ODELAY: En storskala metode for kvantitativ kvantifisering av gjærvekst

Summary

Vi presenterer en metode for å kvantifisere vekstfenotyper av individuelle gjærceller etter hvert som de vokser inn i kolonier på faste medier ved bruk av tidsforskjellsmikroskopi betegnet, En-celledubblende evaluering av levende arrays of yeast (ODELAY). Befolknings heterogenitet av genetisk identiske celler som vokser til kolonier, kan observeres og kvantifiseres direkte.

Abstract

Vekstfenotyper av mikroorganismer er en sterk indikator på deres underliggende genetiske egenskaper og kan segregeres i 3 vekstregimer: lagfase, logfase og stasjonær fase. Hver vekstfase kan avsløre ulike aspekter av kondisjon som er relatert til ulike miljømessige og genetiske forhold. Høyoppløselige og kvantitative målinger av alle 3 faser av vekst er generelt vanskelig å oppnå. Her presenterer vi en detaljert metode for å karakterisere alle 3 vekstfaser på solid media ved hjelp av en analyse som heter En-celledubbling Evaluering av Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY kvantifiserer vekstfenotyper av individuelle celler som vokser til kolonier på fast media ved bruk av tidsforskyvningsmikroskopi. Denne metoden kan direkte observere populasjons heterogenitet med hver vekstparameter i genetisk identiske celler som vokser til kolonier. Denne populasjons heterogeniteten gir et unikt perspektiv for forståelse av genetisk og epigenetisk regulering og respons påGenetiske og miljømessige forstyrrelser. Mens ODELAY-metoden er demonstrert ved bruk av gjær, kan den benyttes på enhver kolonidannende mikroorganisme som er synlig ved lyse feltmikroskopi.

Introduction

Vekstfenotyper av mikroorganismer er en sterk indikator på deres underliggende genetiske egenskaper til en gitt miljøtilstand. Veksten er klassisk segregert i 3 forskjellige vekstregimer: lagfase, logfase og stasjonær fasevekst ¹ . Hver vekstfase kan avsløre ulike aspekter av kondisjon som er avhengig av ulike miljømessige og genetiske forhold. For eksempel kan lagringstid eller lengden på tiden en organisme bruker i lagfase før begynnelsen av eksponentiell vekst, være indikativ for en organismes evne til å reagere på endrede miljøforhold ² . Doblingstid under logfasevekst, den vanligste metriske for cellulær kondisjon, avslører den samlede effektiviteten til en organisasjons evne til å dele seg ved å metabolisere og bruke miljømaterialer til replikasjon. Stasjonær fase, der veksten etter logfase raskt reduseres, er en annen indikator på kondisjon, som er vanligBrukes som et vekstendepunkt i spotbaserte gjærvækstanalyser.

Flere gjærvækstanalyser er for tiden tilgjengelige og anses som standardmetoder for å evaluere vekstfenotyper i gjær ^{3 , 4 , 5} . Disse analysene er hovedsakelig basert på metoder for voksende gjær, enten på fast eller i flytende medier. På faste medier overfører koloni-pinningsanalyser et lite antall celler til fast agar med en pinne, og gjærceller får vokse i en bestemt tidsperiode. Kolonier blir deretter avbildet og deres størrelser sammenlignes ved et terminal endepunkt ⁶ . Disse kolonibestemmingsanalysene har vist seg robuste og skalerbare for å generere gjennomsiktige skjermbilder. Mer nylig har periodisk avbildning ved bruk av flatbed-skannere og kameraer med enkelt-linserefleks (SLR) blitt innarbeidet i disse analysene for å registrere koloni vekst over tid ^{7 , 8, 9} . Oppløsningen av disse enhetene forhindrer imidlertid dem i å detektere enkeltceller, og disse koloni-pinning-analysene observerer ikke direkte lagtid og kan ikke observere variasjon mellom de enkelte cellene som vokser inn i kolonier.

Væskebaserte vekstanalyser har også vært benyttet for å utføre genom-brede skjermbilder ³ . Kobling av en væskevækstassay med tidsforskjellmikroskopi avslørte populasjons heterogenitet i fordoblingstiden for genetisk identiske individuelle celler, som gir et viktig perspektiv for forståelse av genetisk regulering og miljøtilpasning. Imidlertid måler denne analysen ikke andre aspekter av vekst slik som forsinkelsestid og bæreevne ¹⁰ . Her presenterer vi en metode for å karakterisere alle tre vekstfaser av kolonidannende mikroorganismer på fast medium ved hjelp av en analyse vi betegner ODELAY ¹¹ . ODELAY består av utiliZing high-through time-lapse mikroskopi for å ta opp bilder av enkeltceller som vokser inn i kolonier på solid media. Denne populasjonen av individuelle celler som vokser inn i kolonier, avslører den underliggende populasjons heterogeniteten, som ikke oppdages av andre mindre følsomme målinger som terminal endepunktscore. Vi demonstrerer metoden på gjær, men ODELAY kan brukes på enhver organisme som viser kontrast i lysfeltmikroskopi.

Protocol

1. Fremstilling av agarosegelbestand

1. Veier 2 g agarose med høy renhet.
2. Legg agarosen til en 500 ml flaske og registrer deres samlede masse.
3. Beregn målmassen på flasken pluss 2 g agarose med 150 g ultra rent vann, og tilsett deretter 150 g ultra rent vann til innenfor 0,1 g av denne målmassen.
4. Merk massen av flasken pluss agarose og vann.
5. Plasser flasken i en mikrobølgeovn og sørg for å plassere flasken med en løs hette på toppen for å minimere vanndamping mens du oppvarmer agarosen.
6. Mikrobølgen flasken i 15 - 20 s bursts etterfulgt av kort swirling flasken for å blande agarose og vann. Gjenta denne prosedyren til løsningen kokes og blandingen er homogen.
   FORSIKTIG: Pass på å unngå skylling av huden med damp som kommer ut av flasken. Også flasken vil bli varm, og passende beskyttelse, som for eksempel en autoklavhanske, er nødvendig for å unngå skade.
7. Etter at den smeltede agarosen er homogen, veier flasken igjen og tilsett ultralitt vann til 0,1 g av den opprinnelige massen. Dette vil erstatte vann som er tapt på grunn av fordampning.
8. Før den smeltede agarosen størkner, virvel for å blande i det tilsatte vannet for å sikre homogenitet.
9. Aliquot 15,2 g agarose i 9 - 50 ml plastrør.
10. Kjøl rørene til det trengs.

2. Forbereder ODELAY Agarose Media

1. Varm 400 ml deionisert vann til å koke i et overdekket beger på en kokeplate under forsiktig omrøring med magnetisk omrøringsstang.
2. Tilsett 2 ml 10X medier ( f.eks . Gjærkstraktpepton (YEP) eller komplett tilsetningsstoffblanding (CSM)) til en 15,2 g agarosalikvot i et 50 ml konisk rør fra trinn 1.10.
   MERK: CSM-medium har en tendens til å holde seg til glassglassene. Hvis du bruker CSM media formuleringer, tilsett 5 μL 50% wt polyetylenglykol (PEG) i sterilt vann til mediumformuleringen. PEG forhindrer aGar fra å stikke til glassglassene under muggfrigivelse og hindrer ikke gjærvekst.
3. Legg til ytterligere 100X næringsstoffer, hvis nødvendig, og bruk vann for å bringe totalt tilsatt volum fra dette trinnet til 1 ml.
4. Vei agarosalikoten med tilsatte medier og kosttilskudd før du plasserer det 50 ml koniske rør i kokende vann fra trinn 2.1.
5. Etter 16 min, ta ut 50 ml røret og homogeniser blandingen ved hjelp av en hvirvel. Hold lokket festet tett på 50 ml konisk rør.
   MERK: Et deksel på begeret bidrar til å varme hele røret jevnt ellers vil en film av solid agarose danne og muligens ikke smelte. Også i løpet av denne tiden er det praktisk å montere agaroseformen ( figur 1 ).
6. Homogeniser blandingen ved hjelp av en hvirvel.
7. Kok i ytterligere 2 minutter for å sikre at alle agarene blandes og smelter.
8. Vektrør og erstatt masse som er tapt med ultra-rent sterilt vann.
9. Tilsett 2 ml 10X karbon-surCe reagens ( f.eks . 20% vekt / volum glukose) og hvirvel for å oppnå agarosemediumoppløsning.
   MERK: Separasjon av glassglass: Ved montering av formen må det tas hensyn til at de lange avstandsstykkene plasseres i formen med riktig orientering. Dette skyldes at når laseren kutter akryl, har den en tendens til å kutte som en kjegle som forlater delen med litt vinklede sider i stedet for nøyaktig 90 ° sider. Så når formen er plassert på benken for å frigjøre glasset fra agar, skal kanten av spaceren være i skarp vinkel med agar. Den akutte vinkelen bidrar til å komprimere agarets kant bort fra det øvre glassstykket, idet formkroppens ytre kant svinges om den nedre kanten (se figur 1 ). Resultatet er en mer konsistent separasjon av agar fra toppstykket glass.
   MERK: Muggfrigøringsmidler på glasset som oljer, silisiumsprayer eller til og med kommersielle vindubehandlinger bør ikke brukes fordi de vil forurense s Agarets overflate og muligens hemmer veksten. Disse metodene tar litt øvelse for å være konsistente.
10. Rengjør fire 2 i x 3 i x 1 mm tykke glassrør med 70% etanol og tørk med tvungen luft.
11. Rengjør akrylformene med 70% etanol, tørk og sett sammen som vist på figur 1 . Ta de tre bunnstykkene, som vist, og sett dem sammen slik at de to identiske brikkene smelter det tredje stykket ( figur 1B ). Klem basisstykkene på hver side ved hjelp av to små klemmeklemmer ( figur 1C ). Plasser stolpene inn i formen, og kontroller at laserskinnen er riktig plassert ( Figur 1E ).
12. Plasser den rensede og tørkede glidelåsen på formen og hold den på plass mens du plasserer et andre glidelås på den andre siden. Klem forsamlingen med et større bindemiddelklips ( Figur 1D ). Klem ned begge lysbildene med større bindemiddelklemmer (Lass = "xfig"> Figur 1D). Pass på at det øvre bindemiddelklipset er i kontakt med glassruten overlappende med akryl.
13. Legg til resterende bindemiddelklemmer. Igjen, kontroller at klemmene kontakter lysbildet der det overlapper akrylet ( Figur 1D ).
    MERK: Før du fyller den sammenstøpte formen med smeltet agar, sørg for at kantene er forseglet ved pipettering av ca. 70 μl smeltet agarmedium langs den indre siden av formen. Denne agaren vil raskt størkne og forhindre eventuelle lekkasjer.
14. Fyll støpeformen med smeltet agar, pass på at du unngår fettluftbobler i formen.
    MERK: Dette kan oppnås ved langsom pipettering av den smeltede agar langs formen av formen. Etter at den er fylt, la molden avkjøles i 40 minutter til 1 time ved ca. 23 ° C omgivelsestemperatur. Hvis det får lov å avkjøle for lenge, kan agaret bryte i formen.
    MERK: Mold Separation: Riktig fjerning av formen fra støpt agar er viktig for å sikre et jevnt fast stoffAgarpute for gjærvekst. Unnlatelse av effektiv separering av formen ved dette trinnet vil forårsake vekstforskjeller som skyldes ufullkommenhet i den faste agarpute. Øvelse av dette trinnet noen ganger anbefales.
15. Begynn med å fjerne det nederste bindemiddelklipset. Fjern den nederste delen av formen som består av de tre smørbrødene. Hold lysbildene ved å komprimere dem og fjern deretter bindemiddelklipsene. Pass på at du ikke støter på støpeformene når du fjerner bindemiddelklipsene. Dette vil deformere media.
16. Legg støpeformen på kanten av benkplaten slik at siden av formen med den blå prikken vender opp og i nedre venstre hjørne ( Figur 1E ). Plasser tommelen under akryl og fingeren på toppen mot forkanten av formen.
17. Skyv langsomt og forsiktig opp med tommelen mot formen, som om du dreier formeavstanden rundt den nedre kanten ( Figur 1F ). Påfør konstantMen sakte økende press. Brukere vil se en pause og luftboble vises langs linjen der toppglasset dekker støpeformeren.
18. Etter å ha sett den første linjen, fortsett å skyve opp med tommelen og påføre konstant trykk. Agar skal begynne å bryte seg bort fra glasset på dette punktet ( Figur 1F ). Fortsett å dreie formen oppover. Dette vil løfte glasset uten å skyve det. En linje der agaren skreller bort fra glasset, bør fortsette å bevege seg bort fra den opprinnelige bruddlinjen.
    MERK: På dette punktet holder agarene seg til både bunnen og toppen av glasset. Dette vil noen ganger skje med venstre kant. Så lenge området deformert ikke er i området der gjær er oppdaget, bør dette være bra.
19. Da glasset kommer helt fri, ta det og fjern det helt fra formen. Deretter fjerner du det andre støpestykket med en tilsvarende bevegelse for å løfte stykket fritt uten å bevege agaret. Plasser lysbildene i enSteril tipsboks med litt sterilt vann med høy renhet i bunnen. Lukk boksen og oppbevar ved 4 ° CO / N for bruk neste dag. Hvis lagret i lengre tid, vil vekstratene bli inkonsekvente.

3. ODELAY Culture Preparation

1. Legg ut stammer i en 96-brønn plate for O / N vekst.
2. Neste dag, fortynn 20 μl av nattkultur i 200 μl medium for 220 μl totalt volum i en ny plate.
3. Mål den optiske tettheten ved 600 nm (OD600) av hver kultur i en plateleser. Bruk en plateavleser og en flytende håndteringsrobot, følg den automatiske fortynningsprotokollen i trinn 3.3.1 - 3.3.6. Manuell fortynning av kulturer i platen til ca. 0,1 OD600 (valgfritt).
   1. På plateleseren, trykk "Eksperiment" under "Opprett ny". Velg ODELAYDilution.exp og kjør eksperimentet. Skriv inn eksperimentnavn som ODELAY "Date" "Time" "Experiment Name" iterasjon.
   2. Klikk på sTatistikk kategorien og klikk deretter på ikonet Excel. Lagre dataene til en tommelen og overfør den til en flytende håndteringsrobot datamaskin.
   3. Åpne Robotens Layout and Method Editor. Åpne Metodefilen "ODELAYDilution_v1.med". Kjør Executable "Convert_SynergyFiles.exe". Angi 0,09 for mål OD600.
   4. Klikk på "Glu Correction" og "Gal Correction" til 0.05. Mål blanke medier i en identisk plate. Klikk på "Generer fil". Velg filen i metodeditoren. Klikk på stopplysikonet for å starte metoden for å åpne kjøretidsfortynningsprogrammet.
   5. Sørg for at rørene ikke er tilkoblet, og platene har lokkene fjernet og støvdekslene fjernes fra tipsene. Legg plater, rør og spisser på væskebehandlingsrobotens dekk, som angitt av dekkoppsettet.
   6. Klikk på "Spill" -knappen for å kjøre fortynningsprogrammet. Velg riktig antall 50 μL tips. Velg riktig antall 300 μL tips. Vent på12 minutter for prosessen å løpe.
4. Ta fortynningsplaten fra roboten, dekk tipsene, og sett opp 15 ml medierørene. Kultur platen i 5-6 timer ved 30 ° C.
5. Omtrent 1 - 2 timer før du begynner den andre fortynningen, må du skru på inkubasjonskamrene for mikroskopet. La dem balansere ved ° C eller temperaturen som kreves for eksperimentet.
6. Gjenta fortynningstrinnene 3.3 - 3.4, men fortynnede kulturer til en OD600 på 0,01-0,02 for å spotte kulturer på agarosesklier.
7. Dekk fortynningsplaten med en metallfrysningstetning.
8. Sonikér fortynningsplaten i et isbad i 30 s med platen som flyter i isvann ved hjelp av en centrifugemetallbøtte for å holde platen ( figur 2A ). Overfør de sonikerte kulturer fra fortynningsplaten til en flat bunnplate. Label 4 x 96 brønn flate bunnplater 1, 2, 3 og 4 ( figur 2B ).
   1. Overfør 150 &# 181; L av fortynningsplaten fra brønnene A01 - D06 i brønnene C04 - F09 på platen merket 1. Deretter overføres 150 μl av fortynningsplaten fra brønnene A07 - D12 til brønnene C04 - F09 på platen merket 2. Deretter overføres 150 pl Av fortynningsplaten fra brønnene E01 - H06 i brønner C04 - F09 på platen merket 3. Til slutt overfør 150 μL av fortynningsplaten fra brønnene E07 - H12 til brønnene C04 - F09 på platen merket 4.
9. Gå videre til trinn 4, Spotting on Agar.

4. Spotting på agar ved hjelp av en automatisert væskespottingrobot

1. Fjern agarosesklier lagret ved 4 ° C / N (fra trinn 2.19) fra deres fuktede sterile pipettkasser.
2. Om nødvendig, trim hjørner av agarosemediet med et rent knivblad for å sikre at de passer på glidekammeret.
3. Fjern glideklemmen av festet. Plasser agarplaten forsiktig inn i utsparingsområdet på scenekammeret.
   MERK: Pass på at ellerIentasjon av lysbildet er konsistent fra eksperiment for å eksperimentere.
4. Kontroller at klemmen er flush med bunnen av kammeret. Hvis det er skråt, kan lysbildet ikke være fullt sett i forsenket område. Plasser nivelleringsavstanden i senterplattens posisjon på spottrobotten. Denne mellomrommet gir kontakt for nivelleringsskruene slik at glidekammeret kan utjevnes med spissene.
5. Plasser platene på bordet i rekkefølge av kvadranten. Plater 1, 2, 3 og 4 bestilt fra venstre mot høyre ( figur 2B ).
6. Legg ut spissene slik at de indre 24 brønnene C04 - F09 er opptatt med tips i 4 tomme spissbokser. En femte boks må ha ett tips i C10 posisjon, samt 4 tips med endene avskåret i A01, A12, H01 og H12 posisjonene. Disse 4 kuttespissene gir stabilitet for spissplaten ( figur 2C og 2D ).
7. Fjern toppdekselet fra slIde kammerfeste.
8. Plasser den første tipsstansen i startstedet til robotkontrollspottingprogrammet. Dette burde slå et hull i agarosen som senere vil bli brukt til å justere opprinnelseskoordinatet. Plasser tallerken 1 på den flytende håndteringsrobotten for å få øye på den første kvadranten. Pass på at lokket er fjernet, og fortsett spottprogrammet.
9. Sjekk at alle flekker er til stede. Vent også på ~ 30 s for å tørke. Når platene er omtrent 1 mm i diameter, kan programmet fortsette. Tøm de brukte tipsene i biohazard-beholderen, og legg ferske tips på roboten. Bytt ut platen 1 for 2. kvadrantplaten.
10. Gjenta for den tredje kvadranten. Og gjenta igjen for ^fjerde kvadrant.
11. Når flekkene er tørre, skift skyvekammeret og vip apparatet over.
12. Monter rørtilkoblingene med et luftfilter.
13. Plasser en glassglass på kammerets øverste side.
    MERK: Dette lysbildet er avgjørende for reduksjonNg varmen fluxen til agar og minimerer dannelsen av kondens på den objektive dekselens side av kammeret. Ikke glem dette dekselet. Avhengig av mikroskopkonfigurasjonen, forhindrer dette dekselglasset oppvarming fra belysningssiden fra å forårsake kondens på objektivsiden.
14. Plasser en vifte for å blåse varm luft på kammerets objektive side. Denne viften forhindrer at kondens blir dannet på dekselet. Still luftstrømmen gjennom bobleren til 10 ml / min.

5. Kjører ODELAY på mikroskop

1. Kjør skriptet "ODELAY_Microscope_Control.m".
2. Klikk på "Shutter" for å åpne den overførte lyslukeren og deretter "Focus" -knappen for å starte høyhastighetshastigheten ( Figur 3A , Røde piler).
3. Klikk på "Gå opprinnelse" og flytt scenen for å finne opprinnelsesmerket som ble stanset i agar.
4. Deretter beveger du litt til høyre tilFokus på gjærceller oppdaget i område E07.
5. Flytt tilbake til opprinnelsesstemmen og senter den i synsfeltet.
6. Still opprinnelsen til denne verdien ved å trykke på "Set" -knappen ( Figur 3A , Blåpiler). Gå nå til posisjon H18 og fokus med hekseskruen nærmest den aktuelle plasseringen. Flytt deretter til posisjon L07 og fokus med hekseskruen nærmest den plasseringen. Flytt deretter til posisjon E07 og fokus med hekseskruen nærmest den aktuelle plasseringen.
7. Gjenta trinn 5.5 - 5.7 etter behov til de stillingene er i fokus.
8. Kontroller fokuset i midten og på kantene på punktene E12, H12, L12. Juster autofokusområdet hvis fokus Z-verdiene, som angitt av Z-verdien, er større enn ± autofokusområdet ( f.eks . Sett autofokusområdet til 60 μm Z-verdien for et midtpunkt som er større enn ± 40 um).
9. Trykk på reset-knappen, da dette vil aktivere knappegenskapene, og trykk deretter påODELAY ( figur 3A , grønne piler). Velg katalogen for å lagre dataene. Pass på at det er nok ledig plass.
   MERK: Mikroskopet samler data i 48 timer, eller til programmet er stengt.

6. Behandling av ODELAY-data

1. Åpne ODELAY_IPT.exe eller bruk skriptet ODELAY_Image_Processing_Tool_v7.m-skriptet ( Figur 3C ).
2. Forbered et * ODELAYExpDisc.xlsx Excel-regneark.
3. Gi eksperimentet navn i celle B1.
4. Velg Image Directory der bildefilene E07 - H18 er lagret.
5. Velg datakatalogen der data skal skrives.
6. Skriv datoen da forsøket ble startet i celle B04. Bruk formatet MM / DD / ÅÅÅÅ.
7. Skriv fortynningstiden i celle C04. Denne gangen er omtrent fem minutter før det første bildet samles inn. Bruk formatet HH: MMpm hvor HH er for h og MM er for min.
8. Legg til i stammenavnene i henhold til tO kildeplaten (trinn 3.1). På grunn av måten stammer oppdages, blir de omorganisert på ODELAY-agarose-lysbildet. Celler i regnearket B31-B126 er kildeplaten, mens cellene C31 - C126 er spotstedene i ODELAY-agarplaten.
9. Deretter trykker du på "Prosessdata" -knappen og velger * ODELAYExpDisc.xlsx som bare ble utarbeidet.
10. Vent 16-24 timer avhengig av datasystemet som brukes til å behandle data.
11. Når bildene behandles, vises en katalog med navnet "ODELAY Well Data" og en fil "* _Index_ODELAYData.mat". Trykk på "Last data" -knappen og velg filen "* _Index_ODELAYData.mat" som nettopp ble generert. Dette vil laste inn datasettet som bare ble behandlet. "*" I filnavnet vil bli oppført i samsvar med eksperimentnavnet som er angitt i Excel-regnearket.
12. Etter å ha lastet inn dataene, kontroller den ved hjelp av tidslinjen som er funnet over bunnen, klikk på et bildefelt for å se vekstkurver fEller det stedet, eller finn en interesse i listen til venstre, og last deretter inn bildene for den listen.
13. Generer histogrammer av populasjonsvekstparametere ved å trykke på "Violinplott" -knappen. Dette vil generere et plott vist i figur 4 eller figur 6 .

Representative Results

Eksempler på gjær voksende i tidsforskjellmikroskopi er vist i figur 3B . Etter å ha behandlet time-lapse-bildene, vises et representativt datasett som sammenligner gjærstammer BY4741 og BY4742, vist i figur 4 . I dette eksempeldatasettet er det svært liten variasjon i fordoblingstiden mellom forskjellige stillinger på platen. Hvis agarosemediet fremstilles dårlig, vil en åpenbar avvik i både doblingstid og forsinkelsestid være tydelig i spotposisjonene som sammenfaller med deformert region av agarosegelen. Mens fordoblingstider ser ut til å være relativt ensartede, viser dette eksemplet variasjoner i lagtidsmålinger. Et mer konsistent datasett er vist i figur 6 . I dette datasettet er både lagtid og doblingstid ensartet.

Filer / ftp_upload / 55879 / 55879fig1.jpg "/>
Figur 1: Agar Mold Assembly.
Komponentene i agarformen er vist i ( A ). Monter basen som vist i ( B ) og klem deretter basen med små klemmer. Plasser de lengre oppreistene i hulrommet på basen ( C ) og leir deretter glidene til formen som vist i ( D ). En sidevisning som viser vinkelen av formen og orienteringen av formen som er nødvendig for konsekvent adskillelse av agar fra glassruten ( E ). Legg merke til stillingen av tommelen og forefingerne, så vel som den rette linjen av agar som skiller seg fra lysbildet ( F ), og merk den horisontale pilen. Adskillelseslinjen skal bevege seg jevnt i retning av de vertikale pilene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

= "Jove_content" fo: keep-together.within-page = "1">
Figur 2: Sonikering og spotting Metode.
Sonikér platen i isvann og bruk en sentrifugebufferholder for å støtte platen ( A ). Legg platene fra trinn 3.8.1 ut for spotting på agaroseplaten ( B ). Også ordne tipsene slik at den venstre tippboksen har et tips i posisjon C10 og deretter fire andre tips med endene avskåret slik at de ikke kolliderer plateholderen ( C ). Legg de resterende tipsene i fire bokser slik at de indre 24 tipsene er opptatt ( D ). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

55879fig3.jpg "/>
Figur 3: Grafisk brukergrensesnitt ODELAY.
Et skjermbilde av det grafiske brukergrensesnittet for "ODELAY_Microscopecontrol.m" ( A ). Dette grensesnittet gjør det mulig å overvåke kameraet og justere innstillingene for mikroskopbelysning for epifluorescerende og lysfeltmodus. Røde piler peker på knappene Focus and Transmitted som aktiverer kameraet for å skaffe bilder raskt og åpne den overførte lyslukker henholdsvis. Blåpiler brukes til å flytte scenen for opprinnelsen og deretter sette opprinnelsen med "Go Origin" -knappen og "Set" -knappen. Grønne piler peker til "Reset" og "ODELAY !!!" Knapper som tilbakestiller ODELAY bildemodi til de nåværende forholdene og starter ODELAY bildesamling. Time-lapse bilder av gjær vokser på fast medium ved 0, 3, 6 og 9 timer etter spotting ( B ). Et skjermbilde av det grafiske brukergrensesnittet for "ODELAY_IPT.m" eller th E ODELAY bildebehandlingsverktøy ( C ). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Eksempel ODELAY Output.
Denne datasettet sammenligner stammer BY4741 og BY4742 på YPD media. Denne figuren er et eksempel på et godt forberedt agarose lysbilde; Imidlertid er autofokusinnstillinger ikke optimale. Dataene som presenteres i hver kolonne, fra venstre til høyre, er: bærekapasiteten i log ₂ i koloniområdet; Doblingstid, gitt i min; Og lagringstid, gitt i min. I dette eksemplet, doblingstider av alle flekker på agar-glidbanen, går det bra med en liten økning av fordoblingstiden mot kolonnen. Lagringstider varierer imidlertid betydelig i dette datasettet._upload / 55879 / 55879fig4large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Vekstkurveeksempler.
Dette eksempelet viser hvordan dårlig startfokus kan føre til at estimert lagringstid (t _lag ) øker ( A ), mens den tilstøtende posisjonen viser en kortere lagringstid ( B ). T _d er doblingstiden i min, og t _lag er lagetiden i min. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: Eksempel på godt utført testeksperiment.
En eEksempel på BY4742-stammen testet etter å ha erstattet en wolfram-halogenpære med en diodbelysning, og at autofokuset er riktig satt. Alle doblingstider ser ut til å overlappe seg godt, og forsinkelsestidene ser ut til å være konsistente. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

ODELAY-analysen har flere kritiske punkter for å sikre reproduserbare og pålitelige fenotypiske målinger. Det første kritiske punktet er konsistent fremstilling av gjærkulturer. Det må tas hensyn til å høste gjærcellene fra logaritmisk vekst. Hvis kulturen er mettet, vil deres populasjons heterogenitet økes, noe som kan forvirre heterogenitet forårsaket av genetiske eller miljømessige ( f.eks. Karbonkilde) faktorer ¹¹ . Det andre kritiske punktet er konsekvent forberedelse av media. Generelt bør et stort volum 10X lagermedieoppløsning genereres og deretter brukes over tid for å minimere batcheffekter. Formulering av media etter vekt, når det er mulig, bidrar til å forbedre konsistensen av mediet over tid ved å sikre tettheten av agar og det totale vanninnholdet i agarosen kan overvåkes nøye. Det tredje kritiske punktet innebærer minimering eller eliminering av mekanisk deformasjon av agarose megdia. Mekanisk deformasjon av mediet vil oftest oppstå under separering av agarosen fra glassruten. Som med mange laboratorieteknikker er det nødvendig med praksis for å mestre dette trinnet.

Variasjon i forsinkelsestid som vist i figur 4 , er ofte relatert til en av de tre faktorene: mekanisk deformasjon av agarosemediet, variasjon i støpt agartykkelse eller en ustabil lyskilde. Hvis agarosemediet varierer i Z-høyde over det spottede systemet, kan høydevariasjonen overvelde rekkevidden til autofokusrutinen, slik at de første bildene blir litt ute av fokus. Av denne grunn må du kontrollere fokushøyden på flere steder i midten og langs kantene av den merkede gruppen for å sikre at autofokusrutinen har tilstrekkelig Z-rekkevidde for å finne fokus. Hvis nødvendig, bruk autofokuspanelet til å øke fokusområdet og øke antallet fokuseringssteg.

En tredje mulighetIon som kan føre til dårlig fokus er en ustabil eller flimrende lyskilde, som kan forstyrre den beregnede fokuspunkten for en bestemt Z-høyde. Tungsten halogenpærer har en tendens til å flimme godt før pærene brenner ut. Effekten av dårlig fokus er observert i et eksempel hvor vekstkurverne dobler mellom første og andre tidspunkter ( Figur 5 A ), mens tilstøtende punkt ikke har samme dip ( Figur 5 B ). I dette tilfellet ble den svake fokustilstanden lindret ved å erstatte wolframhalogenlyskilden.

I praksis har forfatterne funnet at for å redusere flimmer av 100W tungsten halogenpærer, må pærene byttes ut hver 500 time eller omtrent hver annen måned når mikroskopene er under tung bruk. For å unngå dårlige fokusproblemer fra en blinkende pære, erstatt tungstoff halogen lyskilden ofte eller bytt halogenpæren med en diodelyskilde. enEksempel på et datasett som viser lav variasjon i doblingstider, så vel som mer ensartede lagringstider, er vist i figur 6 . Dette datasettet ble tatt med en diode illuminator som gir en mer stabil belysning over tid mens du utfører autofokus.

Mens mange av punktene som er nevnt her for optimalisering av mediepreparasjon, kan synes å være åpenbare, gjentar de fleste storskala-skjermer ikke godt med hverandre ^{8 , 11} . Derfor har vi nøye beskrevet utarbeidelsen av kulturer og agarosemedier slik at mer reproducerbare fenotypiske skjermbilder kan genereres.

ODELAY-analysen er for tiden begrenset i gjennomstrømning sammenlignet med pinningsbaserte analyser som syntetiske genetiske arrays eller Scan-O-Matic-analysen. Mens disse metodene øker antall stammer som måles, mangler de en evne til å løse enkelte celler aNd kan således ikke måle populasjons heterogenitet som vi observerer i klonale gjærstammer. Opprinnelsen til denne populasjons heterogeniteten forstås ikke for øyeblikket, men sammenslåingen av teknologi og beregning som vist her gir en mulighet for objektivt å adressere de underliggende cellemekanismer ¹² .

Forfatterne ønsker å merke seg at ODELAY for tiden bare er optimalisert for et bestemt mikroskopmerke og kroppstype. Endring av ODELAY for andre mikroskopsystemer er rett fram, men krever kunnskap om åpen kildekode-API ¹³ . Imidlertid er både API og ODELAY-skriptene skrevet for å tilpasses enkelt til forskjellige systemer og eksperimentelle analyser.

Mens ODELAY ble opprinnelig utviklet for gjær, har vi vært i stand til å benytte den uten modifikasjon for å observere vekst av Mycobacterium smegmatis . Observasjon av de andre kolonidannende mikroorganismer erMulig med endringer i kildekoden gitt ¹¹ . Generelt er ODELAY et kraftig og fleksibelt verktøy for å sammenligne mikroorganismer dyrket under ulike miljøforhold og genetiske forstyrrelser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose UltraPure	ThermoFisher	16500500	Gel Temp 36C, Gel Strength (1%) 1.2 g/sq cm
Yeast Extract Peptone (YEP)	Fisher Scientific	BP1422-2
Complete Suplement Mixture (CSM)	Fisher Scientific	MP114560222
Polyethylene Glycol 3350 (av. mol. wt. 3000-3700)	SigmaAldrich	P2906
Yeast Strain BY4741	ThermoFisher	95400.BY4741
Yeast Strain BY4742	ThermoFisher	95400.BY4742
50 mL Falcon tubes	Corning	430291	1 case
15 mL Falcon tubes	Corning	352096
2 x 3 inch 1.0 mm thick slides 1/2 gross	VWR	48382-179
96-well plate flat bottom	Corning	353072
Hydra liquid handleing robot	Thermo	1096-DT-100
Hamilton Microlab Star Liquid Handleing Robot	Hamilton
hydra 100 mL tips Extended Length DARTS	Thermo	5527
Synergy H4 Plate Reader	Biotek	H4MLFAD
Leica DMI6000 B Microscope	Leica
Leica 10X/0.3NA objective	Leica	11506289
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Camera	Hamamatsu	C11440-22CU
MATLAB with image processing tool box	Mathworks
MicroManager	Open Imaging		https://micro-manager.org/
ODELAY Microscope Control (MATLAB scripts and GUI)			www.aitchisonlab.com\ODELAY for Matlab scripts and software
ODELAY Microscope Chamber			www.aitchisonlab.com\ODELAY for Mechanincal Drawings
ODELAY Agar Molds			www.aitchisonlab.com\ODELAY for mold drawings