Summary
在这里,我们描述了光漂白后三维荧光恢复(3D-FRAP)的应用,用于分析miRNA的间隙连接依赖穿梭。与通常应用的方法相比,3D-FRAP允许实时定量小RNA的细胞间转移,具有高的时空分辨率。
Abstract
小反义RNA(如miRNA和siRNA)在细胞生理学和病理学中起重要作用,而且可用作治疗几种疾病的治疗剂。开发miRNA / siRNA治疗新的创新策略是基于对基础机制的广泛了解。最近的数据表明,小细胞以间隙连接依赖的方式在细胞之间进行交换,从而在受体细胞中诱导基因调控作用。分子生物学技术和流式细胞仪分析通常用于研究miRNA的细胞间交换。然而,这些方法不提供高的时间分辨率,这在研究分子的间隙连接通量时是必需的。因此,为了研究miRNA / siRNA作为细胞间信号分子的影响,需要新的工具,这将允许在细胞水平上分析这些小RNA。本协议描述了ap光漂白后三维荧光恢复(3D-FRAP)显微镜的澄清,以阐明心脏细胞之间的miRNA分子的间隙连接依赖性交换。重要的是,这种直接和非侵入性的活细胞成像方法允许实时荧光标记的小RNA的间隙连接穿梭的可视化和定量,具有高的时空分辨率。通过3D-FRAP获得的数据证实了细胞间基因调控的新途径,其中小RNA作为细胞间网络内的信号分子。
Introduction
小的非编码RNA是细胞基因调控的重要参与者。这些分子由与特异性靶mRNA结合的20-25个核苷酸组成,导致翻译的阻断或mRNA降解1,2 。由小RNA(例如miRNA和siRNA)进行的基因调控过程是许多不同物种中发现的高度保守的机制。特别地,miRNA分子对多种生理过程至关重要,包括增殖,分化和再生4,5 。此外,miRNA表达的失调归因于许多病理学障碍。相应地,miRNA已经被证明适合作为诊断的生物标志物和用作基因治疗的治疗剂6,7
间隙连接(GJs)是两个相邻细胞的质膜中的专门的蛋白质结构,允许分子量高达1kD的扩散交换。已被证明对于组织发育,分化,细胞死亡和病理性疾病如癌症或心血管疾病8,9,10很重要 。已经描述了几个分子能够穿过GJ通道,包括离子,代谢物和核苷酸。有趣的是,还发现GJs为小RNA 11,12的细胞间移动提供了途径。因此,miRNA不仅可以在其产生的细胞内,而且在受体细胞内起作用。这突出了miRNA在细胞间信号转导系统中的作用。同时,数据显示该间隙连接细胞间通讯与miRNA功能密切相关。由于miRNA和GJs对组织稳态,病理学和诊断的重大影响,全面了解GJs的功能和miRNA的相关细胞间动力学有助于阐明基于miRNA的疾病的机制,并制定新的策略miRNA疗法。
根据间隙连接耦合的程度,miRNA分子在细胞间的转移可以是非常快速的过程。因此,需要一种允许可视化和量化这些调节信号分子的快速细胞间移动的方法。通常,已经应用流式细胞术和分子生物学技术来证明小RNA的穿梭11,12,13,14。然而,与FRAP微观相反复制,这些方法缺乏高时间分辨率,这是通过GJs分析miRNA的交换时强制的。此外,FRAP显微镜侵入性较小,因此代表了一种功能强大且新颖的活细胞成像技术,用于评估几种15,16,17型细胞中分子的GJ依赖性交换。
在这里,我们提出了一个详细的协议,描述了3D-FRAP应用于评估心肌细胞之间的miRNA穿梭。为此,用荧光标记的miRNA转染心肌细胞。用该miRNA标记的细胞被光漂白,并且以时间依赖的方式记录来自相邻细胞的间隙连接miRNA再流入。 FRAP实验的高时间分辨率提供了进行动力学研究以准确评估活细胞之间的miRNA和siRNA的细胞间转移的可能性。 Moreo由于小RNA可以通过具有高度不同动力学的不同机制进行交换,FRAP显微镜可以帮助澄清GJ在相应的穿梭过程18中涉及的程度。此外,3D-FRAP可用于研究GJ通透性的生理和病理学改变及其对小RNA转移的影响15,19。
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Protocol
根据罗斯托克大学医学中心动物护理的道德准则进行了涉及新生小鼠的本议定书中的所有步骤。
1.细胞培养皿和心肌细胞培养基的制备
- 用PBS中的0.1%明胶包被细胞培养板,并在37℃下孵育4小时或在4℃下孵育过夜。取出明胶,使其在无菌层流空气流下干燥。
- 准备由补充有10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/链霉素(P / S)的50mL的DMEM组成的细胞培养基。预热至37°C。
2.新生儿心肌细胞的分离
- 用无菌剪刀斩首新生儿小鼠(1-2天),沿胸骨打开胸部。使用镊子去除心脏,同时轻轻地将胸部按压在一起,并将心脏转移到含有冰冷HBSS的24孔板中(不含Ca 2+和Mg 2+ )。
- 使用无菌镊子去除非心脏组织和较大的血管。将清洁的心脏转移到含有冰冷HBSS的1.5mL管中。每管最多使用5颗心进行酶消化。
- 用小剪刀将心脏夹碎成0.5至1毫米3片。
- 使用1 mL微量移液管抽吸/添加HBSS,用HBSS洗涤切碎的心脏两次。加入酶前,彻底清除HBSS。
- 对于新生儿心脏的酶消化,使用市售的试剂盒,并遵循制造商的方案(参见材料表 )。每5分钟摇动含有切碎的心脏的管,同时用酶在37℃下孵育35分钟。
- 将含有细胞培养基的未包被的细胞培养皿上的悬浮细胞悬浮1.5-2小时以允许非心肌细胞部分的粘附。如果高纯度重复此步骤需要心肌细胞。如果需要,进一步培养非心肌细胞部分。
注意:对于15个心脏的细胞悬浮液,可以在75cm 2的细胞培养瓶上进行预镀层步骤。通常,从一个新生儿心脏获得〜5×10 5个细胞。 - 将上清液收集在15 mL锥形管中,并以300 x g离心10 min。将细胞重悬于1mL细胞培养基中。
- 用Neubauer室血细胞计数器计数细胞,或使用等效方法。
- 在密度为3×10 5个细胞/ cm 2的6孔板上平板分离的心肌细胞。在37℃和5%CO 2下孵育细胞过夜。
注意:任选地,细胞也可以在这一点被转染。然而,当在进行电穿孔之前将细胞培养一天时,观察到增加的活力。
3.用荧光标记的miRNA进行转染
- 预温水细胞培养基(参见步骤1.2)至37℃在水浴或等效装置中。
- 在无RNase的无菌水中制备20μM的荧光miRNA储备溶液。
- 制备含有90mM Na 2 HPO 4,90mM NaH 2 PO 4,5mM KCl,10mM MgCl 2和10mM琥珀酸钠的电穿孔缓冲液,并将pH调节至7.2;电穿孔缓冲液可以在-20°C储存几个月。
- 使用0.05%胰蛋白酶从培养皿中分离细胞5分钟。通过添加细胞培养基灭活胰蛋白酶。
- 用Neubauer室血细胞计数器计数细胞,或使用等效方法。将细胞以300xg离心10分钟。
- 将细胞重悬于电穿孔缓冲液中以获得每100μL4×10 5个细胞的浓度。
- 将100μL细胞悬浮液与荧光miRNA(终浓度:0.25μM)在管中混合将混合物装入电穿孔试管。
- 根据细胞类型经验性地确定适当的miRNA数量。
- 使用“G-009”程序,使用电穿孔装置进行电穿孔(参见材料表 )。
- 加入500μL预热后的细胞培养液,将全细胞悬浮液(4×10 5个细胞)转移到4孔玻璃底部载玻片的孔中。在37℃,5%CO 2气氛中培养细胞1天。
注意:对于FRAP分析,细胞密度为〜80%是最佳的。标记的miRNA的转染应该仅使用电穿孔进行。由于标记的miRNA分子的均匀分布对于FRAP测量是有益的,因此不推荐基于试剂的转染。
4.应用3D-FRAP显微镜(第3天)
- 将显微镜孵化器预热至37°; C,并在FRAP测量前至少2小时开启共焦显微镜系统,建立热平衡并降低漂移的可能性。如果可能,保持5%二氧化碳气氛。
- 将腔室载玻片插入平台样品架。
- 使用1.4 NA油物镜(400倍放大)和561nm激光激发光在低激光功率下寻找转染的心肌细胞簇,检测范围为570-680nm。
注意:使用显微镜专用软件(参见“材料表” )对FRAP设置,图像采集和分析进行了定义 。 - 激活“安装管理器”中的“z-Stack”,“时间序列”,“漂白”和“区域”按钮。
- 定义FRAP参数。
- 通过设置“帧大小”来定义“采集模式”菜单中的图像采集设置4;到512×512,“行步”为1,“扫描时间”为<1秒。
- 在“通道”菜单中,调整激光功率,偏移和增益设置,以从最小激光激发( 例如,激光功率:1-5%)获得最大荧光;调整以避免强度饱和。将“针孔尺寸”设置为2μm。
- 接下来,在“区域”菜单中,选择“ROI绘图工具”,并使用光标标记目标单元格,参考单元格和背景区域。如果需要,选择几个目标细胞进行光漂白。
- 调整“漂白”菜单中的漂白设置( 例如,迭代:9-14,光漂白激光功率:100%,图像采集间隔:60秒,周期:15)。定义3次初始扫描后的漂白开始。
- 在“z-Stack”菜单中,根据单元格的厚度定义z-stack采集的限制。调整“数字of z层“至12 - 15。
- 开始FRAP实验并记录荧光恢复。
注意:由于FRAP实验的设置取决于细胞类型,荧光染料和显微镜系统,最好进行试验性实验以确定FRAP的最佳参数。漂白应足以将初始荧光强度降低至少50%。通常,每30-60秒应记录荧光恢复,直到达到平台期。
数据分析
- 创建所获得的z-叠层的最大投影并获得漂白的靶细胞,参考细胞和背景的荧光强度值。使用显微镜专用软件,点击“处理”→“最大强度投影”→选择文件→“应用”。
- 或者,使用等效图像分析工具(
- 或者,使用等效图像分析工具(
- 将所有时间点的荧光强度数据从目标单元格,背景和参考单元复制到电子表格中。
- 从目标单元的强度值中减去参考单元的背景强度和强度,以校正在采集过程中产生的漂白。对每个时间点执行背景和参考单元校正。
- 通过将每个值除以初始荧光,将校正的FRAP数据归一化为漂白前的初始荧光强度。
- 为了获得FRAP曲线,通过从每个时间点的强度值中减去,将基线设置为漂白后立即的荧光强度。
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Representative Results
在这里,我们提出3D-FRAP显微镜作为非侵入性技术研究新生儿心肌细胞荧光miRNA间隙连接穿梭。分离的心肌细胞显示典型的条纹α-肌动蛋白模式,并且沿着细胞 - 细胞边界包含大量的Cx43斑块( 图1A ,白色箭头),这允许分子的高细胞间通量。通过显微定量α-肌动蛋白阳性细胞评估分离的心肌细胞的纯度。虽然培养物中存在一些非心肌细胞(α-肌动蛋白阴性细胞),但分离后新生儿心肌细胞代表主要细胞类型(79.62±3.68%; 图1B )。
为了研究miRNA的间隙连接交换,用荧光标记的miRNA转染细胞。 ELE诱导是将miRNA分子递送到细胞的选择方法,因为它确保了高转染效率和转染化合物的均匀分布,这是FRAP分析所必需的。在我们的实验设置中,我们通过流式细胞术测定了转染效率〜45%( 图2A )。用于FRAP的心肌细胞的制备包括从培养板脱离,电穿孔和重新附着到室载玻片上。流式细胞术活/死测定显示大多数细胞表现出高活力,这在分析间隙连接通讯时是重要的( 图2B )。此外,细胞密度是影响FRAP结果的关键参数。对于最佳FRAP测量,细胞应以约80%的密度接种,以形成细胞簇并建立细胞之间的功能性间隙连接( 图2C)。
对于FRAP分析,在细胞簇内选择靶细胞,并用100%激光功率进行光漂白,导致所选细胞中的miRNA荧光降低( 图3A ,漂白剂)。随后,记录荧光恢复以显现miRNA从相邻细胞转移到漂白区域中。由于在13分钟后达到了荧光恢复的平台期,所以将该时间跨度用于FRAP实验中的图像采集。所得数据的定量分析和归一化显示平均回收率为20%。数据还表明,FRAP显微镜允许以高时间分辨率快速记录miRNA穿梭。根据染料性质,可以改变采集参数以进一步提高时间分辨率。
使用3D-FRAP实现在不同条件下GJ通透性与miRNA的比较。为了证明这一点,我们诱导了siRNA介导的Cx43敲低,导致蛋白质表达降低( 图3C )和间隙连接通讯的抑制。结果,荧光回收率降低了50%以上,表明miRNA转移的效率强烈依赖于细胞间隙连接耦合的程度( 图3B ,Cx43敲低)。为了证实荧光恢复反映了荧光标记的miRNA的通过,而不是分离的Dy547标签,我们还获得了钙黄绿素染料的FRAP数据( 图3D )。钙黄绿素具有与Dy547相当的分子量,因此具有相似的转移动力学。与Dy547标记的miRNA的荧光恢复相反,钙黄绿素显示出增加的间隙连接交换,表明Dy547标记i不分离miRNA分子( 图3D )。
在整个FRAP实验中,稳定的对焦条件是强制性的,特别是在进行长期测量时。与2D应用相比,3D-FRAP可以补偿潜在的焦点漂移。 如图4所示 ,当仅使用单个2D层用于FRAP实验时,甚至轻微的焦点变化影响miRNA的荧光信号的适当检测( 图4B )。相比之下,对于3D-FRAP,记录目标单元的整个z-叠层,并对最大投影进行数据分析( 图4A )。聚焦漂移对归一化荧光强度曲线的影响如图4C所示 。虽然3D-FRAP中荧光恢复稳定增加,但2D-FRAP采集导致了下降f荧光信号。
除了焦点变化的补偿之外,3D-FRAP还提供了miRNA间隙连接交换的空间数据。 图5显示了FRAP实验的3D表面渲染。与最大预测相比,z-stacks的采集可用于创建3D重建,以调查细胞内miRNA的定位和迁移率( 图5 )。与细胞器共同标记将允许调查其他细胞成分参与miRNA转移。
图1:分离的新生儿心肌细胞的代表性显微镜图像。 ( A )结构照明显微镜显示Cx43的高表达,其积聚在大的p细胞细胞边界的笑脸(箭头)。与相邻细胞的GJs的显着形成使得能够广泛交换包括miRNA在内的小分子。刻度棒=20μm( B )分离的心肌细胞的纯度。 α-肌动蛋白的标记表明心肌细胞代表分离后的主要细胞类型。刻度棒=50μm。细胞用抗Cx43(绿色)和抗α-肌动蛋白抗体(红色)染色。使用DAPI(蓝色)显现核。在以前的出版物20中提供了结构化照明显微镜和免疫标记的描述。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2:转染效率,生存力 ,和新生儿心肌细胞培养细胞密度。 ( A )流式细胞术显示miR547电穿孔导致〜45%的转染效率。 ( B )用于FRAP的心肌细胞的细胞活力。在分离,电穿孔和再附着后,心肌细胞进行活细胞死亡细胞染色并显示高细胞活力。 ( C )用于FRAP显微镜制备的mir547转染的心肌细胞的显微镜图像。 80-90%的细胞密度确保间隙连接的细胞 - 细胞接触的显着形成。刻度棒=50μm。以前的出版物20,21中提到了转染效率和活力染色的流式细胞分析方法。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3:新生儿心肌细胞中miRNA的GJ依赖性交换。 ( A )FRAP实验的代表性图像。在用标记的miRNA转染后,细胞簇内的靶细胞通过强激光脉冲(预漂白剂与漂白剂)进行光漂白。根据间隙连接耦合的程度,来自相邻细胞的miRNA间隙连接的流入导致漂白的靶细胞中的荧光强度增加(漂白后t = 3,6,9和13分钟)。比例尺= 20μm( B )获得的FRAP数据的定量分析显示13分钟后的荧光回复率为20%。为了证实参与GJs的miRNA细胞间转移,进行了cx43敲低,导致荧光恢复强烈降低(50%)。 ( C )用抗Cx43免疫染色抗体和随后的共聚焦显微镜显示Cx43在蛋白质水平上的敲低效率。刻度棒=50μm。 ( D )miR547和钙黄绿素染料的FRAP数据比较显示不同的转移动力学。与dy547标记的miRNA分子相比,钙黄绿素的较小分子量导致增加的荧光恢复。 FRAP曲线总结了n≥56个细胞的数据,显示为平均值±SEM。使用双因素ANOVA进行统计学分析,随后进行Bonferroni的事后检验(* P <0.05,** P <0.01,*** P <0.001)。 请点击此处查看此图的较大版本。
图4:使用3D-FRAP显微镜补偿焦点漂移。 (
图5:3D-FRAP实验的3D表面渲染。 (左)FRAP测量的最大投影。光漂白细胞(红框)显示由于相邻细胞的miRNA转移而导致的荧光强度的增加。 (右)将相同的漂白细胞(红色)的获得的z-叠层进行3D表面渲染以显现miRNA的空间分布。刻度棒=20μm。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
miRNA是细胞生理学中的关键参与者,并被证明通过使用G_s作为细胞间交换途径,作为信号分子11,12,22。目前的方案提出体外活细胞成像技术来表征使用荧光miRNA在细胞簇内的GJ依赖性穿梭。
该方案作为细胞模型系统在心肌细胞上开发。然而,如果电穿孔是miRNA转染的合适方法,则该方法可以应用于几种细胞类型。除了细胞间细胞交换,所提出的技术也适用于研究miRNA分子的细胞内迁移率( 例如,用于鉴定细胞内可能的转运机制) 23,24 。
内容“>通过FRAP显微镜检测miRNA转移需要荧光标记的miRNA分子( 图2 ),由于特异性细胞miRNA的标记是不可行的,只有外源引入的标记miRNA才能用于3D-FRAP,以分析其细胞间移动在我们的实验中,细胞用250-nm的miRNA转染,与生理条件相比,这个浓度要高得多,其中miRNA水平范围是每个细胞10到50,000个分子, 27,28 ,这样低的浓度不能用于FRAP实验,因为需要一定程度的荧光miRNA分子才能获得足够的荧光信号,并确保背景荧光和荧光标记的miRNA之间的适当区别。然而,根据共聚焦成像系统和染料性质,使用低浓度的miRNA浓度-nM范围对于FRAP测定应该是可行的/ P>通常应用不同的技术来研究细胞间miRNA的转移,包括流式细胞术,PCR和荧光素酶报告物测定12,13 。这些方法用低时间分辨率( 即从几小时到几天)检测miRNA穿梭。相比之下,3D-FRAP显微镜可以实时显示和量化miRNA的转移和迁移。除了间隙连接的细胞 - 细胞接触之外,miRNA的细胞间穿梭也由其他机制介导,例如外源体18,29,30。只有3D-FRAP提供足够高的时间分辨率以区分外来体和间隙连接转移。因此,它可以对不同病理或生理条件下的GJ渗透性对miRNA信号传导的直接作用进行具体研究(Figure 2)。
我们建议使用3D-FRAP,其优于常规2D-FRAP,因为它提供了更精确的GJ依赖性miRNA转移数据。 3D-FRAP测量包括整个细胞体积,这在使用大体积细胞类型时很重要。此外,它可以补偿焦点变化或细胞运动,这显示显着损害2D-FRAP中的荧光恢复( 图3 )。最后,在3D-FRAP实验中记录z-stack提供了获得空间信息的可能性,当仅使用单个2D层用于分析荧光强度时,这是不可行的( 图3B )。
由于荧光恢复取决于来自相邻细胞的miRNA的流入,连接到漂白细胞的细胞数量是关键的,并且必须在不同测量之间相似以获得可靠的数据。因此,需要高细胞密度d以确保最适合FRAP分析的细胞簇的形成。此外,必须进行初步实验以选择温和的漂白条件( 即激光功率,漂白时间和扫描设置),以避免由高激光强度25,26引起的光毒性影响。这也有助于减少在采集过程中发生的漂白。
尽管有局限性,我们的数据显示,3D-FRAP是评估miRNA作为细胞网络中的信号分子的作用的有力工具。连接蛋白组成对miRNA穿梭的影响或GJs对特异性miRNA的选择性渗透性的影响可以通过传输效率的直接量化来解决。 3D-FRAP可以提供重要信息,以改进miRNA和siRNA特征的新疗法的发展,例如通过定义促进分配的适当条件n个小RNA 通过 GJ网络31,32 。
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Disclosures
作者宣称没有利益冲突。
Acknowledgments
德国联邦教育和研究部(FKZ 0312138A和FKZ 316159),梅克伦堡 - 西波美拉尼亚与欧盟结构基金(ESF / IVWM-B34-0030 / 10和ESF / IVBM-B35-0010 / 12),DFG(DA1296-1)和德国心脏基金会(F / 01/12)。此外,RD由罗斯托克大学医学中心(889001),DAMP基金会和BMBF(VIP + 00240)的FORUN计划支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
neonatal NMRI mice | Charles River | ||
Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | 0.1% solution in PBS, sterilized |
PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
Dulbecco´s modified medium | Pan Biotech | P04-03550 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/mL, 100µg/mL |
Fetal bovine serum | Pan Biotech | P30-3306 | |
Cell culture plastic | TPP | ||
Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | 88281 | |
HBSS | Thermo Fisher Scientific | 88281 | included in primary cardiomyocyte isolation kit |
Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic | Dharmacon | CP-004500-01-05 | dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | |
Sodium phosphate dibasic | Carl Roth | T877.2 | |
Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
Magnesium chloride | Serva | 28305.01 | |
Sodium succinate | Carl Roth | 3195.1 | |
0.05% Trypsin/EDTA solution | Merck | L2153 | |
4-well- Glass bottom chamber slides | IBIDI | 80827 | coat with 0.1% gelatin solution |
Amaxa Nucleofector II | Lonza | program G-009 was used for Electroporation | |
LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
Excel software | Microsoft | ||
α-actinin antibody | Abcam | ab9465 | dilution 1:200 |
Connexin43 antibody | Santa Cruz | sc-9059 | dilution 1:200 |
goat anti-mouse Alexa 594 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | dilution 1:300 |
goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | dilution 1:300 |
Connexin43 siRNA | Thermo Fisher Scientific | AM16708 ID158724 | final concentration 250 nM |
Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 |
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