여기, 우리 기술, 단백질 영화 적외선 전기 화학, 탄소 전극에 직접 전기 통제 시선 공부 고정된 산화 단백질을 수 있는 설명 합니다. 단일 단백질 시료의 적외선 스펙트럼 적용된 잠재력의 범위는 다양 한 솔루션 조건 아래에 기록할 수 있습니다.
단백질 내 센터 화학 산화 환 원 정밀 하 게 제어를 제공 하는 산화 환 원 단백질 요구 방법의 이해. 있는 단백질은 움직일 전극 표면에 전극 대체 생리 전자 기증자 또는 수락자, 그런 단백질 필름 전기 화학의 기술을 다양 한 다른의 산화 환 원 반응으로 기능 통찰력 제공 단백질입니다. 전체 화학 이해 전기 제어를 추가 구조 및 기계적 통찰력을 추가할 수 있는 다른 기술로 결합 될 필요 합니다. 여기 기술, 단백질 영화 적외선 전기 화학, 산화 환 원 단백질의 적외선 분 광 샘플링 단백질 영화 전기 화학을 결합 하 여 설명 합니다. 기술은 높은 표면적 카본 블랙 전극에 움직일 산화 단백질을 다중 반사 감쇠 총 반사율 기하학을 사용 합니다. 흐름의 셀이 전극의 결합 솔루션 pH 또는 용 질 농도를 측정 하는 동안 변경 될 수 있습니다. 이것은 특히 강력한 산화 환 원 효소, 촉매 급속 한 회전율을 지속 수 있으며 촉매 메커니즘에 긴 중간 종의 분 광 관측을 허용 하는 전극에서 제어 해결. 회전율 (H2 산화)와 비-매출 조건에서 대장균 hydrogenase 1에 실험 기술을 설명합니다.
단백질 기능 연구에 핵심 과제 중 vivo에서 또는 사용 하 여 그들의 생리 적 역할을 수행 하는 단백질의 직접 관찰 절연 단백질 샘플을 허용 하는 현장에서 방법의 개발을 포함 한다. 이 단백질 기능 동시에 측정 하는 동안 컨트롤 또는 트리거링 실험 절차와 평가 될 모두 반응성을 허용 하는 결합 된 기술의 사용 프로세스의 통합 및 개별 화학 단계 필요 합니다. 산화 단백질의 경우이 종종 동일한 정확 하 게 적용 된 잠재력을 제어 하지만 화학적으로 특정에 민감한 분 광 기술로 직접 아무 화학 정보를 제공 하는 전기 화학 기법을 결합 하 변경 연관 단백질 기능입니다. 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry는 다양 한 분 광 기술 및 전기 제어의 수준을 포함 하는 결합 된 전기 및 분 광 방법의 범위에 대 한 일반적인 용어입니다. 이 작은 분자를 사용 하 여 전자 전송, UV-표시,4,5 와 결합을 포함 하 여 중재를 연구에 이용 되 고 많은 단백질 인공, 수용 성 전자 기증자와 수락자로 전자를 교환할 수 있습니다. , 6 , 7 자석 원형이 색 성8 및 적외선5,,910,11,12,13,14 (IR) spectroscopies입니다. 제한 된 수의 경우 단백질과 전극 unmediated, 보급 통제 전자 교류를 악용 수 입증 했다. 15 , 16
촉매 반응에 대 한 실시 산화 환 원 효소, 현재의 솔루션 전기 화학 방법에 의해 명확한 불리. 될 가능성이 높습니다 확산 제어 전자 전송을 통해 redox 중재자 솔루션에서 속도 제한. 효소에 대 한 운동 및 기계 정보 손실 될 수 있습니다 또는 적어도 실험 방법에서 발생 하는 확산 유물에서 deconvolute 어려워. 직접, unmediated 전기 제어 따라서 산화 단백질 및 효소의 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 단백질 필름 전기 (PFE)의 기술 산화 환 원 전극 움직일 단백질, 전극 잠재력의 시리즈에서 편광으로 직접 또는 산화 환 원 공동 인자 단백질 내에서 전자 전송 되는 방식으로 사용 합니다. 17 , 18 , 19 PFE은 산화 환 원 효소에 의해 촉매 산화 또는 감소 반응의 연구에 대 한 특정 값의 계면 전자 전송 매우 높은 속도로 달성 될 수 있다. 예를 들어 Allochromatium vinosum 에서 니켈-철 합금 ([NiFe]) hydrogenase의 electrocatalytic 이직 률 PFE에 의해 H2 산화에 대 한 ca 1000-10000의− 1 로 측정 되었다. 20 잠재적인 전극 촉매 ” 또는 ‘해제’ 및 효소 활동에 electrocatalytic 현재 보고서를 방 아 쇠 역할을 합니다. PFE 잠재력, [페]의 디-철 활성 사이트의 반응 등을 속속들이 의존 하는 복잡 한 효소의 반응성을 분석 하기 위한 유용한 방법 이므로-CO와 O2,21 hydrogenases 또는 잠재력 유도 hydrogenases,22 일산화 탄소 효소,23 및 다른 복잡 한 산화 환 원 효소의 비활성화 반응. 24
산화 환 원 효소, 1-2 pmol cm-2 [NiFe] hydrogenase A. vinosum에서 순서의 낮은 표면 범위에서 발생 하는 주요 장벽 PFE에 의해 받으면 직접 전기 제어와 분 광 기법을 결합 하 대량 금속 전극에 작은 분자 adsorbates의 표면 과학 연구 현장에 상대적인 20 . 이 분 광 측정의 감도 대 한 도전을 선물 한다. 여러 가지 spectroelectrochemical 방법을 보고 되었습니다 공부에 대 한 다양 한 다른 전극에서 산화 환 원 단백질 움직일: 투명 금속 산화물 전극;에서 UV 보이는 분광학 25 , 26 , 금 전극;에서 27 형광 분광학 28 , 29 (세이 라) 표면 강화 된 적외선 흡수 분광학에서 금 전극; 30 , 31 , 32 , 33 그리고 표면 강화 라만 분 광 기술을, 주로 실버 전극. 34 , 35
여기는 커플링 PFE IR 분광학, 단백질 영화 적외선 전기 화학 (PFIRE)로 알려져 있는 기술에 대 한 방법에 설명 합니다. 36 는 PFIRE 메서드는 산화 환 원 효소를 이용 하는 다양 한 탄소 표면에 단백질의 흡착의 용이성 감쇠 총 반사율 (ATR-IR) IR 기하학와 함께에서 높은 표면적 탄소 작업 전극에 움직일 수를 공부 한다. 적외선 분광학은 많은 작은 분자, ligands 및 공동 인자는 반응성, 바인딩, 억제 및 산화 환 원 상태를 평가 하는 데 사용할 수 있는 진단 absorbances 산화 환 원 효소와 단백질의 연구에 유용 합니다. 아니 철 황 센터, flavoproteins,38,,3940 작은 분자 헤 센터 등을37 연구의 바인딩을 등이 있습니다. 41 는 ATR-IR 형상 최적화 된 3-전극 (spectro) 전기 화학 셀42 의 건설을 허용 하 고 따라서 우수한 전기 제어를 제공 합니다. 솔루션 저항 및 잠재적인 드리프트 작업 전극 가까이 참조 전극 배치 하 여 최소화 됩니다. 높은 표면적 카운터 전극 빠른 효소 회전율 작업 전극에 의해 생성 하는 높은 electrocatalytic 전류와 호환 되는 사용 됩니다. Spectroelectrochemical 셀 솔루션의 흐름 손쉬운 제어를 기판, 저 해제 및 pH의 농도 수 있습니다. 36 , 43 , 44 는 PFIRE 메서드는 따라서 IR 스펙트럼이 지속적인된 효소 electrocatalysis 동안 기록 된 위치에 있을 수 있습니다. 36 , 44 PFIRE PFE 산화 환 원 효소에서 이외의 촉매 프로세스에서 정보를 추출이 어려울 수 있습니다 어디 달리 촉매 현재,43 의 부재에 화학 정보를 제공 하는 능력 이기도 합니다. 45 , 46
우리는 [NiFe] hydrogenases, 바이메탈 액티브 사이트에서 Fe를 조정 하는 내장 CO와 CN ligands를 포함 하 여 electrocatalytic H2 산화의 연구에 대 한 PFIRE 메서드를 증명 하고있다. 36 , 43 , 44 [NiFe] hydrogenases는 따라서 PFIRE에 의해 공부 하는 데 특히 적합. PFIRE 메서드를 사용 하면 정상 매출 중 존재 하는 종족에 대 한 정보를 제공 합니다. 및 따라서 실험적인 통제 없이 hydrogenases의 IR 분광학에 문학 부 뿐만 아니라 중요 한 기계적 통찰력을 제공 합니다. 동안 회전율. 47 , 48 다이어와 동료 고용 시간 해결 IR 메서드 NiFe hydrogenases,49,50,51 작은 부정적인 잠재적인 단계 (를 통해 사용 하거나 적용할 빛 방 아 쇠를 사용 하 여 연구를 솔루션 중재자와는 ‘감 금된’ 전자 소스) 또는 photolyse 바운드 수소. PFIRE 메서드를 사용 하면 수 없습니다, 현재 제공 시간 분해능이이 측정에 맞게40 연구 공정의 감소와 산화 촉매, 잘 정의 된 잠재력의 범위에 액세스를 허용 하지 않으며 대량 전송에서 무료 제한입니다.
PFIRE 메서드는 산화 환 원 단백질, 또한 ATR IR 기하학을 사용 하 고 전극 표면에 흡착 분자의 IR 흡 광도 향상 시키기 위해 나노 roughened 금속 전극 사용의 세이 라 연구에 다릅니다. 30 세이 라 막 단백질, 특히 흡착 공부에 대 한 매우 중요 한 기술 또는 모방 막 내 아키텍처,32 그러나 금속 전극에 대 한 필요성 때문에 반응성 기판 및 억제제 범위를 제한할 수 있습니다. 작은 분자 CO, CN–, 공동2 등 을 향한 전극 지원의 양성자 감소와 자기 조립된 단층 탈 착은 매우 부정적인 잠재력에 금속 표면에 문제가 될 수 있습니다,1,52 보호에 효소 electrocatalysis 금속 전극 비록 보고 되었습니다. 53 , 54 세이 라를 기준으로 PFIRE의 단점은 막 단백질 네이티브 또는 모방 멤브레인 구조에 통합의 상대 어려움입니다. 그러나, 경쟁 작은 분자 활성화 반응에 탄소 전극의 상대 화학 inertness는 PFIRE 효소 electrocatalysis, 생물학 산화 환 원에 관련 된 낮은 잠재력 도메인에 특히 공부에 대 한 우수한 기술 hydrogenases에 의해 양성자 감소 등 프로세스입니다. 1 , 43
이 문서의 목표는 산화 환 원 전극 움직일 단백질, 예를 들어 대장균 에서 NiFe hydrogenase 1 (Hyd1)를 사용 하 여 공부에 대 한 기법으로 PFIRE 메서드를 소개 하는 것입니다. 샘플 준비, 좋은 기질 흐름과 데이터 처리에 대 한 요구의 고려 사항은 설명 합니다. PFIRE은 광범위 하 게 적용 가능한 기술, (와 함께 독특한 IR absorbances) 수 흡착 될 탄소 전극에도 직접 모든 산화 단백질을 공부 하 고 또는 그것으로 전자를 교환할 수 있는 그런 표면 개 질를 사용 하 여 적합된 합니다 전극입니다.
PFIRE 산화 환 원 전극 움직일 단백질을 해결 하기 위한 광범위 하 게 적용 가능한 IR 분 광 기술입니다. 특히, 산화 환 원 효소의 electrocatalytic 반응 빠른 회전율 조건 하에서 조사 될 수 있습니다. PFIRE 메서드는 PFE 없습니다 직접 구조 정보를 제공 하 고 탄소 전극에 IR 분광학을 커플의 기술에 의해 제공 하는 직접 전기 컨트롤 작성 합니다. PFIRE 접근 따라서 혼자 전기 화학에서 사용할 수 있는 정보에 화학 통찰력을 추가 하 고 공부에 매우 적합 한 산화 단백질 및 효소의 분자 바인딩 및 활성화에 관여. 또한, PFIRE 촉매 회전율의 부재에 있는 단백질에 잠재력 종속 구조 변화에 대 한 정보를 제공할 수 있습니다. 이러한 비-매출 전자 전송 이벤트 들은 PFE의 ‘표준’ 응용 프로그램을 사용 하 여 감지 하기 어려운 푸리에 변환 AC voltammetry PFE의 확장 큰 성공을. 와 함께 사용 되었습니다. 45 , 46
PFIRE 메서드는, 원칙적으로, PFE를 사용 하 여 공부 될 수 있다 산화 환 원 단백질 든 지의 연구에 적합. 따라서, PFE와 마찬가지로 단백질 흡착 성공적인 PFIRE 실험에 대 한 중요 한 단계입니다. 이 프로토콜에서 우리는 PFIRE 기술 사례 연구로 대장균 Hyd1를 사용 하 여 응용 프로그램을 설명 합니다. 36 , 그러나 43 , 우리는 또한 적용 PFIRE 기술을 R. eutropha,44 에서 세포질 규제 hydrogenase 플 라빈 mononucleotide 카본 블랙에 흡착 하 고. 40 이 모든 경우에 수정 되지 않은 높은 표면적 카본 블랙 (로이 프로토콜에서 설명)을 간단한 물리적 흡착 높은 신호 대 잡음 비율 기록 좋은 품질 적외선 스펙트럼을 충분히 높은 단백질의 표면 적용을 제공 합니다. 흡착의 이러한 높은 레벨을 얻을 수 없는 경우에 그것은 전극 표면에 단백질의 공유 첨부 파일을 허용 하도록 예, 탄소 입자의 표면 수정 해야 합니다. 60 , 61 , 62 PFIRE 측정 한 글러브를 사용 하 여 때만 필요한 공부 샘플을 anaerobically를 처리 해야 합니다. 그러나 매우 일정 한 연습 및 글러브 분위기에서 제공 하는 수증기의 낮은 (< 80 ° C 이슬점) 수준에서 아주 작은 absorbances의 추출 수 있는 높은 신호-잡음 레벨을 제공 합니다. 44 많은 경우에는 혐 기성 환경, 글러브에서 제공 하는 또한 전기 화학 측정 (PFIRE 기술에 통합)에 대 한 바람직한 작업 전극에 O2 감소 때문에 현재를 피하기 위하여.
대량, 실험적인 버퍼에 샘플 흡착은 탄소 입자 IR absorbances 모든 실험 스펙트럼에 크게 기여할 고의 밴드를 겹칠 수 있는 관심, 특히는 아 미드에에서 I, II 및 III의 지역에서 스펙트럼입니다. 63 아 미드 지역에는 또한 flavins 또는 니코틴 cofactors로 기판 및 많은 산화와 감소 반응의 제품 유기 종에서 정보가 들어 있습니다. NiFe hydrogenases의 경우 활성 사이트의 ν ν와공동 CN 밴드 스펙트럼의 상대적으로 명확한 지역에 빠지게 하 고 그래서 PFIRE 기술을 아주 잘이 효소의 연구에 적합 하다. 그러나 다른 경우에, 차이 스펙트럼 동위 원소 라벨 접근 함께 필요할 수 있습니다 변경 고정된 단백질 인 분리. 비슷한 접근 식별, 예를 들어 protonation 변경, 구조상 재배열 하 고 Michaelis Menten 단지 적외선 분광학을 사용 하 여 공부에 사용 되었습니다. 64 , 65 , 66 PFIRE는, 그러므로, hydrogenases의 연구 하지만 모든 산화 단백질 포함 된 (또는 누구의 기판, 제품 또는 억제제 포함)에 적용할 수 있는 그룹 진단 IR 액티브 진동; 일산화 탄소 dehydrogeanses,67 nitrogenases,68,14 flavoproteins,40 및 편대 dehydrogenases, 예를 들면.
관련된 기술, 세이 라, 아주 잘 biomimetic 환경에서 막 관련 단백질의 연구에 적합 하다. 32 세이 라 IR 분광학을 또한 ATR IR 구성을 사용 하 여 ATR 프리즘 (분노)의 표면에 분자 내에 있는 가까운 (몇 nm)의 IR 흡 광도 증폭 하는 표면 강화 효과의 사용의 적응 이다. 세이 라 절 묘하게 용 매에서 경쟁 신호에서 상대적으로 자유롭다 흡착된 단백질 및 막 아키텍처 내에서 발생 하는 스펙트럼 변화에 민감한 따라서 이며 기판/억제제 솔루션에서 제시. 이것은 분노의 표면 위에 상당히 큰 침투 깊이에 의존 하는 여기에 설명 된 PFIRE 기술은 달리 약간 (~ 1 μ m), PFIRE는 기판에 더 민감한 의미, 제품 또는 억제제 솔루션에서 제시. 이 증가 감도 ‘대량’ 용 매를 유리할 수 있다; 기판 또는 제품 적외선에 의해 직접 관찰 될 수 있다, PFIRE 스펙트럼 긴 활성 종 및 electrocatalysis 중 관련된 제품 형성의 두 안정 상태 활동에 보고 합니다. 69 기질과 제품의 정상 상태 농도 관찰 하는 능력 (는 CO에 CO2, 강한 적외선 흡수의 가역 산화 catalyzes) 일산화 탄소 효소 등 효소에 대 한 특히 도움이 될 것입니다 또는 (는 CO2편대의 가역 산화 catalyzes) 편대 효소
현재, PFIRE 데이터 수집 및 ATR IR 형상에 대 한 분노의 표면에 효소를 ‘집중’ 하는 데 사용 하는 거시적인 탄소 전극 인 효소 electrocatalysis의 정상 상태 운동 연구로 제한 됩니다. 이 점에서 NiFe hydrogenases의 PFIRE 학문은 빛 트리거 과도 흡수 적외선 분광학을 사용 하 여 하위 매출 달성 속도 론 연구49,50 다이어와 동료 들의 작품을 보완. 작업은 진행 spectroelectrochemical 셀,40 을 소형화 하 고 microelectrodes의 사용으로 달성 해야 마이크로초 순서 시간 분해능. 이 ca 까지 회전율 주파수와 효소에 대 한 하위 매출 달성 속도 론 연구-1100-500의 하면 그리고 감소 그리고 산화 과정의 연구를 수 있게 된다.
전반적으로, PFIRE 정상 상태 조건 하에서 산화 환 원 효소의 electrocatalytic 반응의 화학 특성을 허용 하는 광 기술입니다. PFIRE 접근 여러 화학 및 전기 화학 titrations를 단백질의 강력한 흡착을 제공 하는 높은 표면적 전극 사용으로 ATR IR 형상 허용 손쉬운 솔루션 exchange 같은 효소 샘플에 실행 될 수 있습니다. 효소 기능 중 같은 구조 정보를 현장에서 수집 하는 더 넓은 bioelectrochemistry 지역 사회에 대 한 귀중 한 도구입니다.
The authors have nothing to disclose.
K.A.V.와 P.A.A.의 작품 유럽 연구 위원회 (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), 공학 및 물리 과학 연구 위원회 IB 촉매 상 EP/N013514/1, 그리고 생명 공학 및 생물 과학 연구에 의해 지원 되었다 위원회 (BB/L009722/1 및 BB/N006321/1). 상대습도 정부의 데 많은 y Tecnologìa, 코스타리카 대학, 링컨 대학, 옥스포드에 의해 지원 되었다. 저자 찰리 존스 씨, 씨 찰리 Evans 및 기계 워크숍 (화학과)의 설계 및이 작업에 사용 하는 spectroelectrochemical 세포의 제조에 도움에 대 한 인정 합니다.
Spectrometer | Agilent | 680-IR | with an external MCT detector |
ATR accessory | Pike Technologies | GladiATR | Customised for use with a 5-reflection Si IRE |
Glovebox | Glove Box Technology Ltd. | N/A | Custom designed 'wet' and 'dry' box for anaerobic sample handling and measurement |
KBr window | Crystran | Custom | To allow coupling of the glovebox with the external beam of the FTIR spectrometer |
Additional optics | Agilent | N/A | Components from a PM-IRRAS accessory |
Silicon IRE | Crystal GmbH | Custom | Trapezoidal: 8.4 mm x 5 mm (large face), 1 mm thickness, ca 39 degree face angle |
Potentiostat | Metrohm | Autolab PGSTAT 128N | |
Nova 10.1 | Metrohm | Software for controlling the potentiostat | |
Peristaltic pump | Williamson Manufacturing Company Ltd | QL-1000-024-300 | |
Pt wire | Surepure Chemetals | 3272 | 99.95% Pure Platinum Wire, 0.014 inch Diameter |
Carbon rod | WH Smith | 30729209 | 0.7 mm HB pencil lead |
Carbon black | Cabot Corporation | Black Pearls 2000 | |
Ultrasonic bath | Ultrawave | U100 | 35 W |
Centrifugal filter | Merck Millipore | UFC5050BK | Amicon Ultra, 50 KDa MW cutoff |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5452000018 | MiniSpin |
NaCl | Sigma | 71376 | |
H2SO4 | Fisher | S/9240/PB17 | |
HNO3 | Fisher | N/2300/PB17 | |
silicone sealant | Cow Corning Toray Co., Ltd. | SE 4486 | |
Carbon paper | Toray | TGP-H-030 | |
H2 gas | BOC | ||
N2 gas | BOC | ||
OriginPro 2015 | OriginLab | Data analysis/graphing software | |
Resolutions Pro 4.0 | Varian | Software for controlling FTIR spectrometer |