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Cancer Research

Identificação e caracterização dos fatores metastáticos por transferência de genes para a novela RIP-Tag; RIP-tva modelo murino

Published: October 16, 2017 doi: 10.3791/55890
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Weill Cornell Medicine

Summary

Apresentamos um protocolo para demonstrar um sistema de transferência de gene somática romance utilizando RIP-Tag; RIP-tva modelo do rato para estudar a função dos genes em metástase. Os retrovírus aviária são entregues intracardiacally para garantir a transferência de genes em lesões pré-malignas, não-invasivas de células β do pâncreas em ratos adultos.

Abstract

Cancro metastático é responsável por 90% das mortes em pacientes com tumores sólidos. Há uma necessidade urgente para compreender melhor os drivers de metástase do cancro e para identificar novos alvos terapêuticos. Para investigar os eventos moleculares que conduzem a progressão do câncer primário a metástase, desenvolvemos um modelo do rato de bitransgenic, RIP-Tag; RIP-tva. Neste modelo de rato, o promotor de insulina de rato (RIP) conduz a expressão do antígeno T SV40 (Tag) e o receptor para o subgrupo um vírus da leucose aviária (tva) nas células β do pâncreas. Os ratos desenvolvem tumores neuroendócrinos do pâncreas com penetrância de 100% através de etapas bem definidas que são semelhantes a tumorigênese humana, com etapas, incluindo hiperplasia, angiogênese, adenoma e carcinoma invasivo. Porque RIP-Tag; RIP-tva ratos não desenvolvem a doença metastática, alterações genéticas que promovem a metástase podem ser identificadas facilmente. Gene somática transferir para expressar a tva, proliferando β do pâncreas lesões pré-malignas é conseguida através de Injeção intracardíaca de retrovírus aviária, abrigando a alteração genética desejada. Um título de > 1 x 108 infecciosas unidades / ml é considerado apropriado para a infecção na vivo . Além disso, o retrovírus aviária podem infectar linhas de células derivadas de tumores em RIP-Tag; RIP-tva mouses com alta eficiência. As linhas de célula também podem ser usadas para caracterizar os fatores metastáticos. Aqui vamos demonstrar como utilizar este modelo de rato e linhas para avaliar as funções dos genes candidatos em metástase de tumor de células.

Introduction

A maioria dos cânceres resultam de mutações somáticas 1. Modelos de mouse convencional geneticamente modificados (GEMM) forneceu insights significativos sobre a contribuição de alterações genéticas específicas a tumorigênese 2. No entanto, eles têm várias limitações. A grande desvantagem destes modelos é que eles não replicar a natureza esporádica da formação de tumor em seres humanos, em que apenas algumas células dentro de um tecido adquirem alterações genéticas. As mutações em camundongos transgênicos e nocaute também são germline com potencial de afetar o desenvolvimento. Além disso, gerar estes modelos do rato é caro e demorado.

Metástase é uma questão importante no campo do câncer. Metástase de modelagem tem sido difícil em GEMM. Metástase espontânea é rara no mouse. Penetrância é variável e latência é tempo no GEMM de metástase 3. Metástase experimental modelos utilizam injeção direta de células na circulação de ratos, então os primeiros passos em cascata metastática são eliminados.

Para superar algumas das limitações acima em estudar fatores metastáticos em modelos do rato, nós desenvolvemos um modelo do rato de bitransgenic, RIP-Tag; RIP-tva4. A estratégia baseia-se em combinar o uso de um modelo de mouse de progressão de tumor altamente sincronizada, RIP-Tag 5e o receptor para o vírus da leucose aviária subgrupo-A, tva 6,7. Este RIP -Tag; RIP-tvamodelo do rato permite que genes a ser introduzidos somaticamente uma cepa de rato bitransgenic único. Com o antígeno T SV40 suprimindo as funções supressora de tumor de Rb e p53, ratos desenvolvem tumores neuroendócrinos do pâncreas em uma forma similar a tumorigênese humana, com etapas, incluindo hiperplasia, angiogênese, adenoma e carcinoma invasivo. Este modelo RIP-Tag tem sido muito instrutivo para nossa compreensão das características de câncer, não se limitando a tumores neuroendócrinos do pâncreas. Ele também tem sido usado em ensaios pré-clínicos 8.

Apresentamos um protocolo para transferência de genes somáticos através da injeção de retrovírus aviária intracardiacally no RIP-Tag; RIP-tva ratos. Infecção bem sucedida com RCASBP-derivado de retrovírus aviária requer ativamente proliferando nas células-alvo. Portanto, nós escolhemos RIP-Tag; RIP-tva ratos em 7 semanas de idade, quando hiperplasia desenvolve-se em cerca de 50% das ilhotas pancreáticas. Esquerda ventricular Injeção intracardíaca de vírus de alta concentração é necessário para alcançar uma eficiência de infecção de 10-20% 4. Este método de entrega reduz a diluição significativa de partículas virais em circulação antes que vírus atinjam ilhotas pancreáticas.

Usando esta abordagem, temos demonstrado anteriormente que a Bcl-xL promove metástases independente de sua função de anti-apoptotic 4,9. Esta função de anti-independente de apoptotic metastática não foi observada quando Bcl-xL foi expresso por meio de um transgene em todas as células β do pâncreas durante a ontogenia tumorigênico no RIP-Tag; RIP-Bcl-xL mouse modelo 10. Portanto, nosso modelo do mouse oferece uma oportunidade única para identificar e caracterizar as funções dos genes quando expresso numa fase posterior da tumorigênese. Porque 2-4% das ilhotas evoluir para tumores no RIP-Tag; RIP-tva bitransgenic ratos sem infecção viral e nem todas as lesões pré-malignas estão infectados com os retrovírus aviária derivado de RCASBP, podem ser identificados apenas os fatores que conferem uma vantagem selectiva sobre o curso natural da tumorigênese. Em particular, metastáticos fatores serão mais facilmente reconhecidos por este método, porque a metástase para linfonodos pancreáticos ou outros órgãos não ocorre normalmente em RIP-Tag; RIP-tva ratos.

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Protocol

declaração de ética: experimentos em animais foram realizados em conformidade com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Instituto de cuidado Animal e Comitê de uso de Weill Cornell medicina.

1. escolha de vetores retrovirais aviária (base RCASBP ou RCANBP(A)-based)

  • vetores foi derivado de vírus do sarcoma de Rous 11. Vetores retrovirais aviária podem entregar os cDNAs (≤ 2,5 kb), curto grampo RNAs (shRNAs), microRNAs (miRNAs) e outros RNAs não-codificante. Os vetores comercialmente disponíveis são listados em materiais e outros precisam ser solicitados diretamente dos autores.
  • Para overexpress os genes de interesse, use um dos seguintes vetores, RCASBP(A) 12 ( figura 1A), RCAS-X ( figura 1B), RCAS-Y 13 ( Figura 1), RCASBP-Y DV 14, ou outros vetores de ALV-A (https://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/mice.html).
  • Para bater os genes de interesse por shRNA, use um dos seguintes vectores: DV RCAN-X 15 ou RCAS-RNAi 16.
  • a overexpress miRNAs, gerar vector RCAS-miR, conforme descrito em 17.
  • Transformação em exigência de e. coli e DNA.
  • De preferência transformar DNA em células competentes Stbl2 ou Stbl3, que têm o genótipo exclusivo para estabilizar diretas sequências retrovirais e repetição. Purificar o Plasmídeo usando um método que renderá puro, grau de transfeccao DNA. 5 µ g de DNA é necessária com concentração mínima de 0,1 µ g / µ l.

2. Propagação viral em frango fibroblasto DF1 célula linha

  1. o uso de pontas de pipetas filtrada para cultura de células é necessária para evitar a Cruz-contaminação viral estoques 18.
  2. DF1 manter células no prato de 6cm com crescimento médio (DMEM com glicose alta, 10% de soro bovino fetal, 6mm (concentração final) L-glutamina, 10 unidades/ml penicilina, estreptomicina 10 de µ g/ml) em 37 o C e 5% de CO 2. Se células DF1 são recém descongeladas de estoques congelados, cultura-los pelo menos 3 dias antes do transfection.
  3. Um dia antes de transfeccao, passar DF1 células para um prato de cultura de tecido de 6cm, para que eles sejam confluente de 30-50% no momento do transfection.
  4. Diluir 5 µ g de DNA viral puro com DMEM (sem o soro, penicilina e estreptomicina) para um volume total de 150 µ l em um tubo de microcentrifugadora dentro de uma capa de tecido cultura.
  5. Adicionar 30 µ l de Superfect directamente para o tubo de DNA diluído; vórtice essa mistura por 10 s; deixe a mistura à temperatura ambiente por 5-10 min na cultura do tecido capa para permitir a formação de complexos do transfection.
  6. Enquanto formação do complexo ocorre, aspire suavemente meio de crescimento do prato cultura celular DF1 e lavar cuidadosamente as células com 4 ml de PBS - / -.
  7. Pipetar 5 ml de crescimento médio (contendo soro e antibióticos); salvar 4 ml para um tubo Falcon para a próxima etapa; e adicione o restante de 1 ml de meio de crescimento para os complexos do transfection. Misture pipetando para cima e para baixo duas vezes e transferir imediatamente os complexos de transfeccao toda para as células DF1. Redemoinho para garantir que a camada de células é coberta; Incubar durante 2-3 horas a 37 o C.
  8. Aspirar a mistura de transfeccao; lavar as células com 4 ml de PBS - / - adicionar 4 ml de meio de cultura fresco (contendo soro e antibióticos); retorno de células para uma incubadora 37 o C.
  9. Quando as células chegam a confluência, passagem de células (expressão transiente pode ser analisada 48 a 72 h após a transfeccao).
  10. Continuar a passar as células por cerca de 7 dias, até que todas as células são presumivelmente infectadas; testar a integração de DNA viral por PCR e determinar a expressão da proteína pela mancha ocidental; e congelar as células em meio DMEM com 10% DMSO e 20% de soro bovino fetal.

3. Na Vivo Infecção de RIP-Tag; RIP-tva ratos

  1. concentração e coleção de vírus
    uso concentrado fresco vírus para infecção na vivo. O título do vírus mantidos em 4 ó C dentro de uma semana não é significativamente reduzido. No entanto, alíquotas congeladas do viral circulante exibem 10 vezes título reduzido após o descongelamento.
    1. As células DF1 de vírus-produtor de expandir em pratos de 15 cm, dependendo da quantidade de vírus que precisava. Para a infecção de rato na vivo, preparar uma média de uma placa por rato.
    2. Pre-chill o rotor (por exemplo, SW28), o balde de balanço e a máquina se a 4 o C.
    3. Coletar sobrenadante do confluentes pratos de 15 cm. Retire os restos de células com baixa velocidade centrifugação a 1.650 x g durante 10 minutos a 4 o C.
    4. Transferir o sobrenadante viral para tubos se (tubos de centrífuga de Polyallomer). Girar em um se 1,5 horas de 95.400 x g 4 o C. Para Beckman XL-100 se, usar a máquina Accel: 1; Desaceleração: configurações 1.
      5. Tubos de
    5. remover sobrenadante se tanto quanto possível. Adicione PBS sem cálcio e magnésio (PBS - / -) para o tubo se tornar final 100 µ l suspensão viral de um prato de 15 cm. Cobrir os tubos com parafilme. Ressuspender o invisível viral vortexing a se tubos por 2 min em velocidade média.
    6. Os tubos se no 4 o C por uma hora durante a noite de rock.
    7. Transferir o vírus em suspensão em um tubo de microcentrifugadora. Aquecer a suspensão viral à temperatura ambiente antes da injeção em ratos.
  2. Determinação viral Titer.
    Para cada nova construção viral, titulação viral precisa ser determinado antes da infecção na vivo.
    1. Semente DF1 células em todos os poços de uma placa de cultura de tecido 12-poços (sugestão: 2 x 10 4 células/poço, 1 ml/bem), de modo que eles serão confluente de 30% no momento da infecção. Uma placa de 12 é necessária para uma determinação do título viral.
    2. Fazer uma série de diluições de 10 vezes do sobrenadante viral em meio de crescimento como seguindo:
      1. Mix 5 µ l de sobrenadante viral com 495 µ l meio de crescimento para a diluição de 2 10 em um tubo de microcentrifugadora. Vórtice brevemente por alguns segundos.
      2. Tomar 40 µ l do 10 2 diluição em meio de crescimento de 360 µ l em um tubo de microcentrifugadora para a diluição de 3 a 10. Vórtice brevemente por alguns segundos.
      3. Siga os passos 3.2.2.2 para 10 4 e 10 diluição 5.
        4. Tubos de
      4. conjunto 5 de 6 ml de poliestireno. Alíquota 2,25 ml de meio de crescimento por tubo, etiqueta os 10 6, 10 e 7, 10 8 10 9, 10, 10, respectivamente.
      5. Mix 0,25 ml do 10 5 diluição com média de crescimento de 2,25 ml no tubo de poliestireno de 6 ml para a diluição de 6 a 10. Vórtice brevemente por alguns segundos.
      6. Siga os passos 3.2.2.5 para 10 7, 10 8, 10, 9 e 10 10 diluição.
      7. Remover o meio de cultura original do DF1 células sobre a placa de 12. Colocar 1 ml diluído de vírus a cada poço em duplicado (não-infectados, 10 10 10 6 UI/ml).
    3. Permitem que as células a crescer pelo menos 7 dias (executar trypsinzation quando necessário). Recolher pilhas para isolar o DNA e verificar a presença do DNA viral por PCR conforme descrito em " 6. Protocolos PCR ". Se este título viral é 10 8 unidades infecciosas por ml (UI/ml), serão observado um produtos PCR de bp 398 positivo de RCASBP usando o DNA de células com 10 8 10 6 vírus de UI/ml, mas não de células não infectadas ou células com 10 10 10 9 Vírus de UI/ml. Um título de > 1 x 10 8 unidades infecciosas / ml devem ser usadas para infecção na vivo.
  3. Injeção intracardíaca
    heterozigotos RIP-Tag ratos, ratos não homozigotos, são utilizados neste estudo. Ratos RIP-Tag heterozigotos desenvolvem tumores neuroendócrinos do pâncreas em torno de 10 ~ 12 semanas de idade, enquanto os ratos homozigotos têm uma menor latência de tumor. Porque a proliferação celular é necessária para a integração do cDNA viral no host genoma, 7 semanas de idade RIP-Tag; RIP-tva ratos com células β pancreáticas hiperplásica são usados. Por favor, note que as células β mais normais não estão se proliferando em ratos adultos.
    1. Uso 7 semanas de idade RIP-Tag; RIP-tva ratos em um fundo de C57BL/C puro para os experimentos.
    2. Anesthetize rato usando uma combinação de xilazina/cetamina (150 mg/kg; 15 mg/kg). Usar o suporte de calor para manter a temperatura do corpo do mouse durante todo o período da anestesia.
    3. Aplicar lubrificante do olho para os dois olhos para evitar a secura da córnea.
    4. Barba cabelo da cavidade torácica de RIP-Tag; RIP-tva ratos. Rato de posição em suas costas com o peito virado para cima. Uma pitada de dedo do pé é realizada para observar o animal para não-responsividade confirmar o efeito de anestesia completo.
    5. Estender o membro da frente e fixe-os com fitas. Rato de Mark ' peito de s para a injeção. Marcar um meio de localização entre o entalhe esternal e superior do processo de xyphoid e deixou um pouco (anatômico) do esterno ( Figura 2).
    6. Scrub parede torácica anterior com uma esfoliação de iodo-povidona ou clorexidina esfregar seguida por um álcool isopropílico a 70% ou etanol a 70% embebido de gaze.
    7. Desenhar 50 µ l de ar para uma insulina estéril 28 g ½ seringa para criar espaço entre o pistão e o menisco de uma seringa de 500 µ l e em seguida elaborar 100 µ l de vírus. O espaço aéreo, sem qualquer tipo de líquido na parede é crucial para ver pulso cardíaco.
    8. Manter ereto de agulha. Estique a pele de rato com uma mão e insira a agulha no local marcado. Quando o pulso de sangue vermelho brilhante aparece na seringa, pare de fazer avançar a agulha e corrigir a profundidade da agulha no mouse com uma mão.
    9. Use a outra mão para cuidadosamente e empurrar lentamente o êmbolo para entregar suspensão viral (~ 100 µ l volume) ao longo de um período de ~ 60 segundos. Entrega 10-20 µ l sempre que vê um pulso vermelho brilhante de sangue aparecem na seringa. Entrada contínua de vermelho sangue oxigenado para o eixo da agulha transparente indica o posicionamento adequado da agulha para o ventrículo esquerdo.
    10. Após o último empurrão do êmbolo para entregar a suspensão viral e antes de ver o próximo pulso vermelho de sangue, retirar rapidamente a agulha fora da cavidade torácica.
    11. Aplique uma pressão suave sobre o local da injeção para reduzir a hemorragia durante pelo menos 1 min.
    12. , Cuidadosamente, mova o mouse sobre uma almofada de aquecimento ou sob uma lâmpada de calor até totalmente consciente. Os ratos serão vigiados até anestesia desgasta fora, para que eles podem andar longe de estímulos, um período que normalmente dura cerca de uma hora. Os ratos serão monitorados diariamente para casaco mesmo e intacto e quaisquer alterações no comportamento.

4. Análise histopatológica dos tumores

  1. nove semanas após a injeção, eutanásia em 16 semanas de idade RIP-Tag; RIP-tva ratos. Gravar tamanhos e números de tumores pancreáticos principais e qualquer brutos metástases.
  2. Fix pâncreas, fígado e/ou outros órgãos em 10% tamponada formalina a noite à temperatura ambiente em uma plataforma oscilante.
  3. Transferir os tecidos fixos em etanol a 70% no dia seguinte. Processar os tecidos em seções parafina.
    4. Imuno-histoquímica
  4. executar coloração para Sinaptofisina (um marcador neuroendócrino) ou insulina (um marcador de células específicas β) seguindo o fabricante ' instruções de s para identificar metástases de células β pancreáticas em linfonodos pancreáticos ou fígados. No entanto, células tumorais de diferenciada ou células tumorais mal diferenciadas podem perder a expressão de insulina e só pode ser detectadas por imunocoloração Sinaptofisina.

5. In Vitro Infecção de células expressando a tva

não é necessário usar o vírus concentrados para infecção em vitro. O protocolo descrito abaixo é para duas rodadas de infecção. Mais rodadas de infecção podem ser realizadas, repetindo o seguinte protocolo.

  1. Coletar viral sobrenadante do DF1 confluentes. Mantenha o sobrenadante viral 4 o C para infecção dentro de uma semana. Antes da infecção, passar o sobrenadante viral através de um filtro de 0,45 μm para obter vírus sem célula.
  2. Brevemente enxágue tva-expressando nas células-alvo (ou seja, N134 β pancreáticas tumor celular linha celular de um RIP-Tag; RIP-tva rato) com PBS - / - para remover todos os vestígios de soro, que contém inibidor de tripsina. Rapidamente enxágue tva-expressando nas células-alvo com solução de tripsina-EDTA (tais como 0,25% Trypsin-2,21 mM EDTA). Adicionar a solução de tripsina-EDTA e incubar durante 2 minutos. Bata levemente a placa. Observe as células sob um microscópio invertido. Células geralmente desanexar em 2 a 3 min. nas células-alvo semente em uma placa de 6 cm. Uso 3 ~ 4 ml filtrados sobrenadante viral como meio de crescimento.
    Nota: A nutrição no sobrenadante viral é consumida pelas células DF1, portanto, altere o médio no dia seguinte.
  3. No dia seguinte, aquecer a quantidade suficiente de sobrenadante viral à temperatura ambiente. Remover o meio de células-alvo e substitua o sobrenadante viral de 3-4 ml.
  4. No terceiro dia, a passagem de células conforme necessário. Se as células não são suficientemente densas para ser passadas, aquecer ~ 4 ml de meio de crescimento regular (DMEM com glicose alta, 10% de soro bovino fetal, 6mm (concentração final) L-glutamina, a 10 unidades/mL penicilina, a estreptomicina 10 de µ g/mL) para substituir o sobrenadante viral.
  5. Expandir infectava células e examinar a expressão de proteínas do candidato pela mancha 19 ocidental. Os efeitos dos genes candidatos sobre migração e invasão podem ser analisados em ensaios transwell. Estas linhas de célula também podem ser testadas pelo seu potencial metastático para o fígado em um ensaio de veia de cauda para metástase.

6. Protocolos de PCR

soluções devem ser montadas mais rapidamente possível no gelo. Um mastermix sem o modelo pode ser feito por um grande número de amostras e aliquotadas em cadeia da polimerase. Multiplica a quantidade de cada reagente necessário pelo número de amostras. Misturar os reagentes por flicking prior e agite com a ponta da pipeta antes de tomar alguns para adicionar o mastermix. Após a adição de cada reagente ao tubo mastermix, pipetar acima e para baixo para entregar qualquer resíduos dentro do dicas.

  1. Para detectar a presença de RCASBP nas células infectadas ou transfectadas.
    O seguinte protocolo exige 11,5 µ l do mastermix e 1 µ l de DNA genômico para cada amostra. Certifique-se de agitar antes de adicionar cada reagente.
    1. Preparar um mastermix de 7,68 água de nuclease livre µ l 0,75 µ l DMSO, buffer de 10 x 1,25 µ l II para a DNA-polimerase AmpliTaq, 1,375 µ l de 25 mM MgCl 2 e 0,125 µ l de 25 mM dNTP.
    2. Adicionar 0.125 µ l de 100 µM para a frente da primeira demão RCAS5626F: (5 ' - ACCGGGGGATGCGTAGGCTTCA - 3 ') e 0,125 µ l de 100 µM reverter cartilha RCAS6023R: (5 ' - CCGCAACACCCACTGGCATTACC - 3 ') para o mastermix.
    3. Adicionar 0.075 µ l AmpliTaq DNA polimerase para o mastermix.
    4. Misture o mastermix por agredir o tubo com os dedos. Spin para baixo a matermix em uma documentação de máquina centrífugay para 3 ~ 5 segundos.
      5. Tubos de PCR
    5. µ l 11.5 alíquota do mastermix a cada indivíduo. Redemoinho cada vez antes de alíquotas para um tubo novo.
    6. Redemoinho e adicionar 1 modelo de DNA genômico de µ l de cada tubo PCR. Para preparar o DNA genômico:
      1. Lyse centrifugado em 200 µ l de 0,05 M de NaOH. Pipetar para cima e para baixo dissolva a pelota.
      2. Calor lisado a 98 ° C por 20 minutos em uma máquina PCR, o celular, depois de arrefecido a 25 ° C.
      3. Adicionar 20 µ l 1.0 M Tris-HCl (pH 7,5) para os tubos e armazenamento de amostras de DNA em 4 ° C.
    7. Misturar as amostras por agredir e centrífuga brevemente durante 3-5 segundos. Colocar os tubos em uma máquina PCR.
    8. PCR a condição é definida por 2 min a 92 ° C para desnaturação inicial, seguida de 40 ciclos de 30 s a 94 ° C para desnaturação, 30 s a 67° C para recozimento, 30 s em 72 ° C para a extensão e 10m a 72 ° C para a extensão final.
    9. Após a PCR é terminado, adicionar 3 µ l de 6 x tintura do carregamento de DNA de cada amostra. Mix por agredir e centrífuga brevemente para 3 ~ 5 segundos.
    10. Produtos PCR são analisados por eletroforese em gel de agarose a 2% (p/v) em 1 x TAE de buffer. O tamanho do seu produto PCR é 398 BP
  2. Genotipagem tag.
    O seguinte protocolo exige 10,5 µ l do mastermix e 2 µ l de DNA genômico para cada amostra. Certifique-se de agitar antes de adicionar cada reagente.
    1. Preparar um mastermix de 4,5 µ l nuclease livre água e de 4,00 µ l 5 x amortecedor da reação de MyTaq para MyTaq DNA Polymerase.
    2. Adicionar 0,4 µ l de 100 µM para a frente da primeira demão TagF2: (5 ' - GGACAAACCACAACTAGAATGCAGTG - 3 ') e 0,4 µ l de 100 µM reverter cartilha TagR2: (5 ' - CAGAGCAGAATTGTGGAGTGG - 3 ') à mistura mestre.
    3. Adicionar 0,8 µ l de 10 mistura de cartilha de precursora de beta-2-microglobulina (B2m) µM para o controle interno. Iniciadores de PCR para B2m o controle interno, precursor do beta-2-microglobulina (B2m), são B2 F (5 ' - CACCGGAGAATGGGAAGCCGAA - 3 ') e B2 R (5 ' - TCCACACAGATGGAGCGTCCAG - 3 ').
    4. Adicionar 0,4 µ l MyTaq DNA polimerase para o mastermix.
    5. Misture o mastermix por agredir o tubo com os dedos. Spin para baixo o mastermix na máquina centrífuga para 3 ~ 5 s.
      6. Tubos de PCR
    6. µ l 10.5 alíquota do mastermix a cada indivíduo. Redemoinho cada vez antes de alíquotas para um tubo novo.
    7. Redemoinho e adicionar 2 µ l genomic DNA modelo para cada tubo PCR. DNA genômico é preparado como descrito acima.
    8. Misturar a solução por agredir e centrífuga brevemente durante 3-5 segundos. Colocar os tubos na máquina PCR.
    9. PCR a condição é definida por 3 min a 95° C para desnaturação inicial, seguida por 35 ciclos de 15 s a 95 ° C para desnaturação, 15 s a 65 ° C para recozimento, 30 s em 72 ° C para a extensão e a 10 minutos a 72 ° C para a extensão final.
    10. Após a PCR é terminado, adicione 3 µ l de 6 x tintura para cada amostra de carregamento. Mix por agredir e centrífuga brevemente para 3 ~ 5 segundos.
    11. Produtos PCR são analisados por eletroforese em gel de agarose 2% (p/v) em 1 x TAE de buffer. Os tamanhos dos produtos de marca e B2m PCR são ~ 450 bp e 300 bp, respectivamente.
  3. genotipagem tva.
    O protocolo seguinte pede 10,5 µ l da mistura reagente para cada amostra. Certifique-se de agitar antes de adicionar cada reagente.
    1. Preparar um mastermix de 5,6 água livre da nuclease µ l, 0,5 µ l DMSO, 1,25 µ l 10x Buffer II para a DNA-polimerase AmpliTaq e 1,375 µ l de 25 mM MgCl 2 e 0,125 µ l de 25 mM dNTP.
    2. Adicionar 0.125 µ l de 100 µM tva-3 (5 ' - GCCCTGGGGAAGGTCCTGCCC - 3 ') e 0,125 µ l de 100 µM tva-5 (5 ' - CTGCTGCCCGGTAACGTGACCGG - 3 ') para o mastermix.
    3. Adicionar 1,275 µ l de 10 mistura de cartilha B2m µM para o controle interno para o mastermix.
    4. Adicionar 0.125 µ l AmpliTaq DNA polimerase para o mastermix.
    5. Misture o mastermix por agredir o tubo com os dedos. Spin para baixo o mastermix na máquina centrífuga brevemente durante 3-5 segundos.
      6. Tubos de PCR
    6. µ l 10.5 alíquota do mastermix a cada indivíduo. Redemoinho cada vez antes de alíquotas para um tubo novo.
    7. Redemoinho e adicionar 2µL modelo de DNA genômico para cada tubo PCR. DNA genômico é preparado como descrito acima.
    8. Misturar a solução por agredir e centrífuga brevemente para 3-5 s. colocar os tubos na máquina PCR.
    9. PCR a condição é definida por 2 min a 92 ° C para desnaturação inicial, seguida por 35 ciclos de 30 s a 94 ° C para desnaturação, 30 s a 60° C para recozimento, 30 segundos a 72 ° C para a extensão e a 10 minutos a 72 ° C para a extensão final.
    10. Após a PCR é terminado, adicione 3 µ l de 6 x tintura para cada amostra de carregamento. Mix por agredir e centrífuga brevemente para 3-5 s.
    11. Produtos PCR são analisados por eletroforese em gel de agarose a 2% (p/v) em 1 x TAE de buffer. Os tamanhos da tva e produtos do PCR B2m são 500 bp e 300 bp, respectivamente.

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Representative Results

A taxa de infecção in vivo e in vitro de RIP-Tag; RIP-tva células tumorais por vírus baseados em RCASBP ~ 20% e ~ 80% respectivamente são 20. Na RIP-marca de ; RIP-tva modelo do rato, aproximadamente 4% de 400 ilhotas pancreáticas em cada rato desenvolverá naturalmente em tumores 20; Portanto, há uma quantidade suficiente de células tumorais em cada rato para análise histológica e fenotípica do efeito potencial dos genes entregado pelos vírus. Usando este sistema, uma função nuclear romance de Bcl-xL em metástase foi identificado 9. RIP-Tag; RIP-tva camundongos infectados com RCASBP -Bcl-xL exibiram uma maior incidência de carcinomas invasivos do que os ratos infectados com vírus de controle, RCASBP -ALPP (96% contra 74%). Além disso, 47% dos RCASBP -Bcl-xL-infectado RIP-Tag; RIP-tva ratos desenvolveram metástases em linfonodos pancreáticos, quando sacrificados em 16 semanas de idade (Figura 3A), enquanto nenhuma metástase foi encontrado em ratos de controle 20.

Além disso, nós selecionados uma biblioteca de genes do câncer em RIP-Tag; RIP-tva ratos e identificado o primeiro gene que promove a metástase para linfonodos do pâncreas e do fígado 21 (Figura 3B e 3C). Este gene codifica o Receptor de proteína de (RHAMMB) isoforma B motilidade mediada por ácido hialurônico e ativa EGFR sinalização 21. Demonstrámos que metástase do fígado específico pode ser instaurada em um ensaio de veia de cauda de metástase experimental em que as células do tumor N134 inicialmente divulgado através os leitos capilares pulmonares do destinatário camundongos imunodeficientes 21.

Figure 1
Figura 1 : Esquemático de construções RCASBP(A), RCAS-X e Y-RCAS. Clonagem de sites são indicados em azul, negrito fonte. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Colocação de Injeção intracardíaca. Pontos anatômicos são mostrados com linhas tracejadas horizontais no esterno (delineados em branco). Na pele do rato, o entalhe esternal e o processo de xyphoid servem como pontos de referência, e a agulha é inserida 1mm longe no meio do esterno e ligeiramente deixou (anatômica) do esterno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Deteção de β pancreático metastático de células por imunocoloração. As fotografias mostram Sinaptofisina representante coloração de metastáticos tumores neuroendócrinos do pâncreas em linfonodos pancreáticos, (A, B) ou no fígado (C). RIP-Tag; RIP-tva camundongos foram infectados com os retrovírus RCASBP indicados em 7 semanas de idade e sacrificados em 16 semanas de idade. Barra de escala = 50 µm. ampliação Original = 20 X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Neste estudo, descrevemos um modelo poderoso rato, RIP-Tag; RIP-tva, para conseguir a entrega do gene somática via aviária retrovírus para a identificação e caracterização de fatores metastáticos. Embora RIP-Tag; RIP-tva ratos desenvolvem tumores neuroendócrinos do pâncreas, metastáticos factores identificados neste modelo do rato também podem promover a metástase de outros tipos de câncer.

Nossa abordagem tem a vantagem de introduzir alterações genéticas somáticas especificamente em lesões pré-malignas das células β do pâncreas de uma forma de controle de tempo, assim mais fielmente imitando o desenvolvimento do tumor humano esporádicos. Essa abordagem evita qualquer perturbação do potencial de formação de tecido normal, que é frequentemente observada em modelos transgénicos convencionais devido a gravidez ectópica expressão do gene de interesse durante o desenvolvimento. Além disso, é muito mais rápido para gerar vetores retrovirais aviária, carregando os genes de interesse do que gerar ratos transgénicos. RCASBP-derivado aviária vetor retroviral pode entregar cDNAs (≤2.5 kb), shRNAs, miRNAs e outros RNAs não-codificante tva-expressando células in vitro e em vivo. A eficiência da infecção (e infecção múltipla) é dependente da taxa de proliferação das células-alvo e a acessibilidade das células. Um título de > 1 x 108 infecciosas unidades / ml é necessário para a infecção na vivo . Entrega mais eficiente viral pode ser alcançada em vitro devido à proliferação celular induzida e a possibilidade de exposição repetitiva de todas as células ao vírus.

Técnica de Injeção intracardíaca precisos é fundamental para a viabilidade dos ratos. Primeiro, um 50 µ l de espaço aéreo em uma seringa de insulina antes de elaborar a suspensão viral é crucial para ver a pulsação cardíaca. Em segundo lugar, é importante para fixar a posição da seringa, uma vez que aparece um pulso vermelho de sangue e entregar lentamente 10-20 µ l suspensão viral sempre vendo um pulso vermelho brilhante de sangue aparecem na seringa. Se parem de pulsos vermelhos brilhantes de sangue após a entrega de 10 a 20 µ l de suspensão viral, ligeiramente, reposicionar a agulha vai ajudar. Em terceiro lugar, após o último empurrão do êmbolo para entregar a suspensão viral e antes de ver a pulsação do sangue, a agulha precisa ser retraído rapidamente fora da cavidade torácica e uma ligeira pressão aplicada sobre o local da injeção vai ajudar a reduzir a hemorragia interna. Último mas não menos importante, não reutilizar a seringa de insulina em outro rato.

Para aplicações futuras, este RIP-Tag; RIP-tva modelo do rato pode ser combinado com outros modelos de rato transgénico, TOC-no e nocaute. Além disso, nós encaramos combinando esta RIP-Tag; RIP-tva modelo do rato com a ferramenta de edição de genoma CRISPR-Cas9 para gerar mutações de ponto única, exclusão, rearranjos genômicos, tais como inversões e translocações 22.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Agradecemos a Harold Varmus, Brian C. Lewis, Douglas Hanahan, Danny Huang, Sharon Pang, Megan Wong e Manasi M. Godbole. Y.C.N.D. é suportado pelo DOD grant W81XWH-16-1-0619 e NIH grant 1R01CA204916.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RCASBP-Y DV plasmid Addgene 11478
RCAS-RNAi plasmid Addgene 15182
DMEM Corning 10-013-CV
fetal bovine serum Atlanta Biologicals 25-005-CI
L-glutamine, 100x Corning 25-005-CI
Penicillin-Streptomycin solution, 100x Corning 30-002-CI
PBS-/-, 1x Corning 21-040-CV
Superfect Qiagen 301305
Polyallomer centrifuge tube Beckman Coulter 326823
0.45 mm Nalgene
Syringe Filters with PES Membrane		 Thermo Scientific 194-2545
Insulin Syringes BD 329461
synaptophysin Vector Laboratories VP-S284
VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG) Vector Laboratories PK-6101
AmpliTaq DNA Polymerase with Buffer II Life Technologies N8080153
MyTaq DNA Polymerase Bioline BIO-21106

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References

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Pesquisa sobre o câncer edição 128 Mouse modelo transferência de genes somáticos de metástase RCAS marca RIP RIP-tva
Identificação e caracterização dos fatores metastáticos por transferência de genes para a novela <em>RIP-Tag; RIP-tva</em> modelo murino
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Zhang, G., Chi, Y., Du, Y. C. N.… More

Zhang, G., Chi, Y., Du, Y. C. N. Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model. J. Vis. Exp. (128), e55890, doi:10.3791/55890 (2017).

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