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Biology

Analyse du Gap Junction-dependent Transfert de miARN avec microscopie 3D-FRAP

doi: 10.3791/55870 Published: June 19, 2017

Summary

Ici, nous décrivons l'application de la récupération de fluorescence tridimensionnelle après photoblanchage (3D-FRAP) pour l'analyse de la permutation dépendant de la jonction de miRNA. Contrairement aux méthodes couramment appliquées, 3D-FRAP permet de quantifier le transfert intercellulaire de petits ARN en temps réel, avec une résolution spatio-temporelle élevée.

Abstract

Les petits ARN antisens, comme le miARN et l'ARNi, jouent un rôle important dans la physiologie et la pathologie cellulaires et, en outre, peuvent être utilisés comme agents thérapeutiques dans le traitement de plusieurs maladies. Le développement de nouvelles stratégies novatrices pour la thérapie miRNA / siRNA repose sur une connaissance approfondie des mécanismes sous-jacents. Les données récentes suggèrent que les petits ARN sont échangés entre les cellules d'une manière dépendant de la jonction, ce qui induit des effets de régulation des gènes dans la cellule destinataire. Les techniques biologiques moléculaires et l'analyse cytométrique en flux sont couramment utilisées pour étudier l'échange intercellulaire du miARN. Cependant, ces méthodes ne fournissent pas une résolution temporelle élevée, ce qui est nécessaire lors de l'étude du flux de jonction entre les molécules. Par conséquent, pour étudier l'impact du miRNA / siRNA en tant que molécules de signalisation intercellulaire, de nouveaux outils sont nécessaires pour permettre l'analyse de ces petits ARN au niveau cellulaire. Le présent protocole décrit l'apPlication de la récupération de fluorescence tridimensionnelle après microscopie de photoblanchissement (3D-FRAP) pour élucider l'échange de molécules d'ARNm entre les cellules cardiaques. Il est important de noter que cette approche directe et non invasive d'imagerie en cellule vive permet de visualiser et de quantifier le passage à genoux jumelé de petits ARN marqués par fluorescence en temps réel, avec une résolution spatio-temporelle élevée. Les données obtenues par 3D-FRAP confirment une nouvelle voie de régulation des gènes intercellulaires, où les petits ARN agissent comme des molécules de signalisation dans le réseau intercellulaire.

Introduction

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Les petits ARN non codants sont des acteurs importants de la régulation des gènes cellulaires. Ces molécules sont composées de 20 à 25 nucleotides qui se lient à un ARNm cible spécifique, conduisant au blocage de la traduction ou à la dégradation 1 de l'ARNm. Le processus de réglementation des gènes entrepris par les petits ARN, tels que le miARN et l'ARNi, est un mécanisme hautement conservé qui a été trouvé dans de nombreuses espèces différentes 3 . En particulier, les molécules d'ARNm sont d'une importance cruciale pour une variété de processus physiologiques, y compris la prolifération, la différenciation et la régénération 4 , 5 . En outre, la dérégulation de l'expression de l'ARNm est attribuée à de nombreux troubles pathologiques. De manière correspondante, les ARNm ont été démontrés comme appropriés comme biomarqueurs pour le diagnostic et comme agents thérapeutiques pour la thérapie génique 6 , 7

Les jonctions d'écart (GJ) sont des structures de protéines spécialisées dans la membrane plasmique de deux cellules adjacentes qui permettent l'échange diffusaire de molécules avec un poids moléculaire allant jusqu'à 1 kD. Ils ont montré qu'ils étaient importants pour le développement tissulaire, la différenciation, la mort cellulaire et les troubles pathologiques tels que le cancer ou les maladies cardiovasculaires 8 , 9 , 10 . Plusieurs molécules ont été décrites comme étant capables de traverser les canaux GJ, y compris les ions, les métabolites et les nucléotides. Fait intéressant, les GJ ont également été trouvés pour fournir une voie pour le mouvement intercellulaire des petits ARN 11 , 12 . Ainsi, les miARN peuvent agir non seulement dans la cellule dans laquelle ils sont produits, mais aussi dans les cellules destinataires. Cela met en évidence le rôle des miARN dans le système de transduction du signal intercellulaire. Dans le même temps, les données démontrentCette communication intercellulaire de jonction gap est étroitement liée à la fonction miARN. En raison de l'impact significatif du miRNA et des GJ sur l'homéostasie des tissus, la pathologie et le diagnostic, une compréhension globale de la fonction des GJ et de la dynamique interellulaire associée au miARN aidera à clarifier les mécanismes des maladies à base de miARN et à développer de nouvelles stratégies pour Thérapies de l'ARNm.

Selon l'étendue du couplage jonctionnaire, le transfert de molécules d'ARNm entre les cellules peut être un processus très rapide. Par conséquent, une méthodologie permettant la visualisation et la quantification du mouvement intercelulaire rapide de ces molécules de signalisation réglementaire est nécessaire. Généralement, la cytométrie de flux et les techniques de biologie moléculaire ont été appliquées pour démontrer le déplacement des petits ARN 11 , 12 , 13 , 14 . Cependant, par opposition aux micros FRAPCopie, ces approches manquent d'une résolution temporelle élevée, ce qui est obligatoire lors de l'analyse de l'échange de miRNA via GJs. En outre, la microscopie FRAP est moins invasive et représente donc une puissante et nouvelle technique d'imagerie des cellules vivantes pour évaluer l'échange de molécules dépendantes de GJ dans plusieurs types de cellules 15 , 16 , 17 .

Ici, nous présentons un protocole détaillé décrivant l'application de 3D-FRAP pour évaluer le transfert de miARN entre les cardiomyocytes. À cette fin, les cardiomyocytes ont été transfectés avec un miARN marqué par fluorescence. Une cellule marquée par ce miARN a été photoblanchée, et le réintroduction de miARN par jonction entre les cellules adjacentes a été enregistrée de manière dépendant du temps. La résolution temporelle élevée des expériences FRAP offre la possibilité d'effectuer des études cinétiques pour l'évaluation précise du transfert intercellulaire de miARN et d'ARNi entre les cellules vivantes. MoreoEn effet, comme les petits ARN peuvent être échangés via différents mécanismes avec une cinétique très différente, la microscopie FRAP peut aider à préciser dans quelle mesure les GJ sont impliqués dans les processus respectifs de navette 18 . En outre, 3D-FRAP peut être utilisé pour étudier les altérations physiologiques et pathologiques de la perméabilité GJ et son impact sur le transfert d'un petit ARN 15 , 19 .

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Protocol

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Toutes les étapes de ce protocole impliquant des souris néonatales ont été effectuées selon les directives éthiques pour les soins des animaux du Centre médical de l'Université de Rostock.

1. Préparation des plats de culture cellulaire et du milieu pour la culture des cardiomyocytes

  1. Revêtir une plaque de culture cellulaire avec 0,1% de gélatine dans du PBS et incuber à 37 ° C pendant 4 h ou à 4 ° C pendant une nuit. Retirez la gélatine et laissez-la sécher sous un flux d'air laminaire stérile.
  2. Préparer un milieu de culture cellulaire composé de 50 mL de DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine (P / S). Préchauffer à 37 ° C.

2. Isolation des cardiomyocytes néonatals

  1. Sacrifiez les souris néonatales (1-2 jours) par décapitation avec des ciseaux stériles et ouvrez la poitrine le long du sternum. Retirez le cœur en utilisant une pince tout en appuyant légèrement sur le thorax ensemble et transférez le coeur dans une plaque de 24 puits contenant HBSS glacé(Sans Ca 2 + et Mg 2+ ).
  2. Enlever les tissus non cardiaques et les vaisseaux plus grands en utilisant des pinces stériles. Transférer les coeurs nettoyés dans un tube de 1,5 ml contenant de l'HBSS glacé. Utiliser un maximum de 5 coeurs par tube pour la digestion enzymatique.
  3. Pique les cœurs avec de petits ciseaux en <0,5 à 1 mm³ de morceaux.
  4. Laver les coeurs hachés avec HBSS deux fois par aspiration / addition de HBSS en utilisant une pipette à 1 mL de microlitres. Retirez complètement le HBSS avant d'ajouter les enzymes.
  5. Pour la digestion enzymatique des coeurs néonataux, utilisez un kit disponible dans le commerce et suivez le protocole du fabricant (voir la Table des matières ). Secouez le tube contenant les cœurs hachés toutes les 5 minutes tout en incubant avec des enzymes à 37 ° C pendant 35 minutes.
  6. Cellules suspendues à base de graines sur des boîtes de culture cellulaire non revêtues contenant un milieu de culture cellulaire pendant 1,5-2 h pour permettre l'adhérence de la fraction non cardiomyocytaire. Répétez cette étape si une pureté élevéeDes cardiomyocytes est nécessaire. Si désiré, développez davantage la fraction non cardiomyocytaire.
    NOTE: Pour une suspension cellulaire de 15 coeurs, l'étape de pré-plaquage peut être effectuée sur des flacons de culture cellulaire de 75 cm². Généralement, ~ 5 x 10 5 cellules sont obtenues à partir d'un cœur néonatal.
  7. Recueillir le surnageant dans un tube conique de 15 ml et centrifuger pendant 10 min à 300 x g. Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu de culture cellulaire.
  8. Compter les cellules avec un hémocytomètre de la chambre Neubauer, ou utiliser une méthode équivalente.
  9. Cardiomyocytes isolés en plaques sur des plaques à 6 puits avec une densité de 3 x 10 5 cellules / cm². Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO 2 .
    REMARQUE: optionnellement, les cellules peuvent également être transfectées à ce stade. Cependant, une viabilité accrue a été observée lorsque les cellules ont été cultivées pendant un jour avant d'être soumises à une électroporation.

3. Transfection avec microARN marqué par fluorescence

  1. Pré-Milieu de culture de cellules chaudes (voir étape 1.2) à 37 ° C dans un bain d'eau ou un dispositif équivalent.
  2. Préparez une solution mère 20 μM de miARN fluorescent dans de l'eau stérile sans RNase.
  3. Préparer un tampon d'électroporation contenant 90 mM de Na 2 HPO 4 , 90 mM de NaH 2 PO 4 , 5 mM de KCl, 10 mM de MgCl 2 et 10 mM de succinate de sodium et ajuster le pH à 7,2; Le tampon d'électroporation peut être stocké à -20 ° C pendant plusieurs mois.
  4. Détachez les cellules du plat de culture en utilisant 0,05% de trypsine pendant 5 min. Inactive la trypsine en ajoutant un milieu de culture cellulaire.
  5. Compter les cellules avec un hémocytomètre de la chambre Neubauer, ou utiliser une méthode équivalente. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 10 min.
  6. Remettre en suspension les cellules dans un tampon d'électroporation pour obtenir une concentration de 4 x 10 5 cellules par 100 μL.
  7. Mélanger 100 μL de suspension cellulaire avec miARN fluorescent (concentration finale: 0,25 μM) dans un tube etCharger le mélange dans une cuvette à électroporation.
    1. Déterminer de façon empirique la quantité appropriée de miRNA, selon le type de cellule.
  8. Effectuer l'électroporation à l'aide d'un dispositif d'électroporation (voir la Table des matériaux ), en utilisant le programme "G-009".
  9. Ajouter 500 μL de milieu de culture cellulaire préchauffé et transférer la suspension de cellules entières (4 x 10 5 cellules) dans un puits d'une glissière à chambre à fond de verre à 4 puits. Culturez les cellules pendant 1 jour à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5%.
    NOTE: Pour l'analyse FRAP, une densité cellulaire de ~ 80% est optimale. La transfection de l'ARNm marqué doit être exclusivement réalisée par électroporation. Étant donné que la distribution homogène des molécules d'ARNm marquées est bénéfique pour la mesure du FRAP, la transfection à base de réactif n'est pas recommandée.

4. Application de la microscopie 3D-FRAP (jour 3)

  1. Réchauffer l'incubateur au microscope à 37 °; C et allumer le système de microscope confocal au moins 2 h avant la mesure FRAP pour établir un équilibre thermique et diminuer la possibilité de dérive. Si possible, maintenir une atmosphère de CO 2 de 5%.
  2. Insérez la chambre dans le porte-échantillon de l'étape.
  3. Trouver un groupe de cardiomyocytes transfectés en utilisant un objectif d'huile 1.4 NA (grossissement 400X) et une lumière d'excitation laser de 561 nm à faible puissance laser, avec une plage de détection de 570 à 680 nm.
    REMARQUE: la définition des paramètres FRAP, l'acquisition de l'image et l'analyse ont été effectuées à l'aide d'un logiciel spécifique au microscope (voir la Table des matières ).
  4. Activez les boutons "z-Stack", "Time Series", "Blanchiment" et "Régions" dans le "Setup Manager".
  5. Définissez les paramètres FRAP.
    1. Définissez les paramètres d'acquisition d'image dans le menu "Mode d'acquisition" en définissant le "format d'image"4; À 512 x 512, le "pas de ligne" à 1, et le "temps de balayage" à <1 s.
    2. Dans le menu "Chaînes", ajustez les paramètres de puissance, de décalage et de gain du laser pour obtenir une fluorescence maximale à partir d'une excitation laser minimale ( p. Ex., Puissance laser: 1-5%); Ajuster pour éviter la saturation d'intensité. Réglez la "taille d'épingle" à 2 μm.
    3. Ensuite, dans le menu "Régions", sélectionnez le "outil de dessin ROI" et utilisez le curseur pour marquer la cellule cible, la cellule de référence et la zone d'arrière-plan. Si nécessaire, sélectionnez plusieurs cellules cibles pour photoblanchage.
    4. Ajustez les paramètres de photoblanchissement dans le menu "Blanchiment" ( p. Ex., Itérations: 9-14 , alimentation laser pour photoblanchage: 100%, intervalle d'acquisition d'image: 60 s, cycles: 15). Définir le début du blanchiment après 3 scans initiaux.
    5. Dans le menu "z-Stack", définissez les limites pour l'acquisition de la pile z, en fonction de l'épaisseur des cellules. Ajustez le "numéro oF z-layers "à 12-15.
    6. Démarrez l'expérience FRAP et enregistrez la récupération de fluorescence.
      REMARQUE: Étant donné que les paramètres d'une expérience FRAP dépendent du type de cellule, du colorant fluorescent et du système de microscope, il est préférable d'effectuer des expériences pilotes pour déterminer les paramètres optimaux pour FRAP. Le blanchiment doit être suffisant pour réduire l'intensité de fluorescence initiale d'au moins 50%. Généralement, la récupération de fluorescence doit être enregistrée toutes les 30 à 60 s jusqu'à ce que la phase du plateau soit atteinte.

5. Analyse des données

  1. Créez des projections maximales des piles z acquises et obtenez des valeurs d'intensité de fluorescence des cellules cibles blanchies, de la cellule de référence et de l'arrière-plan. En utilisant un logiciel spécifique au microscope, cliquez sur "Traitement" → "Projection d'intensité maximale" → sélectionnez le fichier → "Appliquer".
    1. Alternativement, utilisez un outil d'analyse d'image équivalent (
  2. Copiez les données d'intensité de fluorescence à tous les points de temps de la cellule cible, de l'arrière-plan et de la cellule de référence dans une feuille de calcul.
    1. Soustraire l'intensité de fond et l'intensité de la cellule de référence des valeurs d'intensité de la cellule cible pour corriger le photoblanchage provoqué lors du processus d'acquisition. Effectuez des corrections de base et de cellule de référence pour chaque point de temps.
    2. Normaliser les données FRAP corrigées à l'intensité de fluorescence initiale avant le blanchiment en divisant chaque valeur par la fluorescence initiale.
    3. Pour obtenir des courbes de FRAP, réglez la ligne de base à l'intensité de fluorescence immédiatement après l'eau de Javel en soustrayant les valeurs d'intensité de chaque point de temps.

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Representative Results

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Ici, nous présentons la microscopie 3D-FRAP comme une technique non-invasive pour étudier la liaison de jonction entre le miRNA fluorescent dans les cardiomyocytes néonatals. Les cardiomyocytes isolés ont révélé le schéma typique de l'α-actinine striée et contenaient de grandes plaques de Cx43 le long des frontières des cellules ( figure 1A , pointes de flèches blanches), ce qui a permis le flux intercellulaire élevé des molécules. La pureté des cardiomyocytes isolés a été évaluée par la quantification microscopique des cellules positives à l'α-actinine. Bien que certains non cardiomyocytes (cellules α-actinines négatives) soient présents dans la culture, les cardiomyocytes néonatals ont représenté le type de cellule majeur après l'isolement (79,62 ± 3,68%, figure 1B ).

Pour étudier l'écart d'échange de jonction du miARN, les cellules ont été transfectées avec un miARN marqué par fluorescence. EleLa ctroporation est la méthode de choix pour délivrer des molécules d'ARNm aux cellules, car elle assure une efficacité de transfection élevée et la répartition homogène des composés transfectés, ce qui est obligatoire pour l'analyse du FRAP. Dans notre configuration expérimentale, nous avons atteint une efficacité de transfection de ~ 45%, déterminée par la cytométrie de flux ( Figure 2A ). La préparation de cardiomyocytes pour le FRAP comprend le détachement de la plaque de culture, l'électroporation et la ré-fixation sur les lames de la chambre. Un test cytométrique en direct / mort a été révélé que la majorité des cellules ont démontré une viabilité élevée, ce qui est important lors de l'analyse de la communication intersectorielle gap ( figure 2B ). En outre, la densité cellulaire est un paramètre crucial qui affecte les résultats du FRAP. Pour des mesures de FRAP optimales, les cellules doivent être ensemencées avec une densité de ~ 80% pour permettre la formation de grappes de cellules et l'établissement de jonctions fonctionnelles entre les cellules ( Figure2C).

Pour l'analyse FRAP, les cellules cibles sont sélectionnées dans un cluster cellulaire et sont photoblanchées avec une puissance laser 100%, ce qui conduit à une fluorescence réduite de l'ARNm dans les cellules sélectionnées ( Figure 3A , agent de blanchiment). Par la suite, la récupération de fluorescence est enregistrée pour visualiser le transfert de miARN à partir de cellules adjacentes dans la zone blanchie. Comme la phase du plateau de la récupération de fluorescence a été atteinte après 13 min, cette période a été utilisée pour l'acquisition d'image dans les expériences FRAP. L'analyse quantitative et la normalisation des données acquises ont montré une reprise moyenne de 20%. Les données ont également démontré que la microscopie FRAP permet l'enregistrement rapide de la navigation de miRNA avec une résolution temporelle élevée. Selon les propriétés de colorant, les paramètres d'acquisition peuvent être modifiés pour augmenter encore la résolution temporelle.

L'utilisation de 3D-FRAP permetLa comparaison de la perméabilité GJ au miARN dans des conditions différentes. Pour démontrer cela, nous avons induit un knockdown induit par siRNA de Cx43, conduisant à une réduction de l'expression des protéines ( Figure 3C ) et à l'inhibition de la communication entre jonctions. En conséquence, la récupération de fluorescence a été réduite de plus de 50%, ce qui indique que l'efficacité du transfert d'ARNm dépend fortement de l'étendue du couplage par jonction entre les cellules ( Figure 3B , Cx43 knockdown). Pour confirmer que la récupération de fluorescence reflète le passage du miARN marqué par fluorescence, plutôt que le marqueur détaché Dy547, nous avons également acquis des données FRAP pour le colorant de calcéine ( Figure 3D ). La calcéine a une masse moléculaire comparable à celle de Dy547 et possède donc une dynamique de transfert similaire. Contrairement à la récupération par fluorescence du miARN marqué par Dy547, la calcéine a démontré un échange croisé d'intersection élargi, ce qui indique que le tag Dy547 iS n'est pas détaché de la molécule d'ARNm ( Figure 3D ).

Des conditions de concentration stables sont obligatoires tout au long d'une expérience FRAP, surtout lorsque des mesures à long terme sont effectuées. Par rapport aux applications 2D, 3D-FRAP peut compenser la dérive potentielle du focus. Comme le montre la figure 4 , même de légers changements de focalisation affectent la détection correcte du signal de fluorescence du miRNA lorsque seule une seule couche 2D est utilisée pour l'expérience FRAP ( Figure 4B ). En revanche, pour 3D-FRAP, toute une pile z de la cellule cible est enregistrée et les projections maximales sont soumises à l'analyse des données ( Figure 4A ). L'impact de la dérive d'orientation sur une courbe d'intensité de fluorescence normalisée est représenté à la figure 4C . Alors que la récupération de fluorescence augmente régulièrement au fil du temps en 3D-FRAP, l'acquisition de 2D-FRAP entraîne une baisse oF le signal de fluorescence.

Outre la compensation des changements de mise au point, 3D-FRAP fournit également des données spatiales sur l'échange de jonction entre le miRNA. La figure 5 montre un rendu de surface 3D d'une expérience FRAP. Par rapport aux projections maximales, l'acquisition de piles z peut être utilisée pour créer des reconstructions en 3D pour étudier la localisation et la mobilité du miARN dans les cellules ( Figure 5 ). Le co-étiquetage avec les organites permettra d'enquêter sur l'implication d'autres composants cellulaires dans le transfert de miARN.

Figure 1
Figure 1: Images microscopiques représentatives de cardiomyocytes isolés néonatals. ( A ) La microscopie d'illumination structurée montre l'expression élevée de Cx43, qui s'accumule en grand pLaques aux frontières cellulaires (pointes de flèches). La formation prononcée de GJ avec des cellules adjacentes permet un échange étendu de petites molécules, y compris le miARN. Barre d'échelle = 20 μm ( B ) Pureté des cardiomyocytes isolés. L'étiquetage de l'α-actinine démontre que les cardiomyocytes représentent le type de cellule majeur après l'isolement. Barre d'échelle = 50 μm. Les cellules ont été colorées avec des anticorps anti-Cx43 (verts) et anti-α-actinine (rouge). Les noyaux ont été visualisés en utilisant DAPI (bleu). Une description de la microscopie d'illumination structurée et de l'étiquetage immunologique est fournie dans une publication précédente 20 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2: Efficacité de la transfection, viabilité , Et la densité cellulaire de la culture cardiomyocytaire néonatale. ( A ) La cytométrie de flux a révélé que l'électroporation par miR547 a entraîné une efficacité de transfection de ~ 45%. ( B ) Viabilité cellulaire des cardiomyocytes utilisés pour le FRAP. Après l'isolement, l'électroporation et le rattrapage, les cardiomyocytes ont été soumis à une coloration cellulaire vivante et morte et ont démontré une viabilité cellulaire élevée. ( C ) Image microscopique de cardiomyocytes transfectés au mir547 préparés pour la microscopie FRAP. Une densité cellulaire de 80-90% assure la formation prononcée des contacts cellulaires-cellules de jonction gap. Barre d'échelle = 50 μm. Un procédé pour l'analyse cytométrique en flux d'efficacité de transfection et la coloration de viabilité est mentionné dans les publications précédentes 20 , 21 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 3: Echange de miARN dépendant de GJ chez les cardiomyocytes néonatals. ( A ) Images représentatives d'une expérience FRAP. Après la transfection avec le miARN marqué, les cellules cibles dans un groupe de cellules sont photoblanchées par une forte impulsion laser (pré-blanchiment par rapport à l'eau de Javel). En fonction de l'étendue du couplage par jonction de l'intervalle, l'afflux de jonction de l'intervalle d'ARNm des cellules adjacentes entraîne une augmentation de l'intensité de fluorescence dans les cellules ciblées blanchies (post-blanchiment t = 3, 6, 9 et 13 min). Barre d'échelle = 20 μm ( B ) L'analyse quantitative des données de FRAP acquises montre une récupération de fluorescence de 20% après 13 min. Pour confirmer l'implication des GJ dans le transfert intercellulaire du miARN, un knockdown cx43 a été effectué, entraînant une forte diminution de la récupération de la fluorescence (50%). ( C ) Immunomarquage avec anti-Cx43L'anticorps et la microscopie confocale subséquente démontrent l'efficacité du knockdown Cx43 au niveau de la protéine. Barre d'échelle = 50 μm. ( D ) La comparaison des données FRAP de miR547 et du colorant de calcéine montre les différentes dynamiques de transfert. Le poids moléculaire plus petit de la calcéine a entraîné une augmentation de la récupération de fluorescence par rapport aux molécules de miARN marquées par dy547. Les courbes FRAP résument les données de n ≥56 cellules, exprimées en moyenne ± SEM. L'analyse statistique a été réalisée en utilisant l'ANOVA bidirectionnelle suivie du test post-hoc de Bonferroni (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4: Compensation de la dérive de l'accent grâce à la microscopie 3D-FRAP. ( B ) Les images représentatives d'une cellule photoblanchée (ligne rouge) démontrent l'impact de la dérive de l'accent sur l'intensité de fluorescence pendant les expériences 3D et 2D-FRAP. ( A ) En 3D-FRAP, les piles z sont enregistrées pour chaque point de temps, et les projections maximales sont utilisées pour l'analyse des données, ce qui corrige la dérive de la mise au point. Barre d'échelle = 20 μm. ( B ) En revanche, pour 2D-FRAP, une seule couche 2D est soumise à une analyse de données. Ainsi, l'intensité globale de la fluorescence est profondément réduite par des changements dans le foyer. Barre d'échelle = 20 μm. ( C ) Les courbes d'intensité de fluorescence représentatives représentées par les expériences 3D et 2D-FRAP indiquent l'effet important de la dérive de la mise au point sur la récupération de la fluorescence et montrent les avantages de l'acquisition en 3D lors de l'étude de la transmission de l'ARNm intercellulaire. Cliquez ici pour voir une plus grande version deEst une figure.

Figure 5
Figure 5: Rendement de surface 3D d'une expérience 3D-FRAP. (Gauche) Projections maximales d'une mesure FRAP. La cellule photoblanchée (cadre rouge) démontre une augmentation de l'intensité de fluorescence due au transfert d'ARNm à partir de cellules adjacentes. (Droite) Les piles z acquises de la même cellule photoblanchée (rouge) ont été soumises à un rendu de surface 3D pour visualiser la distribution spatiale du miARN. Barre d'échelle = 20 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

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Les miARN sont des acteurs clés de la physiologie cellulaire et ont été considérés comme des molécules de signalisation en utilisant entre autres les GJ comme voie d'échange intercellulaire 11 , 12 , 22 . Le protocole actuel présente une technique in vitro d'imagerie par cellule vivante pour caractériser ce transfert GJ-dependant en utilisant des ARNm fluorescents dans des grappes de cellules.

Le protocole a été développé sur les cardiomyocytes en tant que système modèle cellulaire. Cependant, cette approche peut être appliquée à plusieurs types de cellules si l'électroporation est une méthode appropriée pour la transfection des ARNm. En plus de l'échange cellulaire à cellule, la technique présentée est également appropriée pour étudier la mobilité intracellulaire des molécules d'ARNm ( par exemple, pour l'identification des mécanismes de transport possibles dans la cellule) 23 , 24 .

"L'étude du transfert de miARN par microscopie FRAP requiert des molécules d'ARNm marquées par fluorescence ( figure 2 ). Comme l'étiquetage des micro-ARNs cellulaires spécifiques n'est pas réalisable, seul le miARN marqué insecte exogène peut être utilisé pour 3D-FRAP pour analyser sa mobilité intercellulaire Dans nos expériences, les cellules ont été transfectées avec un miARN de 250 nM. Cette concentration était beaucoup plus élevée par rapport aux conditions physiologiques, où le niveau d'ARNm varie de 10 à 50 000 molécules par cellule 27,28 . De telles concentrations faibles ne peuvent pas être utilisées dans les expériences de FRAP, Comme un certain niveau de molécules d'ARNm fluorescentes est nécessaire pour obtenir un signal de fluorescence suffisant et pour assurer une discrimination adéquate entre la fluorescence d'arrière-plan et le miARN marqué par fluorescence. Cependant, selon le système d'imagerie confocal et les propriétés de colorant, l'utilisation des concentrations d'ARNm à faible -nM gamme devrait être possible pour les tests FRAP. </ P>

Différentes techniques sont couramment utilisées pour étudier le transfert de miARN intercellulaire, y compris les analyses de cytométrie en flux, de PCR et de rapporteurs de luciférase 12 , 13 . Ces méthodes détectent le transfert de miRNA avec une faible résolution temporelle ( c.-à-d. Heures à jours). En revanche, la microscopie 3D-FRAP permet la visualisation et la quantification du transfert de micro-ARN et de la mobilité en temps réel. En plus des contacts cellulaires à cellules de jonction gap, le transfert intercellulaire du miRNA est également médié par d'autres mécanismes, tels que les exosomes 18 , 29 , 30 . Seul le 3D-FRAP fournit une résolution temporelle suffisamment élevée pour discriminer le transfert de jonction exosomal et gap. Ainsi, il permet une étude spécifique de l'effet direct de la perméabilité GJ sur la signalisation des miARN sous différentes conditions pathologiques ou physiologiques ( FiguRe 2).

Nous recommandons l'utilisation de 3D-FRAP, qui est supérieur au 2D-FRAP conventionnel, car il fournit des données plus précises sur le transfert de miARN dépendant de GJ. Les mesures 3D-FRAP comprennent le volume total de la cellule, ce qui est important lors de l'utilisation de types de cellules à grande masse. En outre, il peut compenser les changements de focus ou les mouvements cellulaires, ce qui a montré une diminution significative de la récupération de fluorescence dans 2D-FRAP ( Figure 3 ). Enfin, l'enregistrement des piles z dans les expériences 3D-FRAP offre la possibilité d'obtenir des informations spatiales, ce qui n'est pas réalisable lorsqu'une seule couche 2D est utilisée pour l'analyse des intensités de fluorescence ( figure 3B ).

Puisque la récupération de fluorescence dépend de l'afflux de miARN provenant de cellules adjacentes, le nombre de cellules connectées à la cellule blanchie est critique et doit être similaire dans différentes mesures pour obtenir des données fiables. Par conséquent, une forte densité cellulaire nécessiteD pour assurer la formation de grappes cellulaires les plus adaptées à l'analyse FRAP. En outre, des expériences préliminaires doivent être effectuées pour sélectionner des conditions de blanchiment doux ( c.-à-d. , Puissance du laser, temps de blanchiment et paramètres de balayage) pour éviter les effets phototoxiques provoqués par une forte intensité laser 25 , 26 . Cela aidera également à réduire le photoblanchage qui se produit au cours de la procédure d'acquisition.

Malgré les limites, nos données montrent que 3D-FRAP est un outil puissant pour évaluer le rôle des miRNA comme molécules de signalisation dans un réseau cellulaire. L'impact de la composition de connexine sur le transfert de miRNA ou la perméabilité sélective des GJ pour des miARN spécifiques peut être abordé avec la quantification directe de l'efficacité du transport. 3D-FRAP peut fournir des informations importantes pour améliorer le développement de nouvelles thérapies mettant en vedette miARN et siRNA, par exemple en définissant des conditions appropriées qui facilitent la distributionN de petits ARN via le réseau GJ 31 , 32 .

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le Ministère fédéral de l'Education et de la Recherche Allemagne (FKZ 0312138A et FKZ 316159), l'État Mecklembourg-Poméranie occidentale avec les Fonds structurels de l'UE (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 et ESF / IVBM-B35-0010 / 12), le DFG (DA1296-1) et la Fondation allemande des cœurs (F / 01/12). En outre, RD est soutenu par le programme FORUN du Centre Médical de l'Université Rostock (889001), la Fondation DAMP et le BMBF (VIP + 00240).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
neonatal NMRI mice Charles River
Gelatin Sigma Aldrich G7041 0.1% solution in PBS, sterilized
PBS Pan Biotech P04-53500
Dulbecco´s modified medium Pan Biotech P04-03550
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 100 U/mL, 100µg/mL
Fetal bovine serum Pan Biotech P30-3306
Cell culture plastic TPP
Primary Cardiomyocyte Isolation Kit Thermo Fisher Scientific 88281
HBSS Thermo Fisher Scientific 88281 included in primary cardiomyocyte isolation kit
Trypan blue Thermo Fisher Scientific 15250061
miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic Dharmacon CP-004500-01-05 dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM
Sodium phosphate monobasic Sigma S3139
Sodium phosphate dibasic Carl Roth T877.2
Potassium chloride Sigma P9333
Magnesium chloride Serva 28305.01
Sodium succinate Carl Roth 3195.1
0.05% Trypsin/EDTA solution Merck L2153
4-well- Glass bottom chamber slides IBIDI 80827 coat with 0.1% gelatin solution
Amaxa Nucleofector II Lonza program G-009 was used for Electroporation 
LSM 780 ELYRA PS.1 system Zeiss
Excel software Microsoft
α-actinin antibody Abcam ab9465 dilution 1:200
Connexin43 antibody Santa Cruz sc-9059 dilution 1:200
goat anti-mouse Alexa 594 antibody Thermo Fisher Scientific A-11005 dilution 1:300
goat anti-rabbit Alexa 488 antibody Thermo Fisher Scientific A-11034 dilution 1:300
Connexin43 siRNA Thermo Fisher Scientific AM16708 ID158724 final concentration 250 nM
Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
CellTrace Calcein Red-Orange Thermo Scientific C34851
DAPI nuclear stain Thermo Scientific D1306

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Analyse du Gap Junction-dependent Transfert de miARN avec microscopie 3D-FRAP
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Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy. J. Vis. Exp. (124), e55870, doi:10.3791/55870 (2017).More

Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy. J. Vis. Exp. (124), e55870, doi:10.3791/55870 (2017).

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