Summary
われわれは、卵巣がんの早期発見のツールとして、卵管直腸切除後の卵管をサンプリングすることによって、卵管細胞診法を検討した。ここでは、新たに受けた外科標本からファローピウス管細胞を収集するためのプロトコルを提示する。
Abstract
現在、大部分の卵巣高悪性度漿液癌(HGSC)は、卵管から生じることが広く受け入れられている。しかし、卵巣癌の同定のためのマーカーまたはツールの欠如のために、HGSCの早期発見は困難なままである。卵管の直接サンプリングは、腫瘍が肉眼で見ることができない場合、腫瘍細胞の検出感度を高めることができる。組織学的所見との良好な相関を示した新鮮な外科的検体から直接に卵管細胞を採取する手順を開発した。このアプローチは、リスクの高い患者集団における低侵襲腹腔鏡検査の将来の有用性の基礎を築く。
Introduction
卵巣高悪性度漿液癌(HGSC)は、最も一般的で致死的なタイプの卵巣癌であり、依然として公衆衛生上の大きな脅威である。過去10年間で、研究者はHGSC症例の大多数は卵管の代わりに、卵巣自体1、2、3、4、5、6から生じることが示唆されています。漿液性卵管上皮内癌(STIC)が広くHGSC 1、7、8、9、10、11の前駆体として受け入れられています。これまでのところ、卵巣癌の早期発見は困難なままである。癌抗原125(CA-125)と経膣超音波を組み合わせた現在のスクリーニングプロトコールが示されている患者の死亡率12、13にはほとんど影響。卵巣癌の検出のための子宮内膜標本採取は、極めて低い感度14を示している。二つの先駆15、16は、良性の卵管の腹腔鏡直接サンプリングの使用を探求し、良性の卵管上皮の細胞学的特徴を特徴研究します。私たちは、卵管からの直接サンプリングもまた、画像化によって腫瘍が可視化されていない初期段階で、STICまたはHGSCを検出するための実用的で直接的な方法であると考えている。
究極の目標は、高リスク因子を有する患者における低侵襲性腹腔鏡下スクリーニングの有用性であるが、現在の研究の即時の目的は、以下である:1)良性卵管上皮のベースライン細胞学的特徴を確立すること。 2)卵巣腺腫の検出における卵管細胞診の感度および特異性を試験することおよび癌前駆体である。そこでHGSC及びその前駆体STIC 17の検出にこのプロトコルの有効性を試験するために、次のベースラインの卵管細胞学的方法を開発しました。この研究では、定期的に受診した大量の外科用検体を利用し、日常的な手技に加えて外科的に切除したファローピウスチューブの直接サンプリングを行った。
私たちの最近の研究17は、悪性または悪性腫瘍のための疑いの細胞学的診断は非常にHGSC(100%)の組織学的診断と相関していることを示しました。さらに、卵管の細胞学的評価は、この研究に関与する唯一の2つの組織学的に確認されたSTIC症例において、腫瘍内腫瘍形成を同定した。我々は、卵管細胞診は早期発見において大きな可能性を有し、患者管理に貴重な情報を提供すると考えている。
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Protocol
この研究を実施するため、アリゾナ大学からInstitutional Review Boardの承認を受けた。患者の同意書が得られた。
1.患者の選択
注:機関審査委員会の承認はアリゾナ大学から得られたものである。合計38人の患者が募集された。患者の年齢は32〜86歳で、平均年齢は55歳であり、その内26名は閉経後であり、12名は閉経前であった。
- 各患者からインフォームドコンセントを得る。
2.ファローピウス管細胞回収手順
注:現在の研究に含まれる患者はすべて、予防的リスク軽減または悪性腫瘍のために、子宮全摘出および両側卵管卵巣摘出術が予定されていた。細胞学的研究を行った病理学者にとって、手術の詳細は不明であった。
- 手術直後子宮、両側卵巣、両側卵管を含む新鮮な組織標本を注意深く調べて、両側卵管を確認する。
- 血液をクランプして30分以内に保存液(表の表を参照)に卵管細胞を集めて置く。推奨される防腐剤は、メタノールをベースにした緩衝化保存溶液です。
注:胸腺細胞の収集には、穏やかなタッチブラシを使用してください(次のステップ)。まれなケースを除いて、卵管が子宮から分離されて提出される場合、卵管筋原線から細胞を収集するためのブラシヘッドを挿入することは、典型的には、卵管が子宮に取り付けられたときに生じる。- 小さな鉗子の助けを借りて、尖端を介して卵管の内腔にブラシ( 材料の表を参照)を挿入します。ゆっくりと時計回りに回転させ、ブラシを秋の鼻のない部分を通して前方に移動させるオピエンスチューブ、そしてそれが脈状に達するまでアンプル。
- ゆっくりとブラシを反時計回りに逆回転させてブラシを引き出します。ルーメン内のブラシの最大速度が1 cm / sより遅いことを確認してください。
- 溶液中でブラシを10回回転させて渦巻かせることにより、保存液(バイアル中)でブラシをすすぐ。
- バイアルキャップを締めます。
- 患者の情報と標本の側面を記録する。
- バイアルを4℃の冷蔵庫(最大6ヶ月間)に保管してください。
3.管幹細胞診スライド調製
- スライドバイアル用のサンプルバイアルを自動化されたプロセッサーにロードします。
注:我々は、スライドの準備のための自動化されたプロセッサを使用しています。以下のステップは、サンプルバイアルをプロセッサに入れた後に自動的に実行される:(i)サンプル中の試験フィルターの回転によって細胞および残屑が分離および分散されるバイアル。 (ii)管状細胞を、穏やかな真空によってフィルターの外面から収集する。 (iii)フィルターを逆さにしてスライドに押し付け、細胞をスライド内の円形領域に接着させる。 (iv)スライドをさらに細胞固定液に固定し、染色および細胞学分析の準備をする。残念なことに、同様の品質で結果を出すことができる代替手動方法はありません。
4.改変パパニコロウ染色プロトコル
- 表1に示すように、自動化された非gyn染色手順を実行することによって、ステップ3.1から作製されたスライドを染色する。
注:染色法は、非婦人科検体に日常的に使用されているパパニコロー染色法の変更を表しています。自動化された組織プロセッサーを使用してスライドを染色します。この研究では、Gyn染色法よりも非Gyn染色法を選択した。使用されるエオシンは、EA-50の代わりにEA-65を使用した婦人科検体(パップスミア検体)。さらに、主に扁平上皮細胞染色のためのGyn染色法におけるOG-6は、この研究では扁平上皮細胞は見られないので染色手順には含まれない。 EA65(Eosin Azure)は、Eosin Y、Fast green FCF、ビスマルクブラウンYの3種類の染料からなるカウンターステイン溶液である。この手順を表1に示す 。 - 次のように手動の迅速なPap染色手順を実行します。
- ステップ3.1で作製したスライドを95%エタノールに10回浸す。各浸漬は約1秒かかる。
- スライドをH 2 Oに10回浸し、各浸漬に約1秒かかる。
- スライドをヘマトキシリンで10〜60秒間出現させる。
- スライドをH 2 Oに10回浸漬する。各浸漬は約1秒かかる。
- スライドを95%エタノールに10回浸漬する。各浸漬は約1秒かかる。
- EA65で1〜3分間スライドを出す。
- スライドをディップするinto H 2 O、10回、各浸漬は約1秒かかる。
- スライドを95%エタノールに10回浸漬する。各浸漬は約1秒かかる。
- スライドが透明になるまでキシレンでスライドを浸します。
注:これは改変されたパパニコラウ染色法である。この方法は、現場の細針吸引およびSTAT検体のような時間または空間が限られている場合に、より迅速な染色方法として使用される。この手順は、自動化された非Gyn染色手順と同等の品質の染色を提供する。この手順を表2に示す 。
5.細胞をスライドにスピンさせる
注:各標本に対して3種類のサイトスピンスライドが作成されています。 1つのスライドは、細胞学スライドとの形態学的比較のために染色されたH&Eである。 2つの染色されていないスライドが、将来のIHC染色研究のために作製された。このセクションの詳細な手順はこのペーパーの焦点ではありません。したがって、我々はそれらを拡張dで議論しないetails。
- 検査されるべき各サンプルについて、標識されたスライド、検体漏斗およびフィルターを備えた細胞遠心分離機を調製する。
- 200×gで5分間遠心分離することによって細胞を濃縮する。
- 上清の約半分を取り出し、穏やかなピペッティングで細胞を再懸濁する。
- 各細胞懸濁液200μLを試料漏斗に加える。
- 250 xgで5分間スピンします。慎重に細胞遠心分離機からスライドを取り出し、固定のために95%エタノールに移す。
- 染色の前に空気乾燥し、長期保存してください。
注:最終スライドのセル密度に応じて、ステップ5.2およびステップ5.3はスキップまたは調整できます。この研究では、適切な細胞密度のために高出力の視野あたり少なくとも2つの細胞クラスターが必要である。
6.浮動端(SEE-FIM)プロトコルのセクション化と広範な検討
- 検体全体(子宮、両側卵管、卵巣を含む)を固定し、10%ホルマリン中で、剥離を最小限に抑えるために累積する。
- 静かに、注意深く小さな鉗子とハサミを使用して、狭窄部で子宮から卵管を外す。癒着がある場合は、小さな鉗子とハサミを使用して、卵巣表面から釣り糸の端を慎重に解剖する。これらのステップは、それらの親密な近接のために卵巣と卵管との間の腫瘍の交差汚染を最小にするために重要である。
- 不全麻痺者および線毛部(卵管の遠位1.0〜2.0cm)を残りの標本から切断する。
- 2mm間隔で縦横に切開部および線毛部を切る。組織学的検査のためにtotoの全てのセクションを提出する。
- 2〜3 mm間隔で胸筋と胸部を切開し、完全に提出する。
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Representative Results
私たちの以前の研究は、穏やかなタッチブラシを使用して切除された卵管から直接サンプリングすることにより、さらなる細胞学的評価のために定量的および定性的に適切な検体を得ることができることを示した。加えて、自動化されたスライド調製と改変されたパパニコラウ染色との組み合わせにより、病理学者は細胞学的詳細をより正確に視覚化して正確な診断を行うことができる。良性ファローピウスチューブからの検体の手作業による迅速なパップ染色の例を図1に示します 。 図1に示すように、ブラシ操縦は試料の適切なサンプリングをもたらす。さらに、手動の迅速なPap染色は、卵管細胞の正確な評価に不可欠な、核の詳細および細胞質の透明性の良好な解明を提供する。
手動クイックPap st細胞学スライドのainおよびサイトスピンスライドのH&E染色を図2に示す。従来の塗抹標本と比較して、上記スライド調製物の利点の1つは、それがはるかにきれいな背景と核の細部と細胞質の透明性のより良い分解能を有することである。ファローピアン管プロトコルのSEE-FIMの一例を図3に示します 。 図1に示すように、2つの細胞集団(繊毛細胞および分泌細胞)の存在は、良性卵管上皮の特徴である。 fimbriaおよびampullaの代表的な切片の組織像を図4に示す。ブラシ操縦は、標本の約3分の1で絨毛構造の軽度の障害を示す。
我々の以前の研究17では、卵管細胞診は、組織学的径と相関していたHGSCのグノーシスは非常によく(100%)。悪性腫瘍の細胞学的外観は、顕著な核小体および無核症を有する細胞からなる三次元クラスターを示す( 図5a )。対照的に、非定常反応性細胞診は、小さな核小体および3次元クラスター化を伴わない中程度の無核細胞症を伴う非定型細胞からなる角膜シートとして提示された( 図5b )。正常な上皮細胞の角膜シートの状況においてHGSC様細胞群が認められた( 図6 )。
図1:良性の上皮上皮の手動クイックポップ染色の例。 ( A )バックグラウンド細胞。背景細胞には、大きな分泌細胞および小さな繊毛細胞からなる小細胞クラスター、単一の大きな(おそらくは秒レトリ細胞)および小さな(おそらく網状の細胞)細胞を含み、大小の裸の核が散在している。 ( B )小さな繊毛細胞と大きな分泌細胞からなる小細胞クラスター(矢印)。 ( C )繊毛上皮の帯(矢印)。 ( D )中皮様シートを伴う管状上皮。周辺に繊毛の細胞が詰まっていることを指摘する(矢印)。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2:細胞スライドのマニュアルクイックポップ染色( A )とサイトスピンスライド( B )のH&E染色との比較。良性角膜細胞クラスターは、Pap染色およびH&E染色スライドの両方の中心に存在する。どちらの方法も良い結果をもたらします標本の細胞学的評価のための分解能。しかし、細胞学スライドのPap染色は、よりきれいな背景をもたらした。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3:ファローピアン管のSEE-FIMの図。穿刺部および線毛部の縦断面および峡部および隆起部の横断面を注意してください。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4:良性の上皮上皮の組織学。( A )フィムブリエ(Fimbriae)セグメント。卵管上皮は、小さな繊毛細胞(矢印)と大きな非繊毛分泌細胞(円)の2つの異なる細胞集団からなる。わずかなヴィラの外乱が記録されています。 ( B )Ampullaセクション。指のような指紋に注意してください。 ( C )絨毛構造の軽度の障害(矢印)。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図5:非定型クラスタの比較(a)と三次元悪性クラスター(B)。悪性細胞診は、顕著な核小体および単核球症( b )を有する細胞からなる三次元クラスターを示す。非定型細胞学は角膜を示す小さな核小体および中程度のアニソン核症を伴う非定型細胞から構成されている。注:3次元クラスタリングは存在しません( a )。この図は、参考文献17から採用されている。
図6:上皮内腫瘍形成の細胞学的および組織学的外観との相関。 ( a )細胞内新生血管新形成。正常な上皮細胞の角膜シート(矢印)の範囲内で、三次元輪郭および有意な無核細胞症および大きなチェリーレッド核小体(円)の獲得を示す細胞学的腫瘍内腫瘍。 ( b )卵管上皮内癌を伴う対応する外科的病理切片。比較的正常な外観の上皮細胞(矢印)に隣接する高度異形成細胞(円)に注意してください。この数字は参考文献17から採用されている。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
95%エタノール | 5分 | ||
水 | 10秒 | ||
ヘマトキシリン | 15秒〜3分 | ||
蒸留水 | 5分 | ||
95%エタノール | 30秒 | ||
EA65 | 2〜5分 | ||
95%エタノール | 30秒 | ||
95%エタノール | 30秒 | ||
100%エタノール | 30秒 | ||
100%エタノール | 30秒 | ||
キシレン | 30秒 | ||
キシレン | 5分 |
95%エタノール | 10ディップ |
水 | 10ディップ |
ヘマトキシリン | 10秒-1分 |
蒸留水 | 10ディップ |
95%エタノール | 10ディップ |
EA65 | 1〜3分 |
95%エタノール | 10ディップ |
100%エタノール | 10ディップ |
キシレン | クリアするまでディップする |
表2:手動クイックパップ染色工程。
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Discussion
予防的な両側性卵管摘除術または卵管卵巣摘出術は、BRCA遺伝子突然変異および強力な家族性癌の病歴を有する女性のような高リスク集団においてHGSCを発症する危険性を低下させることが示されている。しかし、手術によって引き起こされる無菌性および外科的閉経は重大な結果であり、特に出産年齢の女性にとっては困難な決定を下す。以前の研究は、卵管細胞診と組織学の間に優れた相関を示しています17 。私たちは、腹腔鏡下で採取した卵管細胞の卵管細胞診は、早期癌検出のための実用的で低侵襲のツールになる可能性が大きいと考えています。
ファローピウス管細胞の採集のための最も重要なステップは、1)血液供給のクランピングと細胞の収集との間の時間; 2)穏やかなタッチブラシの穏やかで正確な操作。
時間(30分以内細胞の捕捉と回収との間の相互作用は、収集された細胞の形態および核の詳細の良好な保存のために重要である。病理学者と外科医との間の効果的なコミュニケーションは、この期間内に標本が収集場所に確実に送達されるようにする。この研究に含まれた大多数の症例は、凍結切片室で実施された。卵管細胞を正常に採取するには、採取を行う人は、ケースが悪性である場合にステージングの意味でブラシを卵巣の漿膜表面に接触させないように、可能な限り努力すべきである。時には、これは、関連する2つの器官の近接性および標本解剖の複雑さのために、困難なことがある。採取前に検体全体からファローピウス管を分離することは正当である。
この研究で使用された穏やかなタッチブラシは、スライドまたは保存液バイアルに容易に移すことができる多数の細胞を集めることができ、運河の外傷を最小限に抑えるように設計された穏やかな接触チップを有する。さらに、卵管粘膜の絨毛構造をひどく邪魔することを避けるために、操作全体をゆっくりと穏やかにする必要があります。場合によっては、障害のためブラシをファローピーチューブ全体に通すことが困難な場合があります。それにもかかわらず、HGSCの大部分が卵管の遠位端に由来すると考えられるので、線毛および臍帯部分から細胞を収集するために可能な限り最善の努力をすることが重要である。ただし、検体の完全性が損なわれる可能性がある場合は、回収を進めるべきではありません。
我々の経験に基づいて、標本は、収集された細胞の形態を損なうことなく、数ヶ月にわたって保存溶液に保存することができる。パパニコラウ染色は、細胞病理学において一般的に用いられる細胞学的染色技術である。この染色手順の主な利点は次のとおりです。1)核詳細の良好な定義。2)細胞質の透明性。この研究では、自動化された非Gyn染色手順およびQuick Pap染色手順を含む細胞学スライド染色のために、2つの改変Papanicolaou染色手順が使用される。どちらの方法も、優れた信頼性のあるスライド染色を行い、核および細胞質の詳細、およびきれいな背景の良好な保存を示す。サイトスピンスライドは、一般に、細胞スライドと比較してより大きなバックグラウンドを有するが、それらのH&E染色は、同様の細胞染色品質を示した。これらのスライドのH&E染色は、自動プロセッサーが利用できない場合、卵管細胞診分析のための適切な代替方法となり得る。
SEE-FIMプロトコルは、良性および悪性の両方の症例を含む、この研究に含まれる全ての卵管を獲得するために使用される。 SEE-FIMプロトコルは、標準的なリスク軽減オプションであるBRCA陽性の予防的両側卵管卵巣標本のために最初に開発されたまたはBRCA突然変異キャリアを含む。このプロトコールは、STICが由来すると考えられる卵管plicaeの最大の暴露を可能にする。これは、現在、HGSC卵管伸長およびSTICを検出するためのゴールドスタンダードとして採用されている。 SEE-FIMの組織学的所見と卵管の細胞学的所見との間の相関関係は、現在のプロトコルの効率を検証するためにこの研究にとって重要である。
穏やかなタッチブラシを使用する卵管細胞収集の1つの関心事は、操作が卵管上皮の完全性を妨げ、悪性腫瘍が同定された場合には外科標本のより正確な組織学的解釈、特に腫瘍の病期化を妨げる可能性があることである。しかし、私たちの経験に基づいて、約3分の1の症例が絨毛の軽度の擾乱を示し、これは一般に卵管組織学の最終解釈を妨げない。
私たちの以前の研究は、卵管細胞診は敏感で特異的であることを示していますHGSCとSTICの検出にはicが必要である。卵管細胞診とP53およびIMP3などのバイオマーカー染色との組み合わせが、卵管由来の漿液性癌の検出の感度および特異性を増加させるかどうかをさらに試験することは、大きな関心事である。今後の研究は、インビボでの卵巣上皮サンプリングのための腹腔鏡検査法の開発に焦点を当てる。
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Disclosures
著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。
Acknowledgments
著者らは、アリゾナ大学の病理学科に財政的支援を認めています。プロジェクトは、WZへのMark and Jane Gibsonの基金基金によって部分的に支えられています。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cytobrush plus GT gentle touch of Medscand sample collection kit | CooperSurgical | C0112 | |
ThinPrep preservCyt solution | HOLOGIC | 234005 | |
ThinPrep 2000 Processor | HOLOGIC | 70031-001 | |
Papanicolaou Stain, EA 65 | sigma aldrich | HT40432 | |
95% Ethanol | sigma aldrich | 652261 | |
100% Ethanol | sigma aldrich | 493538 | |
Xylene | sigma aldrich | 214736 | |
Hematoxylin | sigma aldrich | H9627 | |
Sakura Tissue Tek 2000 tissue processor | SAKURA | TISSUE-TEK VIP 2000 | |
Mayo Dissecting Scissors,5.5 straight | Pilgrim medical equiment | FA710-45 | |
Chemware Forceps | United state plastic corp | 76122 | |
Tissue-Tek Accu-Edge Trimming blades,short | SAKURA | 4785 | |
Tissue-Tek Accu-Edge Trimming blades handle,short | SAKURA | 4786 |
References
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