전자 교류를 악용 수 입증 했다. 15 , 16

촉매 반응에 대 한 실시 산화 환 원 효소, 현재의 솔루션 전기 화학 방법에 의해 명확한 불리. 될 가능성이 높습니다 확산 제어 전자 전송을 통해 redox 중재자 솔루션에서 속도 제한. 효소에 대 한 운동 및 기계 정보 손실 될 수 있습니다 또는 적어도 실험 방법에서 발생 하는 확산 유물에서 deconvolute 어려워. 직접, unmediated 전기 제어 따라서 산화 단백질 및 효소의 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 단백질 필름 전기 (PFE)의 기술 산화 환 원 전극 움직일 단백질, 전극 잠재력의 시리즈에서 편광으로 직접 또는 산화 환 원 공동 인자 단백질 내에서 전자 전송 되는 방식으로 사용 합니다. 17 , 18 , 19 PFE은 산화 환 원 효소에 의해 촉매 산화 또는 감소 반응의 연구에 대 한 특정 값의 계면 전자 전송 매우 높은 속도로 달성 될 수 있다. 예를 들어 Allochromatium vinosum 에서 니켈-철 합금 ([NiFe]) hydrogenase의 electrocatalytic 이직 률 PFE에 의해 H2 산화에 대 한 ca 1000-10000의− 1 로 측정 되었다. 20 잠재적인 전극 촉매 '' 또는 '해제' 및 효소 활동에 electrocatalytic 현재 보고서를 방 아 쇠 역할을 합니다. PFE 잠재력, [페]의 디-철 활성 사이트의 반응 등을 속속들이 의존 하는 복잡 한 효소의 반응성을 분석 하기 위한 유용한 방법 이므로-CO와 O2,21 hydrogenases 또는 잠재력 유도 hydrogenases,22 일산화 탄소 효소,23 및 다른 복잡 한 산화 환 원 효소의 비활성화 반응. 24

산화 환 원 효소, 1-2 pmol cm-2 [NiFe] hydrogenase A. vinosum에서 순서의 낮은 표면 범위에서 발생 하는 주요 장벽 PFE에 의해 받으면 직접 전기 제어와 분 광 기법을 결합 하 대량 금속 전극에 작은 분자 adsorbates의 표면 과학 연구 현장에 상대적인 20 . 이 분 광 측정의 감도 대 한 도전을 선물 한다. 여러 가지 spectroelectrochemical 방법을 보고 되었습니다 공부에 대 한 다양 한 다른 전극에서 산화 환 원 단백질 움직일: 투명 금속 산화물 전극;에서 UV 보이는 분광학 25 , 26 , 금 전극;에서 27 형광 분광학 28 , 29 (세이 라) 표면 강화 된 적외선 흡수 분광학에서 금 전극; 30 , 31 , 32 , 33 그리고 표면 강화 라만 분 광 기술을, 주로 실버 전극. 34 , 35

여기는 커플링 PFE IR 분광학, 단백질 영화 적외선 전기 화학 (PFIRE)로 알려져 있는 기술에 대 한 방법에 설명 합니다. 36 는 PFIRE 메서드는 산화 환 원 효소를 이용 하는 다양 한 탄소 표면에 단백질의 흡착의 용이성 감쇠 총 반사율 (ATR-IR) IR 기하학와 함께에서 높은 표면적 탄소 작업 전극에 움직일 수를 공부 한다. 적외선 분광학은 많은 작은 분자, ligands 및 공동 인자는 반응성, 바인딩, 억제 및 산화 환 원 상태를 평가 하는 데 사용할 수 있는 진단 absorbances 산화 환 원 효소와 단백질의 연구에 유용 합니다. 아니 철 황 센터, flavoproteins,38,,3940 작은 분자 헤 센터 37 연구의 바인딩을 등이 있습니다. 41 는 ATR-IR 형상 최적화 된 3-전극 (spectro) 전기 화학 셀42 의 건설을 허용 하 고 따라서 우수한 전기 제어를 제공 합니다. 솔루션 저항 및 잠재적인 드리프트 작업 전극 가까이 참조 전극 배치 하 여 최소화 됩니다. 높은 표면적 카운터 전극 빠른 효소 회전율 작업 전극에 의해 생성 하는 높은 electrocatalytic 전류와 호환 되는 사용 됩니다. Spectroelectrochemical 셀 솔루션의 흐름 손쉬운 제어를 기판, 저 해제 및 pH의 농도 수 있습니다. 36 , 43 , 44 는 PFIRE 메서드는 따라서 IR 스펙트럼이 지속적인된 효소 electrocatalysis 동안 기록 된 위치에 있을 수 있습니다. 36 , 44 PFIRE PFE 산화 환 원 효소에서 이외의 촉매 프로세스에서 정보를 추출이 어려울 수 있습니다 어디 달리 촉매 현재,43 의 부재에 화학 정보를 제공 하는 능력 이기도 합니다. 45 , 46

우리는 [NiFe] hydrogenases, 바이메탈 액티브 사이트에서 Fe를 조정 하는 내장 CO와 CN ligands를 포함 하 여 electrocatalytic H2 산화의 연구에 대 한 PFIRE 메서드를 증명 하고있다. 36 , 43 , 44 [NiFe] hydrogenases는 따라서 PFIRE에 의해 공부 하는 데 특히 적합. PFIRE 메서드를 사용 하면 정상 매출 중 존재 하는 종족에 대 한 정보를 제공 합니다. 및 따라서 실험적인 통제 없이 hydrogenases의 IR 분광학에 문학 부 뿐만 아니라 중요 한 기계적 통찰력을 제공 합니다. 동안 회전율. 47 , 48 다이어와 동료 고용 시간 해결 IR 메서드 NiFe hydrogenases,49,50,51 작은 부정적인 잠재적인 단계 (를 통해 사용 하거나 적용할 빛 방 아 쇠를 사용 하 여 연구를 솔루션 중재자와는 '감 금된' 전자 소스) 또는 photolyse 바운드 수소. PFIRE 메서드를 사용 하면 수 없습니다, 현재 제공 시간 분해능이이 측정에 맞게40 연구 공정의 감소와 산화 촉매, 잘 정의 된 잠재력의 범위에 액세스를 허용 하지 않으며 대량 전송에서 무료 제한입니다.

PFIRE 메서드는 산화 환 원 단백질, 또한 ATR IR 기하학을 사용 하 고 전극 표면에 흡착 분자의 IR 흡 광도 향상 시키기 위해 나노 roughened 금속 전극 사용의 세이 라 연구에 다릅니다. 30 세이 라 막 단백질, 특히 흡착 공부에 대 한 매우 중요 한 기술 또는 모방 막 내 아키텍처,32 그러나 금속 전극에 대 한 필요성 때문에 반응성 기판 및 억제제 범위를 제한할 수 있습니다. 작은 분자 CO, CN-, 공동2 을 향한 전극 지원의 양성자 감소와 자기 조립된 단층 탈 착은 매우 부정적인 잠재력에 금속 표면에 문제가 될 수 있습니다,1,52 보호에 효소 electrocatalysis 금속 전극 비록 보고 되었습니다. 53 , 54 세이 라를 기준으로 PFIRE의 단점은 막 단백질 네이티브 또는 모방 멤브레인 구조에 통합의 상대 어려움입니다. 그러나, 경쟁 작은 분자 활성화 반응에 탄소 전극의 상대 화학 inertness는 PFIRE 효소 electrocatalysis, 생물학 산화 환 원에 관련 된 낮은 잠재력 도메인에 특히 공부에 대 한 우수한 기술 hydrogenases에 의해 양성자 감소 등 프로세스입니다. 1 , 43

이 문서의 목표는 산화 환 원 전극 움직일 단백질, 예를 들어 대장균 에서 NiFe hydrogenase 1 (Hyd1)를 사용 하 여 공부에 대 한 기법으로 PFIRE 메서드를 소개 하는 것입니다. 샘플 준비, 좋은 기질 흐름과 데이터 처리에 대 한 요구의 고려 사항은 설명 합니다. PFIRE은 광범위 하 게 적용 가능한 기술, (와 함께 독특한 IR absorbances) 수 흡착 될 탄소 전극에도 직접 모든 산화 단백질을 공부 하 고 또는 그것으로 전자를 교환할 수 있는 그런 표면 개 질를 사용 하 여 적합된 합니다 전극입니다.

Protocol

1. 혐 기성, 건조 글러브 및 일반적인 실험적인 요구는 FTIR 계의 내부 샘플 실 재현

  1. 외부 수은 카드뮴 텔 룰라 이드 (MCT) 검출기와 ATR 액세서리 상업 연결 분석기를 사용 합니다. 건조 한 공기 또는 이질소, 분석기의 시체를 제거 하거나 또는 한 분석기를 사용 하 여 대피 광학 벤치와 함께 합니다.
  2. 혐 기성으로 같은 높이에서 안정, 진동 없는 테이블에 분석기를 배치 (< 1 ppm O2), (노점 <-75 ° C) 글러브를 건조. 충분히 큰 defocused 빔 IR 투명 창을 통해 글러브에는 분석기의 IR 광선을 전환.
    참고: 중요 하다 글러브와 분석기 사이의 간격도 제거 또는 대피, NaCl 등 케이시 검 습기 창 소재, 예를 들어 사용 하는 경우에 특히.
  3. 복제는 글러브 안에 계의 내부 샘플 구획.
    1. 이상적으로 계의 내부 초점 거울으로 동일한 초점 거리와 함께 축에서 타원 거울에 글러브 안에 빔 직접.
      참고: 그것은 높이 글러브; 내부 조정 IR 광선의 방향으로 수 있도록이 초점 거울 앞에 배치 하는 두 추가 평면 거울에 유용 이 계의 초기 배치에 있는 부정확을 상쇄 된다.
    2. 외부 MCT 발견자, 적당 한 완전 한 글러브, 내부 (짧은 초점 거리 ZnSe 렌즈, 또는 꺼짐-축 포물선 거울, 짧은 초점 거리) 등 시 초점 위치와 같은 내부 샘플의 크기를 복제 분석기의 구획입니다.
    3. 적외선 빔 초점 거울 및 MCT 발견자 사이 대략 등거리 수의 '초점'을 조정 합니다.
  4. 액체 질소로 외부 MCT 발견자의 dewar 쿨.
  5. ATR 액세서리 글러브 샘플 구획에 탑재. 입력 및 출력 광학 및 MCT 발견자에 최대 처리량을 달성 하기 위해 ATR 액세서리에 초점을 맞춥니다. 필요한 경우, 검출기 신호의 oversaturation을 조리개 또는 다른 적당 한 감쇠 (와이어 그리드) 등을 사용 합니다.
    참고: 위해 데이터 제시 여기, 모든 반사 광학 및 내부 반사 요소 (분노)를 사용 하는 이동식 사다리꼴 시 5-반사 ATR 액세서리 (크리스탈 GmbH, 차원 ca 5 × 8 × 1 m m3, 얼굴 각도 39.5 °). 분노는 폴 리 에테르 에테르 케 톤 (PEEK)에서 가공 하는 이동식 baseplate에 거치 된다.
  6. 글러브를 사용 하 여 외부에서 지 내게 potentiostat 연결할 수 있도록 적당 한 피드스루와 재현된 샘플 구획 집 (가스 꽉 BNC 연결은 유용 하 게이 목적을 위해), 가스 접속과 MCT에서 신호를 전송 하는 케이블 탐지기입니다. 그것은 어떤 소개 또는 측정에 간섭을 피하기 위해 감지기 케이블에 차폐 유지 해야 합니다.
  7. 연동 펌프, 유량 60 mL/min은 글러브 안에 보다 큰 수를 놓습니다. 계의 도식 보기, ATR 액세서리, 연동 펌프 및 potentiostat 설치 그림 1에 표시 됩니다.
  8. Spectroelectrochemical 셀에에서 표시 된 개요로 그림 2ATR에 물개는 액세서리 등을 생성 합니다. 셀 높은 표면적 카운터 전극 Pt 와이어 (거 즈), 작업 전극 (탄소 막대)과 소형 기준 전극에 대 한 연결을 포함 해야 합니다. 셀은 입구와 셀 통해 솔루션의 빠른 흐름에 대 한 콘센트로 적어도 2 개의 추가 포트를 포함 해야 합니다.
    참고: 미니어처 포화 calomel 참조 전극이이 목적을 위해 이상적입니다. 36

2. 카본 블랙의 입자 대장균 Hydrogenase 1로의 준비

  1. '젖은' 혐 기성 글러브 혼합 높은 표면적의 20 밀리 그램 카본 블랙의 입자 (> 1000 m3/g) 1 mL 초고 순도 물 (저항력 > 18 m ω c m) microcentrifuge 관에서. 낮은 전력 쥡니다에 의해 입자를 분산 (< 100 W) 적어도 15 분, 또는 때까지 분산 유니폼 이며 약 20 mg/mL에의 한 로드 카본 블랙 분산을 주고 1 시간 안에 침전 하지 않는다.
  2. ~ 7 mg 단백질/mL의 농도에서 대장균 hydrogenase 1 (Hyd1, 약 50 µ L,55게시 절차 따라 준비)의 약 수를 받아 하 고 (전자 포인트 가까운 pH에서 낮은 이온 강도 버퍼 교환 예를 들어 칼륨 인산 염, 15 m m, pH 5.8, 추가 소금). 최상의 결과 얻기 위해 가능한 활성화 효소 준비 사용 하 여. 농도와 희석 한 적절 한 분자량 컷오프와 원심 필터 장치에 버퍼 교환 (50 kDa 작품 잘 Hyd1에 대 한)을 수행 합니다.
    1. 필터 장치에는 Hyd1를 추가 합니다.
    2. 교환 버퍼의 약 450 µ L로 희석.
    3. 온화한 원심 분리를 사용 하 여 50 µ L의 볼륨을 reconcentrate (< ~ 2700 × g) 돌이킬 수 없는 강 수를 방지 하기 위해.
    4. 2.2.2, 2.2.3 단계를 반복 하 여 버퍼 교환 완료 되 면 (일반적으로 이내 ~ 5 주기).
  3. 버퍼 교환 Hyd1의 50 µ L 약 수 카본 블랙 분산 (2.1에서 준비) 20 mg/mL의 5 µ L 볼륨 믹스. (0 ° C)에서 냉장고에 효소 입자 혼합을 저장 하룻밤 adsorb 효소 수 있도록 합니다. 그것은 때때로 입자 분산 유지 되도록 혼합을 흔들 해야 합니다.
  4. Microcentrifuge (~ 2700 × g)에서 연속적으로 침전 및 재 분산 주기에 의해 낮은 이온 강도 버퍼 (칼륨 인산 염, 15 m m, pH 5.8, 추가 소금) Hyd1 수정 입자를 씻어. 이 과정을 3-5 회 반복 비 흡착 효소를 제거 하.
    참고: 첫 번째 세척 하기 전에 상쾌한 이어야 한다 거의 무색, 효소의 좋은 흡착을 나타내는.
  5. 효소 수정 입자의 ~ 20 mg/mL의 최종 로드를 주고 ~ 5 µ L의 최종 볼륨을 입자를 집중.
    참고: Hyd1 수정 입자 경우 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 최대 2 주 동안 그들이 남아 화; 이 가장 ~ 50 µ L의 초고 순도 물 희석 하는 입자를 저장 하 여 이루어집니다.

3. 대장균 Hydrogenase 1에 PFIRE 측정을 위한 준비

  1. 그래서 저전력 쥡니다 (< 100 W), H2에서 처음으로 시 분노를 청소4 (< 90 %w / w) 15 ~ 분, 그리고 HNO3 (70 %w / w)에 대 한 최대 1 시간. 이 청소 절차는 친수성 분노 표면에 연결 되어야 합니다. 분노 피 솔루션에 놓일 수 있습니다 더 청소 하는 것이 필요한 경우 (H2O2의 1:3 비율: H24) 어떤 잔여 유기 물질을 산화.
    참고: 가혹한 산 성 청소 방법 모든 분노 재료로 사용 하기 위해 적합 한 않을 수 있습니다. 피 라 솔루션 높게 부식성 이며 강한 산화 제, 표면 되어야 합리적으로 깨끗 한 피 솔루션 및 관리의 사용 준비 하는 동안 이동 해야 하기 전에 과정-항상 발열 특성상 피 솔루션의 사용 추가 H2O 2 천천히 H2이렇게4 고 준비, 사용 및 폐기에 대 한 적절 한 안전 절차를 참조 하십시오.
  2. 초고 순도 물에 깨끗 한 분노를 헹 구 고 건조 질소 가스의 흐름에서 건조. 깨끗 한 핀셋을 사용 하 여 오염을 방지 하는 모든 프리즘 처리를 실시 합니다.
  3. 전기 등급 실리콘 실 란 트의 얇은 스트립을 사용 하 여 ATR 액세서리 baseplate에 분노를 봉인. 분노의 가장자리에 실 란 트를 제한 하는 것을 주의. 완전히 건조 실 란 트를 허용 합니다.
  4. ATR 액세서리 baseplate 분석기 글러브에 전송 그리고 ATR 액세서리에 탑재. 4000-1000 c m-1 4 cm-1 해상도 사용 하 여 표준 급속 사이 참조 (배경) 스펙트럼 측정 검사는 계의 모드와 1024 평균된 interferograms (측정 시간 3-5 분). 입력으로이 스펙트럼을 사용 하 여 실험의 뒷부분에 나오는 흡 광도 스펙트럼의 계산을 허용.
    참고: 작은 흡 광도 Hyd1 활성 사이트에 대 한 기대로 인해 그것은 잡음 비율 높은 신호 스펙트럼을 수집 하는 데 필요한.
  5. 미리 준비 된 Hyd1 수정 입자 분산 (제 2)를 포함 하는 '젖은' 글러브 ATR 액세서리 baseplate 전송. 드롭-캐스트는 분노의 큰 얼굴에 입자 분산의 1 µ L 약 수 표면에 걸쳐 균일 하 게 그들을 확산. 참고: 팬 들은 분노에 완전히 건조 될 입자의 정보를 허용 하지 않습니다.
  6. M m (즉, ca. 8.2 × 4.9 m m2) 분노의 표면 크기 보다 작은 크기 ~0.1을 연료 전지, 가스 확산 층 재료로 사용 하는 것과 같은 탄소 종이의 한 조각 잘라. 탄소 종이의 표면 영역 드롭 캐스트 Hyd1 수정 입자를 커버 하기에 충분 해야 하지만 이렇게 중복으로 큰 실리콘 실 란 트 사용 하는 분노를 확보. 물, 탄소 종이 담근 다 고 부드럽게 입자 필름 위에 그것을 배치. 탄소 종이 전체 입자 필름에서 좋은 전기 연결을 제공 합니다.
    참고: 사전에 여러 조각의 탄소 종이 준비 하 고 미리 '젖은' 혐 기성 글러브 안에 초고 순도 물에 담가 저장에 유리 하다.
  7. 분노를 통해 spectroelectrochemical 셀 (1.7에서 설명 하 고 개요로 그림 2에 표시 된)를 탑재, 나사 baseplate에 그것을 확보. 계속 수산화 효소 실험 버퍼의 ~ 200 µ L를 추가 합니다. 넓은 pH 범위, 버퍼링 수 혼합된 버퍼 시스템 유용 NiFe hydrogenases에 대 한 연구:56 나트륨 아세테이트, 2-[N'-morpholino] 탄 sulfonic 산 (MES), N'-[2-hydroxyethyl] piperazine-N' -[2 탄-sulfonic 산] (HEPES), N'-트라이앵글 [hydroxymethyl] 메 틸-3-아미노-프로 판-sulfonic 산 (도청), 그리고 2-[N'-cyclohexylamino] 탄 sulfonic 산 (CHES), 15 mM의 최종 농도에 각 구성 요소와 포함 된 0.1 M NaCl 전해질, 산도 pH 6을 사용 하 여 조정 지원 집중 NaOH 및 HCl.
    참고: 작업 전극 연결 해야 내 다 약간 탄소 종이 (그림 2)에 좋은 전자 연결 spectroelectrochemical 셀 상단 (~0.1 m m)의 비행기 아래.
  8. 연동 펌프 튜브와 실험 버퍼의 유리병을 포함 하는 흐름 시스템 솔루션 입구와 출구 spectroelectrochemical 셀의 연결. 포함 하는 분석기 '건조' 글러브 조립된 셀 전송.
  9. Spectroelectrochemical 셀 어셈블리 ATR 액세서리에 장착 합니다. potentiostat에 연결할 작업, 카운터 및 기준 전극. 연동 펌프 튜브 펌프에 연결 합니다.
  10. 4000-1000 c m-1의 스펙트럼 범위 4 cm-1 해상도 1024 평균 interferograms로 흡 광도 스펙트럼을 기록, 참조/배경으로 3.4에서 수집 된 스펙트럼을 사용 하 여. 이 시점에서 스펙트럼 중요 한 포함 한다 (> 100 mO.D.) 아 미드 II ~ 1,540 c m-1 에서 밴드와 Hyd1의 활성 사이트 밴드는 스펙트럼 영역 1,850 2,150 cm-1, 산화, 비활성 상태 (그림 3에서 크게에 분명 해야한다 ).

4. 대장균 Hydrogenase 1 및 Spectroelectrochemical 셀 테스트 활성화

  1. Hyd1 수정 입자 필름을 감소 잠재력 (−0.8 V vs SCE)를 적용 합니다. Spectroelectrochemical 셀 통해 천천히 H2 와 흐름 버퍼와 실험 버퍼 포화. 예제는 Hyd1를 활성화 완전히 하룻밤 둡니다.
    참고: 그것은 중요 한 혐 기성 H2, N2 , 그래서 모든 혐 기성 가스를 사용 하는 O2 필터를 통해 전달 되어야 합니다.
  2. 활성화 후 샘플의 흡 광도 스펙트럼을 기록 합니다. ΝCO 와 활성 사이트의 vCN 밴드 이제 감소, '활성'의 배포를 표시 합니다. 이것은 스펙트럼 3.10 (그림 4)에 기록 된 상대적인 차이 스펙트럼의 사용을 통해 가장 쉽게 관찰 된다.
  3. Spectroelectrochemical 셀의 전기 연결을 테스트 합니다. 이 위해 실험 버퍼 N2 가스로 포화. 일련의 산화 (0 V vs SCE)와 Hyd1 수정 입자 필름 (−0.8 V vs SCE) 후보 ( ca 30 분 기간)의 감소를 적용 하 고 각에서 흡 광도 스펙트럼을 기록. Hyd1 해야 될 급속 하 게 산화 하 고 감소, 그리고 입자 영화는 잘 연결 하는 경우 샘플의 100% 적용된 가능성에 응답 해야 합니다.
  4. 실험적인 버퍼의 적절 한 흐름 속도 설정 합니다. 이렇게 하려면 샘플, 감소 잠재력 (−0.8 V vs SCE)를 적용 하 고 실험 버퍼 H2와 함께 포화. -0.707 사이 순환 voltammograms의 일련을 기록-0.039 V vs SCE 10 mV/s 스캔 속도에 점차적으로 H2의 흐름 속도 증가-voltammograms 촉매 형상 평면 회전에서 그를 닮을 때까지 사이 포화 버퍼 디스크 전극55 고 최대 전류는 유량 (그림 5)의 독립.
    참고: H2 물에서의 용 해도 293 K와 1 개의 막대기에 ~0.8 m m 이다.
  5. 샘플은 지금 PFIRE 측정을 위한 준비, 스펙트럼 솔루션 조건 (pH, 온도, H2 의 농도 )의 범위 내에서 전위의 범위에서 수집 합니다. Electrocatalytic 프로세스 Hyd1에 의해 H2 산화 등을 공부 하는 때에 특히 광 및 전기 화학 데이터를 연결할 수 있어야 하는 것이 중요 하다 potentiostat 소프트웨어를 사용 하 여 모든 전기 화학 데이터를 기록 합니다.

5. 분 광 데이터 처리

  1. 그 활성 사이트는 영구적으로 변경 되지 측정 과정 0 V −0.8 V vs 실험의 끝에 SCE에서 스펙트럼을 기록 하 여 확인 합니다. 이러한 스펙트럼 4.3에 기록 된 동일 해야 하 고 활성 사이트의 손실 측정 (그림 6) 동안 관찰 해야 합니다.
  2. 적합 한 형태로 분석기 소프트웨어에서 절대 흡 광도 스펙트럼을 내보내기 (.csv, ASCII, 'matlab', Jcamp ) 원본 또는 Matlab과 같은 소프트웨어를 사용 하 여 처리를 위해.
  3. 초기 계획 데이터를 그림 7에 나와 있는 프로세스를 사용 하 여 수정 합니다.
    1. 작은 식별 범위 1800 2,150 cm-1에 각 흡 광도 스펙트럼의 두 번째 파생을 받아 (< 1 mO.D입니다.) 액티브 사이트 밴드 높은 곡선 물 배경.
    2. 원래 흡 광도 스펙트럼에 기준선 마커 포인트를 놓고 ' 스냅 ' 실험 스펙트럼에 포인트를 설정 합니다.
    3. 입방 스플라인 보간된 함수 또는 다항식 함수를 사용 하 여 포인트를 통해 기준에 맞게. 이 초기 함수를 실험 데이터에서 뺍니다.

Representative Results

그림 1 에서는 PFIRE 측정을 위해 사용 하는 분석기, 글러브, ATR 액세서리, potentiostat, 가스 흐름 시스템의 실험적인 배열의 도식 표현. 그림 2 는 spectroelectrochemical 셀의 그림 대표.

그림 3 은 드롭-캐스트 Hyd1 수정 입자의 실험적인 버퍼 (혼합된 버퍼 시스템, 3.7, pH 6.0에서에서 설명)와 함께 흡 광도 스펙트럼 spectroelectrochemical 셀 통해 흐르는. Hyd1의 표면 범위 ~ 235 mO.D의 아 미드 II 밴드 진도 그림 3에 표시 된 예제에서 특히 높다. 그리고 최소한의 '대량' 물에 의해 입증으로 O-H 기지개 지역 3000 ~ 3600 c m-1의 크기 ~ 1640 c m-1는 아 미드의 회선은에서 밴드를 기준으로 나 Hyd1의 밴드와 물 H-O-H 벤드. 때문에 단백질 추가 밴드 C H 기지개 지역 (ca 2900 c m-1)에서 볼 수 있습니다. 2100 cm-1 을 중심으로 광범위 한 밴드는 낮은 에너지 libration 밴드는 H2O 분자 때문에 액체 물에 수소 결합 네트워크의 제한 된 회전의 세트와 함께 H-O-H 굽 힘 진동의 조합 밴드가 이다. 활성 사이트의 산화, 비활성, Ni-B 상태의 ν공동 밴드 1,943 c m-1, 기준선 보정 없이에서 명확 하 게 분명 하 고 νCN 기능 2,050 2100 c m-1 명확 하 게 볼 수 있습니다. . 높은 Hyd1 보장 범위, 카본 블랙 영화57 의 미소 한 구멍이 있는 구조의 많은 효소에 의해 차단 되 고 따라서 '대량' 물 농도 PFIRE 측정 동안 낮춘 다.

그림 3 에서 스펙트럼 표시, 활성화 하기 전에 Hyd1 영화 포함 산화, 비활성 상태에서 Hyd1. 활성화 된 (감소) - -준비 (산화) 차이 스펙트럼을 보여 주는 그림 4 에서 같이 활성화는 −0.8 V vs H2 분위기에서 SCE 리드 형성의 감소, 촉매로 활성 상태에서 하룻밤 Hyd1의. Hyd1의 차이 스펙트럼은 ν공동 영역을 사용 하 여 가장 명확 하 게 해석 수 있습니다. 활성 사이트의 각 고유 상태는 2 개의 CN 밴드에 비해 하나의 공동 밴드 이며 따라서 νCN 지역 본질적으로 더 복잡 한, 많은 겹치는 밴드와 함께. 그림 4에서 차이 스펙트럼 활성화 손실 (부정적인 흡수 밴드)의 산화, 비활성 Ni-Ni-시 (가장 산화 '활성' 상태)로 준비 Hyd1 필름에 있는 그의 작은 금액에 이르게 보여줍니다. 이러한 Hyd1;의 '활성' 상태로 대체 됩니다. Ni-C, Ni-R 및 Ni-L. 참고 두 ν공동 밴드에 의해 입증으로 두 가지 형태의 Ni-R 및 Ni L 상태는 그림 4에이 종족에 대 한 관찰. 여러 Ni-R 및 Ni L 상태 관찰은 다른 NiFe hydrogenases 계약. 48 , 58 , 59

PFIRE 메서드의 키 확인 순환 voltammograms spectroelectrochemical 흐름 셀 표시 평면 회전 디스크 전극에 그들과 유사한 촉매 파형 기록 내부 Hyd1의 기록 이다. 55 실제로 즉 기판 (H2) 및 spectroelectrochemical 셀에 고정된 Hyd1에서 제품 (H+)의 대량 전송 PFIRE 측정 시 사용 유량에 효율적입니다. 촉매 형상에 유량의 효과 그림 5, spectroelectrochemical 셀 솔루션 유량 증가 H2 분위기 (1 바) 아래 기록 연속 voltammograms를 보여주는 표시 됩니다. 모든 경우에 overpotential Hyd1에 의해 H2 산화는 동일한 (빨강 회색된 사각형)을 산화 비활성화의 범위 하지만 (산화 하 고 감소 하는 동안 현재 사이 히스테리시스 스윕 ca 0 V 이상의 전위에 SCE)와 현재 최대 H2 산화 솔루션 유량에 따라 결정 됩니다. 52 mL/min (밝은 회색 voltammogram) 촉매 형상 추가를 구분 하지 않습니다 위에 유량에서 유량은 증가 합니다.

그림 6 초기 활성화 및 혐 기성 재-0 V vs SCE (아래는 Ar 분위기, 4.3에 설명 된 대로)에서 산화 후 고 아래 혐 기성 산화 비활성화 후 Ni-B의 ν공동 밴드의 상대 농도 비교 Ar는 (5.1에서 설명)으로 연속 실험에의 한 0 V vs SCE 48 시간 후에 대기권. 활성 사이트 밴드 강도의 손실 측정, 동안 관찰 하 고 모든 Hyd1 샘플 적용된 잠재력에 응답.

그림 7 에서는이 작품을 통해 사용 기준 개정 절차를 보여 줍니다. 액티브 사이트 (그림 7) 지역에서 Hyd1 샘플의 절대 스펙트럼에는 물으로 인해 상당한 곡률을 포함 되어 있습니다. 사실, 용 매로 물을 사용 하는 요구 사항을 생명 과학에서 IR 분광학의 대부분의 응용 프로그램에 대 한 문제 이다. 절대 스펙트럼 (그림 7b), Savitsky-Golay 9 포인트 창에 부드럽게와 근원 소프트웨어를 사용 하 여 계산의 두 번째 파생 곡선 배경 Hyd1 활성 사이트의 날카로운 밴드를 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 두 번째 파생 스펙트럼을 사용 하 여 대략적인 피크 위치의 식별 초기 앵커 포인트를 활성 사이트 밴드 ( 그림 7에 원형)의 무료 절대 스펙트럼의 영역에 배치 될 수 있습니다. 입방 스플라인 함수 다음 기준 수정 스펙트럼 Hyd1 액티브 사이트 (그림 7 에서 발생 하는 봉우리만을 포함 하 게 절대 스펙트럼에서 뺀 다음 수 기준 함수를 만들려면 이러한 앵커 포인트를 통해 장착 c)입니다.

그림 8 -매출 (Ar 분위기)와 전위의 범위에서 회전율 (H2 분위기) 조건에서 Hyd1에 PFIRE 측정의 결과 보여 줍니다. 36 현재 시간 추적 (그림 8) 보고서 각 촉매 전류에 잠재력을 적용 하 고 비 매출 조건 (Ar 분위기)에서 제로 전류 가까이 남아 있다. 그림 8b 부분 spectroelectrochemical 산화 환 원 적정 촉매 회전율의 부재에서 각 잠재력에 기대의 분포를 보여 주는 액티브 사이트의 평형 redox 동작에 따라서 보고 합니다. 그림 8c 스펙트럼 (H2 분위기)에서 매출 조건 하에서 기록 된 고 따라서 Hyd1에 의해 촉매 H2 산화 동안 활성 사이트의 정상 분포를 나타냅니다. 촉매 H2 산화 현재 (그림 8, H2) −0.199 V −0.074 V vs 그녀;에서 시간의 기능으로 일정 하 게 유지 하는 사실에 의해 확인 된다 정상 상태 조건 달성 +0.356 V에서 전류에 점진적 붕괴 vs 그녀 Hyd1의 유명한 혐 기성 산화 비활성화 예정 이다. 55 활성 사이트의 배포는 명확 하 게 모든 잠재력에 Ar과 H2 에서 다른 Hyd1 촉매를 수행 (그림 8b, −0.199, −0.074 및 +0.356 V 스펙트럼 vs 그녀). 그러나 Ar과 H2 에 아래에 기록 하는 스펙트럼은 −0.594 V vs 그녀, 거의 동일, 그리고이 실험 일관성;의 중요 한 테스트를 나타냅니다. Hyd1 pH 6.0 ( 그림 8 Ar과 H2 에 전류는 0에 가까운)에 상당한 속도로 H+ 를 감소 하지 않습니다 그리고 −0.594 V에 스펙트럼 따라서 같은 것으로 예상 된다.

그림 9 에 혐 기성 산화 비활성화 방법을 보여 줍니다. Hyd1 통해 +0.35636 대에서 H2 산화 중 Ni-B Ni-시에서의 형성의 스펙트럼은 현재 시간 추적에 회색 시간 간격 동안 기록 되었다 그림 9에. −0.074에서 V Hyd1 산화 비활성화를 받아야 하지 않습니다 하 고 활성 사이트의 배포 전체 잠재적인 단계에 걸쳐 일정 하 게 유지 합니다. 이것은 그림 9b, −0.074 잠재적인 단계, 및 나중에 기록 된 그림 9bii 의 시작에 절대 기준 수정 스펙트럼을 보고 스펙트럼에 의해 증명 잠재적인 단계에서 시간과 그림 9b상대적인 차이 스펙트럼으로 보고 됩니다. 그림 9biii 에 스펙트럼 및 biv 또한 그림 9b, 상대적인 차이 스펙트럼으로 보고 하 고 잠재적인 높은 동안 Ni-b Ni-네의 점진적 변환 표시 비활성화, 그림 9에서 +0.356 V에서 전류에서 단조 감소와 일치.

솔루션 산도의 범위에서 기록 된 스펙트럼 촉매 Hyd1 동안 단계 주기 양성자 전송에 통찰력을 줄. 43 그림 10 pH 3.0 및 pH 9.0, 실험적인 버퍼 교환 spectroelectrochemical 셀에서 솔루션 흐름을 사용 하 여 동일한 Hyd1 필름에 기록 하는 PFIRE 스펙트럼을 보여줍니다. Ni C 및 Ni-L의 상대 농도이 두 스펙트럼에 명확 하 게 다르다. 비-매출 조건 하에서 적용된 가능성을 변화 하 여 NiC 및 Ni-L의 잠재적인 의존 상태 pH 값 (그림 10b)의 범위에서 빠르게 확인할 수 있습니다 그리고 두 국가 발견 isopotential 넓은 pH 범위. ( 그림 10b 피크 absorbances만 편의상, Hyd1의 titrations 히 달고 그 외 여러분에 의해 보고 된 전체 redox Ni C와 Ni L 상태 표시 note) 36 Ni C 및 Ni-L의 농도의 pH 적정 다음 추출할 수 있습니다, 잠재력에서 최대 흡 광도 복용 하 여 총 Ni C와 Ni L 농도그림 10(c) 각 pH에서 최대 이다. 이 방법에서는, 및 EPR 데이터와 함께에서, Ni C와 Ni L 상태 사이 pH 평형 확인 되었습니다. 43

Figure 1
그림 1: 적외선 분석기, 혐 기성 글러브, ATR 액세서리, MCT 발견자 배열의 회로도 가스 흐름 시스템 및 PFIRE 측정을 위해 사용 하는 potentiostat. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 입구/출구 연결 전극 및 솔루션의 배치를 보여주는 PFIRE 측정을 위해 사용 되는 spectroelectrochemical 셀의 회로도. 셀 및 baseplate 폴 리 에테르 에테르 케 톤 (PEEK)에서 탄소 막대 전극 연결, Pt 와이어 카운터 전극, 포화 calomel 참조 전극 및 솔루션 입구 및 출구를 위한 나사 구멍 가공 됩니다. 포화 calomel 참조 전극 건설 이전으로 보고 됩니다. 36 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 분노에 입금 하 고 버퍼 리하이드레이션 된 카본 블랙 Hyd1 수정 입자의 흡 광도 스펙트럼. 내가 밴드 아 미드, 아 미드 II 밴드, 그리고 Hyd1 액티브 사이트 지역의 위치 C-H 스트레칭 진동 및 용 매 물 추가 기능이 표시 됩니다. 삽입 표시 vCOvCN 밴드와 액티브 사이트 영역의 확대 보기를 표시 합니다. '로 준비 된 ' 입자 산화, 비활성 Ni-B 상태에 주로 Hyd1 포함 되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : −0.8 V vs SCE 감소 - 산화 차이 스펙트럼으로 H2 대기권의 밑에 Hyd1의 활성화. 산화 낮은 잠재적인 활성화, 비활성 Ni-B (및 Ni-네의 작은 농도)는 더 감소, 활성 상태 Ni-C, Ni-R 및 Ni-L. 참고 Hyd1 Ni-L과 Ni-r.의 두 가지 하위 상태는 변환 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 : Spectroelectrochemical 셀에 기록 된 촉매 순환 voltammograms의 형상에 솔루션 유량의 영향. Voltammograms H2의 흐름 속도 증가에 기록 되었다-표시 된 버퍼를 포화. 20 mL/min (레드)의 흐름 속도 voltammogram 앞으로 스캔 0 V vs 그녀 위에 중요 한 비활성화를 보여줍니다. 이상 52 mL/min 흐름 속도로 비활성화의 정도 훨씬 낮은 이며 현재 모든 잠재력에 유량의 독립. 다른 매개 변수: H2를 10 mV/s 스캔 속도 바 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6 : 기준선 0 V vs SCE에서 산화, 비활성 Ni-B 상태 활성 사이트 ν공동 지역에서 IR 스펙트럼 수정. 활성 사이트 강도의 측정 손실 연속 PFIRE 측정의 48 h 동안 이며 따라서 Hyd1 튼튼하게 카본 블랙의 입자에 흡착 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7: 데이터 처리에 사용할 기준선 보정 절차의 세부 사항. 초기 앵커 포인트는 어떤 ν ν공동 CN 봉우리 두 번째 파생 상품 분석 (b)에서 식별을 방지 하도록 활성 사이트 (), 지역에서 절대 흡 광도 스펙트럼에 배치 됩니다. 결과 기준 수정된 스펙트럼 (c)에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 8
그림 8: -매출 (아칸소)와 회전율 (H2) 조건에서 Hyd1에 PFIRE 측정. spectroelectrochemical 셀 아칸소 포화 (회색) 및 H2에 Hyd1의 () 현재 시간 흔적-포화 (검정) 버퍼; (b), (c) PFIRE 스펙트럼 보여주는 Ar (b) 및 H2 (c) 각 잠재력에 ν공동 지역. 잠재력 V vs 그녀 인용. 히 달고 허가 재현 35 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 9
그림 9: Ni-B Ni-시에서의 형성을 통해 Hyd1의 혐 기성 비활성화. () 현재 시간 추적 +0.356 V에 안정적인 electrocatalytic −0.074 V와 느린 혐 기성 비활성화 (단조 감소 전류에서) 현재를 보여주는 H2 분위기에서 그녀. (b) 스펙트럼 기록에 표시 된 회색 음영된 지역 중 (a). 스펙트럼 b −0.074 V 잠재적인 단계 시작 부분에 기록 된 기준 수정된 스펙트럼 이다. 스펙트럼 bii, −0.074 V 단계에서 나중에 기록 된 b 상대적인 차이 스펙트럼으로 보고 되 고 −0.074 V에 잠재력의 안정성과 일관 된 활성 사이트의 분포에 변화가 발생을 보여줍니다. 스펙 트 라 b , biv b 상대적인 차이 스펙트럼으로 보고 또한 및 +0.356 V에 혐 기성 비활성화 중 Ni-b Ni-네의 점진적 변환 표시 vs 그녀. 히 달고 허가 재현 35 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 10
그림 10 : 스펙트럼 솔루션 pH의 범위에서 기록 된 Hyd1 촉매 주기 동안 단계 양성자 전송에 통찰력을 주지. () IR 스펙트럼을 보여주는 Hyd1, ν공동 지역 pH 3.0 (-54 mV vs 그녀)와 pH 9.0 (-334 mV vs 그녀)에서 기록. (b) Spectroelectrochemical titrations는 Ni C와 Ni L 농도 솔루션 pH 값의 범위에서 최대 잠재력을 결정 하기 위해 실시 했다. Ni C와 Ni L 농도만 Hyd1 참조 히 달고 의 전체 spectroelectrochemical 적정에 대 한 이해를 돕기 위해 표시 됩니다. Ni C 및 Ni-L, 일련의 (b)에 표시 된 같은 실험에서 결정의 상대 농도의 36 (c) pH 의존성 스펙트럼은 20 ° c.에서 기록 했다 머피 허가 적응 42 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

PFIRE 산화 환 원 전극 움직일 단백질을 해결 하기 위한 광범위 하 게 적용 가능한 IR 분 광 기술입니다. 특히, 산화 환 원 효소의 electrocatalytic 반응 빠른 회전율 조건 하에서 조사 될 수 있습니다. PFIRE 메서드는 PFE 없습니다 직접 구조 정보를 제공 하 고 탄소 전극에 IR 분광학을 커플의 기술에 의해 제공 하는 직접 전기 컨트롤 작성 합니다. PFIRE 접근 따라서 혼자 전기 화학에서 사용할 수 있는 정보에 화학 통찰력을 추가 하 고 공부에 매우 적합 한 산화 단백질 및 효소의 분자 바인딩 및 활성화에 관여. 또한, PFIRE 촉매 회전율의 부재에 있는 단백질에 잠재력 종속 구조 변화에 대 한 정보를 제공할 수 있습니다. 이러한 비-매출 전자 전송 이벤트 들은 PFE의 '표준' 응용 프로그램을 사용 하 여 감지 하기 어려운 푸리에 변환 AC voltammetry PFE의 확장 큰 성공을. 와 함께 사용 되었습니다. 45 , 46

PFIRE 메서드는, 원칙적으로, PFE를 사용 하 여 공부 될 수 있다 산화 환 원 단백질 든 지의 연구에 적합. 따라서, PFE와 마찬가지로 단백질 흡착 성공적인 PFIRE 실험에 대 한 중요 한 단계입니다. 이 프로토콜에서 우리는 PFIRE 기술 사례 연구로 대장균 Hyd1를 사용 하 여 응용 프로그램을 설명 합니다. 36 , 그러나 43 , 우리는 또한 적용 PFIRE 기술을 R. eutropha,44 에서 세포질 규제 hydrogenase 플 라빈 mononucleotide 카본 블랙에 흡착 하 고. 40 이 모든 경우에 수정 되지 않은 높은 표면적 카본 블랙 (로이 프로토콜에서 설명)을 간단한 물리적 흡착 높은 신호 대 잡음 비율 기록 좋은 품질 적외선 스펙트럼을 충분히 높은 단백질의 표면 적용을 제공 합니다. 흡착의 이러한 높은 레벨을 얻을 수 없는 경우에 그것은 전극 표면에 단백질의 공유 첨부 파일을 허용 하도록 예, 탄소 입자의 표면 수정 해야 합니다. 60 , 61 , 62 PFIRE 측정 한 글러브를 사용 하 여 때만 필요한 공부 샘플을 anaerobically를 처리 해야 합니다. 그러나 매우 일정 한 연습 및 글러브 분위기에서 제공 하는 수증기의 낮은 (< 80 ° C 이슬점) 수준에서 아주 작은 absorbances의 추출 수 있는 높은 신호-잡음 레벨을 제공 합니다. 44 많은 경우에는 혐 기성 환경, 글러브에서 제공 하는 또한 전기 화학 측정 (PFIRE 기술에 통합)에 대 한 바람직한 작업 전극에 O2 감소 때문에 현재를 피하기 위하여.

대량, 실험적인 버퍼에 샘플 흡착은 탄소 입자 IR absorbances 모든 실험 스펙트럼에 크게 기여할 고의 밴드를 겹칠 수 있는 관심, 특히는 아 미드에에서 I, II 및 III의 지역에서 스펙트럼입니다. 63 아 미드 지역에는 또한 flavins 또는 니코틴 cofactors로 기판 및 많은 산화와 감소 반응의 제품 유기 종에서 정보가 들어 있습니다. NiFe hydrogenases의 경우 활성 사이트의 ν ν공동 CN 밴드 스펙트럼의 상대적으로 명확한 지역에 빠지게 하 고 그래서 PFIRE 기술을 아주 잘이 효소의 연구에 적합 하다. 그러나 다른 경우에, 차이 스펙트럼 동위 원소 라벨 접근 함께 필요할 수 있습니다 변경 고정된 단백질 인 분리. 비슷한 접근 식별, 예를 들어 protonation 변경, 구조상 재배열 하 고 Michaelis Menten 단지 적외선 분광학을 사용 하 여 공부에 사용 되었습니다. 64 , 65 , 66 PFIRE는, 그러므로, hydrogenases의 연구 하지만 모든 산화 단백질 포함 된 (또는 누구의 기판, 제품 또는 억제제 포함)에 적용할 수 있는 그룹 진단 IR 액티브 진동; 일산화 탄소 dehydrogeanses,67 nitrogenases,68,14 flavoproteins,40 및 편대 dehydrogenases, 예를 들면.

관련된 기술, 세이 라, 아주 잘 biomimetic 환경에서 막 관련 단백질의 연구에 적합 하다. 32 세이 라 IR 분광학을 또한 ATR IR 구성을 사용 하 여 ATR 프리즘 (분노)의 표면에 분자 내에 있는 가까운 (몇 nm)의 IR 흡 광도 증폭 하는 표면 강화 효과의 사용의 적응 이다. 세이 라 절 묘하게 용 매에서 경쟁 신호에서 상대적으로 자유롭다 흡착된 단백질 및 막 아키텍처 내에서 발생 하는 스펙트럼 변화에 민감한 따라서 이며 기판/억제제 솔루션에서 제시. 이것은 분노의 표면 위에 상당히 큰 침투 깊이에 의존 하는 여기에 설명 된 PFIRE 기술은 달리 약간 (~ 1 μ m), PFIRE는 기판에 더 민감한 의미, 제품 또는 억제제 솔루션에서 제시. 이 증가 감도 '대량' 용 매를 유리할 수 있다; 기판 또는 제품 적외선에 의해 직접 관찰 될 수 있다, PFIRE 스펙트럼 긴 활성 종 및 electrocatalysis 중 관련된 제품 형성의 두 안정 상태 활동에 보고 합니다. 69 기질과 제품의 정상 상태 농도 관찰 하는 능력 (는 CO에 CO2, 강한 적외선 흡수의 가역 산화 catalyzes) 일산화 탄소 효소 등 효소에 대 한 특히 도움이 될 것입니다 또는 (는 CO2편대의 가역 산화 catalyzes) 편대 효소

현재, PFIRE 데이터 수집 및 ATR IR 형상에 대 한 분노의 표면에 효소를 '집중' 하는 데 사용 하는 거시적인 탄소 전극 인 효소 electrocatalysis의 정상 상태 운동 연구로 제한 됩니다. 이 점에서 NiFe hydrogenases의 PFIRE 학문은 빛 트리거 과도 흡수 적외선 분광학을 사용 하 여 하위 매출 달성 속도 론 연구49,50 다이어와 동료 들의 작품을 보완. 작업은 진행 spectroelectrochemical 셀,40 을 소형화 하 고 microelectrodes의 사용으로 달성 해야 마이크로초 순서 시간 분해능. 이 ca 까지 회전율 주파수와 효소에 대 한 하위 매출 달성 속도 론 연구-1100-500의 하면 그리고 감소 그리고 산화 과정의 연구를 수 있게 된다.

전반적으로, PFIRE 정상 상태 조건 하에서 산화 환 원 효소의 electrocatalytic 반응의 화학 특성을 허용 하는 광 기술입니다. PFIRE 접근 여러 화학 및 전기 화학 titrations를 단백질의 강력한 흡착을 제공 하는 높은 표면적 전극 사용으로 ATR IR 형상 허용 손쉬운 솔루션 exchange 같은 효소 샘플에 실행 될 수 있습니다. 효소 기능 중 같은 구조 정보를 현장에서 수집 하는 더 넓은 bioelectrochemistry 지역 사회에 대 한 귀중 한 도구입니다.

Disclosures

저자는 경쟁 금융 관심을 선언합니다.

Acknowledgments

K.A.V.와 P.A.A.의 작품 유럽 연구 위원회 (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), 공학 및 물리 과학 연구 위원회 IB 촉매 상 EP/N013514/1, 그리고 생명 공학 및 생물 과학 연구에 의해 지원 되었다 위원회 (BB/L009722/1 및 BB/N006321/1). 상대습도 정부의 데 많은 y Tecnologìa, 코스타리카 대학, 링컨 대학, 옥스포드에 의해 지원 되었다. 저자 찰리 존스 씨, 씨 찰리 Evans 및 기계 워크숍 (화학과)의 설계 및이 작업에 사용 하는 spectroelectrochemical 세포의 제조에 도움에 대 한 인정 합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrometer Agilent 680-IR with an external MCT detector
ATR accessory Pike Technologies GladiATR Customised for use with a 5-reflection Si IRE
Glovebox Glove Box Technology Ltd. N/A Custom designed 'wet' and 'dry' box for anaerobic sample handling and measurement
KBr window Crystran Custom To allow coupling of the glovebox with the external beam of the FTIR spectrometer
Additional optics Agilent N/A Components from a PM-IRRAS accessory
Silicon IRE Crystal GmbH Custom Trapezoidal: 8.4 mm x 5 mm (large face), 1 mm thickness, ca 39 degree face angle
Potentiostat Metrohm Autolab PGSTAT 128N
Nova 10.1 Metrohm Software for controlling the potentiostat
Peristaltic pump Williamson Manufacturing Company Ltd QL-1000-024-300
Pt wire Surepure Chemetals 3272 99.95% Pure Platinum Wire, 0.014 inch Diameter
Carbon rod WH Smith 30729209 0.7 mm HB pencil lead
Carbon black Cabot Corporation Black Pearls 2000
Ultrasonic bath Ultrawave U100 35 W
Centrifugal filter Merck Millipore UFC5050BK Amicon Ultra, 50 KDa MW cutoff
Microcentrifuge Eppendorf 5452000018 MiniSpin
NaCl Sigma 71376
H2SO4 Fisher S/9240/PB17
HNO3 Fisher N/2300/PB17
silicone sealant Cow Corning Toray Co., Ltd. SE 4486
Carbon paper Toray TGP-H-030
H2 gas BOC
N2 gas BOC
OriginPro 2015 OriginLab Data analysis/graphing software
Resolutions Pro 4.0 Varian Software for controlling FTIR spectrometer

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References

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단백질 영화 적외선 전기 화학 [NiFe] Hydrogenase에 의해 H<sub>2</sub> 산화의 연구에 대 한 설명
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Ash, P. A., Hidalgo, R., Vincent, K. A. Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase. J. Vis. Exp. (130), e55858, doi:10.3791/55858 (2017).More

Ash, P. A., Hidalgo, R., Vincent, K. A. Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase. J. Vis. Exp. (130), e55858, doi:10.3791/55858 (2017).

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