Summary
Questo lavoro descrive un protocollo per l'immunoprecipitazione cromatina (ChIP) usando una linea cellulare T-cellula matura. Questo protocollo è idoneo per indagare la distribuzione di marchi specifici di istoni in siti specifici di promozione o nel genoma.
Abstract
I percorsi di segnalazione regolano i programmi di espressione genica attraverso la modulazione della struttura della cromatina a diversi livelli, ad esempio mediante modificazioni post-traslazionali (PTM) delle code di istone, lo scambio di istoni canonici con varianti istone e lo sfratto nucleosomico. Tale regolazione richiede il legame dei fattori di trascrizione sensibili al segnale (TFs) che reclutano gli enzimi che modificano cromatina agli elementi regolatori definiti come potenziatori. Comprendere come le cascate di segnalazione regolino l'attività di miglioramento richiede un'analisi completa del legame delle TF, degli enzimi che modificano cromatina e l'occupazione di marchi specifici di istone e di varianti istone. I campioni di immunoprecipitazione cromatina (ChIP) utilizzano anticorpi altamente specifici per immunoprecipitazioni di complessi proteici / DNA specifici. La successiva analisi del DNA purificato consente di identificare la regione occupata dalla proteina riconosciuta dall'anticorpo. Questo lavoro descrive un protocollo in modo efficiente peRform ChIP di proteine di istone in una linea cellulare T-cellule matura. Il protocollo presentato consente di eseguire i test ChIP in un tempo ragionevole e con un'elevata riproducibilità.
Introduction
Lo sviluppo, la differenziazione e l'omeostasi dipendono da specifici programmi di espressione genica che vengono stabiliti mediante segnalazione di eventi che modulano la struttura della cromatina e pertanto determinano se un determinato gene viene attivato o represso in maniera cellulare e temporale. Durante lo sviluppo di cellule T, devono essere stabiliti programmi specifici di espressione genica per determinare correttamente la maturazione dei precursori delle cellule T dal doppio negativo (DN) allo stato singolo-positivo (SP), passando attraverso diverse fasi intermedie 1 . Come il programma di espressione genica è dinamicamente regolato durante lo sviluppo di cellule T è stato ampiamente studiato negli anni precedenti da diversi laboratori 2 , 3 , 4 , 5 , 6 .
Con modificazioni post-traduzionali (PTMs) di istoni, lo scambio diIsonici canonici con varianti istone, sfratto nucleosomi e metilazione del DNA regolano l'interruttore ON / OFF dei geni. Diversi gruppi hanno esaminato la distribuzione genoma di PTM e varianti istone per determinare marcature associate a diversi stati di cromatina sia nelle regioni regolatori prossimali che distali 7 , 8 , 9 , 10 . Le cascate di segnalazione orchestrano la regolazione dinamica della cromatina mediante lo scambio di enzimi positivi e negativi che modificano cromatina (noti anche come modificatori di cromatina) ad elementi specifici di potenziamento. Questi modificatori di cromatina regolano la struttura della cromatina e quindi la produzione trascrizionale con, ad esempio, la metilazione dinamica dell'istone e l'acetilazione. Questo è il caso nel percorso di segnalazione Notch 11 , 12 , 13 ,14.
Dinamico istone PTMs; Scambi con varianti istone; E l'occupazione dinamica degli istoni, dei fattori di trascrizione e dei cofattori può essere studiata mediante saggi di cromatin immunoprecipitazione (ChIP). Gli anticorpi altamente specifici vengono usati per purificare specifici complessi proteici del DNA e il DNA purificato viene analizzato mediante PCR quantitativo (qPCR); Sequenza profonda (ChIP-Seq); O, meno frequentemente, l'ibridazione a microarray (ChIP-ChIP).
I test di ChIP sono talvolta impegnativi a causa di complicanze con la lisi delle cellule, taglio della cromatina e / o bassa specificità degli anticorpi. Sono state adottate diverse strategie per migliorare il protocollo, come avviene per NEXSON 15 . L'uso di sonicatori a bagno d'acqua raffreddato evita il riscaldamento del campione che potrebbe danneggiare gli epitopi presenti sulla proteina in esame, ma l'energia necessaria per la tranciatura dei campioni viene disperdita nell'acqua.Un altro miglioramento è stato fatto con lo sviluppo di dispositivi a ultrasuoni focalizzati che impediscono la dispersione dell'energia. Pertanto, i dispositivi a ultrasuoni focalizzati consentono di migliorare la lisi cellulare e la cricatura, eliminando le variazioni indotte dall'operatore e aumentando notevolmente la riproducibilità.
Questo lavoro descrive un protocollo (riepilogo schematico in Figura 1 ) per eseguire in modo efficiente il ChIP delle proteine dell'istone in una linea di cellule T di topi chiamata E2-10HA 16 , 17 . Le cellule T sono di solito difficili da lire e la loro cromatina è stata rivelata inefficiente. In questo protocollo, che utilizza un ultrasonicator raffreddato a raffreddamento, il numero di cellule, il buffer di lisi e l'impostazione di taglio sono stati ottimizzati per la linea di cellule T2 mouse da mouse E2-10HA. Questo protocollo consente di eseguire ChIP con un'elevata riproducibilità e in un tempo ragionevole. In effetti, richiedeCirca due giorni per tagliare la cromatina e valutare la qualità della tranciatura e tre giorni per eseguire l'immunoprecipitazione, invertire il reticolato e purificare il DNA.
Protocol
NOTA: Tutti i buffer e il mezzo utilizzato in questo protocollo sono elencati nella tabella 1 .
Giorni 1 e 2
1. Incrociare le cellule
- Trasferire le cellule T da topo da una piastra a 6 pozzetti a un tubo da 50 mL e centrifugare per 5 min a 4 ° C e ~ 271 x g. Resuspendere il pellet cellulare in 30 ml di terreno di coltura cellulare IMDM e contare le cellule utilizzando una camera Neubauer.
- Raccogliere aliquote di 20 x 10 6 cellule in nuovi tubi da 50 ml.
- Aggiungere la formaldeide (FMA) ad una concentrazione finale del 1% direttamente al mezzo di coltura cellulare e incubare a temperatura ambiente per 10 min.
Attenzione: la FMA è tossica se inalato, quindi lavorare sotto una cappa di fumo e indossare attrezzature di protezione adeguate. Inoltre, si prega di gestire i rifiuti FMA secondo le regole dell'istituto ospitante. - Aggiungere un volume di 1/8 di glicina 1 M, pH 7,0 e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Pellet le cellule per centrifugazione per 5Min a 4 ° C e ~ 271 xg e lavare con 10 ml di soluzione salina fosfata-tamponata (PBS).
- Lavare il pellet cellulare con 1 ml di PBS e trasferire in tubi da 1,5 ml.
2. Lysis cellulare e cricatura di cromatina
- Resuspendere il pellet cellulare in 1 ml di tampone di lisi SDS e incubare su ghiaccio per 10 min.
- Trasferire ogni campione in un tubo di sonicazione e eseguire la tranciatura utilizzando un ultrasonicator focalizzato in base alle impostazioni indicate nella tabella 2.
- Dopo il taglio, trasferire i campioni su tubi da 1,5 ml e centrifugare per 10 minuti a 4 ° C e ~ 18,000 x g.
- Trasferire il surnatante ai nuovi tubi.
- Raccogliere 50 μl per determinare l'efficienza di taglio secondo la fase 3 e congelare il lattato tagliato in azoto liquido. Conservare il lisato in aliquote monouso a -80 ° C.
3. Determinazione dell'efficienza di taglio
- Aggiungere 50 μl di tampone di eluizione al 50 &181 L di ogni lisato tritato e incubare a 65 ° C per una notte, con agitazione.
- Aggiungere 100 μl di tampone TE e 4 μL di 10 mg / mL RNasi A (0,2 μg / μL di concentrazione finale). Mescolare e incubare per 2 ore a 37 ° C, con agitazione.
- Aggiungere 2 μL di 20 mg / mL proteinasi K (0,2 μg / μl di concentrazione finale) ad ogni campione e incubare per 2 ore a 55 ° C, agitando.
- Trasferire ogni campione in un tubo di gel idoneo all'estrazione di fenolo / cloroformio / isoamilico; Maneggiare secondo le istruzioni del produttore.
- Aggiungere 200 μl di fenolo / cloroformio / isoamilico alcool (25: 24: 1) e scuotere i tubi. Centrifugare per 5 min a 24 ° C e ~ 16.000 xg e trasferire la fase superiore a nuovi tubi.
Attenzione: Il fenolo, il cloroformio e l'isoamilico sono tossici se inalizzati e corrosivi; Lavorare sotto un cappuccio e utilizzare adeguate attrezzature di protezione individuale. Inoltre, trattare i residui di fenolo, cloroformio e isoamil acSecondo le regole dell'istituzione ospitante.- Ripetere una volta.
- Purificare il DNA utilizzando colonne di purificazione secondo l'istruzione del produttore, con le seguenti modifiche:
- Lavare due volte la membrana. Dopo l'ultimo lavaggio lasciare il tubo aperto per 2 minuti a temperatura ambiente per evaporare l'etanolo residuo.
- Per l'eluizione, aggiungere 50 μl di H 2 O, incubare a temperatura ambiente per 1 min, spin il tubo per 1 s per bagnare correttamente la membrana e incubare a temperatura ambiente per 1 min prima di eluire il DNA per centrifugazione per 1 min 24 ° C e ~ 17.900 x g.
- Quantificare il DNA purificato su un fluorometro utilizzando un kit di alta sensibilità secondo le istruzioni del produttore.
- Analizzare circa 500 ng del DNA purificato su un agarosio di 1,8% e circa 1 ng su un sistema di elettroforesi usando un kit di alta sensibilità.
NOTA: il siz attesoE dei frammenti di DNA è compresa tra 200 e 500 bp.
Giorni 3 e 4
4. Immunoprecipitazione
- Diluire 1 volume di lisato tagliato con 5 volumi di tampone di diluizione.
- Preclear con 30 μL / mL di agarosio A di proteina A (preparato in conformità all'Appendice A ) per 30 minuti mentre ruota nella stanza fredda.
- Centrifugare a 4 ° C per 5 minuti a ~ 750 x g.
- Raccogliere il 10% dell'input e conservarlo a 4 ° C.
- Aliquota la quantità desiderata di lisato nei nuovi tubi (per ulteriori dettagli vedere la Tabella 3 ). Aggiungere gli anticorpi desiderati a ciascun tubo (vedere la tabella 3 per i dettagli) e ruotare per una notte a 4 ° C.
- Aggiungere 40 μL di proteine A e incubare per 1 h a 4 ° C durante la rotazione.
- Lavare le perle con 1 ml di tampone di sale basso, tampone ad alto sale, LiCl buffer e tampone TE (per ogni lavaggio, incubare per 5 minuti a 4 ° C durante la rotazione e centrifugarePer 3 minuti a 4 ° C e ~ 950 xg). Vedere la Tabella 3 per i dettagli.
- Aggiungere 110 μl di tampone di eluizione e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente, vorticando ogni 2 min.
- Centrifugare per 3 min a 4 ° C e ~ 950 xg e trasferire 100 μL di supernatante in un nuovo tubo da 1,5 ml.
- Ripetere i passaggi 4.7-4.8 con 100 μl di tampone di eluizione e combinare gli eluati. Aggiungere un buffer di eluizione fino a 200 μL per immettere i campioni.
- Incubare tutti i campioni durante la notte a 65 ° C, con agitazione.
Giorno 5
5. Purificazione del DNA
- Aggiungere 200 μl di tampone TE ad ogni eluato e 8 μL di 10 mg / mL RNasi A (0,2 μg / μL di concentrazione finale). Mescolare e incubare per 2 ore a 37 ° C, con agitazione.
- Aggiungere 4 μl di 20 mg / mL proteinasi K (0,2 μg / μL di concentrazione finale) ad ogni eluato e incubare per 2 ore a 55 ° C, con agitazione.
- Trasferire ogni campione in un gelTubo adatto all'estrazione di fenolo / cloroformio / isoamilico; Maneggiare secondo le istruzioni del produttore.
- Aggiungere 400 μl di fenolo / cloroformio / isoamilico alcool (25: 24: 1) e scuotere i tubi. Centrifugare per 5 min a 24 ° C e ~ 16.000 x g. Trasferire la fase superiore ai nuovi tubi.
Attenzione: Il fenolo, il cloroformio e l'isoamilico sono tossici se inalizzati e corrosivi; Lavorare sotto un cappuccio e utilizzare adeguate attrezzature di protezione individuale. Inoltre, trattare i rifiuti di fenolo, cloroformio e alcol di isoamilico secondo le regole dell'istituto ospitante.- Ripetere una volta.
- Purificare il DNA utilizzando colonne di purificazione secondo le istruzioni del produttore, con le seguenti modifiche:
- Lavare due volte la membrana. Dopo l'ultimo lavaggio lasciare i tubi aperti per 2 minuti a temperatura ambiente per evaporare l'etanolo residuo.
- Per l'eluizione, aggiungere 50 μl di H 2 O, incubare a temperatura ambientePer 1 min, spin i tubi per 1 s per bagnare la membrana in modo adeguato e incubare a temperatura ambiente per 1 min prima di eluire il DNA mediante centrifugazione per 1 min a 24 ° C e ~ 17.900 x g.
Representative Results
Le cellule T murine mature sono state sottoposte ad analisi ChIP per indagare l'arricchimento della mono-metilazione della lisin 4 sulla istone 3 (H3K4me1), tri-metilazione della lisina 4 sull'istone 3 (H3K4me3) e l'acetilazione della lisina 27 Istone 3 (H3K27ac), così come l'occupazione nucleosomica, come rivelato da panH3 ChIP. La qualità di taglio è stata valutata mediante analisi su un agarosio di 1,8% ( Figura 2A ) e su un sistema di elettroforesi ( Figura 2B ). H3K4me1 e H3K4me3 sono generalmente utilizzati per identificare rispettivamente siti e promotori di miglioramento ( Figura 3A ). Infatti, H3K4me3 è prominente ma non solo arricchito nei promotori 5 , 8 , 14 . Una caratteristica di valorizzatori attivi deve essere altamente arricchita per H3K4me1 e H3K27ac e poco arricchita per H3K4me3 (<(Figura 3A, pannello superiore), mentre gli incrementi inattivi presentano bassi livelli di H3K4me3 e H3K27ac, ma livelli elevati di H3K4me1 ( Figura 3A , pannello inferiore). Come mostrato nella figura 3B , il gene Glyceraldehyde 3-fosfato deidrogenasi ( Gapdh ) è rappresentativo dell'analisi di promotori di gene attivi ( promotore di Gapdh ). Infatti, mostra livelli elevati di H3K4me3 e H3K27ac e bassi livelli di H3K4me1. Nella figura 3B , Deltex1 ( Dtx1 ) è rappresentativo di valorizzatori inattivi ( Dtx1 enhancer ), in quanto è altamente arricchito per H3K4me1 e poco arricchito per H3K4me3 e H3K27ac. Il deserto di Gene è rappresentativo di una regione priva di geni di codifica e di solito è stata citata come un controllo negativo per i segni attivi di cromatina. L'osservazione che H3K4me1, un marchio di miglioramento ben accolto 4 , 5 , 7 , 14 , 18 , non è arricchito nel deserto del Gene suggerisce che questa regione manca di potenziatori.
Figura 1: Panoramica schematica del protocollo ChIP presentato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Controllo della qualità di taglio della linea di cellule T cellule mature. ( A ) Sono state tagliate due aliquote diverse della linea di cellule T-cellule T210HA del mouse, e circa 500 ng di DNA purificato sono state analizzate su un agarosio di 1,8% per valutare il loro taglioQualità. ( B ) 1 ng di DNA purificato del campione 2 è stato analizzato mediante elettroforesi per valutare la sua qualità di taglio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: segni di cromatina che caratterizzano promotori e promotori. ( A ) I potenziatori attivi (pannello superiore) sono caratterizzati da un elevato livello H3K4me1, basso H3K4me3 e alto H3K27ac, mentre i rialzatori inattivi (pannello inferiore) presentano elevati livelli H3K4me1, basso H3K4me3 e basso H3K27ac. ( B ) I campioni presentati nella Figura 2A sono stati raggruppati e utilizzati per l'analisi di ChIP contro i contrassegni istoni H3K4me1, H3K4me3 e H3K27ac e l'occupazione dell'istone, come rivelato da panH3 ChIP. Questa analisi mostra che thE promotore del gene di mantenimento Glyceraldehyde 3-fosfato deidrogenasi ( promoter Gapdh ) è altamente arricchito per H3K4me3 e H3K27ac e abbastanza arricchito per H3K4me1. D'altra parte, l'enhancer del gene inattivo Deltex1 ( Dtx1 enhancer ) è altamente arricchito per H3K4me1 ma poco arricchito per H3K4me3 e H3K27ac. ChIP utilizzando un anticorpo panH3 è stato utilizzato per indagare l'occupazione dei nucleosomi. Il deserto del gene è stato usato come un controllo negativo. Viene mostrato un esperimento rappresentativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Nome del buffer | Reagente | Concentrazione finale |
| Tampone di diluizione | Sodio dodecIl solfato (SDS) | 0,01% (w / v) |
| Triton X-100 | 1,1% (v / v) | |
| Acido etilendiamintetraoacetico (EDTA) pH 8,0 | 1,2 mM | |
| Tris-HCl pH 8.1 | 16,7 mM | |
| Cloruro di sodio (NaCl) | 167 mM | |
| Soluzione DMA | Dimetil adipimidato (DMA) | 10 mM |
| Salina di tampone fosfato (PBS) | 1x | |
| Tampone di eluizione | Sodio dodecilsolfato (SDS) | 1% (w / v) |
| Acido etilendiamintetraoacetico (EDTA) pH 8,0 | 10 mM | |
| Tris-HCl pH 8,0 | 50 mM | |
| Alta tampone di sale | Sodio dodecilsolfato (SDS) | 0,1% (w / v) |
| Triton X-100 | 1% (v / v) | |
| EthylenediamiAcido nitrutametico (EDTA) pH 8,0 | 2 mM | |
| Tris-HCl pH 8.1 | 20 mM | |
| Cloruro di sodio (NaCl) | 500 mM | |
| IMDM medium | Il mezzo di Dulbecco modificato da Iscove (IMDM) | 1x |
| Siero del bovino fetale (FBS) | 2% (v / v) | |
| Penicillina / streptomicina | 1x | |
| Peptone primatone | 0,3 mg / ml | |
| Soluzione insulinica umana | 4,8 mg / ml | |
| Minimo amminoacidi essenziali non essenziali (MEM NEAA) | 1x | |
| Tampone di sale di LiCl | Cloruro di litio (LiCl) | 0,25 M |
| IGEPAL-CA630 | 1% (v / v) | |
| Acido etilendiamintetraoacetico (EDTA) pH 8,0 | 1 mM | |
| Tris-HCl pH 8.1 | 10 mM | |
| Basso buffer di sale | Sodio dodecilsolfato (SDS) | 0,1% (w / v) |
| Triton X-100 | 1% (v / v) | |
| Acido etilendiamintetraoacetico (EDTA) pH 8,0 | 2 mM | |
| Tris-HCl pH 8.1 | 20 mM | |
| Cloruro di sodio (NaCl) | 150 mM | |
| Tampone di lavaggio dei branchi di proteine A Sepharose | Tris-HCl pH 8,0 | 20 mM |
| Cloruro di sodio (NaCl) | 500 mM | |
| Acido etilendiamintetraoacetico (EDTA) pH 8,0 | 2 mM | |
| Sodio dodecilsolfato (SDS) | 0,1% (w / v) | |
| IGEPAL-CA630 | 1% (v / v) | |
| Buffer SDS Lysis | Sodio dodecilsolfato (SDS) | 1% (w / v) |
| EthylenediAcido aminetraacetico (EDTA) pH 8,0 | 10 mM | |
| Tris-HCl pH 8.1 | 50 mM | |
| TE buffer | Tris-HCl pH 8,0 | 10 mM |
| Acido etilendiamintetraoacetico (EDTA) pH 8,0 | 1 mM |
Tabella 1: Elenco dei buffer e del mezzo utilizzato in questo protocollo.
| SOPRA | OFF | |
| Picco di potenza | 150.0 | 2.5 |
| Fattore di dovere | 15.0 | 15.0 |
| Cicli / scoppio | 500 | 500 |
| Numero di cicli | 28 | |
Tabella 2: Shearing delle impostazioni utilizzate in questo protocollo . Queste condizioni sono state ottimizzate per una linea cellulare T-cellule matura.
| Anticorpo | Fornitore | Quantità di anticorpo / immunoprecipitazione | Quantità di cellule / immunoprecipitazione | Condizioni di lavaggio |
| H3 | Abcam (ab1791) | 2,5 mg | 5 x 10 6 | Una volta in tampone di sale basso, due volte nel tampone di sale alto, due volte in tampone di sale LiCl e tre volte in tampone TE |
| H3K4me1 | Abcam (ab8895) | 2,5 mg | 5 x 10 6 | Una volta in tampone di sale basso, due volte nel tampone di sale alto, due volte in tampone di sale LiCl e tre volte in tampone TE |
| H3K4me3 | Diagenode (pAb-003-050) | 2,5 mg | 5 x 10 6 | Una volta in tampone di sale basso, due volte nel tampone di sale alto, due volte in tampone di sale LiCl e tre volte in tampone TE |
| H3K27ac | Diagenode (pAb-174-050) | 2,5 mg | 5 x 10 6 | Oce in tampone di sale basso, due volte nel tampone di sale alto, due volte in tampone di sale LiCl e tre volte in tampone TE |
| IgG | Diagenode (C15410206) | Variabile* | Variabile* | Variabile* |
| * Nel caso del controllo IgG, la quantità di anticorpi e cellule, nonché i passi di lavaggio, devono rispecchiare le condizioni delle altre immunoprecipitazioni. | ||||
Tabella 3: Anticorpi e condizioni di lavaggio utilizzate in questo studio.
| Gene | Primer avanti | Primer inverso | sonda |
| Promotore di Gapdh (0 kb) | 5'-GGG TTC CTA TAA ATA CGG ATTO GC-3 ' | 5'-CTG GCA CTG CAC AAG AAG A-3 ' | 68 |
| Enhancer Dtx1 (+26 kb) | 5'-CTC TGG GTT GTA GGG GAC AG-3 ' | 5'-GCA TGG GAA CTG TGT TAC AGA A-3 ' | 27 |
| Deserto del gene | 5'-CAA TGC ATG GGT CCA GAT TT-3 ' | 5'-ATT GGC ACG GAA GTA GTG CT-3 ' | 94 |
Tabella 4: Primer e sonde utilizzate per qPCR in questo studio.
| Problema | Le cause | Soluzione |
| La cromatina è sotto tosatura e i frammenti sono troppo grandi. | Sono state utilizzate troppe cellule. | Ridurre il numero di celle. |
| Il taglio è troppo basso. | Aumenta il numero di cicli di taglio. | |
| Aumenta la potenza di picco di taglio, il fattore di carico e / oi cicli / burst. | ||
| La cromatina è troppo tesa e i frammenti sono troppo piccoli. | Sono state utilizzate troppo poche cellule. | Aumenta il numero di celle. |
| La cesoia è troppo alta. | Ridurre il numero di cicli di taglio. | |
| Ridurre la potenza di picco di taglio, il fattore di carico e / oi cicli / burst. | ||
| Troppo basso di recupero rispetto a meControllo gG e / o controllo negativo (alto sfondo). | Non è sufficiente cromatina utilizzata per l'esperimento. | Aumenta la quantità di cromatina. |
| Il numero di anticorpi è troppo basso. | Aumenta la quantità di anticorpo. | |
| Il numero di anticorpi è troppo elevato. | Ridurre la quantità di anticorpi. | |
| L'anticorpo ha bassa specificità. | Cambiare l'anticorpo. | |
| Le condizioni di lavaggio sono troppo severe. | Ridurre il numero di lavaggi. | |
| Ridurre la rigidità dei tamponi di lavaggio. | ||
| Le condizioni di lavaggio non sono abbastanza rigorose. | Aumenta il numero di lavaggi. | |
| Aumenta la rigidità dei tamponi di lavaggio. | ||
| Troppo DNA è stato pipettato nel qPCR. | Ridurre la quantità di DNA pipettata nel qPCR. | |
| Le condizioni qPCR non sono ottimali. | Ottimizzare le condizioni qPCR. | |
| Ridurre il numero di cicli. | ||
| Nessun prodotto o prodotto è troppo basso nella reazione qPCR del campione di input. | Non è stato sufficiente un DNA pipettato nel qPCR. | Aumenta la quantità di DNA pipettata nel qPCR. |
| Le condizioni qPCR non sono ottimali. | Ottimizzare le condizioni qPCR. | |
| Aumenta il numero di cicli. | ||
| Non è sufficiente cromatina utilizzata per l'esperimento. | Aumenta la quantità di cromatina. | |
| Nessun segnale nel controllo positivo e / o PanH3 ChIP. | Non è sufficiente cromatina utilizzata per l'esperimento. | Aumenta la quantità di cromatina. |
| Il numero di anticorpi è troppo basso. | Aumenta la quantità di anticorpo. | |
| L'antiIl corpo ha una bassa specificità. | Cambiare l'anticorpo. | |
| L'eluizione è sub-ottimale. | Assicurarsi di vorticarsi frequentemente i campioni per mantenere le perle in soluzione. |
Tabella 5: Risoluzione dei problemi.
Discussion
ChIP è una tecnica valida per indagare se le proteine oi loro PTM sono arricchite in regioni genomiche specifiche. I risultati del test di ChIP sono spesso impegnativi per interpretare a causa di motivi biologici o tecnici. Le ragioni biologiche sono molteplici e includono il legame debole o indiretto delle proteine al DNA. Ci sono anche limitazioni tecniche, come la limitata specificità degli anticorpi e la lisi cellulare inefficace o la cricatura di cromatina. Una guida alla risoluzione dei problemi ( Tabella 5 ) può aiutare il lettore a risolvere i problemi che potrebbero verificarsi con i test ChIP.
Questo protocollo, facendo uso di un dispositivo ultrasonator focalizzato sul raffreddamento, consente di tagliare in modo efficiente la cromatina di una linea cellulare T cellula matura. La fase principale critica del protocollo è rappresentata dalla tranciatura della cromatina, che deve sempre essere ottimizzata per ciascun tipo di cellula. Si suggerisce di variare il numero di celle e il numero di cicli di sonicazione. Inoltre, lei L'efficienza dell'azione è influenzata negativamente dalla presenza di precipitazioni di SDS nei campioni che possono formarsi durante la lisi delle cellule sul ghiaccio con buffer di lisi SDS. In questo caso, è meglio incubare il campione dopo la lisi a temperatura ambiente per alcuni minuti per ridurre la presenza di precipitazioni SDS. Si raccomanda di ottimizzare il protocollo per ottenere frammenti tagliati tra 200 e 500 bp e valutare sempre la qualità di taglio dei campioni prima di procedere con l'immunoprecipitazione. Inoltre, il tempo di fissazione, la quantità di anticorpo e / o le cellule e le condizioni di lavaggio devono essere ottimizzate per ciascun anticorpo.
Un ulteriore passo avanti nella realizzazione di una procedura ChIP è la scelta dell'anticorpo, poiché gli anticorpi a bassa specificità riducono in modo significativo l'efficacia dell'immunoprecipitazione. In precedenza, una procedura di test di qualità unificata ha permesso di valutare la specificità di diversi anticorpi disponibili sul mercato Ss = "xref"> 19. La pipeline di screening è stata basata su macchia dot blot, Western blot e ChIP, fornendo un elenco di reagenti di alta qualità adatti per ChIP 19 . Più recentemente, la specificità di alcuni anticorpi disponibili in commercio è stata valutata usando piattaforme microarray a peptide ad alta densità di istone, consentendo la creazione di un database sulla specificità degli anticorpi 20 . Il lettore può utilizzare questo strumento utile per identificare gli anticorpi più specifici che possono essere utilizzati per gli esperimenti ChIP.
Questo protocollo non è stato testato per le cellule T primarie e, in questo caso, il lettore dovrebbe fare riferimento a altri protocolli pubblicati che eseguono con successo ChIP sulle cellule T primarie 3 , 4 , 21 . In particolare, questo protocollo è stato utilizzato con successo per eseguire ChIP su una linea di cellule T progenitor del mouse, così come su una linea cellulare endoteliale.
Ove_content "> 5 x 10 6 cellule dovrebbero essere utilizzate per ogni immunoprecipitazione per l'analisi dei segni di istone.Perché questo protocollo può anche essere adatto, con qualche ottimizzazione, per eseguire ChIP su TF o cofattori, è meglio aumentare il numero di cellule Utilizzata per l'immunoprecipitazione in questi casi.Per arrivare al numero di cellule richiesto per ogni esperimento, più aliquote di lutea tagliata possono essere raggruppate insieme prima di diluire la cromatina nel tampone di diluizione.Questo protocollo potrebbe anche essere modificato per eseguire ChIP sulle proteine endogene che non si legano direttamente al DNA. In questo caso, è possibile richiedere la pre-fissazione con crosslinkers proteico-proteico ( ad esempio, dimetiladipimidato, DMA) (vedere l'Appendice B per ulteriori informazioni). La buona prestazione di ChIP sui cofattori è stata precedentemente effettuata mediante sovraespressione di proteine che sono fuse con un tag biotinico. In questo caso, la proteina è stata purificata con streptavidin-conjugaPerline magnetiche, e una pre-fissazione con DMA è stata eseguita 22 .
Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Siamo grati a P. Käse e T. Schmidt-Wöll per un'ottima assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dalla borsa di studio collaborativa TRR81 e dal programma Heisenberg (BO 1639 / 5-1) della DFG (la Fondazione di ricerca tedesca), della Max Planck Society e della EXC 294 di Friburgo e del Cluster di eccellenza per il sistema cardio-polmonare (ECCPS) a Giessen alla TB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent High Sensitivity D5000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5593 | |
| Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5592 | |
| Agilent Tapestation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | |
| Covaris S220 AFA System | Covaris | 500217 | |
| dimethyl adipimidate (DMA) | Thermo Fisher Scientific | 20660 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Pan-Biotech | 1502-P121301 | |
| Formaldehyde (FMA) | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21980-032 | |
| Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| nProtein A Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5280-02 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) |
Gibco | 15140-122 | |
| Peptone primatone | Sigma-Aldrich | P4963-100G | |
| Phase Lock Gel Heavy 2 mL | 5 Prime | 2302830 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Roth | A156.2 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO | 14190-094 | |
| Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| Tube AFA Fiber & Cap | Covaris | 520081 |
References
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