Summary
Il presente metodo serve a identificare isoforma-specifici inibitori dell'istone deacetilasi (HDAC) in cellule HeLa dall'analisi UHPLC-MS di substrati multipli. Questo è un metodo privo di anticorpi sviluppato per riflettere l'attività HDAC1 e HDAC6 del vita ambiente cellulare, in contrasto con le analisi senza cellula singola isoforma.
Abstract
La ricerca di nuovi inibitori delle istone deacetilasi (HDAC) è di crescente interesse nella scoperta della droga. Isoforma selettività è stato sotto i riflettori dopo l'approvazione del romidepsina, una classe ho HDAC inibitore per la terapia del cancro e l'indagine clinica degli inibitori HDAC6-specifico per il mieloma multiplo. Il presente metodo è utilizzato per determinare l'attività inibitoria di sostanze da testare su HDAC1 e HDAC6 nelle cellule. L'attività dell'isoforma è misurata usando la cromatografia liquida ultra-high-performance – analisi di spettrometria di massa (UHPLC-MS) di specifici substrati incubati con cellule HeLa trattate e non trattate. Il metodo ha il vantaggio di riflettere l'attività HDAC endogena all'interno dell'ambiente di cella, in contrasto con analisi senza cellula biochimiche condotte su isoforme isolato. Inoltre, perché si basa sulla quantificazione dei substrati sintetici, il metodo non richiede il riconoscimento anticorpale di proteine endogene acetilati. È facilmente adattabile a diverse linee cellulari e un processo automatizzato. Il metodo ha già dimostrato utile nella ricerca di composti HDAC6-selettiva in neuroblasti. Risultati rappresentativi sono indicati qui con standard HDAC inibitori tricostatina A (non-specifico), MS275 (HDAC1-specifica), e tubastatin un (HDAC6-specifico) utilizzando cellule HeLa.
Introduction
HDAC appartengono ad una famiglia di enzimi in grado di deacetilano gli istoni all'interno della struttura della cromatina. Hanno anche altri substrati della proteina nel citosol e si trovano in vari compartimenti cellulari. Un totale di 18 HDAC isoforme sono state identificate finora e sono stati collegati con parecchi meccanismi delle cellule, compreso la regolazione di fattori di trascrizione e l'espressione genica, come pure la segnalazione delle cellule e trasporto1,2,3,4,5,6,7. Inibitori HDAC catalitici sono emersi come terapeutici potenziali farmaci per la terapia del cancro. La maggior parte delle HDAC inibitori attualmente approvati dalla FDA sono per il trattamento di linfoma a cellula T ed il mieloma multiplo e sono inibitori HDAC aspecifici come vorinostat (SAHA), belinostat e panobinostat8,9. Tuttavia, una serie di effetti collaterali sono stati associati con gli inibitori di pan, e la ricerca di piccole molecole isoforma-specifici è un tema caldo nella scoperta di droga e chimica medicinale. Di conseguenza, la classe ho romidepsina inibitore selettivo (HDAC1-3 e HDAC8) è un farmaco già approvato10, mentre gli inibitori HDAC6-specific sono attualmente oggetto di studi clinici, con maggiore potenziale terapeutico in mieloma multiplo11,12,13,14,15.
Lo screening di saggi per caratterizzare HDAC inibitori sono basati sull'incubazione di un substrato HDAC con un'origine enzimatica (singola isoforma, estratto nucleare o lysate delle cellule). Il substrato è solitamente una sequenza del peptide di piccole dimensioni contenente un residuo di lisina acetil accoppiato ad un fluoroforo spaccabili (ad es., cumarina), ad esempio N-(4-methyl-7-aminocoumarinyl)-Nα-(t-butoxycarbonyl)-Nω-acetyllysineamide (MAL)16. Per distinguere tra attività isoforma-specifici, analisi senza cellula separate che coinvolgono ciascuna isoforma sono necessari e potrebbero non riflettere l'attività dell'isoforma reale in cellule viventi. Isoforma-specifici substrati sono commercialmente disponibili, come benzilico (S)-[1-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)-5-propionylaminopentyl]carbamate (MOCPAC, HDAC1 specifico substrato) e (S)-[5-acetylamino-1-(2-oxo-4-trifluoromethyl-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)pentyl]carbamic acid tert-butile (BATCP, HDAC6 substrato specifico) (Figura 1B). Tuttavia, una miscela di multi-substrata contenente MAL, MOCPAC e BATCP dato alle cellule viventi non permetterà la rilevazione dei singoli prodotti deacetylated da fluorometrica misurazione, dato che essi portano il fluoroforo spaccabili stesso.
Il metodo qui descritto consente la rilevazione e quantificazione relativa di ogni substrato ed il suo prodotto deacetylated in cellule HeLa usando un'analisi multi-substrata seguita da UHPLC-ESI-MS/MS analisi17. Un'analisi HDAC è condotto su cellule HeLa per consentire l'identificazione diretta di attivita ' inibitoria e della specificità della prova composti endogeni HDACs. C'è un focus su HDAC1 e HDAC6, che vengono valutati contemporaneamente. Per ottenere queste misurazioni enzimatiche in un'analisi di incubazione singola, una miscela di substrati HDAC aspecifici e specifici è aggiunto ai trattati e non trattate cellule HeLa placcate su una piastra a 96 pozzetti. A seguito di una fase di incubazione, le cellule vengono lisate per rilasciare i substrati ed i loro prodotti di reazione rispettiva, che sono separati e rilevato usando un metodo UHPLC-MS (Figura 1). I prodotti deacetylated dei substrati MAL, MOCPAC e BATCP sono il MAL deacetylated (dMAL), deacetylated MOCPAC (dMOCPAC) e deacetylated BATCP (dBATCP), rispettivamente. Curve dose-risposta possono essere costruite con composti attivi.
Figura 1: schema generale per il saggio HDAC basati su celle a identificare gli inibitori specifici HDAC1 e HDAC6 dall'analisi dei substrati multipli UHPLC-MS. (A) schema di una tipica piastra a 96 pozzetti contenenti trattati (test composti) e cellule HeLa non trattati (controllo), nonché spazi vuoti senza cellula. (B) struttura chimica dei substrati aggiunti come una miscela (21 µM ciascuna) per essere viene desacetilato agli acidi di HDACs endogeno. (C) UHPLC-MS tipico cromatogramma mostrando le cime dei substrati aggiunto (MAL, MOCPAC e BATCP) e loro prodotti deacetylated (dMAL, dMOCPAC e dBACTP, rispettivamente). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Protocol
1. coltura cellulare
Nota: I seguenti passaggi vengono eseguiti in una cappa di coltura di tessuti standard. Familiarità con tecnica sterile è previsto.
- Coltura di cellule HeLa al confluency di 80% in un matraccio di cultura cellulare T75 in MEM completati con 10% siero bovino fetale, penicillina G (100 U/mL) e la streptomicina (100 mg/mL).
Nota: Cultura, il trattamento e passaggi di lisi delle cellule sono condotti sotto flusso laminare, con fasi di incubazione delle cellule a 37 ° C, eseguite in atmosfera umidificata di 5% CO2 in condizioni sterili. - Lavare le cellule due volte con 5 mL di DPBS, aspirare il DPBS e aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione delle cellule. Incubare a 37 ° C per 5 min staccare le cellule.
- Aggiungere 9 mL di terreno di coltura MEM, accuratamente Risospendere la sospensione cellulare e contare le celle utilizzando un emocitometro.
- Regolare la densità della sospensione delle cellule a 6 x 104 cellule/mL in MEM.
- Aggiungere 100 µ l di sospensione cellulare di controllo e test dei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti sterile, fondo piatto, coltura del tessuto-trattati (Figura 1A).
- Aggiungere 100 µ l di terreno di coltura MEM a vuoti pozzetti della piastra 96 pozzetti (Figura 1A).
- Incubare la piastra a 96 pozzetti a 37 ° C per 24 h.
Nota: Un'incubazione di 24 ore è un tempo adatto per verificare l'attività endogena di HDAC in cellule HeLa. Diversi tipi di cellule con attività di HDAC sconosciuto potrebbero essere necessario una valutazione timecourse delle cellule di controllo.
2. cell trattamento con sostanze da testare e substrati HDAC
- Aspirare il mezzo dai pozzetti della piastra 96 pozzetti.
- Aggiungere 25 µ l di sostanze da testare: 2x (ad es., tricostatina A, MS275 e tubastatin A) in MEM di pozzi di prova. Aggiungere 25 µ l di MEM per controllo e pozzetti del bianco.
Nota: La concentrazione delle sostanze da testare è quello di essere regolato per fornire un intervallo di almeno 5 concentrazioni di prova finale (una concentrazione per pozzetto). La concentrazione finale di DMSO nel composto in esame non dovrebbe superare lo 0,5% e dovrebbe essere la stessa in ciascun pozzetto, compresi spazi vuoti e i controlli. Il volume di incubazione finale è di 50 µ l per pozzetto. Trichostatin A è stato testato in 5 concentrazioni che variano da 500 a 1,95 nM (diluizione 1:4). MS275 e tubastatin A sono testati a 5 concentrazioni che variano da 8.000 a 6,17 nM (diluizione 1:6). La concentrazione di prova finale desiderata per ogni sostanza in esame dovrebbe essere determinata da ogni singolo utente creando una curva dose-risposta. - Aggiungere 25 µ l della miscela substrato (42 µM di MAL, 42 µM di MOCPAC e 42 µM di BATCP in MEM) nei pozzetti di controllo e prova. Aggiungere 25 µ l di MEM per pozzetti del bianco.
Nota: La concentrazione finale di ogni substrato è 21 µM. MOCPAC e BATCP distinguere tra attività HDAC1 e HDAC6, rispettivamente (Figura 1B). Quando nessuna attività è osservata con quei substrati, l'uso di MAL potenzialmente potrebbe portare all'identificazione di attività contro un'altra isoforma HDAC. - Incubare la piastra a 96 pozzetti a 37 ° C per 8 h in un 5% umidificata incubatore a CO2 .
Nota: Questo tempo di incubazione è adatto per le cellule HeLa e permette le HDAC endogena di interagire con i substrati sintetici. Diverse linee cellulari possono richiedere adattamenti nella concentrazione di substrato e/o di tempo di incubazione.
3. cellula Lisi e preparazione del campione per UHPLC-ESI-MS/MS
Attenzione: La procedura di preparazione del campione utilizza prodotti chimici organici, che sono altamente infiammabile e tossico per ingestione o inalazione. Indossare adeguata protezione personale, come guanti e occhiali di sicurezza.
- Aggiungere 10 µ l di buffer di x RIPA 6 (diluito da 10 x RIPA buffer) completati con inibitore della proteasi in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti.
- Bloccare la reazione aggiungendo 160 µ l di acetonitrile freddo in ciascun pozzetto e Miscelare pipettando su e giù.
Nota: Tenere l'acetonitrile a-20 ° C prima di questo passaggio. - Posizionare la piastra in un congelatore-80 ° C per 10 min.
- Rimuovere il piatto dal freezer e trasferire 220 µ l del contenuto di ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti non sterili, fondo conico (fondo V). Centrifugare la piastra a 5.000 x g e a 4 ° C per 10 min.
Nota: Questo passaggio mira a rimuovere le proteine e sali. Se necessario, le soluzioni possono essere trasferite ai tubi singoli conica per centrifuga prima della centrifugazione o filtrate attraverso una serie di 96 pozzetti, piastre filtranti di 0,65 µm PVDF. La rimozione di successo del precipitato è richiesta prima dell'analisi UHPLC. - Trasferire 200 µ l di supernatante (o filtrato) in una piastra a 96 pozzetti compatibile con il sistema UHPLC e sigillare con un foglio pelabile, termosaldatura, utilizzando un foglio sigillante.
Nota: Evitare di pipettaggio il pellet quando si rimuove i sovranatante. Se l'analisi UHPLC non può essere eseguita immediatamente, la piastra possa essere memorizzata a 4 ° C per un massimo di 24 h fino all'analisi.
4. UHPLC/MS-MS Analysis
- Preparare il sistema UHPLC riempiendolo con il sistema della fase mobile (95% A:5% B):
R: H2O, HPLC-grado, contenente acido formico 0.1% (preparare 1 L)
B: Acetonitrile, HPLC-grado, contenente acido formico 0.1% (preparare 1L).
Attenzione: La fase mobile contiene prodotti chimici organici, che sono altamente infiammabile e tossico per ingestione o inalazione. Indossare adeguata protezione personale, come guanti e occhiali di sicurezza. - La gestione di esempio contenente un portatarga, inserire la piastra a 96 pozzetti. Eseguire i campioni secondo le condizioni di UHPLC-ESI-MS/MS indicati nella tabella 1.
Nota: Ogni colonna della piastra 96 pozzetti analitica dovrebbe avere un controllo del bene ed un pozzetto vuoto (come raffigurato nello schema di Figura 1Apiastra). I controlli sono rappresentante del 100% di attività enzimatica nella linea cellulare testata, mentre gli spazii in bianco sono lì per verificare se l'origine di MS stia fornendo sfondo coerenza. Insolito MS picchi rilevati in un determinato campo vuoto dovrebbero essere studiati per impedire i cambiamenti di sensibilità di MS.
5. analisi dei dati
- Integrare l'area del picco di ogni substrato ed il suo prodotto deacetylated con un software di integrazione UHPLC appropriato.
Nota: Utilizzare i parametri di integrazione automatica con un metodo smoothing (media, dimensione della finestra 3 e numero di liscio 2, ad esempio). Utilizzando le condizioni cromatografiche indicate nella tabella 1, l'ordine di eluizione è dMAL (5,8 min), dBATCP (6,0 min), dMOCPAC (6,2 min), MAL (7,6 min), MOCPAC (8,9 min) e BATCP (9,8 min), come illustrato nella Figura 1. - Per ogni substrato, calcolare il rapporto tra area di picco (viene desacetilato agli acidi/acetilato) in ogni cromatogramma (campioni di controllo e test).
- Calcolare l'inibizione di HDAC percentuale di ciascun campione da testare:
Nota: HDAC1 inibizione viene calcolata utilizzando il rapporto tra area di picco di dMOCPAC/MOCPAC; HDAC6 inibizione viene calcolata con dBATCP/BATCP. Il rapporto dMAL/MAL può essere utilizzato per esprimere generale inibizione di HDAC.
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Representative Results
Per illustrare l'applicazione del metodo all'identificazione di inibitori selettivi e non selettivi per HDAC1 (classe I) e HDAC6 (classe IIb), le cellule HeLa sono state trattate con composti standard conosciuti: tricostatina A (non-selettivi tra HDAC1 e HDAC6)18, MS275 (HDAC1-selettivo inibitore)19e tubastatin (HDAC6-selettivo inibitore)20. Utilizzando il presente metodo (Figura 1), valori di IC50 potrebbero essere direttamente determinati in cellule viventi per HDAC1 (osservando deacetilazione MOCPAC) e per HDAC6 (osservando deacetilazione BATCP) (Figura 2). Trichostatin A era un inibitore potente ma non selettivi verso HDAC1 e HDAC6. D'altra parte, MS275 era selettivo per HDAC1, mentre tubastatin A era chiaramente selettivo per HDAC6.
Figura 2: IC50 Dose-response curve ottenute simultaneamente per HDAC1 e HDAC6 di tre inibitori HDAC standard: il non-selettivi tricostatina A, il MS275 HDAC1-selettivo e la HDAC6-selettiva tubastatin r. IC50 valori presentati in tabella adiacente sono la media ± SD di tre misurazioni indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Volume di iniezione | 5 ΜL |
| Colonna | C18 (2,6 μm, 100 mm x 3 mm di diametro interno) |
| Temperatura della colonna | 40 ° C |
| Portata di eluizione | 0,8 mL/min (range tipico pressione: 400-600 bar) |
| Gradiente di eluizione | B 5-45% in 10 min |
| 45-98% B in 2 min | |
| Ciclo di lavaggio | 98% B per 2 min |
| Passo riequilibranti | 5% B per 4 min |
| ESI-MS/MS | tensione di cono, 30 V; tensione di fonte capillare, 3.0 kV; temperatura capillare, 350 ° C; temperatura di origine, 120 ° C; guaina gas - azoto (600 L/h); pressione del gas di collisione, argon impostato su 3 x 10-3 mbar |
| Parametri di collisione e canali di reazione ottimizzati con un tempo di sosta di 0,1 s, 0.01 s interscan ritardi ed energia di collisione impostato a 20 eV. | |
| Rilevamento di MAL con massa transizioni 446 → 346 (MAL) e 404 → 304 (dMAL). | |
| Rilevamento di MOCPAC con massa transizioni 494 → 449 (MOCPAC) e 439 → 394 (dMOCPAC). | |
| Rilevamento di BATCP con transizioni massa 500 → 400 (BATCP) e 476 → 376 (dBATCP). |
Tabella 1: Condizioni UHPLC-ESI-MS/MS.
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Discussion
Inibizione di HDAC è un tema caldo nella scoperta della droga, con un focus corrente su HDAC6-selettivi per cancro terapia21. Selettività HDAC solitamente è valutata da una serie di saggi di alto-rendimento, senza cellula, che intende determinare la potenza inibitoria verso singoli HDAC isoforme21. Tuttavia, la selettività di un inibitore deve essere ulteriormente confermata in cellule viventi valutando lo stato di acetilazione di substrati di proteine endogene, quali gli istoni (per la classe I HDACs) e tubulina (per HDAC6). Di conseguenza, delle cellule saggi che coinvolgono riconoscimento anticorpale (ad es., immunostaining, western blot, citometria a flusso ed ELISA) sono in genere necessarie per ottenere una valutazione quantitativa o semiquantitativa dell'isoforma potenza di un determinato composto in vita cellule21. Non è raro che un composto che era selettivo in un dosaggio enzimatico senza cellula risulta per essere non-selettivi in cellule o tessuti17,22e vice versa19. Ciò può essere spiegato da differenze nelle fonti enzimatiche non standardizzati e assenza di co- fattori di o partner di proteina in saggi biochimici21.
Il metodo qui descritto è un'alternativa rapida, privo di anticorpo permettendo per la misura diretta di classe I (HDAC1) e classe IIb (HDAC6) potenza inibitoria nella vita delle cellule ambiente17. Un altro vantaggio del metodo è che può essere facilmente adattato a diverse linee cellulari, come ad esempio neuroblasti23, con la possibilità per la miniaturizzazione e l'automazione, come descritto in precedenza per altre analisi cell-based24. La rilevazione di specifici substrati mediante spettrometria di massa contribuisce all'accurata misurazione dei prodotti deacetylated, fornendo risultati quantitativi comparabili. Questo è il primo metodo disponibile per determinare i valori di IC50 verso specifiche isoforme di HDAC in cellule viventi. Come una questione di confronto, il profilo selettivo non quantitativi di inibitori HDAC osservato mediante western blot sono stati dimostrati per essere in linea con il profilo di selettività ottenuto con il metodo qui descritto17. Anche se questo metodo è stato sviluppato per la scoperta di nuovi inibitori di HDAC di classe-selettiva, potrebbe anche essere applicato per misurare l'attività HDAC all'interno di modelli cellulari nel corso di una malattia. Questo potrebbe contribuire alla delucidazione dei meccanismi epigenetici e molecolari nelle malattie rilevanti e potenzialmente in grado di identificare candidati farmaci. In considerazione di estrapolando questo metodo verso HDAC isoforme diverse da HDAC1 e HDAC6, lo sviluppo di nuovi substrati HDAC selettivi è fortemente incoraggiato. Inoltre, la specificità di substrato di MOCPAC e BATCP dovrebbe essere completamente caratterizzata in termini di singole isoforme di targeting. Infatti, mentre MOCPAC è classificato come un substrato HDAC1-specifici (classe I classe II), è più probabile che sia un generico substrato (tra cui isoforma di HDAC3), come precedentemente dimostrato25di classe I. Di conseguenza, BATCP è un ben noto substrato selettivo HDAC6 (classe II classe oltre I HDACs), ma la sua specificità verso altre classe II HDACs, quali HDAC4, merita ulteriore caratterizzazione25.
L'attività enzimatica può differire secondo la linea cellulare, cellula numero, confluenza e incubazione tempo. Quando una linea cellulare viene utilizzata per la prima volta nell'analisi, è importante verificare un intervallo di concentrazioni nel substrato in cellule di controllo, in diversi momenti, per analizzare la cinetica enzimatica di UHPLC-MS (ad es., attraverso una trama di Michaelis-Menten). Questo permetterà ai ricercatori di scegliere la più idonea concentrazione tempo e substrato di incubazione. Questa scelta si basa su due parametri principali: 1) la cinetica enzimatica e 2) la rilevazione dei substrati e loro prodotti deacetylated. Quando l'analisi cinetica degli enzimi, è essenziale per valutare i valori della velocità iniziale (cioè, quando la formazione di prodotto è all'interno della gamma lineare) per stabilire la cinetica enzimatica. Secondo la cinetica, le concentrazioni di substrato sotto Km dovrebbero essere scelti per fornire una precisa percentuale di inibizione, soprattutto nel caso di inibitori competitivi e non competitivi26. D'altra parte, la concentrazione di substrato scelto dovrebbe fornire segnali di MS rilevabili e quantificabili per sia il substrato ed il prodotto deacetylated (signal-to-noise ratio ≥ 20)17. Quando si utilizza più substrati, il metodo cromatografico dovrebbe garantire la separazione di tutti i picchi da analizzare. Sistemi cromatografici alternativi possono richiedere modifiche il tipo di sfumatura e colonna di separazione.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono COST Action CM1406 (epigenetici Chemical Biology). Ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dalla Fondazione Pierre Mercier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BATCP | Sigma-Aldrich | B4061 | |
| MAL | Sigma-Aldrich | SCP0168 | Synonym: BOC-Ac-Lys-AMC |
| MOCPAC | Sigma-Aldrich | M2195 | |
| MS275 | Sigma-Aldrich | EPS002 | |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich | T8552 | |
| Tubastatin A | Sigma-Aldrich | SML0044 | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | 10660131 | |
| Formic acid, LC/MS grade | Fisher Scientific | 10596814 | |
| H2O, HPLC grade | distilled H2O filtered through a Milli-Q purification system | ||
| HeLa cells | ATCC | ATCC CRM-CCL-2 | |
| Cell dissociation reagent TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | |
| DMSO, cell culture grade | Applichem | 146463 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1810 | |
| MEM | ThermoFisher Scientific | 22561021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Bioconcept | 4-01F00-H | |
| 10x RIPA buffer | Abcam | ab156034 | |
| SigmaFast protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| 96-well plates, sterile, flat-bottom, tissue culture treated Corning | VWR | 29442-058 | |
| 96-well plates, non-sterile, V-bottom Corning | VWR | 29442-404 | used in the centrifugation step |
| 96-well plate, conical bottom, Nunc | ThermoFisher Scientific | 249944 | compatible with the Acquity UHPLC system |
| T75 cell culture flasks Corning | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| Peelable heat sealing foil | Waters | 186002789 | |
| Acquity UPLC system | Waters | ||
| Eppendorf Centrifuge 5810 R | Fisher Scientific | 05-413-323 | |
| Integration software: MassLynx V4.1 | Waters | Catalog number not available | |
| Combi thermo-sealer SP-0669/240 | Waters | Catalog number not available | |
| Quattro micro API Tandem Quadrupole System | Waters | Catalog number not available |
References
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