Här, beskriver vi en teknik, protein film infraröd elektrokemi, som tillåter immobiliserade redox proteiner studeras spectroscopically under direkt kontroll av elektrokemiska på en kol elektroden. Infraröda spektra av ett enda protein prov kan registreras på ett utbud av tillämpad potentialer och under en mängd lösning villkor.
Förstå kemi redox proteiner krav metoder som ger exakt kontroll över redox centra inom proteinet. Tekniken med protein film elektrokemi, där ett protein är orörlig på en elektrod ytan så att elektroden ersätter fysiologiska Elektronoljedoseringar eller acceptorer, har lämnat funktionella inblick in i redoxreaktioner av en rad olika proteiner. Fullständiga kemiska förståelse kräver elektrokemiska kontroll ska kombineras med andra tekniker som kan lägga till ytterligare strukturella och mekanistiska insikt. Här visar vi en teknik, protein film infraröd elektrokemi, som kombinerar protein film elektrokemi med infraröd spektroskopiska provtagning av redox proteiner. Tekniken använder en multipel-reflektion försvagat totala reflektans geometri sond en redox protein orörlig på en hög yta kimrök elektrod. Införlivandet av denna elektrod i en flöde cell tillåter lösning pH eller Lösningens koncentration ändras under mätningarna. Detta är särskilt kraftfull i att ta itu med redox enzymer, där snabb katalytisk omsättning kan bevaras och kontrollerade på elektroden tillåter spektroskopiska observationer av långlivade mellanliggande arter i katalytiska mekanismen. Vi demonstrera tekniken med experiment på E. coli hydrogenase 1 omsättning (H2 oxidation) och icke-omsättning villkor.
En viktig utmaning i studien av proteinfunktion innebär utveckling av i situ metoder som tillåter direkt observation av proteiner som utför sina fysiologiska roller, antingen i vivo eller använda isolerade protein prover. Detta kräver integrering av kontroll eller utlösa processer experimentella rutiner och användning av kombinerade tekniker som tillåter både reaktiviteten bedömas och enskilda kemiska steg under proteinfunktion skall mätas, samtidigt. När det gäller redox proteiner motsvarar detta ofta kombinera elektrokemiska tekniker, som exakt styr tillämpad potential men ger ingen direkt kemisk information, med spektroskopiska tekniker som är känsliga för kemiskt-specifika förändringar i samband med proteinfunktion. 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry är en allmän term för en rad kopplat elektrokemiska och spektroskopiska metoder som omfattar en mängd olika spektroskopiska tekniker och elektrokemiska kontroll. Många proteiner kan utbyta elektroner med konstgjorda, lösligt Elektronoljedoseringar och acceptorer och detta har utnyttjats i studier som använder små molekyler för att medla elektronöverföring, inklusive koppling med UV-synliga,4,5 , 6 , 7 magnetisk cirkulärdichroism8 och infraröd5,9,10,11,12,13,14 (IR) spektroskopier. I ett begränsat antal fall har det visat sig möjligt att utnyttja oförmedlat, diffusion-kontrollerad elektron utbyte mellan proteiner och elektroder. 15 , 16
För katalytiska reaktioner som utförs av redox enzymer, lösning elektrokemi metoder finns en klar nackdel. Diffusion-controlled electron överföring via redox medlare i lösningen kommer sannolikt att bli hastighetsbegränsning. Kinetiska och mekanistiska information om enzymet kan förloras eller åtminstone bli svårt att deconvolute från diffusion artefakter som härrör från den experimentella metoden. Direkt och oförmedlat elektrokemiska kontroll är därför ett viktigt verktyg för studiet av redox proteiner och enzymer. Tekniken med protein film elektrokemi (PFE) sysselsätter elektrod-orörlig redox proteiner, på ett sådant sätt att elektroner överförs direkt till eller från de redox kofaktorer inom proteinet som elektroden är polariserat på en rad möjligheter. 17 , 18 , 19 PFE är av särskilt värde för studien av oxidation eller reduktion reaktioner katalyseras av enzymer som redox, gränsskiktspänning elektronöverföring kan uppnås med en mycket hög hastighet. Exempelvis mättes elektrokatalytiska Omsättningshastigheten av det nickel-järn ([NiFe]) hydrogenase från Allochromatium vinosum av PFE som ca 1.000-10.000 s−1 för H2 oxidation. 20 elektroden potentiella fungerar som en utlösare att vända katalys ‘på’ eller ‘off’, och elektrokatalytiska aktuella rapporter på enzymaktivitet. PFE är därför en värdefull metod för att analysera Reaktiviteten hos komplexa enzymer som intimt beroende av potential, såsom reaktioner av di-järn aktiva platsen för [FeFe]-hydrogenases med CO och O2,21 eller potential-inducerad inaktivering reaktioner av hydrogenases,22 kolmonoxid dehydrogenas,23 och andra komplexa redox enzymer. 24
Det främsta hindren för att kombinera spektroskopiska tekniker med direkt elektrokemiska kontroll ges av PFE uppstår från den låga yttäckning av redox enzymer, storleksordningen 1-2 pmol cm-2 för den [NiFe] hydrogenase från A. vinosum, 20 i förhållande till i situ ytan naturvetenskapliga studier av små molekyler adsorbates på bulk metallelektroderna. Detta är en utmaning för känsligheten i spectroscopic mätningen. Flera spektroelektrokemisk metoder har rapporterats för att studera orörlig redox proteiner på en rad olika elektroder: UV-synliga spektroskopi på transparent metalloxid elektroder; 25 , 26 , 27 fluorescens-spektroskopi på guld elektroder; 28 , 29 surface enhanced infraröd absorption (SEIRA) spektroskopi på guld elektroder; 30 , 31 , 32 , 33 och surface enhanced Raman spektroskopiska tekniker, främst på silver elektroder. 34 , 35
Här beskriver vi en metod för koppling PFE med IR spektroskopi, i en teknik som kallas protein film infraröd elektrokemi (PFIRE). 36 den PFIRE metoden studier redox enzymer orörlig på en hög yta kol arbetselektroden i samband med ett försvagat totala reflektans IR (ATR-IR) geometri, att utnyttja användarvänlighet adsorption av en rad proteiner på kol ytor. IR-spektroskopi är användbar i studier av redox enzymer och proteiner som många små molekyler, ligander och kofaktorer har diagnostiska absorbanserna som kan användas för att bedöma reaktivitet, bindande, hämning och redox tillstånd. Exempel: bindande av nej till järn-svavel centrerar,37 studie av andningskedjans,38,39,40 liten molekyl binder till heme centers etc. 41 ATR-IR-geometri tillåter byggandet av en optimerad tre-elektrod (spectro) elektrokemiska cellen42 och ger därför utmärkt elektrokemiska kontroll. Lösning motstånd och potentiella drift minimeras genom att placera en referenselektrod nära arbetselektroden. Höga yta counter elektroder används som är kompatibla med hög elektrokatalytiska strömmar produceras av snabb enzym omsättning på arbetselektroden. Flödet av lösning genom den spektroelektrokemisk cellen tillåter lättköpt kontroll över koncentrationen av substrat, hämmare och pH. 36 , 43 , 44 den PFIRE metoden tillåter därför IR spectra att vara inspelad i situ under ihållande enzym elektrokatalys. 36 , 44 PFIRE är också kan ge kemisk information i avsaknad av katalytisk nuvarande,43 i motsats till PFE där det kan vara svårt att utvinna information från icke-katalytiska processer i redox enzymer. 45 , 46
Vi har visat den PFIRE metoden för studien av elektrokatalytiska H2 oxidation av [NiFe] hydrogenases, som innehåller inneboende CO och CN ligander samordnas till Fe på en bimetallic aktiv webbplats. 36 , 43 , 44 [NiFe] hydrogenases är därför särskilt väl lämpade att studera genom PFIRE. Metoden PFIRE ger information om de arter som är närvarande under steady state omsättning, och därför ger avgörande mekanistisk insikt förutom rikedomen av litteratur om IR spektroskopi av hydrogenases utan experimentell kontroll över omsättningen. 47 , 48 Dyer och medarbetare har sysselsatt tid-löst IR metoder för att studera av NiFe hydrogenases,49,50,51 med en ljus utlösare att antingen använda ett litet negativa potentiella steg (via användning av lösning medlare och en ‘bur’ elektron källa) eller photolyse en bunden hydrid. Även om metoden PFIRE kan för närvarande ge tidsupplösning att matcha dessa mätningar,40 det tillåta studie av både reduktiv och oxidativ katalytiska processer, finns på en rad väldefinierade potentialer och fri från masstransporter begränsningar.
Den PFIRE metoden är skild från SEIRA studier av redox proteiner, som också använder ett ATR-IR-geometri och anställa en nanoskala ruggas-upp metall elektroden att förbättra IR absorbans molekyler adsorberat på elektrod ytan. 30 SEIRA är en ytterst värdefull teknik för att studera membranproteiner, särskilt adsorberat på eller inom mimetiska membran arkitekturer,32 men behovet av en metall elektrod kan begränsa substrat och hämmare på grund av reaktivitet av stödet som elektrod för små molekyler som CO, CN–, CO2 osv Proton minskning och själv monterade enskiktslager desorption kan vara problematiskt på metallytor på mycket negativ potential, har1,52 även om enzym elektrokatalys på oskyddade metall elektroder rapporterats. 53 , 54 en nackdel med PFIRE i förhållande till SEIRA är relativa svårigheten att införliva membranproteiner i enhetligt eller mimetiska membran arkitekturer. Men gör den relativa kemiska tröghet av kol elektroderna till konkurrerande småmolekylära aktiveringen reaktioner PFIRE en utmärkt teknik för att studera enzym elektrokatalys, särskilt i låg-potential domänen relevanta för biologiska redox processer såsom proton minskning av hydrogenases. 1 , 43
Syftet med denna artikel är att införa metoden PFIRE som en teknik för att studera elektrod-orörlig redox proteiner, med NiFe hydrogenase 1 (Hyd1) från Escherichia coli som exempel. Överväganden för provberedning, kravet på bra substrat flöde och hantering av data diskuteras. PFIRE är en allmänt tillämplig teknik, väl lämpad att studera någon redox protein (med karakteristiska IR absorbanserna) som kan vara adsorberat på Kolelektroder, antingen direkt eller med hjälp av ytmodifiering, sådan att det kan utbyta elektroner med den elektroden.
PFIRE är en allmänt tillämplig IR spektroskopisk teknik för adressering elektrod-orörlig redox proteiner. Elektrokatalytiska reaktioner av redox enzymer kan i synnerhet vara probed snabb omsättning villkor. Metoden PFIRE bygger på direkta elektrokemiska kontroll som tillhandahålls av tekniken av PFE, som ger inga direkta strukturinformation, och par det att IR spektroskopi på en kol elektroden. Metoden PFIRE således lägger kemisk insikt till tillgänglig information från elektrokemi ensam och är mycket lämpad att studera redox proteiner och enzymer involverade i liten molekyl bindning och aktivering. PFIRE kan dessutom ge information om potential beroende av strukturella förändringar i proteiner i avsaknad av katalytisk omsättning. Sådana icke-omsättning elektron överföring händelser är ofta svåra att upptäcka med hjälp av ‘standard’ tillämpningar av PFE, även om tillägget av PFE att Fourier-omvandlad AC voltametri har använts med stor framgång. 45 , 46
Den PFIRE metoden är, i princip, lämplig för studier av något redox-protein som kan studeras med hjälp av PFE. Därför, som med PFE, protein adsorption är ett kritiskt steg för en framgångsrik PFIRE experiment. I detta protokoll beskriver vi ett program i PFIRE teknik med E. coli Hyd1 som en fallstudie. 36 , 43 men vi har också tillämpat PFIRE tekniken att den cytoplasmiska reglerande hydrogenase från R. eutropha,44 och titulerades mononucleotide adsorberat på kimrök. 40 i alla dessa fall, enkla fysiska adsorption till oförändrad hög yta kimrök (som beskrivs i detta protokoll) ger en yttäckning av protein som är tillräckligt hög för att bra inspelningskvalitet IR spectra med högt signal-brus-förhållande. I fall där sådana höga nivåer av adsorption inte kan uppnås kan det vara nödvändigt att ändra ytan av kolpartiklar, till exempel att tillåta covalent tillbehöret av protein till elektrod ytan. 60 , 61 , 62 ett handskfack för PFIRE mätningar används endast absolut nödvändigt när man studerar prover som måste hanteras anaerobt. Men i praktiken den extremt konstant och låg (< 80 ° C daggpunkt) nivåer av vattenånga som tillhandahålls av glovebox atmosfären ger hög signal-brus-nivåer som tillåter utvinning av mycket små absorbanserna. 44 i många fall en syrefri miljö, till exempel som tillhandahålls av glovebox, är också önskvärt för elektrokemisk mätning (integrerad med tekniken som PFIRE) för att undvika nuvarande på grund av O2 minskning på arbetselektroden.
IR absorbanserna på grund av bulk vatten, experimentell buffertar och de kolpartiklar som provet är adsorberat bidrar avsevärt till de experimentella spectrana och kan överlappa band av intresse, särskilt i amiden I, II och III regioner i den Spectrum. 63 regionen amide innehåller också information från organiska arter såsom flaviner eller nikotinamid kofaktorer, såväl som substrat och produkter av många oxidation och reduktion reaktioner. När det gäller NiFe hydrogenases, νCO och νCN band av den aktiva platsen faller i en relativt tydlig region av spektrumet och så den PFIRE tekniken är mycket väl lämpad för studier av dessa enzymer. I andra fall dock kan skillnaden spectra tillsammans med isotopiska märkning metoder behövas att isolera förändringar på grund av immobiliserade proteinet. Liknande metoder har använts att identifiera, exempelvis protonation förändringar, strukturella rearrangements och studera Michaelis-Menten komplex med IR spektroskopi. 64 , 65 , 66 PFIRE begränsas inte, därför att studien av hydrogenases men kan tillämpas på något redox protein som innehåller (eller vars substrat, produkter eller hämmare innehålla) grupper med diagnostiska IR-aktiva vibrationer; kolmonoxid dehydrogeanses67 nitrogenases,68,14 andningskedjans,40 formate mellan östradiol och östron, till exempel.
Den relaterade tekniken, SEIRA, är mycket väl lämpad för studier av membran-associerade proteiner i biomimetiska miljö. 32 SEIRA är en anpassning av IR spektroskopi som också använder ett ATR-IR, och använder sig av en yta enhancement effekt som förstärker IR absorbansen av molekyler som ligger nära (inom några nm) ytan av ATR prismat (IRE). SEIRA är därför utsökt känslig för spektrala förändringar som inträffar inom den adsorberade protein och membran arkitekturen och är relativt fri från konkurrerande signaler från lösningsmedel och substrat/hämmare finns i lösningen. Detta är något i motsats till den PFIRE teknik som beskrivs här som förlitar sig på en betydligt större genomträngningsdjupet ovanför ytan av IRE (~ 1 µm), vilket innebär att PFIRE är mer känsliga för substrat, produkter eller hämmare presentera i lösning. Denna ökade känslighet för ‘bulk’ lösningsmedel kan vara fördelaktiga; om den substrat eller produkt kan observeras direkt av IR, rapportera PFIRE spectra om båda steady-state kinetiken för långlivat aktiva arter och associerade produkten bildandet under elektrokatalys. 69 förmåga att iaktta steady state-koncentrationer av substrat och produkten kommer att vara särskilt värdefull för enzymer såsom kolmonoxid dehydrogenas (som katalyserar reversibel oxidation av CO till CO2, en stark IR absorbator) eller formate dehydrogenas (som katalyserar reversibel oxidation av formate till CO2).
För närvarande är PFIRE begränsad till steady state kinetiska studier av enzymet elektrokatalys på grund av de makroskopiska Kolelektroder brukade ‘koncentrera’ enzymet på ytan av en IRE för insamlingen av uppgifter och ATR-IR geometri. I detta avseende är PFIRE studier av NiFe hydrogenases kompletterande arbete Dyer och medarbetare,49,50 som använder ljus-utlöst övergående absorption IR spektroskopi för att studera sub omsättning kinetik. Arbete pågår för att krympa den spektroelektrokemisk cellen,40 och med användning av mikroelektroder tidsupplösning på order av mikrosekunder bör uppnås. Det gör att studien av sub omsättning kinetik för enzymer med omsättning frekvenser upp till ca 100-500 s-1, och gör det möjligt att studera både reduktiv och oxidativa processer.
Sammantaget är PFIRE en spektroskopisk teknik som tillåter kemisk karakterisering av elektrokatalytiska reaktioner av redox enzymer under steady state-förhållanden. Den PFIRE metoden tillåter flera kemiska och elektrokemiska titreringar skall utföras på samma enzym prov, eftersom de höga yta elektroder används ger en robust adsorption av protein och ATR-IR geometri tillåter lättköpt lösning exchange. Förmågan att samla sådan strukturell information i situ under enzym funktion är ett ovärderligt verktyg för samhället i bioelektrokemi.
The authors have nothing to disclose.
K.A.V. och P.A.A. arbete stöddes av Europeiska forskningsrådet (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), teknik och Physical Sciences Research rådet IB katalysator award EP/N013514/1, och bioteknik och biologiska vetenskaper forskning Rådet (BB/L009722/1 och BB/N006321/1). R.H. stöddes av Ministerio de Ciencia y Tecnologìa, Universidad de Costa Rica, och Lincoln College, Oxford. Författarna erkänner Mr Charlie Jones, Mr Charlie Evans och personal på den mekaniska verkstaden (Institutionen för kemi) för hjälp med design och tillverkning av spektroelektrokemisk celler som används i detta arbete.
Spectrometer | Agilent | 680-IR | with an external MCT detector |
ATR accessory | Pike Technologies | GladiATR | Customised for use with a 5-reflection Si IRE |
Glovebox | Glove Box Technology Ltd. | N/A | Custom designed 'wet' and 'dry' box for anaerobic sample handling and measurement |
KBr window | Crystran | Custom | To allow coupling of the glovebox with the external beam of the FTIR spectrometer |
Additional optics | Agilent | N/A | Components from a PM-IRRAS accessory |
Silicon IRE | Crystal GmbH | Custom | Trapezoidal: 8.4 mm x 5 mm (large face), 1 mm thickness, ca 39 degree face angle |
Potentiostat | Metrohm | Autolab PGSTAT 128N | |
Nova 10.1 | Metrohm | Software for controlling the potentiostat | |
Peristaltic pump | Williamson Manufacturing Company Ltd | QL-1000-024-300 | |
Pt wire | Surepure Chemetals | 3272 | 99.95% Pure Platinum Wire, 0.014 inch Diameter |
Carbon rod | WH Smith | 30729209 | 0.7 mm HB pencil lead |
Carbon black | Cabot Corporation | Black Pearls 2000 | |
Ultrasonic bath | Ultrawave | U100 | 35 W |
Centrifugal filter | Merck Millipore | UFC5050BK | Amicon Ultra, 50 KDa MW cutoff |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5452000018 | MiniSpin |
NaCl | Sigma | 71376 | |
H2SO4 | Fisher | S/9240/PB17 | |
HNO3 | Fisher | N/2300/PB17 | |
silicone sealant | Cow Corning Toray Co., Ltd. | SE 4486 | |
Carbon paper | Toray | TGP-H-030 | |
H2 gas | BOC | ||
N2 gas | BOC | ||
OriginPro 2015 | OriginLab | Data analysis/graphing software | |
Resolutions Pro 4.0 | Varian | Software for controlling FTIR spectrometer |