Summary
Denna metod används för att identifiera isoform-specifika hämmare av Histon deacetylases (HDAC) i HeLa celler av UHPLC-MS analys av flera substrat. Detta är en antikropp-fri metod utvecklats för att spegla HDAC1 och HDAC6 aktivitet i levande cellen miljö, i motsats till singel-isoform cellfria analyser.
Abstract
Sökandet efter nya Histon histondeacetylas (HDAC)-hämmare får allt större intresse för läkemedelsutveckling. Isoform selektivitet har varit i rampljuset sedan godkännande av romidepsin, en klass jag HDAC-hämmare för cancerbehandling, och den kliniska utredningen av HDAC6-specifika hämmare för multipelt myelom. Denna metod används för att bestämma den hämmande effekten av test föreningar på HDAC1 och HDAC6 i celler. Isoform aktiviteten mäts med den extremt högpresterande vätskekromatografi – masspektrometri (UHPLC-MS) analys av specifika substrat inkuberas med behandlat och obehandlat HeLa cells. Metoden har fördelen av reflekterande endogena HDAC aktiviteten inom cellen miljön, i motsats till cellfria biokemiska analyser utförda på isolerade isoformer. Dessutom eftersom den är baserad på kvantifiering av syntetiskt substrat, kräver metoden inte antikropp erkännande av endogena acetylerade proteiner. Det är lätt att anpassa till flera cellinjer och en automatiserad process. Metoden har redan visat sig användbart att finna HDAC6-selektiv föreningar i neuroblasts. Representativa resultat visas här med den standard HDAC-hämmare trichostatin en (icke-specifik), MS275 (HDAC1-specifik), och tubastatin en (HDAC6-specifik) använder HeLa cells.
Introduction
HDAC tillhör en familj av enzymer kan deacetylate histoner inom kromatinstruktur. De också har andra protein substrat i cytosolen och är belägna i olika cell fack. Sammanlagt 18 HDAC isoformer har identifierats hittills och har anknytning till flera cell mekanismer, inklusive regleringen av transkriptionsfaktorer och genuttryck, samt cellsignalering och transportera1,2,3,4,5,6,7. HDAC katalytisk hämmare har dykt upp som potentiella terapeutiska läkemedel för cancerbehandling. De flesta HDAC-hämmare för närvarande godkänts av FDA är för behandling av T-cells lymfom och multipelt myelom, och icke-specifik HDAC-hämmare, såsom vorinostat (SAHA), belinostat och panobinostat8,9. Dock ett antal biverkningar har förknippats med pan-hämmare, och sökandet efter isoform-specifika små molekyler är ett hett ämne i medicinsk kemi och drug discovery. Följaktligen klassen jag (HDAC1-3 och HDAC8) selektiv hämmare romidepsin är en redan godkända läkemedel10, medan HDAC6-specifika hämmare är för närvarande under kliniska prövningar, med ökad terapeutisk potential i multipelt myelom11,12,13,14,15.
Screening analyser för att karakterisera HDAC är hämmare baserad på inkubering av en HDAC substrat med en enzymatisk källa (enda isoform, nukleära extrakt eller cell lysate). Substratet är oftast en liten peptid sekvens innehållande en acetyl lysin rester kopplad till en cleavable fluorophore (t.ex. kumarin), såsom N-(4-methyl-7-aminocoumarinyl)-Nα-(t-butoxycarbonyl)-Nω-acetyllysineamide (MAL)16. För att skilja mellan isoform-specifika aktiviteter, separat cellfria analyser som rör varje isoform är nödvändiga och kanske inte återspeglar den verkliga isoform aktiviteten i levande celler. Isoform-specifika substrat finns kommersiellt tillgängliga, såsom bensyl (S)-[1-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)-5-propionylaminopentyl]carbamate (MOCPAC, HDAC1 särskilda substrat) och (S)-[5-acetylamino-1-(2-oxo-4-trifluoromethyl-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)pentyl]carbamic acid tert-butyl ester (BATCP, HDAC6 särskilda substrat) (figur 1B). Emellertid kommer en multi substrat blandning som innehåller MAL, MOCPAC och BATCP ges till levande celler inte tillåta detektion av de enskilda deacetylated produkterna med fluorometric mätning, med tanke på att de bär samma cleavable fluorophore.
Den metod som beskrivs här möjliggör detektering och relativ kvantifiering av varje substrat och dess deacetylated produkt i HeLa cells använder en multi substrat assay följt av UHPLC-ESI-MS/MS analys17. Ett HDAC-test utförs på HeLa cells aktivera direkt identifiering av HDAC hämmande aktivitet och specificitet test föreningar på endogena HDAC. Det finns ett fokus på HDAC1 och HDAC6, som utvärderas samtidigt. För att uppnå dessa enzymatisk mätningar i en enda inkubation-analys, tillsätts en blandning av ospecifika och specifika HDAC substrat behandlat och obehandlat HeLa cells pläterade på en plattan med 96 brunnar. Efter en inkubation steg, är celler lyserat för att släppa substratesna och deras respektive reaktionsprodukter, vilka skiljs åt och detekteras med hjälp av en UHPLC-MS metod (figur 1 c). Deacetylated produkter av de MAL, MOCPAC och BATCP substratesna är deacetylated MAL (dMAL), deacetylated MOCPAC (dMOCPAC) och deacetylated BATCP (dBATCP), respektive. Dos-responskurvor kan byggas med aktiva föreningar.
Figur 1: systematik för cellbaserade HDAC analysen att identifiera HDAC1 - och HDAC6-specifika hämmare av UHPLC-MS analys av flera substrat. (A) systemet av en typisk plattan med 96 brunnar innehållande behandlas (test föreningar) och obehandlade (kontroll) HeLa celler, samt cellfria blankvärden. (B) kemisk struktur av substrat tillsätts som en blandning (21 µM varje) vara deacetylated av endogena HDAC. (C) typiska UHPLC-MS kromatogrammet visar topparna av de tillagda substratesna (MAL, MOCPAC och BATCP) och deras deacetylated produkter (dMAL, dMOCPAC, och dBACTP, respektive). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cell kultur
Obs: Följande steg utförs i en standard vävnadsodling huva. Förtrogenhet med steril teknik förväntas.
- Kultur HeLa cells till 80% konfluens i en T75 cell kultur kolv i MEM kompletteras med 10% fetalt bovint serum, penicillin G (100 U/mL), och streptomycin (100 mg/mL).
Obs: Cell kultur, behandling och lysis steg genomförs under laminärt flöde, med cell inkubationsstegen vid 37 ° C utförs i en fuktad atmosfär av 5% CO2 under sterila förhållanden. - Tvätta cellerna två gånger med 5 mL av DPBS, aspirera i DPBS och tillsätt 1 mL av cell dissociation reagens. Inkubera vid 37 ° C i 5 min till lossa cellerna.
- Tillsätt 9 mL MEM odlingssubstratet noggrant Omsuspendera cellsuspensionen och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer.
- Justera tätheten av cellsuspensionen till 6 x 104 celler/mL i MEM.
- Tillsätt 100 µL cellsuspension i kontroll och testa brunnarna i en steril, platt botten, vävnadsodling-behandlade plattan med 96 brunnar (figur 1A).
- Tillsätt 100 µL av MEM odlingsmedium till tomma brunnar i plattan med 96 brunnar (figur 1A).
- Inkubera i plattan med 96 brunnar vid 37 ° C under 24 h.
Obs: En 24 h inkubation är en lämplig tid att testa för endogena HDAC aktivitet i HeLa cells. Olika celltyper med okänd HDAC aktivitet kan behöva en timecourse utvärdering av kontroll celler.
2. cellen behandling med Test föreningar och HDAC substrat
- Aspirera på medellång från brunnarna av plattan med 96 brunnar.
- Tillsätt 25 µL av 2 x test föreningar (t.ex. trichostatin A, MS275 och tubastatin A) i MEM att testa brunnar. Tillsätt 25 µL av MEM kontroll och tomma brunnar.
Obs: Koncentrationen av test föreningar är justeras för att ge ett intervall av minst 5 slutlig koncentration (en koncentration per brunn). DMSO slutliga koncentration i testet förening bör inte överstiga 0,5% och bör vara samma i varje brunn, inklusive blanksteg och kontroller. Slutlig inkubering volymen är 50 µL per brunn. Trichostatin A är testad vid 5 koncentrationer, från 500 till 1,95 nM (1:4 spädning). MS275 och tubastatin A testas på 5 koncentrationer från 8.000 till 6.17 nM (1:6 spädning). Den önska slutliga testkoncentrationen för varje test förening bör fastställas av varje enskild användare genom att skapa en dos-respons kurva. - Tillsätt 25 µL av substrat blandningen (42 µM MAL, 42 µM av MOCPAC och 42 µM av BATCP i MEM) kontroll och test brunnar. Tillsätt 25 µL av MEM tomma brunnar.
Obs: Den slutliga koncentrationen av varje substrat är 21 µM. MOCPAC och BATCP skilja mellan HDAC1 och HDAC6 aktivitet, respektive (figur 1B). När ingen aktivitet observeras med dessa substrat, kan användning av MAL potentiellt leda till identifiering av aktivitet mot en annan HDAC-isoform. - Inkubera i plattan med 96 brunnar vid 37 ° C i 8 h i en fuktad 5% CO2 inkubator.
Obs: Denna inkubationstid är lämplig för HeLa cells och tillåter den endogena HDAC att interagera med de syntetiska substratesna. Olika cellinjer kan kräva justeringar i inkubation tid och/eller substrat koncentrationen.
3. cell Lysis och provberedning för UHPLC-ESI-MS/MS
Varning: Provberedningssteg Använd organiska kemikalier som är mycket brandfarligt och giftigt vid förtäring eller inandning. Bära lämplig personlig skyddsutrustning som handskar och skyddsglasögon.
- Tillsätt 10 µL av 6 x RIPA buffert (utspädd från 10 x RIPA buffert) kompletterad med proteashämmare till varje brunn plattan med 96 brunnar.
- Stoppa reaktionen genom att lägga till 160 µL kallt acetonitril till varje brunn och blanda genom pipettering upp och ner.
Obs: Håll acetonitril vid-20 ° C innan detta steg. - Placera plattan i-80 ° C frys i ca 10 min.
- Avlägsna plattan från frysen och överföra 220 µL av innehållet i varje brunn till en icke-sterila, konisk-(V-botten) 96 brunnar bottenplatta. Centrifugera plattan på 5 000 x g och 4 ° C i 10 min.
Obs: Detta steg syftar till att undanröja proteiner och salter. Om det behövs kan lösningar överföras till enskilda koniskt centrifugrör före centrifugering eller filtreras genom en uppsättning 96 brunnar, 0,65 µm PVDF filter plattor. Framgångsrika avlägsnande av fällningen krävs före UHPLC analys. - Över 200 µL av supernatanten (eller filtratet) till en kompatibel med systemet UHPLC plattan med 96 brunnar och försegla det med avdragbar, värmeförsegling folie med hjälp av en tallrik sealer.
Obs: Undvik pipettering pellets när du tar bort supernatanterna. Om UHPLC analysen inte kan utföras omedelbart, kan plattan lagras vid 4 ° C i högst 24 h tills analys.
4. UHPLC/MS-MS-analys
- Förbereda UHPLC systemet genom att fylla det med mobila fassystem (95% A:5% B):
A: H2O, HPLC-kvalitet, som innehåller 0,1% myrsyra (Förbered 1 L)
B: acetonitril, HPLC-kvalitet, som innehåller 0,1% myrsyra (Förbered 1 L).
Varning: Den mobila fasen innehåller organiska kemikalier som är mycket brandfarligt och giftigt vid förtäring eller inandning. Bära lämplig personlig skyddsutrustning som handskar och skyddsglasögon. - Placera plattan med 96 brunnar i provet chefen som innehåller en tallrik hållare. Kör exemplen enligt de UHPLC-ESI-MS/MS villkor som anges i tabell 1.
Obs: Varje kolumn i den analytiska plattan med 96 brunnar bör ha en kontroll väl och en tom brunn (som skildras i plattan systematik figur 1A). Kontroller är representativa för 100% enzymaktivitet i den testade cellinje, medan blanks är där för att kontrollera huruvida MS källan ger enhetlig bakgrund. Ovanlig MS toppar upptäcks i en viss tom bör utredas för att förhindra MS känslighet ändringar.
5. dataanalys
- Integrera topparean för varje substrat och dess deacetylated produkt med en lämplig UHPLC integration programvara.
Obs: Använd automatisk integrering parametrar med en utslätande metod (medelvärde, fönsterstorlek 3 och antalet slät 2, till exempel). Använder de gaskromatografiska förhållanden som anges i tabell 1, är eluering ordningen dMAL (5,8 min), dBATCP (6,0 min), dMOCPAC (6,2 min), MAL (7,6 min), MOCPAC (8,9 min) och BATCP (9,8 min), som avbildas i figur 1 c. - För varje substrat, beräkna peak förhållandet (deacetylated/acetylerade) i varje kromatogram (test- och prover).
- Beräkna en hämning av HDAC av varje prov:
Obs: HDAC1 hämning beräknas med hjälp av toppareorna för dMOCPAC/MOCPAC; HDAC6 hämning beräknas med dBATCP/BATCP. Det baserat dMAL/MAL kan användas för att uttrycka allmänna HDAC hämning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Att visa att metoden att identifiera icke-selektiva och selektiva hämmare för HDAC1 (klass I) och HDAC6 (klass IIb), HeLa cells behandlades med standard substanser: trichostatin A (icke-selektiva mellan HDAC1 och HDAC6)18, MS275 (HDAC1-selektiv hämmare)19och tubastatin en (HDAC6-selektiva hämmare)20. Genom att använda denna metod (figur 1), IC50 värden kunde fastställas direkt i levande celler för HDAC1 (genom att titta på MOCPAC deacetylering) och för HDAC6 (genom att titta på BATCP deacetylering) (figur 2). Trichostatin A var en potent men icke-selektiva hämmare mot HDAC1 och HDAC6. Å andra var MS275 selektiv för HDAC1, medan tubastatin A var tydligt selektiv för HDAC6.
Figur 2: IC50 dos-respons kurvor samtidigt erhålls för HDAC1 och HDAC6 av tre standard HDAC-hämmare: den icke-selektiva trichostatin A, den HDAC1-selektiv MS275 och den HDAC6-selektiv tubastatin A. IC50 värden presenteras i tabellen intill är det medelvärde ± SD av tre oberoende mätningar. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Injektionsvolym | 5 ΜL |
| Kolumn | C18 (2,6 μm, 100 x 3 mm i.d.) |
| Kolonntemperatur | 40 ° C |
| Eluering flöde | 0,8 mL/min (typiska Tryckområde: 400-600 barer) |
| Eluering övertoning | 5-45% B i 10 min |
| 45-98% B i 2 min | |
| TVÄTTNINGSSTEGET | 98% B för 2 min |
| Balanserande steg | 5% B för 4 min |
| ESI-MS/MS | Cone spänning, 30 V; Kapillär matningsspänning, 3,0 kV; Kapillär temperatur, 350 ° C, Källa temperatur, 120 ° C; skidan gas - kväve (600 L/h). kollision gastryck, argon inställd på 3 x 10-3 mbar |
| Kollision parametrar och reaktion kanaler optimerad med en uppehållstid på 0,1 s, 0,01 s interscan förseningar och kollision energi satt till 20 eV. | |
| MAL detektion med massa övergångar 446 → 346 (MAL) och 404 → 304 (dMAL). | |
| MOCPAC detektering med massa övergångar 494 → 449 (MOCPAC) och 439 → 394 (dMOCPAC). | |
| BATCP detektering med massa övergångar 500 → 400 (BATCP) och 476 → 376 (dBATCP). |
Tabell 1: UHPLC-ESI-MS/MS villkor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HDAC hämning är ett hett ämne i läkemedelsutveckling, med nuvarande fokus på HDAC6-selektiva hämmare för cancer behandling21. HDAC selektivitet bedöms vanligtvis genom en serie av hög genomströmning, cell-gratis analyser, som avser att fastställa hämmande potens mot enskilda HDAC isoformer21. Dock en hämmare selektivitet dessutom måste bekräftas i levande celler genom att utvärdera statusen acetylering av endogen protein substrat, såsom histoner (för klass I HDAC) och tubulin (för HDAC6). Därför cell analyser som rör antikropp erkännande (t.ex. immunfärgning, western blot, flödescytometri och ELISA) är oftast nödvändigt för att uppnå en kvantitativa eller Halvkvantitativa utvärdering av isoform styrka av en viss förening i levande celler21. Det är inte ovanligt att en förening som var selektiv i en cell-fri enzymatisk analys visar sig vara icke-selektiva i celler eller vävnader17,22, och vice versa19. Detta kan förklaras av skillnader i icke-standardiserade enzymatisk källor och avsaknad av co-faktorer eller protein partners i biokemiska analyser21.
Den metod som beskrivs här är en snabb, antikropp-fria alternativ som möjliggör direkt mätning av klass I (HDAC1) och klass IIb (HDAC6) hämmande potens i levande cellen miljö17. En annan fördel med metoden är att det enkelt kan anpassas till olika cellinjer, såsom neuroblasts23, med möjlighet för miniatyrisering och automation, som tidigare beskrivits för andra cellbaserade analyser24. Påvisande av specifik substrat av masspektrometri bidrar till korrekt mätning av de deacetylated produkter, som ger jämförbara kvantitativa resultat. Detta är den första tillgängliga metoden för att fastställa IC50 värden mot specifika HDAC isoformer i levande celler. Som en jämförelse, icke-kvantitativa selektiva profilen av HDAC-hämmare observeras av western blot har visats vara i linje med den selektivitet profil som erhållits med metod beskrivs här17. Även om denna metod har utvecklats för upptäckten av nya klass-selektiva HDAC-hämmare, skulle det också kunna tillämpas för att mäta HDAC aktivitet inom cellmodeller under loppet av en sjukdom. Detta skulle kunna bidra till förtydligandet av epigenetiska och molekylära mekanismer i relevanta sjukdomar och potentiellt kunde identifiera läkemedelskandidater. Med tanke på extrapolerar denna metod mot HDAC isoformer än HDAC1 och HDAC6, är utvecklingen av nya selektiva HDAC substrat starkt uppmuntras. Dessutom bör substrat specificitet MOCPAC och BATCP vara fullt karaktäriseras i termer av inriktning enda isoformer. Faktiskt, medan MOCPAC är klassificerad som en HDAC1-specifika substrat (klass I över klass II), det är mer troligt att det är en generisk klass I substrat (inklusive HDAC3 isoform), som tidigare visats25. BATCP är därför en välkänd HDAC6-selektiva substrat (klass II över klass I HDAC), men dess särart gentemot andra klass II HDAC, såsom HDAC4, förtjänar ytterligare karakterisering25.
Enzymatisk aktivitet kan variera beroende på cellinje, cell nummer, konfluens och inkubation tid. När en cell fodrar används för första gången i analysen, är det viktigt att testa ett intervall av substrat koncentrationer i kontroll celler, vid olika tidpunkter, att analysera enzymkinetik av UHPLC-MS (t.ex. genom en Michaelis-Menten tomt). Detta gör att forskare att välja lämpligaste inkubation tid och substrat koncentrationen. Detta val är beroende av två stora parametrar: 1) enzymkinetik och (2) upptäckt av substratesna och deacetylated produkter. När man analyserar enzymkinetik, är det viktigt att utvärdera de inledande hastighet-värdena (dvs. när produkten bildandet är inom det linjära området) att upprätta enzymkinetik. Enligt kinetik, bör substrat koncentrationer under Km väljas för att ge en korrekt procentsats för hämning, särskilt när det gäller konkurrenskraftiga och konkurrenskraftig hämmare26. Valda substrat koncentrationen bör däremot, ger påvisbara och kvantifierbara MS signaler till både substrat och den deacetylated produkt (signal-brusförhållande ≥20)17. När du använder flera substrat, bör den kromatografiska metoden säkerställa separationen av alla topparna ska analyseras. Alternativa kromatografiska system kan kräva ändringar i separation lutning och kolumn typ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner kostnad åtgärden CM1406 (epigenetiska kemisk biologi). Forskning som redovisas i denna publikation stöds av stiftelsen Pierre Mercier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BATCP | Sigma-Aldrich | B4061 | |
| MAL | Sigma-Aldrich | SCP0168 | Synonym: BOC-Ac-Lys-AMC |
| MOCPAC | Sigma-Aldrich | M2195 | |
| MS275 | Sigma-Aldrich | EPS002 | |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich | T8552 | |
| Tubastatin A | Sigma-Aldrich | SML0044 | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | 10660131 | |
| Formic acid, LC/MS grade | Fisher Scientific | 10596814 | |
| H2O, HPLC grade | distilled H2O filtered through a Milli-Q purification system | ||
| HeLa cells | ATCC | ATCC CRM-CCL-2 | |
| Cell dissociation reagent TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | |
| DMSO, cell culture grade | Applichem | 146463 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1810 | |
| MEM | ThermoFisher Scientific | 22561021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Bioconcept | 4-01F00-H | |
| 10x RIPA buffer | Abcam | ab156034 | |
| SigmaFast protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| 96-well plates, sterile, flat-bottom, tissue culture treated Corning | VWR | 29442-058 | |
| 96-well plates, non-sterile, V-bottom Corning | VWR | 29442-404 | used in the centrifugation step |
| 96-well plate, conical bottom, Nunc | ThermoFisher Scientific | 249944 | compatible with the Acquity UHPLC system |
| T75 cell culture flasks Corning | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| Peelable heat sealing foil | Waters | 186002789 | |
| Acquity UPLC system | Waters | ||
| Eppendorf Centrifuge 5810 R | Fisher Scientific | 05-413-323 | |
| Integration software: MassLynx V4.1 | Waters | Catalog number not available | |
| Combi thermo-sealer SP-0669/240 | Waters | Catalog number not available | |
| Quattro micro API Tandem Quadrupole System | Waters | Catalog number not available |
References
- Arrowsmith, C. H., Bountra, C., Fish, P. V., Lee, K., Schapira, M. Epigenetic protein families: a new frontier for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 11 (5), 384-400 (2012).
- Henikoff, S., Greally, J. M. Epigenetics, cellular memory and gene regulation. Curr Biol. 26 (14), R644-R648 (2016).
- Kim, C., et al. HDAC6 inhibitor blocks amyloid beta-induced impairment of mitochondrial transport in hippocampal neurons. PLoS One. 7 (8), (2012).
- Kawaguchi, Y., et al. The deacetylase HDAC6 regulates aggresome formation and cell viability in response to misfolded protein stress. Cell. 115 (6), 727-738 (2003).
- Zhao, Y., et al. Acetylation of p53 at lysine 373/382 by the histone deacetylase inhibitor depsipeptide induces expression of p21(Waf1/Cip1). Mol Cell Biol. 26 (7), 2782-2790 (2006).
- Berger, S. L. Histone modifications in transcriptional regulation. Curr Opin Genet Dev. 12 (2), 142-148 (2002).
- Simões-Pires, C., et al. HDAC6 as a target for neurodegenerative diseases: what makes it different from the other HDACs? Mol Neurodegener. 8 (7), 1-16 (2013).
- Mottamal, M., Zheng, S., Huang, T. L., Wang, G. Histone deacetylase inhibitors in clinical studies as templates for new anticancer agents. Molecules. 20 (3), 3898-3941 (2015).
- Manal, M., Chandrasekar, M. J., Gomathi Priya, J., Nanjan, M. J. Inhibitors of histone deacetylase as antitumor agents: A critical review. Bioorg Chem. 67, 18-42 (2016).
- Mack, G. S. To selectivity and beyond. Nat Biotech. 28 (12), 1259-1266 (2010).
- U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-1215 alone and in combination with bortezomib and dexamethasone in multiple myeloma (ACY-1215). , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01323751 (1211).
- U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-1215 in combination with lenalidomide, and dexamethasone in multiple myeloma. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01583283 (2012).
- U.S. National Institutes of Health. 13ACY-1215 (ricolinostat) in combination with pomalidomide and low-dose dex in relapsed-and-refractory multiple myeloma. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01997840 (2013).
- U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-241 alone and in combination with pomalidomide and dexamethasone in multiple myeloma. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02400242 (2015).
- Yee, A. J., et al. Ricolinostat plus lenalidomide, and dexamethasone in relapsed or refractory multiple myeloma: a multicentre phase 1b trial. Lancet Oncol. 17 (11), 1569-1578 (2016).
- Jung, M. Homogenous non-isotopic assays for histone deacetylase activity. Expert Opin Ther Pat. 13 (6), 935 (2003).
- Zwick, V., Simões-Pires, C., Cuendet, M. Cell-based multi-substrate assay coupled to UHPLC-ESI-MS/MS for a quick identification of class-specific HDAC inhibitors. J Enzyme Inhibi Med Chem. 31 (1), 209-214 (2016).
- Khan, N., et al. Determination of the class and isoform selectivity of small-molecule histone deacetylase inhibitors. Biochem J. 409 (2), 581-589 (2008).
- Glaser, K. B., et al. Differential protein acetylation induced by novel histone deacetylase inhibitors. Biochem Biophys Res Commun. 325 (3), 683-690 (2004).
- Butler, K. V., et al. Rational design and simple chemistry yield a superior, neuroprotective HDAC6 inhibitor, tubastatin A. J Am Chem Soc. 132 (31), 10842-10846 (2010).
- Jung, M., Yong, K. -J., Velena, A., Lee, S. Cell-Based Assays for HDAC Inhibitor Hit Validation. Epigenetic Targets in Drug Discovery. Sippl, W., Jung, M. , Wiley-VCH. (2010).
- Milli, A., et al. Proteomic analysis of cellular response to novel proapoptotic agents related to atypical retinoids in human IGROV-1 ovarian carcinoma cells. J Proteome Res. 10 (3), 1191-1207 (2011).
- Zwick, V., et al. Synthesis of a selective HDAC6 inhibitor active in neuroblasts. Bioorg Med Chem Lett. 26 (20), 4955-4959 (2016).
- Ciossek, T., Julius, H., Wieland, H., Maier, T., Beckers, T. A homogeneous cellular histone deacetylase assay suitable for compound profiling and robotic screening. Anal Biochem. 372 (1), 72-81 (2008).
- Heltweg, B., Dequiedt, F., Marshall, B. L., Brauch, C., Yoshida, M., et al. Subtype selective substrates for histone deacetylases. J Med Chem. 47 (21), 5235-5243 (2004).
- Copeland, R. A. Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery. , Wiley. (2005).
