Summary
Biz bir roman somatik gen aktarım sistem RIP-etiket kullanmak göstermek için bir iletişim kuralı mevcut; RIP-tva metastaz genlerinde fonksiyonu çalışmaya fare modeli. Kuş Retrovirüsler gen transferi önceden Malign, invaziv olmayan lezyonlar yetişkin farelerde pankreas β hücrelerinin içine sağlamak için intracardiacally teslim edilir.
Abstract
Metastatik kanser ölümleri solid tümör olan hastalarda yüzde 90'ını hesapları. Kanser metastaz sürücüleri daha iyi anlamak için ve yeni tedavi hedefleri belirlemek için acil bir ihtiyaç vardır. İlerleme birincil kanser metastaz için sürücü moleküler olayları araştırmak için bir bitransgenic fare modeli, RIP-Tag geliştirdik; RIP-tva. Bu fare modelinde, sıçan insülin organizatörü (RIP) pankreas beta hücrelerinde SV40 T antijen (etiket) ve reseptör alt grubu bir kuş lökozu virüs (tva) için ifade kullanıyor. Fareler pankreas nöroendokrin tümörlerin % 100 alellerle Hiperplazi, anjiogenez, adenoma ve invaziv karsinom gibi aşamaları ile insan tumorigenesis için benzer iyi tanımlanmış aşamalarla ile geliştirmek. Çünkü RIP-etiket; RIP-tva fareler metastatik hastalık geliştirmek değil, metastaz teşvik genetik değişikliklere kolayca belirlenebilir. Somatik gen aktarım tva ifade, pankreas β Proliferasyona premalign lezyonlar elde edilir kuş Retrovirüsler istenen genetik değişikliği barındıran İntrakardiyak sızdırma yoluyla. Bir titresi > ml başına 1 x 108 bulaşıcı birim vivo içinde enfeksiyon için uygun kabul edilir. Buna ek olarak, kuş Retrovirüsler tümörler RIP-etiket içinde türetilmiş hücre hatları bulaşabilir; RIP-tva fareler yüksek verimlilik ile. Hücre hatları metastatik faktörler karakterize etmek için de kullanılabilir. Burada nasıl bu fare modeli kullanmak ve tümör metastazı aday genler işlevleri değerlendirmek için satırları hücre göstermektedir.
Introduction
En kanserleri somatik mutasyon 1ile ortaya çıkmaktadır. Geleneksel genetiği fare modelleri (et) tumorigenesis 2için belirli genetik değişiklik katkısını önemli anlayışlar hazırladık. Ancak, bazı sınırlamaları vardır. Bu modellerin en büyük dezavantajı sadece bir doku bazı hücrelerde genetik değişiklikler elde insanlarda tümör oluşumu sporadik doğası çoğaltılmaz var. Transgenik ve nakavt fareler mutasyonların da germline geliştirme etkiler için potansiyeli vardır. Ayrıca, bu fare modelleri üreten pahalı ve zaman alıcı olduğunu.
Metastaz kanser alanında önemli bir konudur. Metastaz modelleme et içinde zor olmuştur. Spontan metastaz fare nadirdir. Alellerle değişken ve gecikme süresi uzun metastaz 3et içinde. Metastatik cascade erken adımda ortadan kalkar böylece deneysel metastaz modelleri fareler, dolaşımı içine direkt enjeksiyon hücre istihdam.
Bazı fare modelleri metastatik faktörler eğitim yukarıdaki sınırlamaları aşmak için bir bitransgenic fare modeli, RIP-Tag geliştirdik; RIP-tva4. Strateji alt grubu-A kuş lökozu virüs, tva 6,7için bir son derece senkronize tümör ilerleme fare modeli, RIP-etiket 5ve reseptör kullanımını birleştirerek üzerinde temel alır. Bu RIP-etiket; RIP-tvafare modeli gen somatically bir tek bitransgenic fare yük sunulmasına olanak sağlar. Rb ve p53 Tümör baskılayıcı fonksiyonlarını baskılayarak SV40 T antijen ile fareler Hiperplazi, anjiogenez, adenoma ve invaziv karsinom gibi aşamaları ile pankreas nöroendokrin tümör insan tumorigenesis benzer bir şekilde geliştirin. Bu RIP-Tag model kanser, bunlarla sınırlı olmamak için pankreas nöroendokrin tümör işaretlerinden anlayışımız için çok öğretici oldu. Preklinik denemeler 8' de kullanılmaktadır.
Biz kuş Retrovirüsler intracardiacally enjeksiyonuyla RIP-etiket içine somatik gen transferi için bir iletişim kuralı mevcut; RIP-tva fareler. Kuş Retrovirüsler RCASBP elde edilen başarılı enfeksiyonu aktif Proliferasyona hedef hücrelerin gerekli. Bu nedenle, RIP-Tag seçti; RIP-tva fareler, 7 hafta-in yaş, ne zaman Hiperplazi pankreas adacıkları yaklaşık % 50 geliştirir. Sol ventrikül İntrakardiyak enjeksiyon yüksek titresi virüslerin % 10-20 4bir enfeksiyon verimlilik elde etmek için gereklidir. Virüs pankreas adacıkları ulaşmadan bu teslim yöntemi dolaşım içinde viral parçacıkların önemli seyreltme azaltır.
Bu yaklaşımı kullanarak, daha önce Bcl-xL kanser metastaz onun anti-apoptotik işlev 4,9/ bağımsız teşvik göstermiştir. BCL-xL RIP-etiket tumorigenic Ontojeni boyunca tüm pankreas β hücrelerindeki bir transgene ile ifade edildi zaman bu anti-apoptotik-bağımsız metastatik işlev gözlenen değil; RIP-Bcl-xL fare modeli 10. Bu nedenle, bizim fare modeli tanımlamak ve tumorigenesis daha sonraki bir aşamada ifade genler işlevleri tanımlamak için eşsiz bir fırsat sunmaktadır. Çünkü adacıkları % 2-4'ü geliştirmek tümörler RIP-Tag; içinde içine RIP-tva bitransgenic fareler viral enfeksiyon ve tüm premalign lezyonlar olmadan RCASBP elde edilen kuş Retrovirüsler ile enfekte, sadece tumorigenesis doğal seyri üzerinde seçici bir avantaj görüşmek faktörler belirlenebilir. Özellikle, pankreas lenf düğümleri veya diğer organlara metastaz normalde RIP-Tag oluşmaz çünkü metastatik faktörler en kolay bu yöntem tarafından tanınır; RIP-tva fareler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
etik beyanı: deneylerin hayvanlar üzerinde yönergeleri ve ileri hayvan bakım ve kullanım Komitesi Weill Cornell Tıp Enstitüsü tarafından belirlenen düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilen.
1. seçim kuş Retroviral vektörler (RCASBP A-esaslı ya da RCANBP(A)-based)
- vektörler Rous sarkomu virüs 11 ' den elde edilen. Kuş retroviral vektörler cDNAs sunabilirsiniz (≤ 2,5 kb), kısa saç tokası RNA'ların (shRNAs), mikroRNA (miRNAs) ve diğer kodlamayan RNA'ların. Piyasada bulunan vektörel çizimler malzemeleri listelenir ve diğerleri doğrudan yazarlardan istenmesi gerekiyor.
- Genler ilgi overexpress için aşağıdaki vektörel çizimler, birini kullanın RCASBP(A) 12 ( şekil 1A), RCAS-X ( şekil 1B), RCAS-Y 13 ( şekil 1 c), RCASBP-Y DV 14 veya diğer ALV-A vektörel çizimler (https://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/mice.html).
- Gen shRNA tarafından ilgi çalmak için aşağıdaki vektörel çizimler birini kullanın: RCAN-X DV 15 veya RCAS RNAi 16.
- MiRNAs overexpress için 17 ' açıklandığı gibi RCAS-miR vektör oluşturmak.
- E. coli ve DNA gereksinimi dönüşmenin.
- Tercihen doğrudan yineleme ve retroviral diziler dengelemek için benzersiz genotip olan Stbl2 veya Stbl3 yetkili hücrede, DNA dönüşümü. Saf, verecek bir yöntemle plazmid DNA arındırmak transfection sınıf DNA. DNA'ın 5 µg 0.1 µg/µl en düşük konsantrasyon ile gereklidir.
2. Tavuk Fibroblast DF1 hücre kültürünü viral yayılmasında
- hücre kültürü çapraz-bulaşıcı viral önlemek için gereklidir için filtre uygulanmış pipet ipuçları kullanımını 18 stokları.
- Büyüme ile 6 cm çanak hücrelerde korumak DF1 orta (DMEM yüksek glikoz, % 10 fetal sığır serum, 6 mM (son konsantrasyonu) ile L-glutamine, 10 adet/ml penisilin, 10 µg/ml streptomisin) 37 o C ve %5 CO 2. İzin verirseniz DF1 hücreleri taze donmuş stokları çözdürülen, onları en az 3 gün önce transfection için kültür.
- Transfection anda % 30-50 birleşmesi olacak ki bir gün önce transfection, 6 cm doku kültürü çanak DF1 hücreleri geçmek.
- DMEM (olmadan serum, penisilin veya streptomisin) ile saf viral DNA seyreltik 5 µg microcentrifuge tüp bir doku kültürü başlık içinde 150 µl toplam hacmiyle.
- Superfect ekleyin 30 µL seyreltilmiş DNA tüp içine doğrudan; girdap bu karışımı 10 s; oda sıcaklığında 5-10 dk doku kültüründe karisimin hood transfection-kompleks oluşumu izin vermek için bırakın.
- Karmaşık oluşumu gerçekleşir, yavaşça DF1 hücre kültür çanak büyüme ortamından Aspire edin ve dikkatle 4 ml PBS - / - hücrelerle yıkayın. (Serum ve antibiyotik içeren);
- damlalıklı 5 ml büyüme orta Falcon tüp sonraki adıma; 4 ml kaydedin ve büyüme orta 1 ml geri kalanı transfection kompleksleri için ekleyin. Yukarı ve aşağı iki kez pipetting karıştırın ve hemen bütün transfection kompleksleri DF1 hücrelere aktarın. Girdap hücre katmanı kaplı emin olmak için; 2-3 saat 37 o C., kuluçkaya
- Transfection karışımı Aspire edin yıkama hücreleri ile 4 ml PBS - / - 4 ml taze büyüme orta (içeren serum ve antibiyotik) ekleyin; 37 o C kuluçka hücreleri iade.
- Hücre confluency ulaştığınızda, hücreleri (geçici ifade denetlesinler 48 ila 72 h transfection sonra) geçiş.
- Devam yaklaşık 7 gün kadar tüm hücreleri muhtemelen enfekte hücreleri geçmek; viral DNA entegrasyon tarafından PCR testi ve Western Blot tarafından; protein ifadesini belirleyin ve DMEM orta % 10 DMSO ve % 20 fetal sığır serum ile hücrelerde dondurmak.
3. Vivo RIP-Tag enfeksiyon; RIP-tva fareler
- virüs toplama ve konsantrasyon
Kullanım taze vivo içinde enfeksiyon virüs yoğunlaşmıştır. Bir hafta içinde 4 o C sürekli virüs titresi azaltılacağını değil. Bununla birlikte, viral stok donmuş aliquots çözdürme üzerine 10 kat azaltılmış titresi görüntüler.- Genişletme virüs-yapımcı DF1 hücreleri içine gerekli virüs miktarına bağlı olarak 15 cm yemekler. Vivo içinde fare enfeksiyon için bir plaka fare başına ortalama hazırlayın.
- Rotor (örneğin, SW28), salıncak kova ve ultracentrifuge makinesi 4 o C. önceden chill
- Toplamak süpernatant Konfluent 15 cm yemeklerin. Düşük hızlı Santrifüjü 1.650 x g 10 dk 4 o C. az için hücre artıkları çıkarın
- Ultracentrifuge tüpler (Polyallomer santrifüj tüpleri) viral süpernatant aktarın. Bir ultracentrifuge 95,400 x g 4 o C. 1,5 saat spin Beckman XL-100 ultracentrifuge için Accel çekebilir: 1; Düşüş: 1 ayarlar.
- Kaldır süpernatant ultracentrifuge üzerinden tüpler mümkün olduğu kadar. PBS kalsiyum ve magnezyum (PBS - / -) son 100 µl viral süspansiyon bir 15 cm yemek yapmak için ultracentrifuge tüp ekleyin. Parafilm ile tüplerin kapak. Görünmez viral pelet tarafından ultracentrifuge tüpleri Orta hızda 2 min için vortexing resuspend.
- 4 o C gece bir saat, ultracentrifuge tüpleri rock.
- Viral süspansiyon microcentrifuge tüp içine aktarın. Viral süspansiyon için oda sıcaklığında fareler içine enjeksiyon önce ısınmak.
- Viral titresi belirlenmesi.
Her yeni viral yapı için viral titresi vivo içinde enfeksiyon önce belirlenmesi gerekiyor.- Tohum DF1 hücreler 12-iyi doku kültürü plaka bütün Wells (öneri: 2 x 10 4 hücreleri/iyi, 1 ml/da), böylece enfeksiyon anda % 30 birleşmesi olacak. Bir 12-şey plaka bir viral titresi belirlenmesi için gereklidir.
- Büyüme aracı olarak aşağıdakileri de viral süpernatant ile 10 kat dilutions bir dizi yapmak:
- Mix 5 µl viral süpernatant ile 495 µl büyüme orta microcentrifuge tüp içinde 10 2 seyreltme için. Kısa bir süre için bir kaç saniye girdap.
- Al 40 µl 10 2 seyreltme 360 µl büyüme orta 10 3 seyreltme için bir microcentrifuge tüp içine. Kısa bir süre için bir kaç saniye girdap.
- Takip adım 3.2.2.2 10 için 4 ve 10 5 seyreltme.
- Set 5 6 ml polistiren yukarı tüpler. Aliquot 2,25 ml büyüme orta tüp ve etiket onları 10 6, 10 başına 7, 10 8, 10 9, 10 10, sırasıyla.
- Mix 10 0.25 ml 5 seyreltme 2,25 ml büyüme aracı olarak 10 6 seyreltme için 6 ml polistiren tüp ile. Kısa bir süre için bir kaç saniye girdap.
- Takip adım 3.2.2.5 10 7, 10 8, 10 9 ve 10 10 seyreltme.
- 12-şey plaka üzerinde DF1 hücrelerden özgün kültür orta kaldırın. Her iyi çoğaltılamaz için 1 ml sulandırılmış virüs koymak (bulaşmamış, 10 10 10 6 IU/ml).
- Hücreleri (gerçekleştirmek trypsinzation gerektiğinde) en az 7 gün boyunca büyümeye izin. DNA ve viral DNA PCR tarafından varlığı için kontrol açıklandığı gibi izole etmek için hücreleri toplamak " 6. PCR iletişim kuralları ". Eğer bu viral titresi ml (IU/ml) başına 10 8 bulaşıcı adet, 10 ile hücrelerden DNA'yı kullanarak bir pozitif 398 bp PCR Urun RCASBP gözlenir 8 10 6 IU/ml virüs, ancak hastalık bulaşmamış tek hücre veya hücreleri ile 10 10 10 9 IU/ml virüs. Bir titresi > ml başına 1 x 10 8 bulaşıcı birim vivo içinde enfeksiyon için kullanılması gerekir.
- İntrakardiyak enjeksiyon
Hemizygous RIP-Tag fareler, değil homozigoz farelerin, bu çalışmada kullanılır. Hemizygous RIP-Tag fareler geliştirmek pankreas nöroendokrin tümörlerin yaklaşık 10 ~ 12 hafta-in yaş, homozigoz farelerin daha kısa bir tümör gecikme süresi varken. Hücre çoğalması viral cDNA birleşme ev sahibi içine gerekli olduğundan genom, 7-hafta-yaşlı RIP-etiket; RIP-tva fareler hyperplasic pankreas beta hücreleri ile kullanılır. Unutmayın ki en normal β hücreleri yetişkin fareler Proliferasyona değil.- Kullanım 7 haftalık RIP-etiket; RIP-tva deneyler için saf C57BL/C arka plan farelerde.
- Anesthetize fare (150 mg/kg; 15 mg/kg) ketamin/xylazine birleşimiyle. Anestezi tüm dönem boyunca fare vücut ısısını korumak için ısı desteğini kullanın.
- Her iki gözün kornea kurutma önlemek için göz yağ uygulamak. RIP-Tag göğüs boşluğuna
- tıraş saç; RIP-tva fareler. Pozisyon fare yukarı dönük olacak şekilde göğüs ile sırtında. Bir ayak parmağı-çimdik sigara tam anestezi etkisi onaylamak duyarlılık için hayvan gözlemlemek için gerçekleştirilir.
- Açık bacak uzatmak ve onları şeritler, güvenli. Mark fare ' s göğüs enjeksiyon için. Sternal çentik ve üst xyphoid sürecinin arasında bir yerde orta işaretlemek ve biraz (sternum ( Şekil 2) anatomik) sol.
- Bodur ön göğüs duvarı bir povidone-iyot fırçalayın ya da bir klorheksidin bodur ile takip bir % 70 izopropil alkol veya % 70 etanol tarafından batırılmış gazlı bez sünger.
- Steril 28 g ½ insülin içine hava çizmek 50 µl dalgıç ve Menisküs 500 µL şırınganın arasında boşluk oluşturmak için şırınga ve virüs 100 µl kadar çizin. Hava alanı duvarda herhangi bir sıvı olmadan kalp nabız kabul ettiğiniz için çok önemlidir.
- Tutun iğne dik. Fare derinin gergin bir elinizle tutun ve iğne işaretli konuma yerleştirin. Parlak kırmızı nabzı kan şırıngada görüntülendiğinde, iğne ilerleyen durdurmak ve iğne derinliği içinde fare ile bir yandan düzeltmek.
- Öte yandan dikkatli kullanın ve yavaş yavaş bir ~ 60 saniyelik bir süreçte viral süspansiyon (~ 100 µl cilt) teslim etmek pistonu itin. Parlak kırmızı nabzı kan görmek görünür zaman şırıngada 10-20 µl teslim. Şeffaf iğne hub içine kırmızı oksijenli kan sürekli giriş gösterir uygun iğne sol ventrikül konumlandırma.
- Viral süspansiyon teslim ve kan sonraki kırmızı darbe görmeden önce hızlı bir şekilde iğne göğüs boşluğu dışında geri çekmek için dalgıç son basarak sonra.
- En az 1 dk. için kanamayı azaltmak için enjeksiyon izi üzerinde hafif basınç uygula
- Dikkatli bir Isıtma yastığı üstüne veya altında a ısı lamba bilinci kadar fareyi hareket ettirin. Böylece uzak bir çekim gücü, yürüyüş yapabilirsiniz anestezi etkisi kadar fareler izledim genellikle yaklaşık bir saat süren bir dönem. Fareler izlenen her gün hatta ve sağlam ceket ve davranış değişiklikleri için.
4. Tümör histopatolojik analizi
- dokuz hafta sonra enjeksiyon, ötenazi 16 haftalık RIP-etiket; RIP-tva fareler. Kayıt birincil pankreas tümörleri ve herhangi bir brüt Metastazlari numaralarını ve boyutunu.
- Düzeltme pankreas, karaciğer, ve/veya % 10 diğer organlara arabelleğe alınmış formalin gecede, oda sıcaklığında sallanan bir platformda.
- Sabit dokular ise ertesi gün % 70 etanol aktarın. İşlem dokuları parafin gömülü bölümlere. Synaptophysin (nöroendokrin marker) ya da insülin (bir β hücre özgü marker) Üretici takip için boyama
- gerçekleştir immunohistokimyasal ' s yönergeleri Metastazlari pankreas β hücrelerinin pankreas lenf düğümleri tanımlamak için ya da karaciğer. Ancak, de-farklılaştırılmış tümör hücreleri veya kötü farklılaştırılmış tümör hücreleri insülin ifade kaybedebilir ve sadece synaptophysin immunostaining tarafından tespit edilebilir.
5. Vitro Enfeksiyon tva ifade hücre
konsantre virüs vitro enfeksiyon için kullanmak gerekli değildir. Aşağıda açıklanan enfeksiyon iki tur için protokolüdür. Daha fazla mermi enfeksiyon gerçekleştirilen aşağıdaki protokol yineleyerek.
- Toplamak viral süpernatant Konfluent DF1 hücrelerden. Viral süpernatant 4 o C enfeksiyonu bir hafta içinde tutun. Önce enfeksiyon, viral süpernatant boş hücre virüs elde etmek için 0,45 mikron filtreden geçmek.
- Kısaca tva ifade hedef hücreleri (yani N134 pankreas β hücre tümör hücre satırından bir RIP-Tag; durulama RIP-tva fare) Serum tüm izlerini silmek için PBS - / - ile aşağıdakileri içeren tripsin inhibitörü. Kısaca tva ifade hedef hücreleri tripsin-EDTA (örneğin % 0.25 tripsin 2.21 mM EDTA) çözüm ile yıkayın. Tripsin-EDTA çözüm ekleyin ve 2 dakika boyunca kuluçkaya. Plaka hafifçe dokunun. Hücreleri ters bir mikroskop altında gözlemlemek. Hücreleri genellikle 2-3 dk. içinde tohum hedef hücreleri bir 6 cm tabak bağlantısını kesin. Kullanım 3 ~ 4 ml filtre büyüme aracı olarak viral süpernatant.
Not: Viral süpernatant beslenmesinde DF1 hücreleri tarafından tüketilir, bu yüzden ertesi gün orta değiştirin. - Sonraki gün, yeteri kadar viral süpernatant oda sıcaklığına kadar sıcak. Orta hedef hücrelerdeki kaldırmak ve 3-4 ml viral süpernatant ile yerine.
- Üçüncü günde, geçiş hücreleri gerektiği gibi. Hücreleri pasajlı için yoğun değilseniz, normal büyüme ortamının kadar ~ 4 ml sıcak (DMEM yüksek glikoz, % 10 fetal sığır serum, 6 mM (son konsantrasyonu) ile L-glutamine, 10 adet/mL penisilin, 10 µg/mL streptomisin) viral süpernatant yerine.
- Genişletme hücreleri enfekte ve Western Blot 19 tarafından aday protein ifade inceleyin. Aday genler etkileri göç ve işgali üzerine transwell deneyleri içinde analiz edilebilir. Bu hücre satırları da metastatik potansiyellerini karaciğere metastaz için kuyruk ven tahlil için test edilebilir.
6. PCR protokolleri
çözümleri monte en kısa zamanda buz üzerinde. Bir mastermix şablonu olmadan çok sayıda örnekleri ve PCR tüpleri içine bölünmemeli için yapılabilir. Her reaktif örnekleri sayısı ile gerekli miktarda çarpın. Reaktifler flicking rahip tarafından karıştırın ve damlalıklı ucu ile bazı mastermix için eklemek için almadan önce girdap. Her reaktif mastermix tüp, damlalıklı yukarı ve aşağı herhangi bir kalanlar ipuçları içinde teslim etmek için ekledikten sonra.
- Bulaştırmak ya da transfected hücrelerde RCASBP olup olmadığını belirlemek için.
Aşağıdaki iletişim kuralı mastermix 11,5 µL ve her örnek için genomik DNA'ın 1 µL çağırır. Her reaktif eklemeden önce girdap emin olun.- Bir mastermix 7,68 µL nükleaz ücretsiz su, 0,75 µL DMSO, 1,25 µl 10 x arabellek II için AmpliTaq DNA polimeraz, 25 mm MgCl 2 1,375 µl ve 25 mM dNTP 0,125 µl hazırlayın.
- 100 µM ileri astar RCAS5626F 0,125 µL ekleyin: (5 ' - ACCGGGGGATGCGTAGGCTTCA - 3 ') ve astar RCAS6023R ters 0,125 µL 100 µM,: (5 ' - CCGCAACACCCACTGGCATTACC - 3 ') mastermix için.
- 0.075 µL eklemek AmpliTaq DNA polimeraz mastermix için.
- Tüp parmak ile flicking tarafından mastermix karıştırın. Spin aşağı bir santrifüj makine dosyayı matermixy için 3 ~ 5 saniye.
- Her birey mastermix üzerinden aliquot 11,5 µL PCR tüpleri. Girdap her zaman önce yeni bir tüp aliquoting.
- Girdap ve her PCR tüp 1 µL genomik DNA şablonu ekleyin. Genomik DNA hazırlamak için:
- Lyse hücre Pelet 0,05 M NaOH 200 µl içinde. Yukarı ve aşağı Pelet çözülmeye damlalıklı.
- 25-soğuduktan sonra hücre lysate 20 dakika içinde bir PCR makinesi için 98 ° c ısı ° C.
- Ekle 20 µL 1.0 M Tris-HCl (pH 7.5) tüpler ve DNA örnekleri 4'te mağaza ° C.
- Örnekleri flicking ve santrifüj tarafından 3-5 saniye için kısa bir süre karıştırın. Tüpler bir PCR makineye koy.
- PCR koşul için ilk denatürasyon 30 40 döngüsü tarafından takip, 92 ° C'de 2 min için ayarla denatürasyon, 30 için 94 ° C'de s s 67° C'de tavlama, 30 için uzantısı için 72 ° C ve son uzantısı için 72 ° C'de 10 m s. PCR bittikten sonra
- 6 x DNA yükleme boya 3 µL her örnek için ekleyin. Karıştırmak yanında flicking ve santrifüj kısa bir süre için 3 ~ 5 saniye.
- PCR ürünleri 1 x TAE tampon %2 (w/v) özel Jel Elektroforez tarafından incelenir. PCR ürünü 398 boyutudur bp.
- Etiket Genotipleme.
Aşağıdaki iletişim kuralı mastermix 10.5 µL ve her örnek için genomik DNA'ın 2 µL çağırır. Her reaktif eklemeden önce girdap emin olun.- Bir mastermix 4,5 µL nükleaz ücretsiz su ve MyTaq reaksiyon arabellek x 4.00 µL 5 MyTaq DNA polimeraz için hazır olun.
- 100 µM ileri astar TagF2 0.4 µL ekleyin: (5 ' - GGACAAACCACAACTAGAATGCAGTG - 3 ') ve astar TagR2 ters 0.4 µL 100 µM,: (5 ' - CAGAGCAGAATTGTGGAGTGG - 3 ') ana karışıma.
- 10 µM beta-2-Mikroglobulin habercisi (B2a) astar Mix iç kontrol için 0.8 µL ekleyin. PCR astar B2a için iç kontrol, beta-2-Mikroglobulin habercisi (B2a), çoğu B2 F (5 ' - CACCGGAGAATGGGAAGCCGAA - 3 ') ve B2 R (5 ' - TCCACACAGATGGAGCGTCCAG - 3 ').
- 0.4 µL eklemek MyTaq DNA polimeraz mastermix için.
- Tüp parmak ile flicking tarafından mastermix karıştırın. Spin aşağı mastermix santrifüj makinesi 3 ~ 5 s.
- Her birey mastermix üzerinden aliquot 10,5 µL PCR tüpleri. Girdap her zaman önce yeni bir tüp aliquoting.
- Girdap ve her PCR tüp 2 µL genomik DNA şablonu ekleyin. Genomik DNA yukarıda açıklandığı gibi hazırlanmıştır.
- Çözüm flicking ve santrifüj tarafından kısa bir süre için 3-5 saniye karıştırın. Tüpler PCR makineye koy.
- PCR durumu ilk denatürasyon, 15 35 döngüsü tarafından takip için 95° C'de 3 dakikadır ayarla denatürasyon, 15 için 95 ° c s s 65 ° C'de tavlama, 30 için uzantısı için 72 ° C ve son uzantısı için 72 ° C'de 10 dakika s. Boya her örnek için yükleme x 6 3 µL PCR bittikten sonra
- ekleyin. Karıştırmak yanında flicking ve santrifüj kısa bir süre için 3 ~ 5 saniye.
- PCR ürünleri 1 x TAE tampon %2 (w/v) özel Jel Elektroforez tarafından incelenir. ~ 450 ölçüleridir etiket ve B2a PCR ürünlerinin bp ve 300 bp, sırasıyla.
- tva Genotipleme.
Aşağıdaki iletişim kuralı her örnek için reaktif karışımı 10.5 µL çağırır. Her reaktif eklemeden önce girdap emin olun.- Bir mastermix 5.6 µL nükleaz boş su, 0.5 µL DMSO, 1,25 µL arabellek II AmpliTaq DNA polimeraz için x 10 ve 25 mm MgCl 2 1,375 µL ve 25 mM dNTP 0,125 µL hazırlayın.
- 100 µM tva-3 0,125 µL ekleyin (5 ' - GCCCTGGGGAAGGTCCTGCCC - 3 ') ve 0,125 µL 100 µM tva-5 (5 ' - CTGCTGCCCGGTAACGTGACCGG - 3 ') mastermix için.
- 10 µM B2a astar Mix mastermix için iç kontrol için eklemek 1.275 µL.
- 0,125 µL eklemek AmpliTaq DNA polimeraz mastermix için.
- Tüp parmak ile flicking tarafından mastermix karıştırın. Spin aşağı mastermix santrifüj makinesi içinde kısa bir süre için 3-5 saniye.
- Her birey mastermix üzerinden aliquot 10,5 µL PCR tüpleri. Girdap her zaman önce yeni bir tüp aliquoting.
- Girdap ve her PCR tüp 2µL genomik DNA şablonu ekleyin. Genomik DNA yukarıda açıklandığı gibi hazırlanmıştır.
- Flicking tarafından çözüm mix ve santrifüj kısa bir süre için 3-5 s. koymak tüpler PCR makinesi.
- PCR koşul için ilk denatürasyon 30 35 döngüsü tarafından takip, 92 ° C'de 2 min için ayarla denatürasyon, 30 için 94 ° C'de s s 60° C'de, besleme uzantısı için 72 ° C'de 30 saniye ve son uzantısı için 72 ° C'de 10 dakika için. Boya her örnek için yükleme x 6 3 µL PCR bittikten sonra
- ekleyin. Karıştırmak yanında flicking ve kısa bir süre için 3-5 s. santrifüj
- PCR ürünleri 1 x TAE tampon %2 (w/v) özel Jel Elektroforez tarafından incelenir. 500 ölçüleridir tva B2a PCR ürünleri, bp ve 300 bp, sırasıyla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vivo ve in vitro enfeksiyon oranı RIP-etiket; RIP-tva tümör hücreleri RCASBP tabanlı virüs tarafından 20~ % 20 ve % 80 ~ sırasıyla vardır. RIP-etiket; RIP-tva fare modeli, her fare 400 pankreas adacıkları yaklaşık % 4'ü doğal olarak geliştirmek tümörler 20; Bu nedenle tümör hücreleri her fare virüsler tarafından teslim genlerin potansiyel etkisinin histolojik ve fenotipik analiz için yeterli miktarda yoktur. Bu sistemi kullanarak, bir roman nükleer işlevinde Bcl-XL metastaz saptanan 9yaşındaydım. RIP-etiket; RIP-tva RCASBP -Bcl-xL ile enfekte fareler sergilenen bir daha yüksek insidansı invaziv karsinomlar denetim virüs ile enfekte fareler daha RCASBP -ALPP (%74 vs % 96). Ayrıca, RCASBP -Bcl-xL% 47-enfekte RIP-etiket; RIP-tva fareler geliştirilen Metastazlari pankreas lenf düğümlerinde hiçbir metastaz kontrol fareler 20dakika sonra bulundu iken 16 hafta-in yaş (şekil 3A), ötenazi zaman.
Ayrıca, kanser genleri RIP-etiketi içinde bir kütüphane ekranlı; RIP-tva fareler ve metastaz Lenf bezleri pankreas ve karaciğer 21 (şekil 3B ve 3 C) teşvik ilk gen tespit edilmiştir. Bu gen reseptör hyaluronan aracılı hareketliliği izoformu B (RHAMMB) protein için kodlar ve 21sinyal EGFR etkinleştirir. Bu karaciğer özgü metastaz deneysel metastaz içinde N134 tümör hücreleri sirküle başlangıçta alıcı immünyetmezligi fareler 21akciğer kapiller yatak, bir kuyruk ven tahlil recapitulated gösterdi.
Resim 1 : RCASBP(A), RCAS-X ve Y RCAS yapıları, şematik. Klonlama siteleri mavi, kalın yazı tipinde gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : İntrakardiyak enjeksiyon yerleşimini. Anatomik yerler (beyaz özetlenmiştir) göğüs kemiği üzerinde yatay Kesikli çizgilerle gösterilir. Fare deri, sternal çentik ve xyphoid işlemi Simgesel hizmet, ve iğne 1 mm orta göğüs kemiği uzak eklenen ve biraz (sternum anatomik) yaptı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Metastatik pankreas β algılama hücreleri tarafından immunostaining. Metastatik pankreas nöroendokrin tümör pankreas lenf düğümleri (A, B) veya (C) karaciğerde temsilcisi synaptophysin boyama fotoğrafları göster. RIP-etiket; RIP-tva fare ile belirtilen RCASBP Retrovirüsler 7 haftalıkken enfekte ve 16 haftalık euthanized. Ölçek çubuğu 50 µm. özgün büyütmeye = 20 X =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, bir güçlü fare modeli, RIP-Tag açıkladığımız; RIP-tva, yoluyla kimlik ve metastatik faktörler karakterizasyonu için kuş Retrovirüsler somatik gen teslim elde etmek için. Her ne kadar RIP-etiket; RIP-tva fareler geliştirmek pankreas nöroendokrin tümör, bu fare modelde tanımlanan metastatik faktörler de metastaz diğer kanser türleri teşvik.
Bizim yaklaşım somatik genetik değişiklikler özellikle premalign lezyonlar pankreas β hücrelerinin böylece daha sadakatle tek tük insan tümör geliştirme taklit eden bir zamanı denetimi şekilde tanıtılması avantajı vardır. Bu yaklaşım herhangi bir potansiyel pertürbasyon kez geliştirme sırasında faiz gen ifade Ektopik nedeniyle konvansiyonel transgenik modellerinde gözlenen normal doku oluşumu önler. Ayrıca, transgenik fareler oluşturmak daha ilgi genleri taşıyan kuş retroviral vektörler oluşturmak çok daha hızlıdır. Kuş retroviral vektör RCASBP elde edilen cDNAs (≤2.5 kb), shRNAs, miRNAs ve diğer kodlamayan RNA'ların tva ifade hücreleri içinde in vitro ve in vivoteslim edebilirsiniz. Enfeksiyon (ve çoklu enfeksiyon) verimliliğini hedef hücre proliferasyon oranı ve hücreleri erişilebilirliğini bağlıdır. Bir titresi > ml başına 1 x 108 bulaşıcı birim vivo içinde enfeksiyon için gereklidir. Daha verimli bir şekilde viral teslim elde vitro indüklenen hücre çoğalması ve virüsler için tüm hücrelerin tekrarlanan maruz kalma olasılığı nedeniyle olabilir.
Kesin İntrakardiyak enjeksiyon tekniği fareler canlılık için önemlidir. İlk olarak, bir insülin şırınga kadar viral süspansiyon çizim önce hava alanı 50 µl kalp nabız görmek için önemlidir. İkinci olarak, kan kırmızı bir darbe göründüğünde şırınga konumunu düzeltmek için ve parlak kırmızı nabzı kan görmek görünür zaman şırıngada yavaş yavaş 10-20 µl viral süspansiyon teslim etmek önemlidir. Kan ve parlak kırmızı darbeleri 10-20 µl viral süspansiyon doğumdan sonra durdurursanız, biraz iğne yeniden konumlandırma yardımcı olacaktır. Üçüncü olarak, son itme pistonu viral süspansiyon teslim etmek ve kan darbe görmeden önce sonra iğne göğüs boşluğu dışında hızlı bir şekilde geri çekildi gerekiyor ve hafif bir basınç enjeksiyon sitesi üzerinden uygulanan iç kanama azaltmak için yardımcı olacaktır. Son olarak, insülin şırınga başka bir fare yeniden kullanmayın.
Gelecekteki uygulamalarda, bu RIP-etiket; RIP-tva fare modeli diğer transgenik, çakma ve nakavt fare modelleri ile kombine edilebilir. Ayrıca, biz bu RIP-Tag birleştirerek öngörülüyor; RIP-tva tek nokta mutasyonlar, silme, silinme ve translokasyonlar 22gibi genomik düzenlemeler oluşturmak için CRISPR-Cas9 genom-baskı alet ile fare modeli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz Harold Varmus, Brian C. Lewis, Douglas Hanahan, Danny Huang, Sharon Pang, Megan Wong ve Manasi M. Godbole teşekkür ederim. Y.C.N.D. DOD grant W81XWH-16-1-0619 ve NIH grant 1R01CA204916 tarafından desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RCASBP-Y DV plasmid | Addgene | 11478 | |
| RCAS-RNAi plasmid | Addgene | 15182 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | 25-005-CI | |
| L-glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| Penicillin-Streptomycin solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| PBS-/-, 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Superfect | Qiagen | 301305 | |
| Polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 326823 | |
| 0.45 mm Nalgene Syringe Filters with PES Membrane |
Thermo Scientific | 194-2545 | |
| Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| synaptophysin | Vector Laboratories | VP-S284 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-6101 | |
| AmpliTaq DNA Polymerase with Buffer II | Life Technologies | N8080153 | |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21106 |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W.
- Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv Cancer Res. 106, 113-164 (2010).
- Khanna, C., Hunter, K.
- Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS biology. 5 (10), e276 (2007).
- Hanahan, D. Heritable formation of pancreatic beta-cell tumours in transgenic mice expressing recombinant insulin/simian virus 40 oncogenes. Nature. 315 (6015), 115-122 (1985).
- Fisher, G. H., et al. Development of a flexible and specific gene delivery system for production of murine tumor models. Oncogene. 18 (38), 5253-5260 (1999).
- Orsulic, S. An RCAS-TVA-based approach to designer mouse models. Mamm Genome. 13 (10), 543-547 (2002).
- Tuveson, D., Hanahan, D. Translational medicine: Cancer lessons from mice to humans. Nature. 471 (7338), 316-317 (2011).
- Choi, S., et al. Bcl-xL promotes metastasis independent of its anti-apoptotic activity. Nat Commun. 7, 10384 (2016).
- Naik, P., Karrim, J., Hanahan, D. The rise and fall of apoptosis during multistage tumorigenesis: down-modulation contributes to tumor progression from angiogenic progenitors. Genes Dev. 10 (17), 2105-2116 (1996).
- Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. J Virol. 61 (10), 3004-3012 (1987).
- Petropoulos, C. J., Payne, W., Salter, D. W., Hughes, S. H. Appropriate in vivo expression of a muscle-specific promoter by using avian retroviral vectors for gene transfer [corrected]. J Virol. 66 (6), 3391-3397 (1992).
- Dunn, K. J., Williams, B. O., Li, Y., Pavan, W. J. Neural crest-directed gene transfer demonstrates Wnt1 role in melanocyte expansion and differentiation during mouse development. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (18), 10050-10055 (2000).
- Loftus, S. K., Larson, D. M., Watkins-Chow, D., Church, D. M., Pavan, W. J. Generation of RCAS vectors useful for functional genomic analyses. DNA Res. 8 (5), 221-226 (2001).
- Bromberg-White, J. L., et al. Delivery of short hairpin RNA sequences by using a replication-competent avian retroviral vector. J Virol. 78 (9), 4914-4916 (2004).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Dev Biol. 6 (2), (2006).
- Huse, J. T., et al. The PTEN-regulating microRNA miR-26a is amplified in high-grade glioma and facilitates gliomagenesis in vivo. Genes Dev. 23 (11), 1327-1337 (2009).
- Ahronian, L. G., Lewis, B. C. Generation of high-titer RCAS virus from DF1 chicken fibroblasts. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (11), 1161-1166 (2014).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS Biol. 5 (10), 2255-2269 (2007).
- Du, Y. C., Chou, C. K., Klimstra, D. S., Varmus, H. Receptor for hyaluronan-mediated motility isoform B promotes liver metastasis in a mouse model of multistep tumorigenesis and a tail vein assay for metastasis. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16753-16758 (2011).
- Guernet, A., Grumolato, L. CRISPR/Cas9 editing of the genome for cancer modeling. Methods. , (2017).
