Summary
Burada, miRNA'nın aralık bağlantısına bağımlı tomurcuk analizi için photobleaching (3D-FRAP) sonrası üç boyutlu floresan geri kazanımının uygulanmasını açıklıyoruz. Yaygın olarak uygulanan yöntemlerin aksine, 3D-FRAP, küçük RNA'ların hücreler arası transferinin gerçek zamanlı olarak, yüksek uzaysal-zamanlı çözünürlük ile nicelendirilmesini sağlar.
Abstract
MiRNA ve siRNA gibi küçük antisens RNA'lar, hücresel fizyoloji ve patolojide önemli rol oynar ve dahası, çeşitli hastalıkların tedavisinde terapötik ajanlar olarak kullanılabilir. MiRNA / siRNA tedavisi için yeni, yenilikçi stratejilerin geliştirilmesi, temel mekanizmalar hakkında kapsamlı bir bilgiye dayanmaktadır. Yeni veriler, küçük RNA'ların hücreler arasında bir boşluk bağlantısına bağlı bir şekilde değiştirildiğini ve böylece alıcı hücrede gen düzenleyici etkilere yol açtığını düşündürmektedir. Moleküler biyolojik teknikler ve akış sitometrik analizi, miRNA'nın hücrelerarası alışverişini incelemek için yaygın olarak kullanılır. Bununla birlikte, bu yöntemler moleküllerin boşluk birleşim akışını incelerken gerekli olan yüksek zamansal çözünürlüğü sağlamazlar. Dolayısıyla, miRNA / siRNA'nın hücreler arası sinyal molekülleri olarak etkisini araştırmak için, bu küçük RNA'ların hücresel seviyede analiz edilmesine izin verecek yeni araçlar gereklidir. Bu protokol, apKardiyak hücreler arasındaki miRNA moleküllerinin boşluk birleşimine bağımlı değişimini aydınlatmak için photobleaching (3D-FRAP) mikroskopisi sonrası üç boyutlu flüoresan iyileşmesinin plikasyonu. Önemlisi, bu basit ve non-invaziv canlı hücre görüntüleme yaklaşımı, yüksek zaman zamanlı çözünürlük ile gerçek zamanlı olarak floresanla işaretlenmiş küçük RNA'ların boşluk birleşimsel geçişinde görselleştirme ve miktar tayini yapılmasına olanak tanır. 3D-FRAP tarafından elde edilen veriler, küçük hücrelerin içinde hücrelere sinyal düzenleyici moleküller olarak etki eden hücreler arası gen düzenlenmesinin yeni bir yolunu teyit etmektedir.
Introduction
Küçük kodlamayan RNA'lar hücresel gen düzenlemesinde önemli oyunculardır. Bu moleküller, belirli bir hedef mRNA'ya bağlanan 20-25 nükleotidden oluşur, bu da translasyonun bloke edilmesine veya mRNA parçalanmasına yol açar 1 , 2 . MiRNA ve siRNA gibi küçük RNA'lar tarafından üstlenilen gen düzenleyici süreç, birçok farklı türde 3 bulunmuş olan oldukça korunmuş bir mekanizmadır. Özellikle miRNA molekülleri çoğalma, farklılaşma ve rejenerasyon 4 , 5 dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik süreçler için çok önemlidir. Buna ek olarak, miRNA ekspresyonunun düzensizliği, bir çok patolojik bozukluğa atfedilir. Buna uygun olarak, miRNA'ların teşhis için biyolojik belirteç olarak ve gen terapisi için terapötik ajanlar olarak uygun olduğu gösterilmiştir 6,7
Boşluk kavşakları (GJs), iki bitişik hücrenin plazma zarında, 1 kD'ye kadar bir molekül ağırlığına sahip moleküllerin difüzyonel değişimini sağlayan özel protein yapılarıdır. Dokuların gelişimi, farklılaşması, hücre ölümleri ve kanser veya kardiyovasküler hastalık 8 , 9 , 10 gibi patolojik bozukluklar için önemli oldukları gösterilmiştir. Birkaç molekül, iyonlar, metabolitler ve nükleotidler de dahil olmak üzere GJ kanallarını geçebilecek nitelikte olarak tarif edilmiştir. İlginç bir şekilde, GJ'lerin küçük RNA'ların hücre içi hareketi için bir yol sağladığı 11,12 bulundu. Dolayısıyla, miRNA'lar yalnızca üretildikleri hücrede değil, aynı zamanda alıcı hücreler içinde de hareket edebilir. Bu, hücrelerarası sinyal iletim sisteminde miRNA'ların rolünü vurgular. Aynı zamanda, veriler gösterilenBu boşluk bağlantılı hücresel-iletişim, miRNA fonksiyonuyla yakından ilişkilidir. MiRNA ve GJ'lerin doku homeostazı, patoloji ve teşhis üzerindeki belirgin etkisi nedeniyle, GJ'lerin ve miRNA'nın ilgili hücre içi dinamikleri hakkında kapsamlı bir anlayış, miRNA'ya dayalı hastalıkların mekanizmalarını aydınlatmaya ve yeni stratejiler geliştirmeye yardımcı olacaktır. MiRNA terapileri.
Boşluk bağlantılı bağlanmanın derecesine bağlı olarak, miRNA moleküllerinin hücreler arasında aktarılması çok hızlı bir işlem olabilir. Bu nedenle, bu düzenleyici sinyal moleküllerinin hızlı hücresel hareketi görselleştirilmesi ve miktarının belirlenmesine izin veren bir yöntem gereklidir. Genellikle, akış sitometrisi ve moleküler biyolojik teknikler küçük RNA'ların 11 , 12 , 13 , 14'ün geçişini göstermek için uygulanmıştır. Bununla birlikte, FRAP mikrolarına karşıBu yaklaşımlar yüksek zamansal çözünürlüğe sahip değildir, bu da GJs yoluyla miRNA değişimini analiz ederken zorunludur. Ayrıca, FRAP mikroskopisi daha az invazivtir ve bu nedenle birkaç hücre tipinde 15 , 16 , 17 moleküllerin GJ'ye bağlı değişimini değerlendirmek için güçlü ve yeni bir canlı hücre görüntüleme tekniğini temsil eder.
Burada, kardiyomiyositler arasındaki miRNA'yı değerlendirmek için 3D-FRAP uygulamasını açıklayan ayrıntılı bir protokol sunmaktayız. Bu amaçla kardiyomiyositlere flüoresan etiketli miRNA transfekte edildi. Bu miRNA ile işaretlenmiş bir hücre fotobleached edildi ve bitişik hücrelere ait boşluk birleşimsel miRNA re-influx'a zamana bağlı bir şekilde kaydedildi. FRAP deneylerinin yüksek zamansal çözünürlüğü, yaşayan hücreler arasında miRNA ve siRNA'nın hücreler arası transferinin hassas değerlendirilmesi için kinetik çalışmalar yapma imkanı sunar. MoreoKüçük RNA'lar farklı mekanizmalar vasıtasıyla çok farklı kinetiklerle değiştirilebildiğinden FRAP mikroskopisi, GJ'lerin ilgili kepçme süreçlerinde ne dereceye kadar yer aldığını açıklığa kavuşturmaya yardımcı olabilir 18 . Ek olarak, 3D-FRAP, GJ geçirgenliğinde fizyolojik ve patolojik değişiklikler ve bunun küçük RNA transferi üzerindeki etkisini araştırmak için kullanılabilir 15,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yenidoğan farelerini içeren bu protokolün tüm basamakları, Rostock Üniversitesi Tıp Merkezi hayvan bakımına ilişkin etik kurallara göre gerçekleştirildi.
1. Hücre Kültürü Tabletlerinin Hazırlanması ve Kardiyomiyosit Kültürü için Orta
- PBS içinde% 0.1 jelatin ile bir hücre kültürü plaka kaplayın ve 37 ° C'de 4 saat süreyle inkübe edin veya gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Jelatı çıkarın ve steril laminer hava akımı altında kurumasına izin verin.
- % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin (P / S) ile takviye edilmiş 50 mL DMEM'den oluşan hücre kültürü ortamı hazırlayın. 37 ° C'ye kadar ısıtın.
2. Yenidoğan Kardiyomiyositlerinin İzolasyonu
- Yenidoğan farelerini (1-2 günlük) steril makaslarla kesilerek kurutun ve göğsü göğüs kafesi boyunca açın. Toraksı hafifçe bastırırken forseps kullanarak kalbi çıkarın ve kalbi, buz gibi HBSS içeren 24 yuvalı bir plakaya aktarın(Ca 2+ ve Mg 2+ olmadan).
- Steril forseps kullanarak kalp dışı dokuları ve daha büyük damarları çıkarın. Temizlenmiş kalpler buz soğukluğunda HBSS içeren 1.5 mL tüp içine aktarılır. Enzimatik sindirim için tüp başına maksimum 5 kalp kullanın.
- Küçük makaslarla kalpleri <0,5 ila 1 mm³ parçaya kesin.
- Öğütülmüş kalpler HBSS ile 1 mL mikrolitrelik pipet kullanılarak aspirasyon / ilave HBSS ile iki kez yıkanır. Enzimleri eklemeden önce HBSS'yi tamamen çıkarın.
- Yenidoğan kalplerindeki enzimatik sindirim için, piyasada bulunan bir kit kullanın ve üreticinin protokolünü izleyin (Malzeme Tablosuna bakın ). 35 ° C'de 37 ° C'de enzimlerle inkübe ederken kıyılmış kalpleri içeren tüpü her 5 dakikada sallayın.
- Tohum, kardiyomiyosit fraksiyonunun yapışmasına izin vermek için 1.5-2 saat boyunca hücre kültürü ortamı içeren kaplanmamış hücre kültürü kaplarında hücreleri askıya aldı. Yüksek saflık varsa bu adımı tekrarlayınKardiyomiyositlerin tedavisi gereklidir. Arzu edildiği takdirde, kardiyomiyositsiz fraksiyonu daha da kültürleyin.
NOT: 15 kalp içeren bir hücre süspansiyonu için, ön kaplama adımı 75 cm2'lik hücre kültürü şişeleri üzerinde gerçekleştirilebilir. Genellikle, bir yenidoğan kalpten yaklaşık 5 x 105 hücre elde edilir. - 15 mL konik tüp içinde süpernatantı toplayın ve 300 x g'de 10 dakika santrifüjleyin. 1 mL hücre kültürü ortamında hücreleri tekrar süspanse edin.
- Bir Neubauer odacık hemositometresi ile hücreleri sayın veya eşdeğer bir yöntem kullanın.
- Plaka, kardiyomiyositleri 6 yuvalı plakalarda 3 x 10 5 hücre / cm² yoğunlukta izole etti. Hücreleri gece boyunca 37 ° C'de ve% 5 C02'de inkübe edin.
NOT: İsteğe bağlı olarak hücreler de bu noktada transfekte edilebilir. Bununla birlikte, hücreler elektroporasyona tabi tutulmadan önce bir gün kültüre alındığında canlılığın arttığı gözlenmiştir.
Floresanla Etiketli miRNA ile Transfeksiyon
- öncesiSıcak bir hücre kültür ortamı (adım 1.2'ye bakın) ile 37 ° C'ye kadar bir su banyosu veya eşdeğer bir cihazda inkübe edin.
- RNaz içermeyen steril suda flüoresan miRNA'nın 20 uM stok solüsyonu hazırlayın.
- 90 mM Na2HPO4, 90 mM NaH2PO4, 5 mM KC1, 10 mM MgCl2 ve 10 mM sodyum süksinat içeren elektroporasyon tamponunu hazırlayın ve pH'ı 7.2'ye ayarlayın; Elektroporasyon tamponu birkaç ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir.
- 5 dakika süreyle% 0.05 tripsin kullanarak kültür çanak hücrelerini çıkarın. Hücre kültürü ortamı ilave ederek tripsini inaktive edin.
- Bir Neubauer odacık hemositometresi ile hücreleri sayın veya eşdeğer bir yöntem kullanın. Hücreleri 300 xg'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
- 100 uL başına 4 x 10 5 hücre konsantrasyonu elde etmek için elektroporasyon tampon hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin.
- Bir tüpte flüoresan miRNA (son konsantrasyon: 0.25 uM) ile hücre süspansiyonunun 100 uL'sini karıştırın veKarışımı bir elektroporasyon küvetine yükleyin.
- Ampirik olarak hücre türüne bağlı olarak uygun miktarda miRNA belirler.
- "G-009" programını kullanarak bir elektroporasyon cihazı (bkz . Malzeme Tablosu ) kullanılarak elektroporasyon gerçekleştirin .
- Önceden ısıtılmış hücre kültürü ortamı 500 mcL ekleyin ve 4-iyi cam-alt oda slayt bir kuyuya tüm hücre süspansiyonu (4 x 10 5 hücre) aktarın. 37 ° C'de 1 gün boyunca hücreleri% 5 CO 2 atmosferinde kültürleyin.
NOT: FRAP analizi için ~% 80'lik bir hücre yoğunluğu en uygunudur. Etiketli miRNA transfeksiyonu sadece elektroporasyon ile yapılmalıdır. Etiketli miRNA moleküllerinin homojen dağılımı FRAP ölçümü için yararlı olduğu için reaktif temelli transfeksiyon önerilmez.
4. 3D-FRAP Mikroskopi Uygulaması (3. Gün)
- Mikroskop inkübatörünü 37 ° C'ye ısıtın; C ve FRAP ölçümünden önce en az 2 saat konfokal mikroskop sistemi üzerinde geçiş yaparak bir termal denge kurun ve kayma olasılığını azaltın. Mümkünse% 5 CO2 atmosferi uygulayın.
- Oda slaydını sahne örneği tutucusuna yerleştirin.
- Transfekte edilmiş kardiyomiyositlerin bir kümesini 1.4 NA yağ hedefi (400X büyütme) ve düşük lazerli güçte 561 nm lazer uyarma ışığı kullanarak, 570-680 nm'lik bir algılama aralığıyla bulun.
NOT: FRAP ayarlarının tanımı, görüntü elde etme ve analiz, mikroskop spesifik yazılımı kullanılarak yapılmıştır (bkz . Malzeme Tablosu ). - "Kurulum Yöneticisi" nde "z-Stack", "Zaman Serileri", "Ağartma" ve "Bölgeler" düğmelerini etkinleştirin.
- FRAP parametrelerini tanımlayın.
- "Acquisition Mode" menüsündeki görüntü toplama ayarlarını, "frame size"4; 512 x 512, "satır adım" 1 ve "tarama süresi" <1 sn.
- "Kanallar" menüsünde, minimum lazer uyarımından maksimum flüoresan elde etmek için lazer gücü, ofset ve kazanç ayarlarını yapın ( örn., Lazer gücü:% 1-5); Yoğunluk doygunluğundan kaçınmak için ayarlayın. "İğne deliği boyutu" nu 2 μm olarak ayarlayın.
- Ardından, "Bölgeler" menüsünde "ROI çizim aracı" nı seçin ve hedef hücrenin, referans hücrenin ve arka plan alanını işaretlemek için imleci kullanın. Gerekirse, photobleaching için birkaç hedef hücre seçin.
- "Ağartma" menüsünde ( örneğin, yinelemeler: 9-14, ışıkla temizleme için lazer gücü:% 100, görüntü yakalama aralığı: 60 s, devir sayısı: 15) foto-ağartma ayarlarını yapın. 3 ilk taramadan sonra ağartmanın başlangıcını tanımlayın.
- "Z-Stack" menüsünde, hücrelerin kalınlığına bağlı olarak z-stack alımının sınırlarını tanımlayın. "Sayı o" ayarlayınF z-katmanları "yı 12 - 15'e ayarlar.
- FRAP denemesini başlatın ve flüorür iyileşmesini kaydedin.
NOT: Bir FRAP deneyinin ayarları hücrenin türüne, flüoresan boyaya ve mikroskop sistemine bağlı olduğundan, FRAP için en uygun parametreleri belirlemek için pilot denemeler yapmak en iyisidir. Ağartma, ilk floresan yoğunluğunu en az% 50 azaltmak için yeterli olmalıdır. Tipik olarak, floresan iyileşmesi, plato fazına erişilinceye kadar 30-60 saniyede bir kaydedilmelidir.
5. Veri Analizi
- Elde edilen z-yığınlarının maksimum projeksiyonlarını oluşturun ve ağartılmış hedef hücrelerin, referans hücrenin ve arka planın flüoresan yoğunluk değerlerini elde edin. Mikroskopa özgü yazılımı kullanarak, "İşleniyor" → "Maksimum yoğunluk projeksiyonu" → dosya seçin → "Uygula" yı tıklayın.
- Alternatif olarak, eşdeğer bir görüntü analiz aracı (
- Alternatif olarak, eşdeğer bir görüntü analiz aracı (
- Hedef hücre, arka plan ve referans hücrenin tüm zaman noktalarında bulunan flüorens yoğunluk verilerini bir elektronik tabloya kopyalayın.
- Edinme işlemi sırasında oluşan photobleaching'i düzeltmek için hedef hücrenin yoğunluk değerlerinden referans hücrenin arka plan yoğunluğunu ve yoğunluğunu çıkartın. Her zaman noktası için arka plan ve referans hücre düzeltmeleri yapın.
- Düzeltilmiş FRAP verilerini, ilk flüoresan ile her bir değeri bölerek ağartmadan önce ilk flüoresans yoğunluğuna göre normalize edin.
- FRAP eğrilerini elde etmek için, her bir zaman noktasının yoğunluk değerlerinden çıkararak çamaşır suyu bittikten hemen sonraki flüoresan yoğunluğuna taban çizgisini ayarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, yenidoğan kardiyomiyositlerde flüoresan miRNA'nın boşluğun junctional geçişini incelemek için non-invaziv bir teknik olarak 3D-FRAP mikroskobisini sunuyoruz. İzole edilen kardiyomiyositlerde, tipik olarak çizgili α-aktinin paterni görüldü ve hücreler arası hücre sınırları boyunca yüksek Cx43 plakları bulundu ( Şekil 1A , beyaz ok başları), bu da moleküllerin yüksek hücre içi akılarına izin verdi. İzole edilen kardiyomiyositlerin saflığı, α-actinin pozitif hücrelerin mikroskopik olarak ölçülmesi ile değerlendirildi. Kültürde bazı non-kardiyomiyosit (α-aktin-negatif hücreler) mevcut olmasına rağmen yenidoğan kardiyomiyositleri, izolasyondan sonra başlıca hücre tipini temsil ettiler (% 79.62 ± 3.68, Şekil 1B ).
Membranların junctional değişimini araştırmak için, hücreler flüoresan etiketli miRNA ile transfekte edildi. EleFRAP analizi için zorunlu olan transfekte edilmiş bileşiklerin homojen dağılımı ve yüksek transfeksiyon verimliliği sağlaması nedeniyle, ctroporasyon, miRNA moleküllerini hücrelere vermek için tercih edilen yöntemdir. Deneysel kurulumumuzda, akış sitometrisi ( Şekil 2A ) ile belirlendiği gibi ~% 45'lik bir transfeksiyon etkinliği elde ettik. FRAP için kardiyomiyositlerin hazırlanması, kültür plakasından ayrılmayı, elektroporasyonu ve odadaki slaytlara yeniden bağlanmayı içerir. Bir akış sitometrik canlı / ölü tahlili, hücrelerin büyük kısmının canlılık göstermiş olduğunu ortaya çıkarmıştır ve bu, boşluk bağlantılı iletişim analizinde önemlidir ( Şekil 2B ). Üstelik, hücre yoğunluğu, FRAP sonuçlarını etkileyen önemli bir parametredir. Optimum FRAP ölçümleri için, hücre kümelerinin oluşturulmasına ve hücreler arasında işlevsel boşluk bağlantılarının kurulmasına izin vermek için hücrelere ~% 80'lik bir yoğunluk ekilmelidir ( Şekil2C).
FRAP analizi için, hedef hücre, bir hücre kümesi içinde seçilir ve% 100 lazer gücü ile photobleached, seçilen hücrelerde azaltılmış miRNA floresanına yol açar ( Şekil 3A , ağartıcı). Daha sonra, bitişik hücrelerden miRNA'nın ağartılmış bölgeye transferinin görselleştirilmesi için flüoresans iyileşmesi kaydedilir. Floresans iyileşmesinin plato fazı 13 dakika sonra ulaştığından, bu zaman aralığı FRAP deneylerinde görüntü elde etmek için kullanılmıştır. Edinilen verilerin nicel analizi ve normalizasyonu ortalama% 20 iyileşme gösterdi. Veriler ayrıca, FRAP mikroskopisinin, yüksek zaman çözünürlüğünde miRNA dolaşımının hızlı kayıt edilmesine izin verdiğini göstermiştir. Boya özelliklerine bağlı olarak, edinim parametreleri zamansal çözünürlüğü daha da artırmak için değiştirilebilir.
3D-FRAP kullanımı,Farklı koşullar altında GJ geçirgenliğinin miRNA ile karşılaştırılması. Bunu göstermek için, azaltılmış protein ekspresyonu ( Şekil 3C ) ve boşluk bağlantılı iletişimi inhibisyonuna yol açan bir Cx43 siRNA aracılı knockdown'u indükledik. Sonuç olarak, floresans iyileşmesi% 50'den fazla azaldı, ki bu, miRNA transferinin etkinliğinin, hücreler arasındaki boşluk birleştirme bağlantısının derecesine bağlı olduğunu gösteriyor ( Şekil 3B , Cx43 knockdown). Floresans iyileşmesinin, ayrılmış Dy547 etiketinden ziyade floresan etiketli miRNA'nın geçişini yansıtıldığını doğrulamak için kalsein boyası için FRAP verilerini de elde ettik ( Şekil 3D ). Calcein'in molekül ağırlığı Dy547'ye benzer ve bu nedenle benzer aktarım dinamiklerine sahiptir. Dy547 etiketli miRNA'nın flüoresans iyileşmesinin aksine, kalsein, artmış boşluk birleşme değişimini göstermiştir; bu, Dy547 etiketi i'ninMiRNA molekülünden ayrılmamıştır ( Şekil 3D ).
Bir FRAP deneyi boyunca, özellikle uzun vadeli ölçümler yapılırken, kararlı odaklanma koşulları zorunludur. 2D uygulamaları ile karşılaştırıldığında, 3D-FRAP potansiyel odağı sürüklenmeyi telafi edebilir. Şekil 4'te gösterildiği gibi, hafif odak değişiklikleri bile, FRAP deneyinde ( Şekil 4B ) tek bir 2D katman kullanıldığında, miRNA'nın floresans sinyalinin doğru algılanmasını etkiler. Buna karşılık, 3D-FRAP için, hedef hücrenin tüm z-yığını kaydedilir ve maksimum projeksiyonlar veri analizine tabi tutulur ( Şekil 4A ). Odak sürüklenmesinin, normalleştirilmiş bir flüoresans-yoğunluk eğrileri üzerindeki etkisi Şekil 4C'de gösterilmektedir. 3D-FRAP'de zamanla flüoresan düzelmesi sürekli olarak artarken, 2D-FRAP edinimi sonuçta bir düşüşe neden olur.Floresans sinyali.
Odak değişikliklerinin telafisinin yanı sıra, 3D-FRAP de miRNA'nın boşluk birleşimsel değişiminin mekansal verilerini sağlar. Şekil 5 , bir FRAP denemesinin bir 3D yüzey sunumunu göstermektedir. Maksimum projeksiyonlarla karşılaştırıldığında, z-yığınlarının edinilmesi, hücrelerdeki miRNA'nın lokalizasyonu ve hareketliliğini araştırmak üzere 3D rekonstrüksiyonlar oluşturmak için kullanılabilir ( Şekil 5 ). Organellerle birlikte etiketleme miRNA transferinde diğer hücresel bileşenlerin katılımıyla ilgili soruşturmayı mümkün kılacaktır.
Şekil 1: İzole Yenidoğan Kardiyomiyositlerinin Temsilci Mikroskopik Görüntüleri. ( A ) Yapısal aydınlatma mikroskopisi, büyük p'de biriken Cx43'ün yüksek ekspresyonunu gösterirHücre-hücre sınırlarında laques (ok başları). Bitişik hücreler ile GJs'nin belirgin oluşumu, miRNA da dahil olmak üzere küçük moleküllerin geniş bir değişimini sağlar. Ölçek çubuğu = 20 μm ( B ) İzole edilen kardiyomiyositlerin saflığı. Α-actinin'in işaretlenmesi, izolasyondan sonra ana hücre türünü kardiyomiyositlerin temsil ettiğini gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Hücrelere anti-Cx43 (yeşil) ve anti-α-aktinin antikorları (kırmızı) ile boyandı. Çekirdekler, DAPI (mavi) kullanılarak görselleştirildi. Yapısal aydınlatma mikroskopisi ve immünolojik etiketlemenin bir açıklaması daha önceki yayınlarda sunulmuştur 20 . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Transfeksiyon Verimliliği, Canlılık , Ve Neonatal Kardiyomiyosit kültürünün Hücre Yoğunluğu. ( A ) Akış sitometrisi, miR547 elektroporasyonunun% 45'lik bir transfeksiyon etkinliği ile sonuçlandığını ortaya koymuştur. ( B ) FRAP için kullanılan kardiyomiyositlerin hücre yaşayabilirliği. İzolasyon, elektroporasyon ve yeniden birleştirmeden sonra, kardiyomiyositlere canlı ve ölü hücrelerin boyanmasına maruz kaldılar ve yüksek hücre canlılığı gösterdiler. ( C ) FRAP mikroskopisi için hazırlanmış mir547 ile transfekte edilen kardiyomiyositlerin mikroskopik görüntüsü. % 80-90'lık bir hücre yoğunluğu, boşluk birleşimsel hücre-hücresi temaslarının belirgin oluşumunu sağlar. Ölçek çubuğu = 50 μm. Transfeksiyon etkinliği ve yaşayabilirlik boyamasının akış sitometrik analizi için bir yöntem daha önceki yayınlarda 20,21 açıklanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Yeni doğan kardiyomiyositlerde miRNA'nın GJ'ye bağlı değişimi. ( A ) Bir FRAP denemesinin temsilci görüntüleri. Etiketli miRNA ile transfeksiyondan sonra, bir hücre kümesindeki hedef hücreler güçlü bir lazer darbesi ile (ağartıcıya karşı ağartıcıya karşı) photobleached edilir. Boşluk bağlantılı bağlantının derecesine bağlı olarak, komşu hücrelerden miRNA'nın boşluk birleşim akışı, ağartılmış hedef hücrelerde (ağartıcı t = 3, 6, 9 ve 13 dakika) artan floresan yoğunluğuyla sonuçlanır. Ölçek çubuğu = 20 μm ( B ) Elde edilen FRAP verilerinin kantitatif analizi, 13 dakika sonra% 20'lik bir floresan iyileşmesini göstermektedir. MiRNA'nın hücrelerarası transferi içindeki GJ'lerin katılımını teyit etmek için, bir cx43 knockdown gerçekleştirildi, bu da flüoresan iyileşmesinin güçlü bir azalmasına (% 50) yol açtı. ( C ) Anti-Cx43 ile immün boyamaAntikor ve daha sonra konfokal mikroskopi, protein seviyesinde Cx43 knockdown verimliliğini göstermektedir. Ölçek çubuğu = 50 μm. ( D ) miR547'nin FRAP verilerinin ve kalsein boyanın karşılaştırılması, farklı aktarım dinamiklerini göstermektedir. Kalcein moleküler ağırlığı daha düşük olduğunda, dy547 etiketli miRNA moleküllerine kıyasla artmış bir flüoresans iyileşmesi sağlandı. FRAP eğrileri n ≥56 hücrelerin verilerini özetler (ortalama ± SEM olarak gösterilir). İstatistiksel analiz, iki yönlü ANOVA ve bunu takiben Bonferroni'nin post-hoc testi (* P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001) kullanılarak yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: 3D-FRAP Mikroskopisi ile Odak Sürüklenmesinin Dengelenmesi. (
Şekil 5: 3D-FRAP Deneyinin 3D Yüzey İşleme. (Sol) Bir FRAP ölçümünün maksimum projeksiyonları. Fotobleached hücre (kırmızı çerçeve) komşu hücrelerden miRNA aktarımı nedeniyle flüoresan yoğunluğunda bir artış olduğunu gösterir. (Sağda) Aynı photobleached hücrenin (kırmızı) kazanılan z-yığınları, miRNA'nın mekansal dağılımını görselleştirmek için 3B yüzey işleme tabi tutuldu. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MiRNAlar, hücresel fizyolojideki kilit aktörlerdir ve hücrelerarası değişim için bir yol olarak GJ'leri 11 , 12 , 22 kullanarak - diğerlerinin yanında - kullanarak sinyal molekülleri olarak hareket ettiği gösterilmiştir. Mevcut protokol , hücre kümelerinde flüoresan miRNA'lar kullanarak bu GJ'ye bağımlı mekikleşmeyi karakterize etmek için bir in vitro canlı hücre görüntüleme tekniği sunmaktadır.
Protokol, kardiyomiyositlerde bir hücre modeli sistemi olarak geliştirildi. Ancak, elektroporasyon, miRNA transfeksiyonu için uygun bir yöntem ise, bu yaklaşım birkaç hücre tipine uygulanabilir. Hücre-hücre değişimine ek olarak, sunulan teknik, miRNA moleküllerinin hücre içi hareketliliğini araştırmak için de uygundur ( örneğin hücre içindeki olası nakil mekanizmalarının tanımlanması için) 23 , 24 .
İçerik "> FRAP mikroskopisi ile miRNA transferi araştırması floresan etiketli miRNA moleküllerine ihtiyaç duyar ( Şekil 2 ) Belirli hücresel miRNA'ların etiketlenmesi mümkün olmadığından, sadece ekzojen, tanıtılan etiketli miRNA, interselüler hareketliliği analiz etmek için 3D-FRAP için kullanılabilir Deneylerimizde, hücreler 250 nM miRNA ile transfekte edilmiştir Bu konsantrasyon, hücre başına 10 ila 50.000 molekül arasında değişen fizyolojik koşullara kıyasla çok daha yüksek 27,28 Bu tür düşük konsantrasyonlar FRAP deneylerinde kullanılamamaktadır, Floresan miRNA moleküllerinin belirli bir seviyesinin yeterli bir flüoresan sinyali elde etmek ve arka plan flüoresansı ile floresan etiketli miRNA arasında doğru ayırım yapılmasını sağlamak için gereklidir Ancak, konfokal görüntüleme sistemi ve boya özelliklerine bağlı olarak düşük miRNA konsantrasyonlarının kullanılması FRAP tahlilleri için -nM aralığı uygulanabilir olmalıdır. </ P>Farklı teknikler, akış sitometrisi, PCR ve lusiferaz raportör testleri 12 , 13 dahil olmak üzere hücreler arası miRNA transferini incelemek için yaygın olarak uygulanır. Bu yöntemler düşük zaman çözünürlüğü ile ( yani saatler ila günler arası) miRNA salınımını tespit eder. Buna karşılık, 3D-FRAP mikroskopisi, gerçek zamanlı olarak miRNA transferinin ve hareketliliğinin görselleştirilmesi ve nicelenmesini sağlar. Boş junctional hücre-hücre temaslarına ilaveten, miRNA'nın hücreler arası salınımı, ekzozomlar 18 , 29 , 30 gibi diğer mekanizmalar tarafından da yönlendirilir. Sadece 3D-FRAP, ekzozomal ve boşluk birleşim transferi arasında ayrım yapmak için yeterince yüksek zamansal çözünürlük sağlar. Dolayısıyla, farklı patolojik veya fizyolojik koşullar altında miRNA sinyallemesi üzerine GJ geçirgenliğinin direkt etkisi üzerindeki spesifik araştırmalara izin verir ( FiguRe 2).
Geleneksel 2D-FRAP'den üstün 3D-FRAP kullanımını öneriyoruz, çünkü GJ'ye bağımlı miRNA aktarımı hakkında daha doğru veri sağlar. 3D-FRAP ölçümleri, büyük hacimli hücre tiplerini kullanırken önem taşıyan tüm hücre hacmini içerir. Buna ek olarak, 2D-FRAP'deki flüoresans iyileşmesini önemli derecede bozduğu gösterilen odağı değiştiren veya hücre hareketlerini telafi edebilir ( Şekil 3 ). Son olarak, z-yığınlarının 3D-FRAP deneylerinde kaydedilmesi, sadece tek bir 2D katmanın floresan yoğunluklarının analizi için kullanıldığında mümkün olmayan, mekansal bilgi edinme imkânı sağlar ( Şekil 3B ).
Floresans geri kazanımının, bitişik hücrelerden gelen miRNA akışına bağlı olduğundan, ağartılmış hücrelere bağlı hücrelerin sayısı kritiktir ve güvenilir veriler elde etmek için farklı ölçümlerde benzer olmalıdır. Bu nedenle, yüksek hücre yoğunluğu gerektirirD FRAP analizi için en uygun hücresel kümelenmelerin oluşmasını sağlamaktır. Ayrıca hafif bir ağartma koşulunu ( örn. Lazer gücü, ağartma süresi ve tarama ayarları) seçmek için ön deneyler yapılmalı ve yüksek lazer yoğunluğundan kaynaklanan fototoksik etkilerden kaçınılmalıdır 25,26. Bu aynı zamanda edinme işlemi sırasında ortaya çıkan foto-ağartmayı azaltmaya yardımcı olacaktır.
Sınırlamalara rağmen, verilerimiz, 3-FRAP'in, hücresel bir ağ içindeki sinyal molekülleri olarak miRNA'ların rolünü değerlendirmek için güçlü bir araç olduğunu gösteriyor. Connexin kompozisyonunun miRNA salınımı veya belirli miRNA'lar için GJs'in seçici geçirgenliği üzerindeki etkisi, nakliye verimliliğinin direkt kantifikasyonu ile ele alınabilir. 3D-FRAP, derişimi kolaylaştıran uygun koşulları tanımlayarak, miRNA ve siRNA içeren yeni tedavilerin geliştirilmesini iyileştirmek için önemli bilgiler sağlayabilirGJ ağı aracılığıyla küçük RNA'ların n'si 31 , 32 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Bu çalışma Federal Almanya Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (FKZ 0312138A ve FKZ 316159), AB Yapısal Fonlarıyla Devlet Mecklenburg-Batı Pomerania (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 ve ESF / IVBM-B35-0010 / 12), DFG (DA1296-1) ve Alman Kalp Vakfı (F / 01/12). Buna ek olarak, RD, Rostock Üniversitesi Tıp Merkezi (889001), DAMP Vakfı ve BMBF (VIP + 00240) FORUN Programı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| neonatal NMRI mice | Charles River | ||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | 0.1% solution in PBS, sterilized |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| Dulbecco´s modified medium | Pan Biotech | P04-03550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/mL, 100µg/mL |
| Fetal bovine serum | Pan Biotech | P30-3306 | |
| Cell culture plastic | TPP | ||
| Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | 88281 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 88281 | included in primary cardiomyocyte isolation kit |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic | Dharmacon | CP-004500-01-05 | dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | |
| Sodium phosphate dibasic | Carl Roth | T877.2 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium chloride | Serva | 28305.01 | |
| Sodium succinate | Carl Roth | 3195.1 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA solution | Merck | L2153 | |
| 4-well- Glass bottom chamber slides | IBIDI | 80827 | coat with 0.1% gelatin solution |
| Amaxa Nucleofector II | Lonza | program G-009 was used for Electroporation | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| α-actinin antibody | Abcam | ab9465 | dilution 1:200 |
| Connexin43 antibody | Santa Cruz | sc-9059 | dilution 1:200 |
| goat anti-mouse Alexa 594 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | dilution 1:300 |
| goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | dilution 1:300 |
| Connexin43 siRNA | Thermo Fisher Scientific | AM16708 ID158724 | final concentration 250 nM |
| Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 |
References
- Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136 (4), 642-655 (2009).
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Grimm, D. Small silencing RNAs: state-of-the-art. Adv Drug Deliv Rev. 61 (9), 672-703 (2009).
- Raghunathan, S., Patel, B. M. Therapeutic implications of small interfering RNA in cardiovascular diseases. Fundam Clin Pharmacol. 27 (1), 1-20 (2013).
- Sluijter, J. P. G. MicroRNAs in Cardiovascular Regenerative Medicine: Directing Tissue Repair and Cellular Differentiation. ISRN Vasc Med. , 1-16 (2013).
- Li, M., Zhang, J. Circulating MicroRNAs: Potential and Emerging Biomarkers for Diagnosis of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases. Biomed Res Int. , 1-9 (2015).
- Romaine, S. P. R., Tomaszewski, M., Condorelli, G., Samani, N. J. MicroRNAs in cardiovascular disease: an introduction for clinicians. Heart. 101 (12), 921-928 (2015).
- Maes, M., Crespo Yanguas,, Willebrords, S., Cogliati, J., Vinken, B., M, Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease. Transl Res. 166 (4), 332-343 (2015).
- Michela, P., Velia, V., Aldo, P., Ada, P. Role of connexin 43 in cardiovascular diseases. Eur. J. Pharmacol. 768, 71-76 (2015).
- Naus, C. C., Laird, D. W. Implications and challenges of connexin connections to cancer. Nat Rev Cancer. 10 (6), 435-441 (2010).
- Hong, X., Sin, W. C., Harris, A. L., Naus, C. C. Gap junctions modulate glioma invasion by direct transfer of microRNA. Oncotarget. 6 (17), Available from: http://www.impactjournals.com/oncotarget 15566-15577 (2015).
- Lee, H. K. H., et al. Mesenchymal stem cells deliver synthetic microRNA mimics to glioma cells and glioma stem cells and inhibit their cell migration and self-renewal. Oncotarget. 4 (2), 346-361 (2013).
- Katakowski, M., Buller, B., Wang, X., Rogers, T., Chopp, M. Functional microRNA is transferred between glioma cells. Cancer Res. 70 (21), 8259-8263 (2010).
- Zong, L., Zhu, Y., Liang, R., Zhao, H. -B. Gap junction mediated miRNA intercellular transfer and gene regulation: A novel mechanism for intercellular genetic communication. Sci Rep. 6, 19884 (2016).
- Yum, S. W., Zhang, J., Scherer, S. S. Dominant connexin26 mutants associated with human hearing loss have trans-dominant effects on connexin30. Neurobiol Dis. 38 (2), 226-236 (2010).
- Kuzma-Kuzniarska, M., Yapp, C., Pearson-Jones, T. W., Jones, A. K., Hulley, P. A. Functional assessment of gap junctions in monolayer and three-dimensional cultures of human tendon cells using fluorescence recovery after photobleaching. J Biomed Opt. 19 (1), 15001 (2013).
- Lemcke, H., Nittel, M. -L., Weiss, D. G., Kuznetsov, S. A. Neuronal differentiation requires a biphasic modulation of gap junctional intercellular communication caused by dynamic changes of connexin43 expression. Eur J Neurosci. 38 (2), 2218-2228 (2013).
- Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Gap junctional shuttling of miRNA - A novel pathway of intercellular gene regulation and its prospects in clinical application. Cell Signal. 27 (12), 2506-2514 (2015).
- Lemcke, H., Kuznetsov, S. A. Involvement of connexin43 in the EGF/EGFR signalling during self-renewal and differentiation of neural progenitor cells. Cell Signal. 25 (12), 2676-2684 (2013).
- Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 98, 117-127 (2016).
- Laupheimer, M., et al. Selective Migration of Subpopulations of Bone Marrow Cells along an SDF-1 α and ATP Gradient. Bone Marrow Res. , 1-10 (2014).
- Zhang, S., Wang, Q., Liu, L., Hong, X., Zhang, Y., Tao, L. Gap junctions enhance the antiproliferative effect of microRNA-124-3p in glioblastoma cells. J Cell Physiol Physiol. 230 (10), 2476-2488 (2015).
- Vasilescu, C., Tanase, M., Dragomir, M., Calin, G. A. From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular localization. Math Biosci. 280, 50-61 (2016).
- Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly. EMBO Rep. 13 (8), 709-715 (2012).
- Heinze, K. G., Costantino, S., De Koninck, P., Wiseman, P. W. Beyond photobleaching, laser illumination unbinds fluorescent proteins. J Phys Chem B. 113 (15), 5225-5233 (2009).
- Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes. Ann N Y Acad Sci. 1011, 45-56 (2004).
- Dong, H., Lei, J., Ding, L., Wen, Y., Ju, H., Zhang, X. MicroRNA: Function, detection, and bioanalysis. Chem Rev. 113 (8), 6207-6233 (2013).
- Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., Chen, C. Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues. BMC Genomics. 8 (1), 166 (2007).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat Commun. 2, 282 (2011).
- Squadrito, M. L., et al. Endogenous RNAs Modulate MicroRNA Sorting to Exosomes and Transfer to Acceptor Cells. Cell Rep. 8, 1432-1446 (2014).
- Zhang, B., Farwell, M. A. microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy. J Cell Mol Med. 12 (1), 3-21 (2008).
- Chen, Y., Gao, D. -Y., Huang, L. In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy: Challenges and strategies. Adv Drug Deliv Rev. 81C, 128-141 (2015).
