Summary
We presenteren een protocol om aan te tonen van een roman somatic gene transfersysteem met behulp van RIP-Tag; RIP-BTW muismodel om te bestuderen van de functie van genen in metastase. De aviaire retrovirussen zijn intracardiacally om ervoor te zorgen genenoverdracht in pre-maligne, noninvasive laesies van de cellen van de alvleesklier β in volwassen muizen geleverd.
Abstract
Metastatische kanker is verantwoordelijk voor 90% van de sterfgevallen bij patiënten met solide tumoren. Er is een dringende noodzaak om de bestuurders van uitzaaiing van kanker beter te begrijpen en te identificeren van nieuwe therapeutische doelen. Voor het onderzoek naar de moleculaire gebeurtenissen die de progressie van de primaire kanker naar metastase rijden, hebben we een muismodel van bitransgenic, RIP-Tag; RIP-BTW. In dit muismodel drijft de rat insuline promotor (RIP) de uitdrukking van het antigeen SV40 T (Tag) en de receptor voor deelgroep een virus van aviaire leukose (tva) in de alvleesklier β-cellen. De muizen ontwikkelen alvleesklier neuro-endocriene tumoren met 100% doordringendheid door duidelijk omschreven fasen die vergelijkbaar met menselijke tumorvorming, met stadia zijn, met inbegrip van hyperplasie, angiogenese, adenoom en carcinoom invasief. Omdat RIP-Tag; RIP-BTW muizen niet gemetastaseerde ziekte ontwikkelen, genetische wijzigingen die bevordering van metastase kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd. Somatic gene transfer in het tva-uiten, alvleesklier β prolifererende Premaligne laesies is bereikt door middel van intracardiac injectie van aviaire retrovirussen herbergen de gewenste genetische wijziging. Een titer van > 1 x 108 besmettelijke eenheden per ml is geschikt geacht voor in vivo infectie. Daarnaast kunnen aviaire retrovirussen infecteren cellijnen afgeleid van tumoren in RIP-Tag; RIP-BTW muizen met een hoog rendement. De cellijnen kunnen ook worden gebruikt om te karakteriseren de metastatische factoren. Hier laten we zien hoe deze muismodel gebruiken en cellijnen om te beoordelen van de functies van kandidaat-genen in de uitzaaiing van de tumor.
Introduction
De meeste kankers ontstaan van somatische mutaties 1. Conventionele genetisch gemodificeerde Muismodellen (GEMM) hebben belangrijke inzichten in de bijdrage van specifieke genetische wijzigingen op tumorvorming 2verstrekt. Zij hebben echter verschillende beperkingen. Het grote nadeel van deze modellen is dat ze niet de sporadische aard van tumor vorming bij de mens, waarin slechts sommige cellen binnen een weefsel genetische wijzigingen verwerven repliceren. De mutaties in transgene en knockout muizen zijn ook germline met potentieel tot ontwikkeling beïnvloeden. Bovendien, het genereren van deze Muismodellen is duur en tijdrovend.
Metastase is een belangrijke kwestie op het gebied van kanker. Modelleren van metastase moeizaam in GEMM. Spontane metastase is zeldzaam in de muis. Doordringendheid is variabel en latentie is lang in GEMM van metastase 3. Experimentele metastase modellen dienst directe injectie van cellen in de circulatie van muizen, zodat de eerste stappen in de gemetastaseerde opeenvolging worden geëlimineerd.
Om te overwinnen sommige van de bovenstaande beperkingen in het bestuderen van metastatische factoren in muismodellen, hebben we een muismodel van bitransgenic, RIP-Tag; RIP-BTW4. De strategie is gebaseerd op de combinatie van het gebruik van een sterk gesynchroniseerd tumor progressie muismodel, RIP-Tag 5, en de receptor voor aviaire leukose deelgroep-A virus, tva 6,7. Deze RIP-Tag; RIP-BTWmuismodel kunt genen somatically worden ingevoerd in een interne bitransgenic muis stam. Met het onderdrukken van de tumor onderdrukkende functie van Rb en p53 SV40 T-antigeen ontwikkelen muizen alvleesklier neuro-endocriene tumoren in een soortgelijke wijze als menselijke tumorvorming, met stadia, met inbegrip van hyperplasie, angiogenese, adenoom en carcinoom invasief. Dit model van de RIP-Tag is zeer leerzaam voor ons begrip van de kenmerken van de kanker, niet beperkt tot de alvleesklier neuro-endocriene tumoren. Het is ook gebruikt in preklinische proeven 8.
Presenteren we een protocol voor somatische genenoverdracht via injectie van aviaire retrovirussen intracardiacally in RIP-Tag; RIP-BTW muizen. Succesvolle besmetting met aviaire retrovirussen RCASBP afkomstige vereist actief delende cellen van de doelgroep. Daarom kozen we voor RIP-Tag; RIP-BTW muizen op 7 weken van leeftijd, wanneer hyperplasie in ongeveer 50% van de alvleesklier eilandjes ontwikkelt. Linker ventriculaire intracardiac injectie van hoge titer virussen is vereist om de efficiëntie van een infectie van 10-20% 4te bereiken. Deze leveringsmethode vermindert de significante verdunning van virale deeltjes binnen verkeer voordat virussen alvleesklier eilandjes bereiken.
Met behulp van deze aanpak, hebben wij eerder aangetoond dat Bcl-xL kanker uitzaaiingen onafhankelijk van haar anti-apoptotic functie 4,9 bevordert. Deze anti-apoptotic-onafhankelijke metastatische functie werd niet waargenomen als Bcl-xL was uitgedrukt via een transgenic in alle alvleesklier β-cellen in de hele tumorigene ontogenie in de RIP-Tag; RIP-Bcl-xL muis model 10. Daarom biedt onze muismodel een unieke gelegenheid om te identificeren en te karakteriseren genen functies als uitgedrukt in een later stadium van tumorvorming. Omdat 2-4% van de eilandjes uitgroeien tot tumoren in de RIP-Tag; RIP-BTW bitransgenic Muizen zonder virale infectie en niet alle de Premaligne laesies zijn besmet met de RCASBP-afgeleide aviaire retrovirussen, alleen de factoren die een selectief voordeel bieden in de natuurlijke loop van tumorvorming kunnen worden geïdentificeerd. Metastatische factoren met name zal gemakkelijkst worden herkend door deze methode, omdat metastase aan alvleesklier lymfeklieren of andere organen normaal gesproken niet in RIP-Tag treedt; RIP-BTW muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ethische verklaring: experimenten op dieren werden uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren en voorschriften uiteengezet door het Institute for Animal Care en gebruik Comité van Weill Cornell geneeskunde.
1. keuze van aviaire retrovirale vectoren (RCASBP A gebaseerde of RCANBP(A)-based)
- vectoren is afgeleid van Rous Sarcoom virus 11. Aviaire retrovirale vectoren cDNAs kunnen leveren (≤ 2.5 kb), korte haarspeld RNAs (shRNAs), microRNAs (miRNAs) en andere noncoding RNAs. De verkrijgbare vectoren worden vermeld in de materialen en anderen moeten worden aangevraagd direct bij de auteurs.
- Tot overexpress van de genen van belang, gebruik een van de volgende vectoren, RCASBP(A) 12 ( figuur 1A), RCAS-X ( figuur 1B), RCAS-Y 13 ( Figuur 1 c), RCASBP-Y DV 14, of andere vectoren ALV-A (https://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/mice.html).
- Knock genen van belang door shRNA, gebruik een van de volgende vectoren: RCAN-X DV 15 of RCAS-RNAi 16.
- Te overexpress miRNAs, RCAS-miR vector genereren zoals beschreven in 17.
- Transformatie in E. coli en DNA eis. DNA transformeren
- bij voorkeur in Stbl2 of Stbl3 bevoegde cellen, die unieke genotype hebben te stabiliseren directe herhalen en retrovirale sequenties. Plasmide-DNA met behulp van een methode die, zuiver opleveren zal, zuiveren transfectie rang DNA. 5 µg DNA is nodig met minimumconcentratie van 0,1 µg/µl.
2. Virale Propagation in kip Fibroblast DF1 cellijn
- het gebruik van gefilterde Pipetteer tips voor celkweek is vereist om te voorkomen dat cross-besmetting van virale voorraden 18.
- Onderhouden DF1 cellen in 6 cm schotel met groei medium (DMEM met hoge glucose, 10% foetale runderserum, 6 mM (eindconcentratie) L-glutamine, 10 eenheden/ml penicilline, 10 µg/ml streptomycine) op 37 o C en 5% CO 2. Als DF1 cellen zijn vers ontdooid uit bevroren voorraden, cultuur ze voor ten minste 3 dagen vóór de transfectie.
- Één dag vóór de transfectie, DF1 cellen aan een 6 cm weefselkweek schotel doorgeven zodat zij 30-50% heuvels ten tijde van de transfectie zullen.
- Verdund 5 µg pure viraal DNA met DMEM (zonder serum, penicilline en streptomycine) tot een totaal volume van 150 µl in een buis van de microcentrifuge binnen de kap van een weefselkweek.
- Toevoegen 30 µL van Superfect direct in de verdunde DNA buis; vortex dit mengsel voor 10 s; laat het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 5-10 min. in de weefselkweek hood toe transfectie-complex vorming.
- Terwijl complexvorming plaatsvindt, zachtjes gecombineerd groeimedium uit de DF1 schotel voor de cultuur van de cel, en zorgvuldig wassen cellen met 4 ml PBS - / -.
- Pipetteer 5 ml groei medium (met serum en antibiotica); Sla 4 ml op een Falcon buis voor de volgende stap; en de rest van 1 ml groeimedium toevoegen aan de transfectie complexen. Meng door pipetteren twee keer op en neer, en de hele transfectie complexen onmiddellijk overbrengen in de DF1 cellen. Swirl om ervoor te zorgen dat de cellaag wordt gedekt; Incubeer gedurende 2-3 uur op 37 o C.
- Gecombineerd de transfectie mengsel cellen met 4 ml PBS - / - wassen; Voeg 4 ml verse groeimedium (met serum en antibiotica); cellen terug te keren naar een 37 o C incubator.
- Wanneer cellen confluentie bereiken, passage cellen (voorbijgaande expressie kan worden vehiculumcontrolegroep 48 tot 72 uur na de transfectie).
- Blijven doorgeven van cellen voor ongeveer 7 dagen totdat alle cellen zijn vermoedelijk besmet; virale integratie van DNA door PCR te testen eiwit expressie door het westelijke bevlekken; en bevriezen van cellen in DMEM medium met 10% DMSO en 20% foetale runderserum.
3. In Vivo Infectie van RIP-Tag; RIP-BTW muizen
- Virus collectie en concentratie
gebruik vers geconcentreerd virussen voor in vivo infectie. De titer van virussen in 4 o C gehouden binnen een week niet aanzienlijk wordt verminderd. Echter weergeven bevroren aliquots van virale voorraad 10-fold verminderde titer na ontdooien.- Uitvouwen virus-producent DF1 cellen in 15 cm gerechten afhankelijk van de hoeveelheid virus nodig. Voor in vivo muis infectie, bereiden een gemiddelde van één plaat per muis.
- Chill vooraf de rotor (bijvoorbeeld SW28), de swing-emmer, en de machine van de ultracentrifuge naar 4 o C.
- Collect supernatant van confluente 15 cm schotels. Verwijderen van puin van de cel door lage snelheid centrifugeren bij 1.650 x g gedurende 10 minuten bij 4 o C.
- Transfer het virale supernatant ultracentrifuge buizen (Polyallomer centrifuge buizen). Spin in een ultracentrifuge voor 1,5 uur bij 95,400 x g 4 o C. Gebruik voor Beckman XL-100 ultracentrifuge machine, Accel: 1; Bleef: 1 instellingen.
- Verwijderen supernatant van ultracentrifuge buizen zoveel mogelijk. Voeg PBS zonder calcium en magnesium (PBS - / -) aan de ultracentrifuge buis om definitieve 100 µl virale schorsing van één 15 cm schotel. Dekking van de buizen met Parafilm. Resuspendeer de pellet van onzichtbare virale door vortexing de ultracentrifuge voor 2 min op middellange snelheid buizen.
- Rock van de ultracentrifuge buizen bij 4 o C gedurende één uur naar girale.
- Spoel de virale suspensie in een microcentrifuge buis. Opwarmen van de virale schorsing tot kamertemperatuur vóór injectie in muizen.
- Virale Titer vastberadenheid.
Voor elke nieuwe virale construct moet virale titer vóór de in vivo infectie worden vastgesteld.- Zaad DF1 cellen in alle putjes van de plaat van een 12-well weefselkweek (suggestie: 2 x 10 4 cellen/well, 1 ml/putje), zodat zij 30% heuvels op het moment van infectie zullen. Een 12-well plaat nodig is voor virale titer wordt één bepaling verricht.
- Een aantal 10-fold verdunningen van het supernatans dat virale in groeimedium als volgt maken:
- Mix 5 µl virale supernatant met 495 µl groeimedium voor de 10 2 verdunning in de buis van een microcentrifuge. Vortex kort voor een paar seconden.
- Nemen 40 µl van de 10 2 verdunning in 360 µl groeimedium in een microcentrifuge buis voor de 10 3-verdunning. Vortex kort voor een paar seconden.
- Volg stap 3.2.2.2 voor 10 4 en 10 5 verdunning.
- Set tot 5 van 6 ml polystyreen buizen. Groeimedium aliquoot 2,25 ml per buis en label hen 10 6 10 7, 10 8, 10 9, 10 10, respectievelijk.
- Mix 0,25 ml van de 10 5 verdunning met 2,25 ml groeimedium in de polystyreen-tube 6 ml voor de 10 6 verdunning. Vortex kort voor een paar seconden.
- Volg stap 3.2.2.5 voor 10 7, 10 8, 10, 9 en 10 10 verdunning.
- Verwijder het originele kweekmedium uit DF1 cellen op de plaat 12-well. Zet 1 ml verdund virussen moet elk goed in gedupliceerd (niet-geïnfecteerde, 10 10 tot en met 10 6 IU/ml).
- Cellen groeien gedurende ten minste 7 dagen (uitvoeren trypsinzation indien nodig) toestaan. Verzamelen van cellen isoleren van DNA en controleren op de aanwezigheid van viraal DNA door PCR, zoals beschreven in " 6. PCR de protocollen van ". Als deze virale titer 10 8 besmettelijke eenheden per ml (IU/ml), een positieve 398 bp PCR producten uit RCASBP zal worden waargenomen met behulp van DNA uit cellen met 10 8 tot 10 6 IU/ml virussen, maar niet van geïnfecteerde cellen of cellen met 10 10 tot en met 10 9 IU/ml virussen. Een titer van > 1 x 10 8 besmettelijke eenheden per ml moeten worden gebruikt voor in vivo infectie.
- Intracardiac injectie
Hemizygous RIP-Tag muizen, niet homozygoot muizen, worden gebruikt in deze studie. Hemizygous RIP-Tag muizen ontwikkelen alvleesklier neuro-endocriene tumoren ongeveer 10 ~ 12 weken oud, terwijl homozygoot muizen een kortere tumor latency hebben. Omdat celproliferatie vereist voor de opneming van de virale cDNA in de host is genoom, 7-week-oude RIP-Tag; RIP-BTW muizen met hyperplasic alvleesklier β-cellen worden gebruikt. Houd er rekening mee dat de meeste normale β-cellen niet in volwassen muizen zijn prolifererende.- Gebruik 7 week-oude RIP-Tag; RIP-BTW muizen in een zuivere C57BL/C achtergrond voor de experimenten.
- Verdoving muis met een ketamine/xylazine combinatie (150 mg/kg; 15 mg/kg). Warmte ondersteuning gebruiken om de muis lichaamstemperatuur tijdens de gehele duur van de verdoving.
- Oog smeermiddel van toepassing op beide ogen om te voorkomen dat het drogen van de cornea.
- Scheren haar van de borstholte van RIP-Tag; RIP-BTW muizen. De muis van de positie op zijn rug met borst naar boven. Een teen-snuifje wordt uitgevoerd om te zien hoe het dier voor niet-ontvankelijkheid te bevestigen de volledige verdoving effect.
- De voorste ledematen uitbreiden en hen veilig met tapes. Mark muis ' s borst voor injectie. Markeer een locatie halverwege de sternale Inkeping en de bovenkant van xyphoid proces, en iets links van het borstbeen ( Figuur 2) (anatomische).
- Scrub de anterior borstwand met een scrub van Povidon-jood of een scrub chloorhexidine gevolgd door een 70% isopropylalcohol of 70% ethanol gaas spons gedrenkt.
- Trekken 50 µl van lucht in een steriele 28 g ½ insuline syringe om ruimte tussen de zuiger en de meniscus voor een 500 µL spuit te maken, en vervolgens stelt 100 µl van virussen. Het luchtruim zonder iedere vloeistof op de muur is van cruciaal belang voor het zien van de cardiale puls.
- Houd naald rechtop. Huid van muis strak met de ene hand houd, en invoegen van naald naar de gemarkeerde locatie. Wanneer een helder rode puls van bloed in de spuit verschijnt, stoppen met het bevorderen van de naald en herstellen van de diepte van de naald in de muis met de ene hand.
- Gebruik van de andere hand aan zorgvuldig en langzaam duw de zuiger te leveren virale schorsing (~ 100 µl volume) over een periode van ~ 60 seconden. 10-20 µl leveren als het zien van een helder rood puls van bloed worden weergegeven in de spuit. Continu ingang van rode zuurstofrijk bloed op de hub transparante naald geeft de juiste positionering van de naald in het linkerventrikel.
- Na de laatste duw van de zuiger leveren virale schorsing en voordat de volgende rode pols van bloed te zien, intrekken snel de naald uit de borstholte.
- Zachte druk over de injectieplaats te verminderen bloeden voor ten minste 1 min. van toepassing
- Zorgvuldig Verplaats de muis naar een verwarming pad of onder een warmte lamp tot volledig bij bewustzijn. Muizen zal worden gevolgd totdat de verdoving slijt af, zodat ze van stimuli lopen kunnen, een periode die meestal duren ongeveer een uur. Muizen zullen dagelijks worden gecontroleerd op zelfs en intact vacht en eventuele wijzigingen in gedrag.
4. Histopathologisch analyse van tumoren
- negen weken na injectie, euthanaseren 16 week-oude RIP-Tag; RIP-BTW muizen. Opnemen van afmetingen en aantal primaire alvleesklier tumoren en eventuele bruto metastasen.
- Fix alvleesklier, lever, en/of andere organen in 10% gebufferd formaline 's nachts bij kamertemperatuur in een rockende platform.
- Breng de vaste weefsels in 70% ethanol op de volgende dag. Verwerken van weefsels in paraffine-ingebedde secties.
- Uitvoeren immunohistochemische kleuring voor synaptophysin (een neuro-endocriene marker) of insuline (een marker van de cel-specifieke β) na fabrikant ' s instructies voor het identificeren van metastasen van alvleesklier β-cellen in de alvleesklier lymfklieren of levers. Echter de gedifferentieerde tumorcellen of slecht gedifferentieerde tumorcellen de expressie van insuline kan verliezen en kan alleen worden gedetecteerd door synaptophysin immunokleuring.
5. In Vitro Infectie van cellen uiten van BTW
het is niet nodig om geconcentreerde virussen voor in vitro infectie. Het protocol die hieronder beschreven is voor twee rondes van de infectie. Verdere rondes van infectie kunnen worden uitgevoerd door het herhalen van het volgende protocol.
- Collect virale supernatant van confluente DF1 cellen. Houd het virale supernatant bij 4 o C voor besmetting binnen een week. Voordat de infectie, passeren het virale supernatant een 0,45 micrometer filter te verkrijgen van cel-vrij virus.
- Kort spoelen tva-uiten doelcellen (d.w.z. N134 alvleesklier β cel tumor cellijn van een RIP-Tag; RIP-tva muis) met PBS - / - om alle sporen van het serum te verwijderen, die bevatten trypsine-remmer. Kort spoelen doelcellen tva-uitdrukken met trypsine-EDTA (zoals 0,25% trypsine-2.21 mM EDTA) oplossing. Voeg trypsine-EDTA-oplossing toe en incubeer gedurende 2 minuten. Tik zachtjes op de plaat. Observeren van cellen onder een omgekeerde Microscoop. Cellen los meestal in 2 tot 3 min. zaad doelcellen in een plaat van 6 cm. Gebruik 3 ~ 4 ml gefilterd virale bovendrijvende substantie als groeimedium.
Opmerking: De voeding in het virale supernatant wordt verbruikt door DF1 cellen, dus het veranderen van het medium's anderendaags. - Op de volgende dag, warming-up voldoende hoeveelheid virale supernatant tot kamertemperatuur. Verwijder het medium van doelcellen, en vervang door virale supernatans dat 3-4 ml.
- Op de derde dag, passage cellen zo nodig. Als cellen niet dicht genoeg om te worden gepasseerd, opwarmen ~ 4 ml van regelmatige groeimedium (DMEM met hoge glucose, 10% foetale runderserum, 6 mM (eindconcentratie) L-glutamine, 10 eenheden/mL penicilline, 10 µg/mL streptomycine) ter vervanging van het virale supernatant.
- Uitvouwen geïnfecteerde cellen en bestuderen van de kandidaat-eiwit expressie door Western blotting 19. De gevolgen van de kandidaat-genen voor migratie en invasie kunnen worden geanalyseerd in transwell testen. Deze cellijnen kunnen ook worden getest voor hun gemetastaseerde potentieel aan de lever in een staart ader assay voor metastase.
6. PCR protocollen
oplossingen zo spoedig mogelijk moeten worden gemonteerd op het ijs. Een mastermix zonder de sjabloon kan worden gemaakt voor een groot aantal monsters en aliquoted in PCR buizen. Vermenigvuldigt de hoeveelheid van elk reagens nodig door het aantal monsters. Meng de reagentia door flicking voorafgaande en swirl met Pipetteer tip alvorens enkele toe te voegen aan de mastermix. Na elk reagens toe te voegen aan de mastermix buis, omhoog en omlaag om alle storingswaarden binnen de tips Pipetteer.
- Op de aanwezigheid van RCASBP in de besmette of transfected cellen.
Het volgende protocol aangedrongen op 11,5 µL van de mastermix en 1 µL van genomic DNA voor elk monster. Zorg ervoor dat wervelen alvorens toe te voegen elk reagens.- Bereiden een mastermix 7.68 µL nuclease-gratis water, 0,75 µL DMSO, 1,25 µl 10 x buffer II voor AmpliTaq DNA Polymerase, 1,375 µl van 25 mM MgCl 2 en 0,125 µl van 25 mM dNTP.
- Toevoegen van 0,125 µL van 100 µM voorwaartse primer RCAS5626F: (5 ' - ACCGGGGGATGCGTAGGCTTCA - 3 ') en 0,125 µL van 100 µM omkeren primer RCAS6023R: (5 ' - CCGCAACACCCACTGGCATTACC - 3 ') naar de mastermix.
- Voeg 0.075 µL AmpliTaq Polymerase van DNA aan de mastermix.
- Meng de mastermix door flicking de buis met vingers. Spin naar beneden de matermix in een centrifuge machine korty voor 3 ~ 5 seconden.
- Aliquoot 11,5 µL van de mastermix aan elk individu PCR buizen. Swirl telkens voordat aliquoting tot een nieuwe koker.
- Swirl en 1 µL genomic DNA sjabloon toevoegen aan elke PCR-buis. Aan de genomic DNA bereiden:
- Lyse cel pellet in 200 µl van 0,05 M NaOH. Pipetteer omhoog en omlaag te ontbinden de pellet.
- Warmte van de cel lysate tot 98 ° C gedurende 20 minuten in een PCR-machine, en vervolgens afgekoeld tot 25 ° C.
- Voeg toe 20 µL 1.0 M Tris-HCl (pH 7.5) om de buizen, en sla het DNA monsters bij 4 ° C.
- Meng de monsters door flicking en centrifuge kort voor 3-5 seconden. Buizen in een PCR machine gebracht.
- De PCR voorwaarde is ingesteld op 2 min op 92 ° C voor de eerste denaturatie, gevolgd door 40 cycli van 30 bij 94 ° C voor denaturatie, 30 s bij 67° C voor het gloeien, 30 s s bij 72 ° C voor uitbreiding, en 10 m bij 72 ° C gedurende de laatste extensie.
- Nadat de PCR is voltooid, voegt 3 µL van 6 x DNA laden kleurstof toe aan elk monster. Meng door flicking en centrifuge kort voor 3 ~ 5 seconden.
- PCR producten zijn onderzocht door elektroforese in een 2% (g/v) agarose gel in 1 x TAE buffer. De grootte van het PCR-product is 398 bp.
- Tag genotypering.
Het volgende protocol aangedrongen op 10.5 µL van de mastermix en 2 µL van genomic DNA voor elk monster. Zorg ervoor dat wervelen alvorens toe te voegen elk reagens.- Bereiden een mastermix van 4.5 µL nuclease-gratis water en 4.00 µL 5 x MyTaq reactie Buffer voor de MyTaq van DNA Taq.
- Voeg 0.4 µL van 100 µM voorwaartse primer TagF2: (5 ' - GGACAAACCACAACTAGAATGCAGTG - 3 ') en 0.4 µL van 100 µM omkeren primer TagR2: (5 ' - CAGAGCAGAATTGTGGAGTGG - 3 ') aan de master mix.
- Voeg 0.8 µL van 10 µM voorloper van de bèta-2-microglobulin (B2m) primer mix voor de interne controle. PCR de inleidingen voor B2m zijn de interne controle, de voorloper van de bèta-2-microglobulin (B2m), B2-F (5 ' - CACCGGAGAATGGGAAGCCGAA - 3 ') en B2-R (5 ' - TCCACACAGATGGAGCGTCCAG - 3 ').
- Voeg 0.4 µL MyTaq Polymerase van DNA aan de mastermix.
- Meng de mastermix door flicking de buis met vingers. Spin down de mastermix in centrifuge machine voor 3 ~ 5 s.
- Aliquoot 10.5 µL van de mastermix aan elk individu PCR buizen. Swirl telkens voordat aliquoting tot een nieuwe koker.
- Swirl en 2 µL genomic DNA sjabloon toevoegen aan elke PCR-buis. Genomic DNA is opgesteld, zoals hierboven beschreven.
- Meng de oplossing door flicking en centrifuge kort voor 3-5 seconden. Buizen in PCR machine gebracht.
- De PCR voorwaarde is ingesteld op 3 min bij 95° C gedurende eerste denaturatie, gevolgd door 35 cycli van 15 s bij 95 ° C gedurende denaturatie, 15 bij 65 ° C voor het gloeien, 30 s s bij 72 ° C voor uitbreiding, en 10 minuten bij 72 ° C gedurende de laatste extensie.
- Nadat de PCR is klaar, voeg 3 µL van 6 x laden kleurstof aan elk monster. Meng door flicking en centrifuge kort voor 3 ~ 5 seconden.
- PCR producten zijn onderzocht door elektroforese in 2% (g/v) agarose gel in 1 x TAE buffer. De grootte van het label en B2m PCR producten zijn ~ 450 bp en 300 bp, respectievelijk.
- tva genotypering.
Het volgende protocol aangedrongen op 10.5 µL van het reagens mix voor elk monster. Zorg ervoor dat wervelen alvorens toe te voegen elk reagens.- Bereiden een mastermix van 5.6 µL nuclease gratis water, 0,5 µL DMSO 1,25 µL 10 x Buffer II voor AmpliTaq DNA-Polymerase, en 1,375 µL van 25 mM MgCl 2 en 0,125 µL van 25 mM dNTP.
- Toevoegen van 0,125 µL van 100 µM tva-3 (5 ' - GCCCTGGGGAAGGTCCTGCCC - 3 ') en 0,125 µL van 100 µM tva-5 (5 ' - CTGCTGCCCGGTAACGTGACCGG - 3 ') naar de mastermix.
- Toevoegen 1.275 µL van 10 µM B2m primer mix voor de interne controle naar de mastermix.
- Toevoegen van 0,125 µL AmpliTaq Polymerase van DNA aan de mastermix.
- Meng de mastermix door flicking de buis met vingers. Spin down de mastermix in centrifuge machine kort voor 3-5 seconden.
- Aliquoot 10.5 µL van de mastermix aan elk individu PCR buizen. Swirl telkens voordat aliquoting tot een nieuwe koker.
- Swirl en 2µL genomic DNA sjabloon toevoegen aan elke PCR-buis. Genomic DNA is opgesteld, zoals hierboven beschreven.
- Meng de oplossing door flicking en centrifuge kort voor 3-5 s. gestoken buizen PCR machine.
- De PCR voorwaarde is ingesteld op 2 min op 92 ° C voor de eerste denaturatie, gevolgd door 35 cycli van 30 bij 94 ° C voor denaturatie, 30 s s bij 60° C gedurende het gloeien, 30 seconden bij 72 ° C voor uitbreiding, en op 10 minuten bij 72 ° C voor definitieve extensie.
- Nadat de PCR is klaar, voeg 3 µL van 6 x laden kleurstof aan elk monster. Meng door flicking en centrifuge kort voor 3-5 s.
- PCR producten zijn onderzocht door elektroforese in een 2% (g/v) agarose gel in 1 x TAE buffer. De maten van tva en B2m PCR producten zijn 500 bp en 300 bp, respectievelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De in vivo en in vitro besmettingsgraad van RIP-Tag; RIP-BTW tumorcellen door RCASBP gebaseerde virussen zijn ~ 20% resp. ~ 80% 20. In de RIP-Tag; RIP-BTW muismodel, ongeveer 4% van de 400 alvleesklier eilandjes in elke muis zal natuurlijk uitgroeien tot tumoren 20; Daarom is er voldoende hoeveelheid tumorcellen in elke muis voor histologisch en fenotypische analyse van het potentiële effect van de genen die geleverd door de virussen. Met behulp van dit systeem, was een nieuwe nucleaire functie van Bcl-xL in metastase geïdentificeerde 9. RIP-Tag; RIP-BTW muizen geïnfecteerd met RCASBP -Bcl-xL tentoongesteld een hogere incidentie van invasieve carcinomen dan muizen geïnfecteerd met controle virussen, RCASBP -ALPP (96% versus 74%). Bovendien, 47% van de RCASBP -Bcl-xL-besmet RIP-Tag; RIP-BTW muizen ontwikkeld metastasen in de alvleesklier lymfklieren wanneer euthanized op 16 weken oud (figuur 3A), terwijl geen metastase werd gevonden in controle muizen 20.
Bovendien, we gescreend een bibliotheek van kankergenen in RIP-Tag; RIP-BTW muizen, en de eerste gen dat uitzaaiing naar de lymfklieren alvleesklier en de lever 21 (figuur 3B en 3 C bevordert) geïdentificeerd. Dit gen codeert de Receptor voor Hyaluron-gemedieerde motiliteit isovorm B (RHAMMB) eiwit en activeert EGFR signalering van 21. We toonden aan dat lever-specifieke metastase gerecapituleerd kan worden in een kwantitatieve analyse van staart, ader van experimentele metastase waarin N134 tumorcellen aanvankelijk verspreid via de longen capillair bedden van de ontvangende immunodeficiëntie muizen 21.
Figuur 1 : Schematische van RCASBP(A), RCAS-X en RCAS-Y constructen. Klonen sites zijn aangegeven in blauw, vet lettertype. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Plaatsing van intracardiac injectie. Anatomische monumenten worden weergegeven met horizontale stippellijnen op het borstbeen (aangegeven in wit). Op de muis van de huid, de sternale Inkeping en xyphoid proces dienen als monumenten, en de naald is ingevoegd van 1 mm afstand van het midden borstbeen en iets links van het borstbeen (anatomische). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Detectie van metastatische alvleesklier β cellen door immunokleuring. Foto's tonen representatieve synaptophysin kleuring van metastatische alvleesklier neuro-endocriene tumoren in de alvleesklier lymfklieren (A, B) of in de lever (C). RIP-Tag; RIP-BTW muizen geïnfecteerd met de aangegeven RCASBP retrovirussen op 7 weken van leeftijd en euthanized op 16 weken leeftijd. Schaal bar = 50 µm. oorspronkelijke vergroting = 20 X. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie beschreven we een krachtige muismodel, RIP-Tag; RIP-tva, om de somatische gene levering via aviaire retrovirussen voor de identificatie en karakterisering van metastatische factoren. Hoewel RIP-Tag; RIP-BTW muizen alvleesklier neuro-endocriene tumoren ontwikkelen, metastatische factoren geïdentificeerd in het muismodel van deze ook uitzaaiingen van andere soorten kanker kunnen bevorderen.
Onze aanpak heeft het voordeel van de invoering van somatische genetische veranderingen specifiek in Premaligne laesies van de alvleesklier β-cellen in een tijdcontrole manier, dus meer getrouw de sporadische menselijke tumor ontwikkeling na te bootsen. Deze aanpak vermijdt elke potentiële verstoring van normale weefsel formatie, die vaak in conventionele transgene modellen als gevolg van de ectopische uitdrukking van het gen van belang tijdens de ontwikkeling wordt waargenomen. Bovendien is het veel sneller te genereren van aviaire retrovirale vectoren uitvoering van genen van belang dan aan het genereren van transgene muizen. RCASBP-afgeleide aviaire retrovirale vector kan cDNAs (≤2.5 kb), shRNAs, miRNAs en andere noncoding RNAs leveren voor de tva-uiten cellen in vitro en in vivo. De efficiëntie van de infectie (en meerdere infectie) is afhankelijk van het tempo van de proliferatie van de doelcellen en de toegankelijkheid van de cellen. Een titer van > 1 x 108 besmettelijke eenheden per ml is vereist voor in vivo infectie. Meer efficiënte virale levering kan worden bereikt in vitro als gevolg van geïnduceerde celproliferatie en de mogelijkheid van repetitieve Gasbedwelming met behulp van alle cellen virussen.
Precieze intracardiac injectietechniek is essentieel voor de levensvatbaarheid van muizen. Eerst, een 50 µl van het luchtruim in een insuline spuit vóór het opstellen van virale schorsing is cruciaal voor het zien van de cardiale puls. Ten tweede, het is belangrijk de positie van de spuit oplossen zodra een rode puls van bloed verschijnt, en langzaam leveren 10-20 µl virale schorsing als het zien van een helder rood puls van bloed worden weergegeven in de spuit. Als felle rode pulsen van bloed na de uitspraak van 10-20 µl virale schorsing stopt, zal enigszins herpositionering van de naald helpen. Ten derde, na de laatste duw van de zuiger te leveren virale schorsing en voordat het zien van de pols van het bloed, de naald moet snel worden teruggetrokken uit de borstholte en een zachte druk toegepast over de injectieplaats zal helpen verminderen interne bloeden. Als laatste, maar daarom niet minder belangrijk, gebruik niet opnieuw de insuline spuit op een andere muis.
Voor toekomstige toepassingen, deze RIP-Tag; RIP-BTW muismodel kan gecombineerd worden met andere transgene knock-in en knockoutstadia Muismodellen. Bovendien, wij voorzien het combineren van deze RIP-Tag; RIP-BTW muismodel met CRISPR-Cas9 genoom-uitgevend hulpmiddel voor het genereren van één punt mutaties, de schrapping, de genomische herschikkingen zoals inversies en translocaties 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Harold Varmus, Brian C. Lewis, Douglas Hanahan, Danny Huang, Sharon Pang, Megan Wong en Manasi M. Godbole. Y.C.N.D. wordt ondersteund door DOD grant W81XWH-16-1-0619 en NIH grant 1R01CA204916.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RCASBP-Y DV plasmid | Addgene | 11478 | |
| RCAS-RNAi plasmid | Addgene | 15182 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | 25-005-CI | |
| L-glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| Penicillin-Streptomycin solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| PBS-/-, 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Superfect | Qiagen | 301305 | |
| Polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 326823 | |
| 0.45 mm Nalgene Syringe Filters with PES Membrane |
Thermo Scientific | 194-2545 | |
| Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| synaptophysin | Vector Laboratories | VP-S284 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-6101 | |
| AmpliTaq DNA Polymerase with Buffer II | Life Technologies | N8080153 | |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21106 |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W.
- Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv Cancer Res. 106, 113-164 (2010).
- Khanna, C., Hunter, K.
- Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS biology. 5 (10), e276 (2007).
- Hanahan, D. Heritable formation of pancreatic beta-cell tumours in transgenic mice expressing recombinant insulin/simian virus 40 oncogenes. Nature. 315 (6015), 115-122 (1985).
- Fisher, G. H., et al. Development of a flexible and specific gene delivery system for production of murine tumor models. Oncogene. 18 (38), 5253-5260 (1999).
- Orsulic, S. An RCAS-TVA-based approach to designer mouse models. Mamm Genome. 13 (10), 543-547 (2002).
- Tuveson, D., Hanahan, D. Translational medicine: Cancer lessons from mice to humans. Nature. 471 (7338), 316-317 (2011).
- Choi, S., et al. Bcl-xL promotes metastasis independent of its anti-apoptotic activity. Nat Commun. 7, 10384 (2016).
- Naik, P., Karrim, J., Hanahan, D. The rise and fall of apoptosis during multistage tumorigenesis: down-modulation contributes to tumor progression from angiogenic progenitors. Genes Dev. 10 (17), 2105-2116 (1996).
- Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. J Virol. 61 (10), 3004-3012 (1987).
- Petropoulos, C. J., Payne, W., Salter, D. W., Hughes, S. H. Appropriate in vivo expression of a muscle-specific promoter by using avian retroviral vectors for gene transfer [corrected]. J Virol. 66 (6), 3391-3397 (1992).
- Dunn, K. J., Williams, B. O., Li, Y., Pavan, W. J. Neural crest-directed gene transfer demonstrates Wnt1 role in melanocyte expansion and differentiation during mouse development. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (18), 10050-10055 (2000).
- Loftus, S. K., Larson, D. M., Watkins-Chow, D., Church, D. M., Pavan, W. J. Generation of RCAS vectors useful for functional genomic analyses. DNA Res. 8 (5), 221-226 (2001).
- Bromberg-White, J. L., et al. Delivery of short hairpin RNA sequences by using a replication-competent avian retroviral vector. J Virol. 78 (9), 4914-4916 (2004).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Dev Biol. 6 (2), (2006).
- Huse, J. T., et al. The PTEN-regulating microRNA miR-26a is amplified in high-grade glioma and facilitates gliomagenesis in vivo. Genes Dev. 23 (11), 1327-1337 (2009).
- Ahronian, L. G., Lewis, B. C. Generation of high-titer RCAS virus from DF1 chicken fibroblasts. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (11), 1161-1166 (2014).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS Biol. 5 (10), 2255-2269 (2007).
- Du, Y. C., Chou, C. K., Klimstra, D. S., Varmus, H. Receptor for hyaluronan-mediated motility isoform B promotes liver metastasis in a mouse model of multistep tumorigenesis and a tail vein assay for metastasis. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16753-16758 (2011).
- Guernet, A., Grumolato, L. CRISPR/Cas9 editing of the genome for cancer modeling. Methods. , (2017).
