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Cancer Research

Identificación y caracterización de factores metastásicos por transferencia de genes dentro de la novela RIP-etiqueta; RIP-tva modelo murino

Published: October 16, 2017 doi: 10.3791/55890
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Weill Cornell Medicine

Summary

Presentamos un protocolo para demostrar un sistema de transferencia génica somática novela utilizando RIP-Tag; RIP-tva modelo de ratón para estudiar la función de genes en la metástasis. El retrovirus aviares se entregan intracardiacally para asegurar la transferencia de genes en las lesiones premalignas, no invasivas de las células β pancreáticas en ratones adultos.

Abstract

Cáncer metastásico representa el 90% de las muertes en pacientes con tumores sólidos. Hay una necesidad urgente de entender mejor las causas de la metástasis del cáncer e identificar nuevas dianas terapéuticas. Para investigar los eventos moleculares que conducen a la progresión de cáncer primario a metástasis, hemos desarrollado un modelo de ratón de Alfredo, RIP-Tag; RIP-tva. En este modelo de ratón, el promotor de la insulina de rata (RIP) conduce la expresión del antígeno T de SV40 (Tag) y el receptor para el subgrupo un virus de la leucosis aviar (tva) en las células β pancreáticas. Los ratones desarrollan tumores neuroendocrinos pancreáticos con penetrancia de 100% a través de etapas bien definidas que son similares a la tumorigénesis humana, con etapas incluyendo hiperplasia, angiogénesis, adenoma y carcinoma invasor. Porque RIP-Tag; RIP-tva ratones no desarrollan enfermedad metastásica, alteraciones genéticas que promueven la metástasis pueden ser identificados fácilmente. Transferencia génica somática en tva-expresar, proliferando β pancreática las lesiones premalignas se logra a través de la inyección intracardiaca de retrovirus aviares que la alteración genética deseada. Un título de > 1 x 108 unidades infecciosas por ml se considera apropiado para la infección en vivo . Además, retrovirus aviares pueden infectar líneas celulares derivadas de tumores en RIP-Tag; RIP-tva ratones con alta eficiencia. Las líneas celulares también pueden utilizarse para caracterizar los factores metastáticos. Aquí se demuestra cómo utilizar este modelo de ratón y líneas para evaluar las funciones de genes candidatos en metástasis de tumor de la célula.

Introduction

Mayoría de los cánceres se deben a mutaciones somáticas 1. Modelos de ratón modificados genéticamente convencional (GEMM) han proporcionado penetraciones importantes en la contribución de las alteraciones genéticas específicas en tumorigenesis 2. Sin embargo, tienen varias limitaciones. El mayor inconveniente de estos modelos es que no replican la naturaleza esporádica de la formación de tumores en seres humanos, en el que sólo algunas células en un tejido adquirirán alteraciones genéticas. Las mutaciones en ratones transgénicos y knockout son germinales con potencial de afectar el desarrollo. Por otra parte, generar estos modelos de ratón es costoso y desperdiciador de tiempo.

La metástasis es un problema importante en el campo del cáncer. Modelado de metástasis ha sido difícil en GEMM. La metástasis espontánea es rara en el ratón. Penetrancia es variable y latencia es largo en GEMM de metástasis 3. Metástasis experimentales modelos utilizan la inyección directa de células en la circulación de ratones, por lo que se eliminan los primeros pasos en la cascada metastásica.

Para superar algunas de las limitaciones en el estudio de factores metastásicos en modelos de ratón, hemos desarrollado un modelo de ratón de Alfredo, RIP-Tag; RIP-tva4. La estrategia se basa en combinar el uso de un modelo del ratón de la progresión del tumor altamente sincronizada, RIP-Tag 5y el receptor para el virus de la leucosis aviar subgrupo-A, tva 6,7. Esta etiqueta de RIP ; RIP-tvamodelo de ratón permite genes a introducirse somáticamente en una cepa de ratón Alfredo sola. Con el antígeno T de SV40 suprime las funciones supresora de tumor de Rb y p53, ratones desarrollan tumores neuroendocrinos pancreáticos en una manera similar a la tumorigénesis humana, con etapas incluyendo hiperplasia, angiogénesis, adenoma y carcinoma invasor. Este modelo de Etiqueta de corte ha sido muy instructivo para la comprensión de las características distintivas del cáncer, no limitado a tumores neuroendocrinos pancreáticos. También se ha utilizado en ensayos preclínicos 8.

Presentamos un protocolo para la transferencia génica somática a través de la inyección de intracardiacally de retrovirus aviar en RIP-Tag; RIP-tva ratones. Exitosa infección con retrovirus aviares RCASBP derivados requiere activamente proliferante de las células diana. Por lo tanto, elegimos RIP-Tag; RIP-tva ratones en 7 semanas de edad, cuando la hiperplasia se desarrolla en aproximadamente el 50% de los islotes pancreáticos. Inyección intracardiaca ventricular izquierdo de virus de alto título es necesaria para lograr una eficiencia de infección del 10-20% 4. Este método reduce la dilución significativa de partículas virales en circulación antes de virus lleguen a islotes pancreáticos.

Usando este acercamiento, previamente hemos demostrado que Bcl-xL promueve la metástasis del cáncer independiente de su anti-apoptotic función 4,9. Esta función de anti-apoptosis-independiente metastásica no se observó cuando Bcl-xL se expresa a través de un transgén en todas las células β pancreáticas a lo largo de la ontogenia tumorígeno en RIP-Tag; RIP-Bcl-xL ratón modelo 10. Por lo tanto, nuestro modelo de ratón ofrece una oportunidad única de identificar y caracterizar las funciones de genes cuando se expresa en una etapa posterior de tumorigénesis. Porque 2-4% de los islotes se convierten en tumores en la RIP-Tag; RIP-tva Alfredo ratones sin infección viral y no todas las lesiones premalignas son infectados con el retrovirus aviares derivado de RCASBP, pueden identificar solamente los factores que confieren una ventaja selectiva sobre el curso natural de la tumorigénesis. En particular, factores metastáticos serán más fácilmente reconocidos por este método, debido a metástasis a ganglios linfáticos pancreáticos o de otros órganos no ocurre normalmente en RIP-Tag; RIP-tva ratones.

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Protocol

declaración de ética: experimentos en animales se realizaron conforme a los lineamientos y regulaciones establecidas por el Instituto de cuidado Animal y el Comité uso de Weill Cornell medicina.

1. elección de vectores retrovirales aviar (basada en RCASBP A o RCANBP(A)-based)

  • vectores fue derivado de Rous sarcoma virus 11. Vectores retrovirales aviares pueden entregar cADN (≤ 2,5 kb), short hairpin RNAs (shRNAs), microRNAs (miRNAs) y otros RNAs noncoding. Los vectores comercialmente disponibles se enumeran en materiales y otros que deba solicitarse directamente de los autores.
  • Para sobreexpresar genes de interés, utilice uno de los siguientes vectores, RCASBP(A) 12 ( figura 1A), RCA-X ( figura 1B), RCA Y 13 ( figura 1), RCASBP Y DV 14 y otros vectores de ALV-A (https://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/mice.html).
  • Eliminar genes de interés por shRNA, utilice uno de los siguientes vectores: RCAN-X DV 15 o ARNi RCA 16.
  • Para sobreexpresar miRNAs, generar vector RCA-miR como se describe en 17.
  • Transformación en e. coli y DNA requisito.
  • Transformar preferentemente ADN en células competentes Stbl2 o Stbl3, que tienen genotipo único para estabilizar secuencias retrovirales y repetición directas. Purificar el DNA plasmídico utilizando un método que dará puro, grado de transfección ADN. se necesita 5 μg de ADN con la concentración mínima de 0,1 μg/μl.

2. Propagación viral en línea de celular de DF1 de fibroblastos de pollo

  1. el uso de puntas de pipeta filtrada para cultivo celular es necesaria para evitar que Cruz-contaminación viral existencias 18.
  2. DF1 mantener las células en el plato de 6 cm con crecimiento medio (DMEM con glucosa alta, 10% suero fetal bovino, 6 mM (concentración final) L-glutamina, 10 unidades/ml de penicilina, estreptomicina 10 de μg/ml) a 37 o C y 5% CO 2. Si las células DF1 son recién descongeladas de acciones congeladas, de la cultura les durante al menos 3 días antes de la transfección.
  3. Un día antes de la transfección, pasar las células DF1 a un plato de cultivo de tejidos de 6 cm para que sean confluentes de 30-50% en el momento de la transfección.
  4. Diluir 5 μg de ADN viral puro con DMEM (sin suero, penicilina o estreptomicina) para un volumen total de 150 μL en un tubo de microcentrífuga dentro de una campana de cultivo de tejido.
  5. Añadir 30 μl de Superfect directamente en el tubo de ADN diluido; vórtice esta mezcla por 10 s, dejar la mezcla a temperatura ambiente durante 5-10 min en la cultura de tejido campana para permitir la formación de complejo de transfección.
  6. Mientras que ocurre formación de complejos, aspirar suavemente el medio de crecimiento de la placa de cultivo DF1 celda y lavar cuidadosamente las células con 4 ml de PBS - / -.
  7. Pipetear 5 ml de crecimiento medio (contiene suero y antibióticos); guardar 4 ml a un tubo Falcon para el siguiente paso; y añadir el resto de 1 ml de medio de cultivo a los complejos de transfección. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo dos veces y transferir inmediatamente los complejos de transfección todo a las células DF1. Agitar para asegurar que la capa de células está cubierta; Incubar durante 2-3 horas a 37 o C.
  8. Aspirar la mezcla de transfección; lavar las células con 4 ml de PBS - / -, añadir 4 ml de medio de cultivo fresco (contiene suero y antibióticos); volver las células a una incubadora de 37 o C.
  9. Cuando las células alcanzan confluencia, paso de las células (expresión transitoria puede ensayarse 48 a 72 h después de transfección).
  10. Siguen pasar células para cerca de 7 días hasta que todas las células están infectadas presumiblemente; probar integración de ADN viral por PCR y determinar la expresión de proteínas por Western Blot; y congelar las células en medio DMEM con 10% DMSO y 20% suero bovino fetal.

3. En Vivo Infección de RIP-etiqueta; RIP-tva ratones

  1. concentración y colección de Virus
    uso concentrado recién virus infección en vivo. El título del virus mantenido en 4 o C dentro de una semana no se reduce significativamente. Sin embargo, alícuotas congeladas de acción viral Mostrar título reducido 10 veces a descongelar.
    1. Células de DF1 virus productor de expandir en platos 15 cm dependiendo de la cantidad de virus necesitada. Infección por el en vivo del ratón, preparar un promedio de una placa por ratón.
    2. Pre-enfriar el rotor (por ejemplo, SW28), el cubo de la oscilación y la máquina de la ultracentrífuga a 4 o C.
    3. Recoger sobrenadante de confluentes platos de 15 cm. Eliminar restos de células por centrifugación a baja velocidad a 1.650 x g durante 10 min a 4 o C.
    4. Transferir el sobrenadante viral a ultracentrífuga tubos (tubos de centrífuga de Polyallomer). Girar en una ultracentrífuga durante 1,5 horas en 95.400 x g 4 o C. Para la máquina de ultracentrífuga Beckman XL-100, utilice Accel: 1; Desaceleración: 1 ajustes.
      5. Tubos de
    5. eliminar sobrenadante de ultracentrífuga tanto como sea posibles. Añadir PBS sin calcio y magnesio (PBS - / -) al tubo de ultracentrífuga para hacer final 100 μl suspensión viral de un plato de 15 cm. Cubrir los tubos con Parafilm. Resuspender el precipitado viral invisible con un vórtex los tubos durante 2 min a velocidad media la ultracentrífuga.
    6. Roca los tubos ultracentrífuga a 4 o C durante una hora hasta toda la noche.
    7. Transferir la suspensión viral en un tubo de microcentrífuga. Calentamiento de la suspensión viral a temperatura ambiente antes de la inyección en ratones.
  2. Determinación de título viral.
    Para cada nueva construcción viral, título viral debe determinarse antes de la infección en vivo.
    1. Semilla DF1 células en todos los pocillos de una placa de cultivo de tejidos de 12 pozos (sugerencia: 2 x 10 4 células/pocillo, 1 ml/pocillo), de modo que sean 30% confluente en el momento de la infección. Una placa de 12 pozos es necesario para una determinación de título viral.
    2. Realizar una serie de diluciones 10 veces del sobrenadante viral en un medio como el siguiente:
      1. Mix 5 μl de sobrenadante viral con 495 μl de medio de crecimiento para la dilución 10 de 2 en un tubo de microcentrífuga. Vortex brevemente durante unos segundos.
        2. Dilución de 2
      2. tomar 40 μl de la 10 en 360 μl de medio de crecimiento en un tubo de microcentrífuga para la dilución 3 10. Vortex brevemente durante unos segundos.
      3. Siga el paso 3.2.2.2 10 4 y 10 dilución de 5.
        4. Tubos de
      4. set 5 de poliestireno de 6 ml. Medio de crecimiento de alícuotas 2.25 ml por tubo y etiqueta los 10 6 10 7 10 8 10 9, 10 10, respectivamente.
      5. Mezclar 0,25 ml de la dilución 5 10 con medio de crecimiento de 2.25 ml en 6 ml de tubo de poliestireno para la dilución 6 10. Vortex brevemente durante unos segundos.
      6. Siga el paso 3.2.2.5 10 7, 10 8 10 9 y 10 dilución 10.
      7. Separar el medio de cultivo original DF1 las células en la placa de la pozo 12. Poner virus 1 ml diluido a cada bien en duplicado (no infectados, 10 10 10 6 IU/ml).
    3. Permite a las células a crecer durante al menos 7 días (realizar trypsinzation cuando sea necesario). Recoger las células para aislar ADN y comprobar la presencia de ADN viral por PCR, como se describe en " 6. Protocolos de la polimerización en cadena ". Si este título viral 10 8 unidades infecciosas por ml (UI/ml), se observa un positivo 398 bp productos de la PCR de RCASBP usando la DNA de las células con 10 8 10 6 virus de UI/ml, pero no de células no infectadas o células con 10 10 10 9 Virus de UI/ml. Un título de > 1 x 10 8 unidades infecciosas por ml deben utilizarse para la infección en vivo.
  3. Inyección intracardiaca
    Hemizygous RIP-Tag, ratones no homocigóticos, se utilizan en este estudio. Hemizygous RIP-Tag ratones desarrollan tumores neuroendocrinos pancreáticos alrededor de 10 ~ 12 semanas de edad, mientras que ratones homocigotos tienen una latencia más corta del tumor. Debido a la proliferación celular se requiere para la incorporación del cDNA viral en el anfitrión genoma, 7 semanas de edad RIP-Tag; RIP-tva se utilizan ratones con células β pancreáticas hiperplásica. Tenga en cuenta que las células β más normales no proliferan en ratones adultos.
    1. Uso 7 semanas de edad RIP-Tag; RIP-tva ratones en un fondo puro de C57BL/C para los experimentos.
    2. Anesthetize ratón utilizando una combinación de ketamina/xilacina (150 mg/kg; 15 mg/kg). Utilizar apoyo de calor para mantener la temperatura corporal de ratón durante todo el período de anestesia.
    3. Aplicar lubricante ocular en ambos ojos para evitar la sequedad corneal.
    4. Afeitar pelo de la cavidad de pecho de RIP-Tag; RIP-tva ratones. Ratón de la posición de espaldas con el pecho hacia arriba. Una pizca del dedo del pie se realiza para observar el animal de no respuesta confirmar el efecto de anestesia completo.
    5. Extender la extremidad delantera y fíjelos con cintas. Mouse marca ' pecho de s para la inyección. Marque una mitad de ubicación entre la esternal y la parte superior del proceso de la xyphoid y ligeramente a la izquierda (anatómica) del esternón ( figura 2).
    6. Fregar la pared de pecho anterior con un scrub povidona-yodo o un scrub clorhexidina seguida por un 70% de alcohol isopropílico o etanol al 70% empapado gasa.
    7. Dibujar 50 μl de aire en una insulina estéril 28 g 1/2 jeringa para crear espacio entre el émbolo y el menisco de una jeringa μl 500 y luego elaborar 100 μl de los virus. El espacio de aire sin líquido en la pared es crucial para ver el pulso cardiaco.
    8. Mantener la aguja en posición vertical. Mantenga tensa con una mano la piel del ratón e Inserte la aguja en la ubicación marcada. Cuando un pulso rojo brillante de la sangre en la jeringa, deje de avanzar la aguja y fijar la profundidad de la aguja en el ratón con una mano.
    9. Otra parte atentamente y empuje lentamente el émbolo para proporcionar una suspensión viral (~ 100 μl volumen) durante un período de ~ 60 segundos. Entregar 10-20 μl cada vez que viendo un pulso rojo brillante de la sangre aparece en la jeringa. Continua entrada de roja sangre oxigenada en el cubo transparente de la aguja indica la colocación apropiada de la aguja hacia el ventrículo izquierdo.
    10. Después del último empujón del émbolo suspensión viral y antes de ver el siguiente pulso rojo de la sangre, rápidamente retraer la aguja fuera de la cavidad torácica.
    11. Aplique presión suave sobre el sitio de la inyección para reducir el sangrado durante al menos 1 min
    12. Cuidadosamente mueva el ratón sobre una almohadilla caliente o bajo una lámpara de calor hasta que plenamente consciente. Ratones se observará hasta que la anestesia desaparece por lo que puede caminar lejos de estímulos, un periodo generalmente dura aproximadamente una hora. Ratones se supervisará diariamente para incluso e intacta y los cambios en el comportamiento de.

4. Análisis histopatológico de los tumores

  1. nueve semanas después de la inyección, eutanasia 16 semanas de edad RIP-Tag; RIP-tva ratones. Registrar tamaños y número de tumores de páncreas primarios y cualquier metástasis brutas.
  2. Fix páncreas, hígado y otros órganos en el 10% tamponada con formol durante la noche a temperatura ambiente en una plataforma oscilante.
  3. Transferencia a los tejidos fijos en etanol al 70% en el día siguiente. Procesar los tejidos en secciones parafina-encajadas.
  4. Realizar coloración immunohistochemical para sinaptofisina (un marcador neuroendocrino) o insulina (un marcador de célula-específico β) tras fabricante ' instrucciones para identificar las metástasis de las células β pancreáticas en nodos de linfa pancreáticas o hígado. Sin embargo, tumor diferenciado de células o tumor pobremente diferenciado pueden perder la expresión de la insulina y sólo pueden ser detectados por inmunotinción synaptophysin.

5. In Vitro Infección de células expresando tva

no es necesario utilizar virus concentrados en vitro de infección. El protocolo descrito a continuación es para dos rondas de la infección. Más rondas de infección pueden realizarse repitiendo el protocolo siguiente.

  1. Recoger sobrenadante viral de células confluentes de DF1. Mantenga el sobrenadante viral a 4 o C infección dentro de una semana. Antes de la infección, pasar el sobrenadante viral a través de un filtro de 0.45 μm para obtener virus libres de células.
  2. Enjuague tva-expresar las células diana (es decir N134 β páncreas tumor célula línea celular de un RIP-Tag; RIP-tva ratón) con PBS - / - para eliminar los restos de suero, que contienen el inhibidor de la tripsina. Enjuague tva-expresar las células diana con solución de tripsina-EDTA (como 0.25% tripsina-2,21 mM EDTA). Añadir solución de tripsina-EDTA e incúbelos durante 2 minutos. Golpear suavemente la placa. Observar las células bajo un microscopio invertido. Células generalmente separación en 2 a 3 minutos las células diana de semillas en una placa de 6 cm. Uso 3 ~ 4 ml filtrada sobrenadante viral como medio de crecimiento.
    Nota: La nutrición en el sobrenadante viral es consumida por las células DF1, así que cambiar el medio al día siguiente.
  3. Al día siguiente, calentar suficiente cantidad de sobrenadante viral a temperatura ambiente. Retire el medio de las células diana y reemplazar con sobrenadante viral 3-4 ml.
  4. En el tercer día, paso de células según sea necesario. Si las células no son lo suficientemente densas para ser pasados, caliente ~ 4 ml de medio de crecimiento regular (DMEM con glucosa alta, 10% suero fetal bovino, 6 mM (concentración final) L-glutamina, 10 unidades/mL de penicilina, estreptomicina 10 de μg/mL) para reemplazar el sobrenadante viral.
  5. Expandir infectadas las células y examina la expresión de la proteína de candidato por Western Blot 19. Los efectos de los genes del candidato sobre la migración y la invasión pueden ser analizados en transwell ensayos. Estas líneas celulares se pueden también probar su potencial metastásico al hígado en un ensayo de vena de la cola para la metástasis.

6. Protocolos de PCR

soluciones deben ser montadas lo más rápidamente posible en hielo. Mastermix sin la plantilla se puede hacer para un gran número de muestras y alícuotas en tubos de PCR. Multiplique la cantidad de cada reactivo que sea necesitada por el número de muestras. Mezclar los reactivos de cajón anterior y agitar con la punta de la pipeta antes de tomar algunas para agregar al mastermix. Después de añadir cada reactivo al tubo de mastermix, pipeta hacia arriba y hacia abajo para entregar cualquier residuos dentro de los consejos de.

  1. Para detectar la presencia de RCASBP en las células infectadas o transfected.
    El siguiente protocolo pide 11.5 μl del mastermix y 1 μl de ADN genómico de cada muestra. Asegúrese de agitar antes de añadir cada reactivo.
    1. Preparar un mastermix de 7.68 μl de agua libre de nucleasa, 0.75 de μl DMSO, 1.25 μl de tampón 10 x II para AmpliTaq DNA polimerasa, 1.375 μl de 25 mM MgCl 2 y 0.125 μl de dNTP 25 mM.
    2. Añadir 0.125 μl de cebador forward de 100 μm RCAS5626F: (5 ' - ACCGGGGGATGCGTAGGCTTCA - 3 ') y 0,125 μl de 100 μm inversa primer RCAS6023R: (5 ' - CCGCAACACCCACTGGCATTACC - 3 ') al mastermix.
    3. Añadir μl 0.075 AmpliTaq DNA polimerasa para el mastermix.
    4. Mezclar el mastermix agitando el tubo con los dedos. Desactivación de la matermix en una centrifugadora máquina brevementey para 3 ~ 5 segundos.
      5. Tubos de PCR
    5. alícuota 11.5 μl del mastermix a cada individuo. Remolino cada vez antes de tomar a un tubo nuevo.
    6. Remolino y añadir 1 μl genomic DNA plantilla a cada tubo PCR. Para preparar la DNA de genomic:
      1. Lyse precipitado de células en 200 μL de 0.05 M NaOH. Pipeta hacia arriba y hacia abajo para disolver el precipitado.
      2. Calentar la célula lisada a 98 ° C por 20 minutos en una máquina PCR, y luego enfriar a 25 ° C.
      3. Añadir 20 μL 1.0 M Tris-HCl (pH 7.5) para los tubos y almacén de muestras de la DNA en 4 ° C.
    7. Mezclar las muestras por chasquear y centrifugar brevemente durante 3-5 segundos. Poner tubos en una máquina PCR.
    8. Condiciones de la PCR se establece por 2 min a 92 ° C para la desnaturalización inicial, seguida de 40 ciclos de 30 s a 94 ° C para la desnaturalización, 30 s a 67° C para recocido, 30 s a 72 ° C por extensión y 10 m a 72 ° C para la extensión final.
    9. Al finalizar la PCR, agregar 3 μl de 6 x tinte carga de ADN a cada muestra. Mix de chasquear y centrifugar brevemente durante 3 ~ 5 segundos.
    10. Productos de la PCR son examinados por electroforesis en un gel de agarosa al 2% (p/v) en buffer de x TAE 1. El tamaño de su producto PCR es de 398 BP
  2. Genotyping etiqueta.
    El siguiente protocolo pide 10,5 μl del mastermix y 2 μl de ADN genómico de cada muestra. Asegúrese de agitar antes de añadir cada reactivo.
    1. Preparar un mastermix de 4.5 μl de agua libre de nucleasas y 4.00 μl 5 x Buffer de reacción MyTaq para polimerasa de la DNA MyTaq.
    2. Agregar 0,4 μL de cebador forward de 100 μm TagF2: (5 ' - GGACAAACCACAACTAGAATGCAGTG - 3 ') y 0,4 μL de 100 μm inversa primer TagR2: (5 ' - CAGAGCAGAATTGTGGAGTGG - 3 ') a la mezcla principal.
    3. Añadir 0,8 μl de 10 μm precursor beta-2-microglobulina (B2m) cartilla mezcla el control interno. Cartillas de la polimerización en cadena para B2m el control interno, precursor de la beta-2-microglobulina (B2m), son F B2 (5 ' - CACCGGAGAATGGGAAGCCGAA - 3 ') y B2 (5 ' - TCCACACAGATGGAGCGTCCAG - 3 ').
    4. Añada 0.4 μL MyTaq polimerasa de la DNA para el mastermix.
    5. Mezclar el mastermix agitando el tubo con los dedos. Desactivación del mastermix en máquina de la centrifugadora para 3 ~ 5 s.
      6. Tubos de PCR
    6. μl de 10.5 alícuota desde el mastermix a cada individuo. Remolino cada vez antes de tomar a un tubo nuevo.
    7. Remolino y añadir 2 μl genomic DNA plantilla a cada tubo PCR. ADN genómico está preparado como se describe arriba.
    8. Mezcle la solución agitando y centrifugar brevemente durante 3-5 segundos. Poner tubos en la máquina PCR.
    9. Condiciones de la PCR se establece por 3 min a 95° C para la desnaturalización inicial, seguida de 35 ciclos de 15 s a 95 ° C para la desnaturalización, 15 s a 65 ° C para recocido, 30 s a 72 ° C por extensión y 10 min a 72 ° C durante la extensión final.
    10. Al finalizar la PCR, agregar 3 μl de 6 x carga colorante a cada muestra. Mix de chasquear y centrifugar brevemente durante 3 ~ 5 segundos.
    11. Productos de la PCR son examinados por electroforesis en gel de agarosa al 2% (p/v) en buffer de x TAE 1. Los tamaños de etiqueta y B2m PCR productos son ~ 450 bp y 300 bp, respectivamente.
  3. genotyping tva.
    El siguiente protocolo pide 10,5 μl de la mezcla de reactivo para cada muestra. Asegúrese de agitar antes de añadir cada reactivo.
    1. Preparar un mastermix de 5,6 agua libre de nucleasa μl, 0,5 μl DMSO, 1.25 μl de 10 x Buffer II de AmpliTaq DNA polimerasa, 1.375 μl de 25 mM MgCl 2 y 0.125 μl de dNTP 25 mM.
    2. Añadir 0.125 μl de 100 μm tva-3 (5 ' - GCCCTGGGGAAGGTCCTGCCC - 3 ') y 0,125 μl de 100 μm tva-5 (5 ' - CTGCTGCCCGGTAACGTGACCGG - 3 ') al mastermix.
    3. 1,275 añadir μl de 10 μm B2m cartilla mezcla el control interno para el mastermix.
    4. Añadir μl 0.125 AmpliTaq DNA polimerasa para el mastermix.
    5. Mezclar el mastermix agitando el tubo con los dedos. Desactivación del mastermix en máquina de la centrifugadora brevemente durante 3-5 segundos.
      6. Tubos de PCR
    6. μl de 10.5 alícuota desde el mastermix a cada individuo. Remolino cada vez antes de tomar a un tubo nuevo.
    7. Remolino y añadir plantilla de ADN genómico de 2µL a cada tubo PCR. ADN genómico está preparado como se describe arriba.
    8. Mezcle la solución agitando y centrifugar brevemente para 3-5 s. pone tubos en máquina PCR.
    9. Condiciones de la PCR se establece por 2 min a 92 ° C para la desnaturalización inicial, seguida de 35 ciclos de 30 s a 94 ° C para la desnaturalización, 30 s a 60° C para recocido, 30 segundos a 72 ° C durante la extensión y a 10 minutos a 72 ° C para la extensión final.
    10. Al finalizar la PCR, agregar 3 μl de 6 x carga colorante a cada muestra. Mix de chasquear y centrifugar brevemente durante 3-5 s.
    11. Productos de la PCR son examinados por electroforesis en un gel de agarosa al 2% (p/v) en buffer de x TAE 1. Los tamaños de tva y los productos de PCR de B2m son 500 bp y 300 bp, respectivamente.

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Representative Results

La tasa de infección en vivo y en vitro de RIP-Tag; RIP-tva las células del tumor por los virus de RCASBP ~ 20% y el ~ 80% respectivamente son 20. En la etiqueta de RIP ; RIP-tva modelo del ratón, aproximadamente 4% de los islotes pancreáticos 400 en cada ratón naturalmente se convertirán en tumores 20; por lo tanto hay una cantidad suficiente de células del tumor en cada ratón para análisis histológico y fenotípico del efecto potencial de los genes de los virus. Usando este sistema, una nueva función nuclear de Bcl-xL en metástasis fue identificado 9. RIP-Tag; RIP-tva ratones infectados con RCASBP -Bcl-xL exhiben una mayor incidencia de carcinomas invasivos que ratones infectados con virus de control, RCASBP -ALPP (96% vs 74%). Además, el 47% de RCASBP -Bcl-xL-infectados RIP-Tag; RIP-tva ratones desarrollaron metástasis en los ganglios linfáticos pancreáticos cuando sacrificados en 16 semanas de edad (Figura 3A), mientras que no fue encontrada ninguna metástasis en ratones de control 20.

Por otra parte, defendimos a una biblioteca de genes del cáncer en RIP-Tag; RIP-tva ratones e identificó el primer gen que promueve la metástasis a los ganglios linfáticos pancreáticos y el hígado 21 (figura 3B y 3C). Este gen codifica el Receptor para la proteína de motilidad mediada por ácido hialurónico isoform B (RHAMMB) y activa 21de señalización de EGFR. Hemos demostrado que metástasis de hígado-específica puede ser recapitulada en un ensayo de la vena de la cola de metástasis experimental en el que las células del tumor N134 inicialmente circularon a través de las camas de capilar pulmonar del receptor ratones inmunodeficientes 21.

Figure 1
Figura 1 : Esquema de constructos RCASBP(A), X RCA y RCA-Y. Sitios de clonación se indican en letra negrita, azul. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Colocación de la inyección intracardiaca. Puntos anatómicos se muestran con líneas punteadas horizontales sobre el esternón (contorneado en color blanco). En la piel del ratón, el proceso de la xyphoid y esternal sirven como puntos de referencia, y la aguja se inserta 1 mm del esternón medio y ligeramente a la izquierda (anatómica) del esternón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Detección de metástasis pancreática β células immunostaining. Las fotografías muestran coloración de synaptophysin representante de tumores neuroendocrinos pancreáticos metastásicos en ganglios pancreáticos (A, B) o en el hígado (C). RIP-Tag; RIP-tva ratones fueron infectados con el retrovirus RCASBP indicados en 7 semanas de edad y sacrificados a las 16 semanas de edad. Barra de escala = 50 μm. magnificación Original = 20 X. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este estudio, hemos descrito un modelo de ratón poderoso, RIP-Tag; RIP-tva, lograr el parto génica somática mediante retrovirus aviares para la identificación y caracterización de factores metastáticos. Aunque RIP-Tag; RIP-tva ratones desarrollan tumores neuroendocrinos pancreáticos, metástasis factores identificados en este modelo de ratón también pueden promover la metástasis de otros tipos de cáncer.

Nuestro enfoque tiene la ventaja de introducir cambios genéticos somáticos específicamente en lesiones premalignas de las células β pancreáticas en una forma de control de tiempo, así mímico más fiel desarrollo del tumor humano esporádico. Este enfoque evita cualquier perturbación potencial de formación de tejido normal, que se observa a menudo en modelos transgénicos convencionales debido a la expresión ectópica del gen de interés durante el desarrollo. Además, es mucho más rápido para generar aviares vectores retrovirales portadores de genes de interés que a generar ratones transgénicos. Derivados de RCASBP aviar vector retroviral puede ofrecer cADN (≤2.5 kb), shRNAs, miRNAs y otros RNAs noncoding a tva-expresar las células in vitro e in vivo. La eficiencia de la infección (infección múltiple) depende de la tasa de proliferación de las células diana y la accesibilidad de las células. Un título de > 1 x 108 unidades infecciosas por ml se requiere para la infección en vivo . Una entrega más eficiente viral puede ser alcanzado en vitro debido a la proliferación celular inducida y la posibilidad de exposición repetitiva de todas las células a virus.

Técnica de inyección intracardiaca precisa es crítica para la viabilidad de los ratones. En primer lugar, 50 μl de espacio de aire en una jeringa de insulina antes de elaborar la suspensión viral es crucial para ver el pulso cardiaco. En segundo lugar, es importante para fijar la posición de la jeringa, una vez que aparezca un pulso rojo de la sangre y para entregar lentamente suspensión viral de 10-20 μl cada vez que viendo un pulso rojo brillante de la sangre aparece en la jeringa. Si deja de pulsos rojo brillantes de la sangre después de la entrega de la suspensión viral de 10-20 μl, ayudará a reposicionar un poco la aguja. En tercer lugar, después del último empujón del émbolo para entregar suspensión viral y antes de ver el pulso de la sangre, la aguja debe retraerse rápidamente fuera de la cavidad torácica y una ligera presión sobre el sitio de la inyección le ayudará a reducir la hemorragia interna. Por último pero no menos importante, no reutilizar la jeringa de insulina en otro ratón.

Para futuras aplicaciones, de esta RIP-Tag; RIP-tva modelo de ratón se puede combinar con otros modelos de ratón transgénico, knock-in y golpe de gracia. Por otra parte, tenemos la visión de combinar este RIP-Tag; RIP-tva modelo de ratón con la herramienta de edición del genoma CRISPR Cas9 para generar mutaciones puntuales, canceladura, reordenamientos genómicos como inversiones y translocaciones 22.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Harold Varmus, Brian C. Lewis, Douglas Hanahan, Danny Huang, Sharon Pang, Megan Wong y Manasi M. Godbole. Y.C.N.D. es apoyado por subvenciones de DOD W81XWH-16-1-0619 y NIH grant 1R01CA204916.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RCASBP-Y DV plasmid Addgene 11478
RCAS-RNAi plasmid Addgene 15182
DMEM Corning 10-013-CV
fetal bovine serum Atlanta Biologicals 25-005-CI
L-glutamine, 100x Corning 25-005-CI
Penicillin-Streptomycin solution, 100x Corning 30-002-CI
PBS-/-, 1x Corning 21-040-CV
Superfect Qiagen 301305
Polyallomer centrifuge tube Beckman Coulter 326823
0.45 mm Nalgene
Syringe Filters with PES Membrane		 Thermo Scientific 194-2545
Insulin Syringes BD 329461
synaptophysin Vector Laboratories VP-S284
VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG) Vector Laboratories PK-6101
AmpliTaq DNA Polymerase with Buffer II Life Technologies N8080153
MyTaq DNA Polymerase Bioline BIO-21106

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References

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Investigación de cáncer número 128 ratón modelo transferencia génica somática de metástasis RCA etiqueta de RIP RIP-tva
Identificación y caracterización de factores metastásicos por transferencia de genes dentro de la novela <em>RIP-etiqueta; RIP-tva</em> modelo murino
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Zhang, G., Chi, Y., Du, Y. C. N.… More

Zhang, G., Chi, Y., Du, Y. C. N. Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model. J. Vis. Exp. (128), e55890, doi:10.3791/55890 (2017).

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