Summary
Hier beschreiben wir die Anwendung der dreidimensionalen Fluoreszenz-Wiedergewinnung nach Photobleichung (3D-FRAP) für die Analyse des spaltübergangsabhängigen Shuttles von miRNA. Im Gegensatz zu allgemein angewandten Methoden ermöglicht 3D-FRAP die Quantifizierung der interzellulären Übertragung von kleinen RNAs in Echtzeit mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung.
Abstract
Kleine Antisense-RNAs, wie miRNA und siRNA, spielen eine wichtige Rolle in der zellulären Physiologie und Pathologie und können darüber hinaus als therapeutische Mittel bei der Behandlung mehrerer Krankheiten eingesetzt werden. Die Entwicklung neuer, innovativer Strategien für die miRNA / siRNA-Therapie basiert auf einer umfassenden Kenntnis der zugrunde liegenden Mechanismen. Jüngste Daten deuten darauf hin, dass kleine RNAs zwischen den Zellen in einer spaltübergangsabhängigen Weise ausgetauscht werden, wodurch die Genregulationseffekte in der Empfängerzelle induziert werden. Molekulare biologische Techniken und Durchflusszytometrie werden häufig verwendet, um den interzellulären Austausch von miRNA zu untersuchen. Allerdings bieten diese Methoden keine hohe zeitliche Auflösung, was notwendig ist, wenn man den lückenübergreifenden Fluss von Molekülen studiert. Um die Wirkung von miRNA / siRNA als interzelluläre Signalmoleküle zu untersuchen, sind daher neue Werkzeuge erforderlich, die die Analyse dieser kleinen RNAs auf zellulärer Ebene ermöglichen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die apPlication der dreidimensionalen Fluoreszenz-Wiedergewinnung nach Photobleichung (3D-FRAP) -Mikroskopie zur Aufklärung des spaltübergangsabhängigen Austauschs von miRNA-Molekülen zwischen Herzzellen. Wichtig ist, dass dieser unkomplizierte und nicht invasive Live-Zell-Imaging-Ansatz die Visualisierung und Quantifizierung des Lücken-Junction-Shuttles von fluoreszenzmarkierten kleinen RNAs in Echtzeit mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung ermöglicht. Die von 3D-FRAP erhaltenen Daten bestätigen einen neuartigen Weg der interzellulären Genregulation, bei dem kleine RNAs als Signalmoleküle innerhalb des interzellulären Netzwerks wirken.
Introduction
Kleine nicht-kodierende RNAs sind wichtige Akteure in der zellulären Genregulation. Diese Moleküle bestehen aus 20-25 Nukleotiden, die an eine spezifische Ziel-mRNA binden, was zu einer Blockade der Translation oder zum mRNA-Abbau 1 , 2 führt . Der Genregulationsprozess, der von kleinen RNAs wie miRNA und siRNA durchgeführt wird, ist ein hochkonservierter Mechanismus, der in vielen verschiedenen Arten gefunden wurde 3 . Insbesondere sind miRNA-Moleküle von entscheidender Bedeutung für eine Vielzahl von physiologischen Prozessen, einschließlich Proliferation, Differenzierung und Regeneration 4 , 5 . Darüber hinaus wird die Dysregulation der miRNA-Expression vielen pathologischen Störungen zugeschrieben. Entsprechend haben sich miRNAs als Biomarker für die Diagnose und als therapeutische Mittel für die Gentherapie 6 , 7 als geeignet erwiesen
Gap-Junctions (GJs) sind spezialisierte Proteinstrukturen in der Plasmamembran von zwei benachbarten Zellen, die den diffusionalen Austausch von Molekülen mit einem Molekulargewicht von bis zu 1 kD ermöglichen. Sie haben sich als wichtig für die Gewebeentwicklung, Differenzierung, Zelltod und pathologische Störungen wie Krebs oder Herz-Kreislauf-Erkrankungen erwiesen 8 , 9 , 10 . Es wurden mehrere Moleküle beschrieben, die in der Lage sind, GJ-Kanäle zu kreuzen, einschließlich Ionen, Metaboliten und Nukleotiden. Interessanterweise wurden auch GJs einen Weg für die interzelluläre Bewegung kleiner RNAs 11 , 12 gefunden . So können miRNAs nicht nur innerhalb der Zelle wirken, in der sie produziert werden, sondern auch innerhalb der Empfängerzellen. Dies unterstreicht die Rolle von miRNAs im interzellulären Signaltransduktionssystem. Gleichzeitig zeigen die DatenDiese lückenübergreifende interzelluläre Kommunikation ist eng mit der miRNA-Funktion verknüpft. Aufgrund des signifikanten Einflusses von miRNA und GJs auf die Gewebshomöostase, Pathologie und Diagnose wird ein umfassendes Verständnis der Funktion von GJs und der damit verbundenen interzellulären Dynamik von miRNA dazu beitragen, die Mechanismen von miRNA-basierten Krankheiten zu klären und neue Strategien zu entwickeln MiRNA-Therapien
Abhängig von der Ausdehnung der Lücken-Junction-Kopplung kann die Übertragung von miRNA-Molekülen zwischen den Zellen ein sehr schneller Prozess sein. Daher ist eine Methodik erforderlich, die die Visualisierung und Quantifizierung der schnellen interzellulären Bewegung dieser regulatorischen Signalmoleküle ermöglicht. Häufig wurden Strömungszytometrie und molekularbiologische Techniken angewendet, um das Shuttling von kleinen RNAs 11 , 12 , 13 , 14 zu demonstrieren. Im Gegensatz zu FRAP microsKopie, diese Ansätze fehlen eine hohe zeitliche Auflösung, die bei der Analyse des Austauschs von miRNA über GJs obligatorisch ist. Darüber hinaus ist die FRAP-Mikroskopie weniger invasiv und stellt daher eine leistungsstarke und neuartige Live-Zell-Bildgebung dar, um den GJ-abhängigen Austausch von Molekülen in mehreren Zelltypen 15 , 16 , 17 zu bewerten.
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das die Anwendung von 3D-FRAP beschreibt, um miRNA-Shuttling zwischen Kardiomyozyten zu beurteilen. Zu diesem Zweck wurden Kardiomyozyten mit fluoreszenzmarkierter miRNA transfiziert. Eine mit dieser miRNA markierte Zelle wurde photobleicht und der spaltübergreifende miRNA-Rückfluss aus benachbarten Zellen wurde zeitabhängig aufgezeichnet. Die hochzeitige Auflösung von FRAP-Experimenten bietet die Möglichkeit, kinetische Untersuchungen zur genauen Auswertung der interzellulären Übertragung von miRNA und siRNA zwischen lebenden Zellen durchzuführen. MehrWenn kleine RNAs über verschiedene Mechanismen mit sehr unterschiedlicher Kinetik ausgetauscht werden können, kann die FRAP-Mikroskopie helfen, zu klären, inwieweit GJs an den jeweiligen Shuttling-Prozessen beteiligt sind 18 . Darüber hinaus kann 3D-FRAP verwendet werden, um physiologische und pathologische Veränderungen in der GJ-Permeabilität und deren Auswirkungen auf den kleinen RNA-Transfer zu untersuchen 15 , 19 .
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Protocol
Alle Schritte in diesem Protokoll mit neonatalen Mäusen wurden nach den ethischen Richtlinien für die Tierpflege der Rostock University Medical Center durchgeführt.
1. Vorbereitung der Zellkultur-Gerichte und des Mittels für die Kardiomyozyten-Kultur
- Eine Zellkulturplatte mit 0,1% Gelatine in PBS beschichten und bei 37 ° C für 4 h oder bei 4 ° C über Nacht inkubieren. Entfernen Sie die Gelatine und lassen Sie sie unter steriler laminarer Luftströmung trocknen.
- Bereiten Sie Zellkulturmedium aus 50 ml DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin (P / S) vor. Vorwärmen auf 37 ° C.
2. Isolierung von neonatalen Kardiomyozyten
- Opfer neonatale Mäuse (1-2 Tage alt) durch Enthauptung mit steriler Schere und öffne die Brust am Sternum. Entfernen Sie das Herz mit Pinzette, während Sie den Thorax zusammen drücken und das Herz in eine 24-Well-Platte mit eiskaltem HBSS überführen(Ohne Ca 2+ und Mg 2+ ).
- Entfernen Sie nicht-kardiales Gewebe und größere Gefäße mit steriler Pinzette. Übertragen Sie gereinigte Herzen in ein 1,5 mL Röhrchen mit eiskaltem HBSS. Verwenden Sie für die enzymatische Verdauung maximal 5 Herzen pro Röhrchen.
- Hacken Sie die Herzen mit einer kleinen Schere in <0,5 bis 1 mm³ Stücke.
- Waschen Sie die gehackten Herzen mit HBSS zweimal durch Aspiration / Zugabe von HBSS mit einer 1-ml-Mikroliter-Pipette. Entfernen Sie die HBSS vollständig, bevor Sie die Enzyme hinzufügen.
- Für die enzymatische Verdauung von Neugeborenenherzen verwenden Sie ein handelsübliches Kit und folgen dem Herstellerprotokoll (siehe Tabelle der Materialien ). Schütteln Sie das Röhrchen, das die gehackten Herzen enthält, alle 5 min, während es mit Enzymen bei 37 ° C für 35 min inkubiert.
- Samen suspendierte Zellen auf nicht-beschichteten Zellkulturschalen, die Zellkulturmedium für 1,5-2 h enthalten, um die Adhäsion der Nicht-Kardiomyozytenfraktion zu ermöglichen. Wiederholen Sie diesen Schritt, wenn eine hohe ReinheitVon Kardiomyozyten benötigt wird. Falls gewünscht, wird die Nicht-Kardiomyozytenfraktion weiter kultiviert.
HINWEIS: Für eine Zellsuspension von 15 Herzen kann der Vorplattierungsschritt auf 75 cm² Zellkulturkolben durchgeführt werden. Normalerweise werden ~ 5 x 10 5 Zellen aus einem neonatalen Herzen gewonnen. - Den Überstand in einem 15 ml konischen Röhrchen sammeln und 10 min bei 300 x g zentrifugieren. Resuspendieren der Zellen in 1 ml Zellkulturmedium.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Neubauer Kammer-Hämocytometer, oder verwenden Sie eine gleichwertige Methode.
- Platten-isolierte Kardiomyozyten auf 6-Well-Platten mit einer Dichte von 3 x 10 5 Zellen / cm². Inkubieren der Zellen über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2 .
HINWEIS: Optional können auch Zellen an dieser Stelle transfiziert werden. Jedoch wurde eine erhöhte Lebensfähigkeit beobachtet, wenn die Zellen für einen Tag kultiviert wurden, bevor sie einer Elektroporation unterworfen wurden.
3. Transfektion mit fluoreszenzmarkierter miRNA
- Vor-Warmzellkulturmedium (siehe Schritt 1.2) bis 37 ° C in einem Wasserbad oder einem gleichwertigen Gerät.
- Bereiten Sie eine 20 μM Stammlösung der fluoreszierenden miRNA in RNase-freiem sterilem Wasser vor.
- Elektroporationspuffer, der 90 mM Na 2 HPO 4 , 90 mM NaH 2 PO 4 , 5 mM KCl, 10 mM MgCl 2 und 10 mM Natriumsuccinat enthält, zubereiten und den pH-Wert auf 7,2 einstellen; Elektroporationspuffer kann bei -20 ° C für mehrere Monate gelagert werden.
- Die Zellen aus der Kulturschale mit 0,05% Trypsin für 5 min abtrennen. Inaktivieren Sie das Trypsin durch Zugabe von Zellkulturmedium.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Neubauer Kammer-Hämocytometer, oder verwenden Sie eine gleichwertige Methode. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 xg für 10 min.
- Resuspendieren der Zellen in Elektroporationspuffer, um eine Konzentration von 4 · 10 & sup5; Zellen pro 100 & mgr; l zu erhalten.
- Mischen Sie 100 μl Zellsuspension mit fluoreszierender miRNA (Endkonzentration: 0,25 μM) in einem Röhrchen undDie Mischung in eine Elektroporationsküvette geben.
- Empirisch bestimmen die entsprechende Menge an miRNA, je nach Zelltyp.
- Führen Sie die Elektroporation mit einem Elektroporation Gerät (siehe Tabelle der Materialien ), mit dem "G-009" -Programm .
- Fügen Sie 500 μl vorgewärmtes Zellkulturmedium hinzu und übertragen Sie die gesamte Zellsuspension (4 x 10 5 Zellen) in eine Vertiefung eines 4-Well-Glasbodenkammer-Objektträgers. Kultur die Zellen für 1 Tag bei 37 ° C in einer 5% CO 2 -Atmosphäre.
HINWEIS: Für die FRAP-Analyse ist eine Zelldichte von ~ 80% optimal. Die Transfektion der markierten miRNA sollte ausschließlich unter Verwendung von Elektroporation durchgeführt werden. Da die homogene Verteilung der markierten miRNA-Moleküle für die FRAP-Messung vorteilhaft ist, wird eine Reagenz-basierte Transfektion nicht empfohlen.
4. Anwendung der 3D-FRAP-Mikroskopie (Tag 3)
- Den Mikroskop-Inkubator auf 37 ° aufwärmenC und schalten das konfokale Mikroskopsystem mindestens 2 h vor der FRAP-Messung ein, um ein thermisches Gleichgewicht zu schaffen und die Möglichkeit der Drift zu verringern. Wenn möglich, halten Sie eine 5% CO 2 Atmosphäre.
- Setzen Sie den Kammerschieber in den Bühnenprobenhalter ein.
- Finden Sie einen Cluster von transfizierten Kardiomyozyten mit einem 1,4 NA Ölobjektiv (400fache Vergrößerung) und 561 nm Laseranregungslicht bei niedriger Laserleistung mit einem Erfassungsbereich von 570-680 nm.
HINWEIS: Die Definition der FRAP-Einstellungen, die Bilderfassung und die Analyse erfolgte mit mikroskopisch-spezifischer Software (siehe Tabelle der Materialien ). - Aktiviere die "z-Stack", "Time Series", "Bleichen" und "Regionen" im "Setup Manager".
- Definiere die FRAP-Parameter.
- Definieren Sie die Bildaufnahmeeinstellungen im Menü "Acquisition Mode", indem Sie die "Frame Size" einstellen4; Auf 512 x 512, der "Zeilenschritt" auf 1 und die "Scanzeit" auf <1 s.
- Im Menü "Kanäle" können Sie die Laserleistung einstellen, die Offset- und Verstärkungseinstellungen einstellen, um eine maximale Fluoreszenz von minimaler Laseranregung zu erhalten ( z. B. Laserleistung: 1-5%); Anpassen, um die Intensitätssättigung zu vermeiden. Stellen Sie die "Pinhole Size" auf 2 μm ein.
- Als nächstes wählen Sie im Menü "Regionen" das "ROI-Zeichenwerkzeug" und verwenden Sie den Cursor, um die Zielzelle, die Referenzzelle und den Hintergrundbereich zu markieren. Bei Bedarf wählen Sie mehrere Zielzellen für das Photobleichen.
- Passen Sie die Photobleaching-Einstellungen im Menü "Bleichen" an ( zB Iterationen: 9-14, Laserleistung für Photobleaching: 100%, Intervall der Bilderfassung: 60 s, Zyklen: 15). Definieren Sie den Beginn des Bleichens nach 3 ersten Scans.
- Im "z-Stack" -Menü definieren Sie die Grenzen für die Z-Stack-Erfassung, abhängig von der Dicke der Zellen. Stellen Sie die "Zahl oF z-Schichten "bis 12 - 15.
- Starten Sie das FRAP-Experiment und notieren Sie die Fluoreszenzwiederherstellung.
HINWEIS: Da die Einstellungen eines FRAP-Experiments von dem Zelltyp, dem Fluoreszenzfarbstoff und dem Mikroskopsystem abhängen, ist es am besten, Pilotversuche durchzuführen, um die optimalen Parameter für FRAP zu bestimmen. Das Bleichen sollte ausreichen, um die anfängliche Fluoreszenzintensität um mindestens 50% zu reduzieren. Typischerweise sollte die Fluoreszenz-Erholung alle 30-60 s aufgezeichnet werden, bis die Plateau-Phase erreicht ist.
5. Datenanalyse
- Erstellen Sie maximale Projektionen der aufgenommenen Z-Stacks und erhalten Sie Fluoreszenzintensitätswerte der gebleichten Zielzellen, der Referenzzelle und des Hintergrunds. Mit mikroskopspezifischer Software klicken Sie auf "Bearbeiten" → "Maximale Intensitätsprojektion" → Datei auswählen → "Anwenden".
- Alternativ verwenden Sie ein entsprechendes Bildanalysegerät (
- Alternativ verwenden Sie ein entsprechendes Bildanalysegerät (
- Kopiere die Fluoreszenzintensitätsdaten zu allen Zeitpunkten aus der Zielzelle, dem Hintergrund und der Referenzzelle in eine Tabellenkalkulation.
- Subtrahieren Sie die Hintergrundintensität und die Intensität der Referenzzelle von den Intensitätswerten der Zielzelle, um das bei der Erfassung verursachte Photobleichung zu korrigieren. Führen Sie für jeden Zeitpunkt Hintergrund- und Referenzzellenkorrekturen durch.
- Normalisieren Sie die korrigierten FRAP-Daten auf die anfängliche Fluoreszenzintensität vor dem Bleichen, indem Sie jeden Wert durch die anfängliche Fluoreszenz dividieren.
- Um FRAP-Kurven zu erhalten, setzen Sie die Grundlinie auf die Fluoreszenzintensität unmittelbar nach dem Bleichen, indem Sie von den Intensitätswerten jedes Zeitpunktes subtrahieren.
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Representative Results
Hier präsentieren wir die 3D-FRAP-Mikroskopie als nicht-invasive Technik, um die lückenübergreifende Shuttling von fluoreszierenden miRNA innerhalb neonataler Kardiomyozyten zu untersuchen. Die isolierten Kardiomyozyten zeigten das typische, gestreifte & agr; -Aktininmuster und enthielten große Plaques von Cx43 entlang der Zellzellgrenzen ( 1A , weiße Pfeilspitzen), was den hohen interzellulären Fluss von Molekülen ermöglichte. Die Reinheit der isolierten Kardiomyozyten wurde durch die mikroskopische Quantifizierung von α-Actinin-positiven Zellen bestimmt. Obwohl einige Nicht-Kardiomyozyten (α-Aktinin-negative Zellen) in der Kultur vorhanden waren, repräsentierten neonatale Kardiomyozyten den Hauptzelltyp nach der Isolierung (79,62 ± 3,68%, Fig. 1B ).
Um den lückenübergreifenden Austausch von miRNA zu untersuchen, wurden die Zellen mit fluoreszenzmarkierter miRNA transfiziert. EleCtroporation ist die Methode der Wahl, um miRNA-Moleküle an Zellen zu liefern, da sie eine hohe Transfektionseffizienz und die homogene Verteilung von transfizierten Verbindungen sicherstellt, was für die FRAP-Analyse obligatorisch ist. In unserem experimentellen Aufbau erreichten wir eine Transfektionseffizienz von ~ 45%, bestimmt durch Durchflusszytometrie (Abbildung 2A ). Die Herstellung von Kardiomyozyten für FRAP umfasst die Ablösung von der Kulturplatte, die Elektroporation und die Wiederbefestigung auf Kammerrutschen. Ein durchflusszytometrischer lebender / toter Test zeigte, dass die Mehrheit der Zellen eine hohe Lebensfähigkeit zeigte, was bei der Analyse der spaltübergreifenden Kommunikation wichtig ist (Abbildung 2B ). Darüber hinaus ist die Zelldichte ein entscheidender Parameter, der die FRAP-Ergebnisse beeinflusst. Für optimale FRAP-Messungen sollten Zellen mit einer Dichte von ~ 80% ausgesät werden, um die Bildung von Zellclustern und die Etablierung funktionaler Lückenübergänge zwischen den Zellen zu ermöglichen ( Abb2C).
Für die FRAP-Analyse werden Zielzellen innerhalb eines Zellclusters ausgewählt und mit 100% Laserleistung photobleicht, was zu einer verminderten miRNA-Fluoreszenz in den ausgewählten Zellen führt (Abbildung 3A , Bleichmittel). Anschließend wird eine Fluoreszenzgewinnung aufgezeichnet, um die Übertragung von miRNA von benachbarten Zellen in den gebleichten Bereich zu visualisieren. Da die Plateauphase der Fluoreszenzrückgewinnung nach 13 min erreicht wurde, wurde diese Zeitspanne für die Bildaufnahme in den FRAP-Experimenten verwendet. Die quantitative Analyse und Normalisierung der erfassten Daten zeigte eine durchschnittliche Erholung von 20%. Die Daten zeigten auch, dass die FRAP-Mikroskopie die schnelle Aufzeichnung von miRNA-Shuttling mit hoher zeitlicher Auflösung ermöglicht. Abhängig von den Farbstoffeigenschaften können die Erfassungsparameter geändert werden, um die zeitliche Auflösung weiter zu erhöhen.
Die Verwendung von 3D-FRAP ermöglichtDer Vergleich der GJ-Permeabilität gegenüber miRNA unter verschiedenen Bedingungen. Um dies zu demonstrieren, haben wir einen siRNA-vermittelten Knockdown von Cx43 induziert, was zu einer verminderten Proteinexpression (Abbildung 3C ) und der Hemmung der Lücken-Junction-Kommunikation führt. Als Ergebnis wurde die Fluoreszenzgewinnung um mehr als 50% reduziert, was darauf hinweist, dass die Effizienz der miRNA-Übertragung stark von dem Ausmaß der spaltübergreifenden Kopplung zwischen den Zellen abhängt (Abbildung 3B , Cx43-Knockdown). Um zu bestätigen, dass die Fluoreszenz-Wiederherstellung den Durchgang der fluoreszenzmarkierten miRNA reflektiert, anstatt das abgetrennte Dy547-Tag, haben wir auch FRAP-Daten für Calcein-Farbstoff (Abbildung 3D ) erworben. Calcein hat ein Molekulargewicht, das mit dem von Dy547 vergleichbar ist und somit eine ähnliche Transmissionsdynamik besitzt. Im Gegensatz zu der Fluoreszenz-Wiedergewinnung von Dy547-markierter miRNA zeigte Calcein einen erhöhten Spalt-Junction-Austausch, was darauf hinweist, dass das Dy547-Tag iS nicht vom miRNA-Molekül abgelöst ( Abbildung 3D ).
Stabile Fokusbedingungen sind während eines FRAP-Experiments obligatorisch, besonders wenn Langzeitmessungen durchgeführt werden. Im Vergleich zu 2D-Anwendungen kann 3D-FRAP potenzielle Fokusdrift kompensieren. Wie in Fig. 4 gezeigt , beeinflussen auch leichte Fokusänderungen die korrekte Erfassung des Fluoreszenzsignals von miRNA, wenn nur eine einzige 2D-Schicht für das FRAP-Experiment verwendet wird ( Fig. 4B ). Im Gegensatz dazu wird für 3D-FRAP ein ganzer z-Stapel der Zielzelle aufgezeichnet und maximale Projektionen einer Datenanalyse unterzogen (Abbildung 4A ). Der Einfluss der Fokusdrift auf eine normalisierte Fluoreszenzintensitätskurve ist in Abbildung 4C dargestellt. Während die Fluoreszenz-Erholung im Laufe der Zeit im 3D-FRAP kontinuierlich zunimmt, führt die 2D-FRAP-Akquisition zu einem Rückgang oF das Fluoreszenzsignal.
Neben der Kompensation von Fokusänderungen liefert 3D-FRAP auch räumliche Daten des lückenübergreifenden Austauschs von miRNA. Abbildung 5 zeigt eine 3D-Oberflächenwiedergabe eines FRAP-Experiments. Im Vergleich zu maximalen Projektionen kann der Erwerb von Z-Stacks verwendet werden, um 3D-Rekonstruktionen zu erstellen, um die Lokalisierung und Mobilität von miRNA innerhalb von Zellen zu untersuchen (Abbildung 5 ). Die Co-Markierung mit Organellen ermöglicht die Untersuchung der Beteiligung anderer zellulärer Komponenten bei der miRNA-Übertragung.
Abbildung 1: Repräsentative mikroskopische Bilder von isolierten neonatalen Kardiomyozyten. ( A ) Die strukturierte Beleuchtungsmikroskopie zeigt die hohe Expression von Cx43, die sich in großen p ansammeltLaques an Zellzellengrenzen (Pfeilspitzen). Die ausgeprägte Bildung von GJs mit benachbarten Zellen ermöglicht einen umfangreichen Austausch von kleinen Molekülen, einschließlich miRNA. Maßstab = 20 μm ( B ) Reinheit der isolierten Kardiomyozyten. Die Markierung von α-Actinin zeigt, dass Kardiomyozyten den Hauptzelltyp nach der Isolierung darstellen. Maßstab = 50 μm. Die Zellen wurden mit anti-Cx43 (grün) und anti-α-Actinin-Antikörpern (rot) gefärbt. Nuklei wurden mit DAPI (blau) visualisiert. Eine Beschreibung der strukturierten Beleuchtungsmikroskopie und der immunologischen Markierung ist in einer früheren Publikation 20 vorgesehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Transfektionseffizienz, Lebensfähigkeit , Und Zelldichte der neonatalen Kardiomyozyten-Kultur. ( A ) Durchflusszytometrie zeigte, dass miR547-Elektroporation zu einer Transfektionseffizienz von ~ 45% führte. ( B ) Zelllebensfähigkeit von Kardiomyozyten, die für FRAP verwendet wurden. Nach der Isolierung, der Elektroporation und der Wiederbefestigung wurden die Kardiomyozyten einer lebenden und toten Zellfärbung unterworfen und zeigten eine hohe Zelllebensfähigkeit. ( C ) Mikroskopisches Bild von mir547-transfizierten Kardiomyozyten, hergestellt für die FRAP-Mikroskopie. Eine Zelldichte von 80-90% sorgt für die ausgeprägte Bildung von lückenübergreifenden Zell-Zell-Kontakten. Maßstab = 50 μm. Ein Verfahren zur strömungszytometrischen Analyse der Transfektionseffizienz und der Lebensfähigkeitsfärbung ist in den früheren Publikationen 20 , 21 erwähnt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: GJ-abhängiger Austausch von miRNA in neonatalen Kardiomyozyten. ( A ) Repräsentative Bilder eines FRAP-Experiments. Nach der Transfektion mit markierter miRNA werden Zielzellen innerhalb eines Zellclusters durch einen starken Laserpuls (Vorbleichen gegen Bleichen) photobleicht. Abhängig von der Ausdehnung der Spalt-Junction-Kopplung führt der spalt-junctionale Zustrom von miRNA aus benachbarten Zellen zu einer erhöhten Fluoreszenzintensität in den gebleichten Zielzellen (Nachbleiche t = 3, 6, 9 und 13 min). Skalenstab = 20 μm ( B ) Die quantitative Analyse der erworbenen FRAP-Daten zeigt nach 13 min eine Fluoreszenzrückgewinnung von 20%. Um die Beteiligung GJs in der interzellulären Übertragung von miRNA zu bestätigen, wurde ein cx43-Knockdown durchgeführt, was zu einer starken Abnahme der Fluoreszenz-Erholung (50%) führte. ( C ) Immunfärbung mit Anti-Cx43Antikörper und anschließende konfokale Mikroskopie zeigen die Effizienz des Cx43 Knockdowns auf Proteinebene. Maßstab = 50 μm. ( D ) Der Vergleich der FRAP-Daten von miR547 und Calcein-Farbstoff zeigt die unterschiedliche Transmissionsdynamik. Das kleinere Molekulargewicht von Calcein führte zu einer erhöhten Fluoreszenz-Erholung im Vergleich zu dy547-markierten miRNA-Molekülen. FRAP-Kurven fassen die Daten von n ≥56 Zellen zusammen, die als Mittelwert ± SEM dargestellt sind. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung von Zwei-Wege-ANOVA durchgeführt, gefolgt von Bonferronis Post-hoc-Test (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Kompensation von Fokus Drift mit 3D-FRAP-Mikroskopie. (
Abbildung 5: 3D-Oberflächenwiedergabe eines 3D-FRAP-Experiments. (Links) Maximale Projektionen einer FRAP-Messung. Die photobleichte Zelle (roter Rahmen) zeigt eine Zunahme der Fluoreszenzintensität aufgrund der miRNA-Übertragung von benachbarten Zellen. (Rechts) Erworbene Z-Stacks der gleichen photobleichten Zelle (rot) wurden einer 3D-Oberflächenwiedergabe unterworfen, um die räumliche Verteilung der miRNA zu visualisieren. Maßstab = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
MiRNAs sind Schlüsselakteure in der zellulären Physiologie und wurden als Signalmoleküle bezeichnet, indem sie unter anderem - GJs als Weg für den interzellulären Austausch 11 , 12 , 22 - verwendet wurden . Das aktuelle Protokoll stellt eine in vitro- Live-Zell-Bildgebung dar, um dieses GJ-abhängige Shuttling unter Verwendung fluoreszierender miRNAs innerhalb von Zellclustern zu charakterisieren.
Das Protokoll wurde auf Kardiomyozyten als Zellmodellsystem entwickelt. Dieser Ansatz kann jedoch auf mehrere Zelltypen angewendet werden, wenn die Elektroporation eine geeignete Methode zur miRNA-Transfektion ist. Neben dem Zell-zu-Zell-Austausch eignet sich die vorliegende Technik auch zur Untersuchung der intrazellulären Mobilität von miRNA-Molekülen ( zB zur Identifizierung möglicher Transportmechanismen innerhalb der Zelle) 23 , 24 .
Inhalt "> Die Untersuchung der miRNA-Übertragung durch FRAP-Mikroskopie erfordert fluoreszenzmarkierte miRNA-Moleküle (Abbildung 2 ). Da die Markierung von spezifischen zellulären miRNAs nicht möglich ist, kann nur exogene, eingeführte miRNA für 3D-FRAP verwendet werden, um ihre interzelluläre Mobilität zu analysieren In unseren Experimenten wurden die Zellen mit 250-nM-miRNA transfiziert.Diese Konzentration war viel höher im Vergleich zu physiologischen Bedingungen, wo der miRNA-Spiegel von 10 bis 50.000 Moleküle pro Zelle 27 , 28. Solche niedrigen Konzentrationen können nicht in FRAP-Experimente verwendet werden, Da ein gewisses Maß an fluoreszierenden miRNA-Molekülen erforderlich ist, um ein ausreichendes Fluoreszenzsignal zu erhalten und die richtige Unterscheidung zwischen der Hintergrundfluoreszenz und der fluoreszenzmarkierten miRNA zu gewährleisten. Je nach dem konfokalen Bildgebungssystem und den Farbstoffeigenschaften ist jedoch die Verwendung von miRNA-Konzentrationen bei niedrigen Werten möglich -nM-Bereich sollte für FRAP-Assays möglich sein. </ P>Verschiedene Techniken werden üblicherweise angewendet, um die interzelluläre miRNA-Übertragung zu untersuchen, einschließlich der Durchflusszytometrie, der PCR und der Luciferase-Reporter-Assays 12 , 13 . Diese Methoden erkennen miRNA shuttling mit geringer zeitlicher Auflösung ( dh Stunden bis Tage). Im Gegensatz dazu ermöglicht die 3D-FRAP-Mikroskopie die Visualisierung und Quantifizierung von miRNA-Transfer und Mobilität in Echtzeit. Zusätzlich zu spaltübergreifenden Zell-Zell-Kontakten wird das interzelluläre Shuttling von miRNA auch durch andere Mechanismen wie Exosomen 18 , 29 , 30 vermittelt. Nur 3D-FRAP bietet eine ausreichend hohe zeitliche Auflösung, um zwischen exosomaler und lückenübergreifender Übertragung zu unterscheiden. So ermöglicht es eine spezifische Untersuchung der direkten Wirkung der GJ-Permeabilität auf die miRNA-Signalisierung unter verschiedenen pathologischen oder physiologischen Zuständen (AbbRe 2).
Wir empfehlen die Verwendung von 3D-FRAP, die dem herkömmlichen 2D-FRAP überlegen ist, da es genauere Daten über die GJ-abhängige miRNA-Übertragung liefert. 3D-FRAP-Messungen beinhalten das gesamte Zellvolumen, was bei der Verwendung von Großzellzelltypen wichtig ist. Darüber hinaus kann es Fokusänderungen oder Zellbewegungen kompensieren, von denen gezeigt wurde, dass sie die Fluoreszenzwiederherstellung in 2D-FRAP signifikant beeinträchtigen (Abbildung 3 ). Schließlich bietet die Aufzeichnung von Z-Stacks in 3D-FRAP-Experimenten die Möglichkeit, räumliche Informationen zu erhalten, was nicht möglich ist, wenn nur eine einzige 2D-Schicht für die Analyse von Fluoreszenzintensitäten verwendet wird (Abbildung 3B ).
Da die Fluoreszenzgewinnung vom Zufluss von miRNA von benachbarten Zellen abhängig ist, ist die Anzahl der mit der gebleichten Zelle verbundenen Zellen kritisch und muss über verschiedene Messungen hinweg ähnlich sein, um zuverlässige Daten zu erhalten. Daher ist eine hohe Zelldichte erforderlichD, um die Bildung von zellulären Clustern zu gewährleisten, die für die FRAP-Analyse am besten geeignet sind. Darüber hinaus müssen vorläufige Experimente durchgeführt werden, um milde Bleichbedingungen ( dh Laserleistung, Bleichzeit und Scan-Einstellungen) auszuwählen, um phototoxische Effekte zu vermeiden, die durch eine hohe Laserintensität verursacht werden 25 , 26 . Dies wird auch dazu beitragen, die Photobleichung zu reduzieren, die während des Erfassungsprozesses auftritt.
Trotz der Einschränkungen zeigen unsere Daten, dass 3D-FRAP ein mächtiges Werkzeug ist, um die Rolle von miRNAs als Signalmoleküle innerhalb eines zellularen Netzwerks zu bewerten. Die Auswirkungen der Connexin-Zusammensetzung auf das miRNA-Shuttling oder die selektive Permeabilität von GJs für spezifische miRNAs können mit der direkten Quantifizierung der Transporteffizienz angesprochen werden. 3D-FRAP kann wichtige Informationen zur Verbesserung der Entwicklung neuer Therapien mit miRNA und siRNA bereitstellen, wie zB durch die Festlegung geeigneter Bedingungen, die die Verteilung erleichternN von kleinen RNAs über das GJ-Netzwerk 31 , 32 .
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung Deutschland (FKZ 0312138A und FKZ 316159), dem Staat Mecklenburg-Vorpommern mit EU-Strukturfonds (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 und ESF / IVBM-B35-0010 / 12), die DFG (DA1296-1) und die Deutsche Herzstiftung (F / 01/12). Darüber hinaus wird RD durch das FORUN-Programm des Rostock University Medical Centers (889001), der DAMP Foundation und des BMBF (VIP + 00240) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| neonatal NMRI mice | Charles River | ||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | 0.1% solution in PBS, sterilized |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| Dulbecco´s modified medium | Pan Biotech | P04-03550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/mL, 100µg/mL |
| Fetal bovine serum | Pan Biotech | P30-3306 | |
| Cell culture plastic | TPP | ||
| Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | 88281 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 88281 | included in primary cardiomyocyte isolation kit |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic | Dharmacon | CP-004500-01-05 | dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | |
| Sodium phosphate dibasic | Carl Roth | T877.2 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium chloride | Serva | 28305.01 | |
| Sodium succinate | Carl Roth | 3195.1 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA solution | Merck | L2153 | |
| 4-well- Glass bottom chamber slides | IBIDI | 80827 | coat with 0.1% gelatin solution |
| Amaxa Nucleofector II | Lonza | program G-009 was used for Electroporation | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| α-actinin antibody | Abcam | ab9465 | dilution 1:200 |
| Connexin43 antibody | Santa Cruz | sc-9059 | dilution 1:200 |
| goat anti-mouse Alexa 594 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | dilution 1:300 |
| goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | dilution 1:300 |
| Connexin43 siRNA | Thermo Fisher Scientific | AM16708 ID158724 | final concentration 250 nM |
| Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 |
References
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