Summary
Dette arbeidet beskriver en protokoll for kromatinimmunutfelling (ChIP) ved hjelp av en moden mus-T-cellelinje. Denne protokollen er egnet til å undersøke fordelingen av spesifikke histonmerker på spesifikke promotorsteder eller genom-bred.
Abstract
Signalveier regulerer genuttrykksprogrammer ved modulering av kromatinstrukturen på forskjellige nivåer, for eksempel ved post-translasjonelle modifikasjoner (PTM) av histontoner, utveksling av kanoniske histoner med histon-varianter og nukleosomuttakelse. Slike reguleringer krever binding av signal-sensitive transkripsjonsfaktorer (TFs) som rekrutterer kromatinmodifiserende enzymer ved regulatoriske elementer definert som forsterkere. Forstå hvordan signaleringskaskader regulerer forsterkeraktivitet, krever en omfattende analyse av bindingen av TFs, kromatinmodifiserende enzymer og belegget til spesifikke histonmerker og histon-varianter. Kromatinimmunpresipitasjon (ChIP) -analyser benytter svært spesifikke antistoffer for immunpresipitering av spesifikke protein / DNA-komplekser. Den påfølgende analyse av det rensede DNA muliggjør identifikasjon av regionen som okkuperes av proteinet som er anerkjent av antistoffet. Dette arbeidet beskriver en protokoll for å effektivt peRform ChIP av histonproteiner i en moden mus-T-cellelinje. Den presenterte protokollen tillater utførelse av ChIP-analyser i en rimelig tidsramme og med høy reproduserbarhet.
Introduction
Utvikling, differensiering og homeostase avhenger av spesifikke genuttrykksprogrammer som er etablert ved å signalere hendelser som modulerer kromatinstrukturen og derfor bestemme om et bestemt gen aktiveres eller undertrykkes på en celle- og tids-spesifikk måte. Under T-celleutvikling må spesifikke genuttrykksprogrammer etableres for å bestemme modningen av T-celleprekursorer fra den dobbelte negative (DN) til den enkelt-positive (SP) tilstanden, og passere gjennom flere mellomliggende stadier 1 . Hvordan genuttrykksprogrammet er dynamisk regulert under T-celleutvikling, har blitt utbredt i tidligere år av flere laboratorier 2 , 3 , 4 , 5 , 6 .
Ved post-translationelle modifikasjoner (PTM) av histoner, utveksling avKanoniske histoner med histon-varianter, nukleosomutkastning og DNA-metylering regulerer PÅ / AV-bryteren av gener. Flere grupper har undersøkt genomspredning av PTM og histonvarianter for å bestemme merker som er forbundet med forskjellige kromatintilstander i både proksimale og distale regulatoriske regioner 7 , 8 , 9 , 10 . Signalkaskader orkestrerer dynamisk kromatinregulering via utveksling av positive og negative kromatinmodifiserende enzymer (også kjent som kromatinmodifikatorer) ved spesifikke forsterkningselementer. Disse kromatinmodifiseringsorganene regulerer kromatinstrukturen og dermed transkripsjonsutgangen ved for eksempel dynamisk histon-metylering og acetylering. Dette er tilfellet i Notch-signalveien 11 , 12 , 13 ,14.
Dynamiske histon PTM; Utveksling med histon-varianter; Og den dynamiske belegget til histoner, transkripsjonsfaktorer og kofaktorer kan undersøkes ved kromatinimmunutfelling (ChIP) -analyser. Helt spesifikke antistoffer brukes til å rense spesifikke DNA-proteinkomplekser, og det rensede DNA analyseres ved kvantitativ PCR (qPCR); Dyp-sekvensering (ChIP-Seq); Eller, mindre ofte i dag, hybridisering til microarray (ChIP-ChIP).
ChIP-analyser er noen ganger utfordrende på grunn av komplikasjoner med cellens lysis, skjæring av kromatinet og / eller lav spesifisitet av antistoffene. Flere strategier har blitt vedtatt for å forbedre protokollen, slik det er tilfelle for NEXSON 15 . Bruk av kjølevann-bad-sonikatorer unngår prøveoppvarming som kan skade epitoperne som er tilstede på proteinet som er undersøkt, men energien som kreves for skjæringen av prøvene blir dispergert i vannet.En annen forbedring ble gjort med utviklingen av fokuserte ultralydapparater som forhindrer spredning av energien. Derfor tillater fokuserte ultralydningsinnretninger forbedringer i cellelyse og kromatinskjæring, eliminerer operatørinducerte variasjoner og øker reproduserbarheten betydelig.
Dette arbeidet beskriver en protokoll (skjematisk oversikt i figur 1 ) for effektivt å utføre ChIP av histonproteiner i en moden mus T-cellelinje kalt E2-10HA 16 , 17 . T-celler er vanligvis vanskelige å lyse, og skjæringen av deres kromatin har blitt påvist å være ineffektiv. I denne protokollen, som bruker en kjølefokusert ultralydapparat, ble antall celler, lysisbufferen og skjæringsinnstillingen optimalisert for E2-10HA-musen T-cellelinjen. Denne protokollen tillater en å utføre ChIP med høy reproduserbarhet og i rimelig tid. Faktisk krever detEr omtrent to dager for å skjære kromatinet og å evaluere kvaliteten på skjæringen og tre dager for å utføre immunutfellingen, reversere tverrbindingen og rense DNA'et.
Protocol
MERK: Alle buffere og mediet som brukes i denne protokollen er oppført i tabell 1 .
Dag 1 og 2
1. Tverrbinding av cellene
- Overfør mus T-cellene fra en 6-brønn plate til et 50 ml rør og sentrifuger i 5 minutter ved 4 ° C og ~ 271 x g. Resuspender cellepelletet i 30 ml IMDM-celledyrkningsmedium og teller cellene ved å bruke et Neubauer-kammer.
- Samle alikvoter på 20 x 106 celler i nye 50 ml rør.
- Tilsett formaldehyd (FMA) til en 1% sluttkonsentrasjon direkte til cellekulturmediet og inkuber ved romtemperatur i 10 minutter.
Forsiktig: FMA er giftig ved innånding, så arbeid under avtrekksdeksel og bruk godt verneutstyr. Også, vær så snill å håndtere FMA-avfall i henhold til vertsinstitusjonens regler. - Tilsett 1/8-volum 1 M glycin, pH 7,0, og inkuber ved romtemperatur i 5 minutter.
- Pellet cellene ved sentrifugering for 5Min ved 4 ° C og ~ 271 xg og vaskes med 10 ml fosfatbuffert saltvann (PBS).
- Vask cellepellet med 1 ml PBS og overfør til 1,5 ml rør.
2. Cell Lysis og Chromatin Shearing
- Resuspender cellepelleten i 1 ml SDS lysisbuffer og inkuber på is i 10 minutter.
- Overfør hver prøve til et sonikeringsrør og utfør skjæring ved hjelp av en fokusert ultralydapparat i henhold til innstillingene angitt i tabell 2.
- Etter skjæring overfør prøvene til 1,5 ml rør og sentrifuger i 10 minutter ved 4 ° C og ~ 18 000 x g.
- Overfør supernatanten til nye rør.
- Samle 50 μl for å bestemme skjæringseffektiviteten i henhold til trinn 3 og snapfryse det skjærte lysatet i flytende nitrogen. Oppbevar lysatet i engangs-alikvoter ved -80 ° C.
3. Bestemmelse av skjæreffektivitet
- Tilsett 50 μl elueringsbuffer til 50 & #181; L av hvert skjæret lysat og inkuber ved 65 ° C over natten, med risting.
- Tilsett 100 μl TE buffer og 4 μl 10 mg / ml RNase A (0,2 μg / μl sluttkonsentrasjon). Bland og inkuber i 2 timer ved 37 ° C, med risting.
- Tilsett 2 μL 20 mg / ml proteinase K (0,2 μg / μl sluttkonsentrasjon) til hver prøve og inkuber i 2 timer ved 55 ° C med risting.
- Overfør hver prøve til et gelrør egnet for fenol / kloroform / isoamylalkoholutvinning; Håndtere i henhold til produsentens anvisninger.
- Tilsett 200 μl fenol / kloroform / isoamylalkohol (25: 24: 1) og rist rørene. Sentrifuger i 5 minutter ved 24 ° C og ~ 16.000 xg og overfør overfasen til nye rør.
Forsiktig: Fenol, kloroform og isoamylalkohol er giftig ved innånding og er etsende; Arbeid under en avtrekksdeksel og bruk godt personlig verneutstyr. Også håndtere fenol, kloroform og isoamylalkoholavfall acI henhold til reglene i vertsinstitusjonen.- Gjenta en gang.
- Rens DNA'et ved å bruke rensekolonner i henhold til produsentens instruksjon, med følgende modifikasjoner:
- Vask membranen to ganger. Etter siste vask, la røret stå åpen i 2 minutter ved romtemperatur for å fordampe restetanol.
- Til elueringen tilsettes 50 μl H20, inkuberes ved romtemperatur i 1 minutt, roterer røret i 1 s for å vaske membranen riktig og inkuberes ved romtemperatur i 1 minutt før eluering av DNA ved sentrifugering i 1 min ved 24 ° C og ~ 17,900 x g.
- Kvantifiser det rensede DNA på et fluorometer ved hjelp av et høysensitiv kit i henhold til produsentens instruksjoner.
- Analyser ca. 500 ng av det rensede DNA på en 1,8% agarosegel og ca. 1 ng på et elektroforesystem ved bruk av et høysensitivsett.
MERK: Den forventede sizE av DNA-fragmentene er mellom 200 og 500 bp.
Dag 3 og 4
4. Immunutfelling
- Fortynn 1 volum skåret lysat med 5 volumener fortynningsbuffer.
- Preclear med 30 μL / ml protein En agarosekuler (fremstilt i henhold til Vedlegg A ) i 30 minutter mens du roterer i det kalde rommet.
- Sentrifuger ved 4 ° C i 5 minutter ved ~ 750 x g.
- Samle 10% av inngangen og lagre den ved 4 ° C.
- Aliquot ønsket mengde lysat i nye rør (se tabell 3 for detaljer). Tilsett de ønskede antistoffene for hvert rør (se tabell 3 for detaljer) og roter over natten ved 4 ° C.
- Tilsett 40 μl protein En perler og inkuber i 1 time ved 4 ° C mens du roterer.
- Vask perlene med 1 ml lavsaltbuffer, høysaltbuffer, LiCl-buffer og TE-buffer (for hver vask, inkuber i 5 minutter ved 4 ° C mens du roterer og sentrifugerI 3 minutter ved 4 ° C og ~ 950 xg). Se tabell 3 for detaljer.
- Tilsett 110 μl elueringsbuffer og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur, vortex hver 2. minutt.
- Sentrifuger i 3 minutter ved 4 ° C og ~ 950 xg og overfør 100 μL supernatant til et nytt 1,5 ml rør.
- Gjenta trinn 4.7-4.8 med 100 μl elueringsbuffer og kombinere eluatene. Legg elueringsbuffer opp til 200 μL for å legge inn prøvene.
- Inkuber alle prøver over natten ved 65 ° C, med risting.
Dag 5
5. DNA-rensing
- Tilsett 200 μl TE buffer til hvert eluat og 8 μl 10 mg / ml RNase A (0,2 μg / μl sluttkonsentrasjon). Bland og inkuber i 2 timer ved 37 ° C, med risting.
- Tilsett 4 μl 20 mg / ml proteinase K (0,2 μg / μl sluttkonsentrasjon) til hvert eluat og inkuber i 2 timer ved 55 ° C med risting.
- Overfør hver prøve på en gelRør egnet for fenol / kloroform / isoamylalkoholutvinning; Håndtere i henhold til produsentens anvisninger.
- Tilsett 400 μl fenol / kloroform / isoamylalkohol (25: 24: 1) og rist rørene. Sentrifuger i 5 minutter ved 24 ° C og ~ 16.000 x g. Overfør overfasen til nye rør.
Forsiktig: Fenol, kloroform og isoamylalkohol er giftig ved innånding og er etsende; Arbeid under en avtrekksdeksel og bruk godt personlig verneutstyr. Også håndtere fenol, kloroform og isoamylalkoholavfall i henhold til vertsinstitusjonens regler.- Gjenta en gang.
- Rens DNAet ved hjelp av rensekolonner i henhold til produsentens instruksjoner, med følgende modifikasjoner:
- Vask membranen to ganger. Etter siste vask, la rørene åpne i 2 minutter ved romtemperatur for å fordampe resterende etanol.
- Til elueringen tilsettes 50 μl H20, inkuberes ved romtemperaturRe i 1 min, roter rørene i 1 s for å vaske membranen riktig og inkuber ved romtemperatur i 1 min før eluering av DNA ved sentrifugering i 1 min ved 24 ° C og ~ 17 900 x g.
Representative Results
Eldre murine T-celler ble utsatt for ChIP-analyse for å undersøke anrikningen av histonmark-mono-metyleringen av lysin 4 på histone 3 (H3K4me1), trimetylering av lysin 4 på histon 3 (H3K4me3) og acetylering av lysin 27 på Histone 3 (H3K27ac), samt nukleosombelegget, som avslørt av panH3 ChIP. Skjærekvaliteten ble evaluert ved analyse på en 1,8% agarosegel ( figur 2A ) og på et elektroforese system ( figur 2B ). H3K4me1 og H3K4me3 brukes generelt til å identifisere enhancer-sider og promotorer, henholdsvis ( figur 3A ). Faktisk er H3K4me3 fremtredende, men ikke utelukkende anriket ved promotorer 5 , 8 , 14 . Et kjennetegn ved aktive forsterkere er å være svært beriket for H3K4me1 og H3K27ac og dårlig beriket for H3K4me3 (<Sterk klasse = "xfig"> Figur 3A, øvre panel), mens inaktive forsterkere presenterer lave nivåer av H3K4me3 og H3K27ac, men høye nivåer av H3K4me1 ( Figur 3A , nedre panel). Som vist i figur 3B er Glyceraldehyd 3-fosfat dehydrogenase-genet ( Gapdh ) -genet representative for analysen av aktive genpromotorer ( Gapdh-promotor ). Faktisk viser det høye nivåer av H3K4me3 og H3K27ac og lave nivåer av H3K4me1. I figur 3B er Deltex1 ( Dtx1 ) representativ for inaktive forsterkere ( Dtx1 forsterker ), da den er høyt anriket for H3K4me1 og dårlig beriget for H3K4me3 og H3K27ac. Gene-ørken er representativ for en region som mangler kodende gener, og saksøges vanligvis som en negativ kontroll for aktive kromatinmerker. Observasjonen at H3K4me1, en godt akseptert forsterker markerer 4 , 5 , 7 , 14 , 18 , er ikke beriket hos Gene desert antyder at denne regionen mangler forsterkere.
Figur 1: Skjematisk oversikt over ChIP-protokollen presentert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjærekvalitetskontroll av den modne mus T-cellelinjen. ( A ) To forskjellige alikvoter av modent mus-T-cellelinje E2-10HA ble skåret, og ca. 500 ng renset DNA ble analysert på en 1,8% agarosegel for å evaluere deres skjærIng kvalitet. ( B ) 1 ng renset DNA fra prøve 2 ble analysert ved elektroforese for å evaluere dens skjærekvalitet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kromatinmerker som karakteriserer forsterkere og promotorer. ( A ) Aktive forsterkere (øverste panel) er preget av høy H3K4me1, lav H3K4me3 og høy H3K27ac, mens inaktive forsterkere (nedre panel) er høye H3K4me1, lave H3K4me3 og lave H3K27ac. ( B ) Prøven presentert i figur 2A ble samlet sammen og anvendt for ChIP-analyse versus histonmerker H3K4me1, H3K4me3 og H3K27ac og histonbelegg, som avslørt av panH3 ChIP. Denne analysen viser at thE promotor av housekeeping genet Glyceraldehyd 3-fosfat dehydrogenase ( Gapdh promoter ) er sterkt beriket for H3K4me3 og H3K27ac og lite beriket for H3K4me1. På den annen side er forsterkeren av det inaktive genet Deltex1 ( Dtx1 forsterker ) sterkt beriget for H3K4me1, men dårlig beriget for H3K4me3 og H3K27ac. ChIP ved bruk av et panH3 antistoff ble brukt til å undersøke nukleosombelegget. Gene ørken ble brukt som en negativ kontroll. Et representativt eksperiment vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Navn på bufferen | reagens | Endelig konsentrasjon |
| Fortynningsbuffer | Natrium dodecYlsulfat (SDS) | 0,01% (vekt / volum) |
| Triton X-100 | 1,1% (volum / volum) | |
| Etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) pH 8,0 | 1,2 mM | |
| Tris-HCl pH 8,1 | 16,7 mM | |
| Natriumklorid (NaCl) | 167 mM | |
| DMA løsning | Dimetyladipimidat (DMA) | 10 mM |
| Fosfatbuffert saltvann (PBS) | 1x | |
| Elueringsbuffer | Natriumdodecylsulfat (SDS) | 1% (vekt / volum) |
| Etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) pH 8,0 | 10 mM | |
| Tris-HCl pH 8,0 | 50 mM | |
| Høy saltbuffer | Natriumdodecylsulfat (SDS) | 0,1% (vekt / volum) |
| Triton X-100 | 1% (volum / volum) | |
| EthylenediamiNetto-eddiksyre (EDTA) pH 8,0 | 2 mM | |
| Tris-HCl pH 8,1 | 20 mM | |
| Natriumklorid (NaCl) | 500 mM | |
| IMDM medium | Iscove er modifisert Dulbeccos medium (IMDM) | 1x |
| Fetal bovint serum (FBS) | 2% (volum / volum) | |
| Penicillin / streptomycin | 1x | |
| Pepton primatone | 0,3 mg / ml | |
| Insulinløsning menneske | 4,8 mg / ml | |
| Minimum essensielle, ikke-essensielle aminosyrer (MEM NEAA) | 1x | |
| LiCl salt buffer | Litiumklorid (LiCl) | 0,25 M |
| IGEPAL-CA630 | 1% (volum / volum) | |
| Etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) pH 8,0 | 1 mM | |
| Tris-HCl pH 8.1 | 10 mM | |
| Lav saltbuffer | Natriumdodecylsulfat (SDS) | 0,1% (vekt / volum) |
| Triton X-100 | 1% (volum / volum) | |
| Etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) pH 8,0 | 2 mM | |
| Tris-HCl pH 8,1 | 20 mM | |
| Natriumklorid (NaCl) | 150 mM | |
| Protein A Sepharose perler vaskebuffer | Tris-HCl pH 8,0 | 20 mM |
| Natriumklorid (NaCl) | 500 mM | |
| Etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) pH 8,0 | 2 mM | |
| Natriumdodecylsulfat (SDS) | 0,1% (vekt / volum) | |
| IGEPAL-CA630 | 1% (volum / volum) | |
| SDS Lysis buffer | Natriumdodecylsulfat (SDS) | 1% (vekt / volum) |
| -etylendiAminetetraeddiksyre (EDTA) pH 8,0 | 10 mM | |
| Tris-HCl pH 8,1 | 50 mM | |
| TE buffer | Tris-HCl pH 8,0 | 10 mM |
| Etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) pH 8,0 | 1 mM |
Tabell 1: Liste over buffere og medium som brukes i denne protokollen.
| PÅ | AV | |
| Toppkraft | 150,0 | 2.5 |
| Tollfaktor | 15,0 | 15,0 |
| Cycles / burst | 500 | 500 |
| Antall sykluser | 28 | |
Tabell 2: Skjæreinnstillinger som brukes i denne protokollen. Disse forholdene er optimalisert for en moden T-cellelinje fra mus.
| antistoff | Leverandør | Mengde antistoff / immunutfelling | Mengde celler / immunutfelling | Vaskeforhold |
| H3 | Abcam (ab1791) | 2,5 mg | 5 x 10 6 | En gang i lav saltbuffer, to ganger i høy saltbuffer, to ganger i LiCl-saltbuffer og tre ganger i TE-buffer |
| H3K4me1 | Abcam (ab8895) | 2,5 mg | 5 x 10 6 | En gang i lav saltbuffer, to ganger i høy saltbuffer, to ganger i LiCl-saltbuffer og tre ganger i TE-buffer |
| H3K4me3 | Diagenode (pAb-003-050) | 2,5 mg | 5 x 10 6 | En gang i lav saltbuffer, to ganger i høy saltbuffer, to ganger i LiCl-saltbuffer og tre ganger i TE-buffer |
| H3K27ac | Diagenode (pAb-174-050) | 2,5 mg | 5 x 10 6 | Oc i lav saltbuffer, to ganger i høy saltbuffer, to ganger i LiCl-saltbuffer og tre ganger i TE-buffer |
| IgG | Diagenode (C15410206) | variabel * | variabel * | variabel * |
| * I tilfelle av IgG-kontrollen må mengden av både antistoff og celler, så vel som vaskningstrinnene, speile betingelsene for de andre immunutfellingene. | ||||
Tabell 3: Antistoffer og vaskevilkår anvendt i denne studien.
| Gene | Fremre primer | Revers primer | sonde |
| Gapdh-promotor (0 kb) | 5'-GGG TTC CTA TAA ATA CGG AKT GC-3 ' | 5'-CTG GCA CTG CAC AAG AAG A-3 ' | 68 |
| Dtx1 forsterker (+26 kb) | 5'-CTC TGG GTT GTA GGG GAC AG-3 ' | 5'-GCA TGG GAA CTG TGT TAC AGA A-3 ' | 27 |
| Gene ørken | 5'-CAA TGC ATG GGT CCA GAT TT-3 ' | 5'-ATT GGC ACG GAA GTA GTG CT-3 ' | 94 |
Tabell 4: Primers og probes brukt til qPCR i denne studien.
| Problem | Fører til | Løsning |
| Kromatin er under skjæret og fragmentene er for store. | For mange celler har blitt brukt. | Reduser antall celler. |
| Skjæringen er for lav. | Øk antall skjæringssykluser. | |
| Øk klippekraften, arbeidsfaktoren og / eller syklusene / utbruddene. | ||
| Kromatin er overskåret og fragmentene er for små. | For få celler har blitt brukt. | Øk antall celler. |
| Skjæringen er for høy. | Reduser antall skjæringssykluser. | |
| Reduser klippekraften, arbeidsfaktoren og / eller syklusene / utbruddene. | ||
| For lav gjenoppretting over jegGG kontroll og / eller negativ kontroll (høy bakgrunn). | Ikke nok chromatin brukt til forsøket. | Øk mengden kromatin. |
| Mengden antistoff er for lavt. | Øk mengden av antistoff. | |
| Mengden antistoff er for høyt. | Reduser mengden av antistoff. | |
| Antistoffet har lav spesifisitet. | Bytt antistoff. | |
| Vaskeforholdene er for strenge. | Reduser antall vasker. | |
| Reduser strenger av vaskebuffere. | ||
| Vaskeforholdene er ikke strenge nok. | Øk antall vasker. | |
| Øk strengen av vaskebufferne. | ||
| For mye DNA ble pipettert i qPCR. | Reduser mengden DNA som pipetteres i qPCR. | |
| QPCR forholdene er ikke optimale. | Optimaliser qPCR-betingelsene. | |
| Reduser antall sykluser. | ||
| Intet produkt eller produkt er for lavt i qPCR-reaksjonen av inngangsprøven. | Ikke nok DNA ble pipettert i qPCR. | Øk mengden DNA som pipetteres i qPCR. |
| QPCR forholdene er ikke optimale. | Optimaliser qPCR-betingelsene. | |
| Øk antall sykluser. | ||
| Ikke nok chromatin brukt til forsøket. | Øk mengden kromatin. | |
| Ingen signal i den positive kontrollen og / eller panH3 ChIP. | Ikke nok chromatin brukt til forsøket. | Øk mengden kromatin. |
| Mengden antistoff er for lavt. | Øk mengden av antistoff. | |
| AntiKroppen har lav spesifisitet. | Bytt antistoff. | |
| Eluering er suboptimal. | Sørg for å vortexe prøvene ofte for å opprettholde perlene i oppløsning. |
Tabell 5: Feilsøking.
Discussion
ChIP er en gyldig teknikk for å undersøke om proteiner eller deres PTM er beriket på bestemte genomiske områder. ChIP-analyseresultater er ofte utfordrende å tolke på grunn av biologiske eller tekniske årsaker. De biologiske årsakene er mangefold og inkluderer svak eller indirekte binding av proteiner til DNA. Det er også tekniske begrensninger, som begrenset antistoff-spesifisitet og ineffektiv cellelys eller kromatinskjæring. En feilsøkingsveiledning ( tabell 5 ) kan hjelpe leseren til å løse problemene som kan oppstå med ChIP-analyser.
Denne protokollen, som benytter seg av en kjølefokusert ultralydapparat, tillater en å effektivt skjære kromatinet av en moden mus-T-cellelinje. Protokollets viktigste kritiske trinn representeres av skjæringen av kromatinet, som alltid må optimaliseres for hver celletype. Det foreslås å variere antall celler og antall sonikasjonssykluser. Videre, hun Aring effektivitet er negativt påvirket av tilstedeværelsen av SDS precipitater i prøvene, som kan danne under lysis av cellene på is med SDS lysis buffer. I dette tilfellet er det best å inkubere prøven etter lys ved romtemperatur i noen minutter for å redusere forekomsten av SDS-utfellingen. Det anbefales å optimalisere protokollen for å oppnå skårte fragmenter mellom 200 og 500 bp og å alltid evaluere skjærekvaliteten av prøvene før de fortsetter med immunutfellingen. I tillegg må fikeringstid, mengde antistoff og / eller celler og vaskebetingelsene optimaliseres for hvert antistoff.
Et mer kritisk skritt i å gjøre en ChIP-prosedyre vellykket er valget av antistoffet, da lav-spesifisitet antistoffer reduserer effektiviteten av immunutfellingen. Tidligere ble en enhetlig kvalitetstestprosedyr tillatt for evaluering av spesifisiteten til flere antistoffer tilgjengelig på markedet Ss = "xref"> 19. Screeningsrøret ble basert på dot blot, Western blot og ChIP, og gir en liste over reagenser av høy kvalitet som passer til ChIP 19 . Mer nylig ble spesifisiteten av flere kommersielt tilgjengelige antistoffer evaluert ved bruk av histonpeptid-mikroarrayplattformer med høy tetthet, hvilket muliggjør etablering av en database på antistoff-spesifisitet 20 . Leseren kan bruke dette nyttige verktøyet til å identifisere de mest spesifikke antistoffene som kan brukes til ChIP-eksperimenter.
Denne protokollen er ikke blitt testet for primære T-celler, og i dette tilfellet bør leseren referere til andre publiserte protokoller som har utført ChIP på primære T-celler 3 , 4 , 21 . Spesielt har denne protokollen blitt vellykket brukt til å utføre ChIP på en T-cellelinje for mus-stamceller, så vel som på en endotelcellelinje.
Ove_content "> 5 x 10 6 celler skal brukes til hver immunutfelling for analyse av histonmerker. Fordi denne protokollen også kan være egnet, med litt optimalisering, for å utføre ChIP på TFs eller kofaktorer, er det best å øke antall celler Brukes til immunutfelling i disse tilfellene. For å nå det nødvendige antall celler for hvert forsøk, kan flere alikvoter av skjæret lysat sammenblandes før fortynning av kromatinet i fortynningsbufferen.Denne protokollen kan også modifiseres for å utføre ChIP på endogene proteiner som ikke binder direkte til DNA. I dette tilfellet kan det forekomme pre-fiksering med protein-protein-tverrbindere ( f.eks. Dimetyladipimidat, DMA) (se vedlegg B for mer informasjon). Den vellykkede ytelsen av ChIP på kofaktorer ble tidligere gjort ved overuttrykning av proteiner som er fusjonert til en biotin-tag. I dette tilfellet ble proteinet renset med streptavidin-conjugaTed magnetiske perler, og en pre-fiksering med DMA ble utført 22 .
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for P. Käse og T. Schmidt-Wöll for utmerket teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av samarbeidsprosjektet TRR81 og Heisenberg-programmet (BO 1639 / 5-1) fra DFG (German Research Foundation), Max Planck Society og EXC 294 i Freiburg, og Excellence Cluster for Cardio Pulmonary System (ECCPS) i Giessen til TB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent High Sensitivity D5000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5593 | |
| Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5592 | |
| Agilent Tapestation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | |
| Covaris S220 AFA System | Covaris | 500217 | |
| dimethyl adipimidate (DMA) | Thermo Fisher Scientific | 20660 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Pan-Biotech | 1502-P121301 | |
| Formaldehyde (FMA) | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21980-032 | |
| Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| nProtein A Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5280-02 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) |
Gibco | 15140-122 | |
| Peptone primatone | Sigma-Aldrich | P4963-100G | |
| Phase Lock Gel Heavy 2 mL | 5 Prime | 2302830 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Roth | A156.2 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO | 14190-094 | |
| Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| Tube AFA Fiber & Cap | Covaris | 520081 |
References
- Rothenberg, E. V. The chromatin landscape and transcription factors in T cell programming. Trends Immunol. 35 (5), 195-204 (2014).
- Zhang, J. A., Mortazavi, A., Williams, B. A., Wold, B. J., Rothenberg, E. V. Dynamic transformations of genome-wide epigenetic marking and transcriptional control establish T cell identity. Cell. 149 (2), 467-482 (2012).
- Cauchy, P., et al. Dynamic recruitment of Ets1 to both nucleosome-occupied and -depleted enhancer regions mediates a transcriptional program switch during early T-cell differentiation. Nucl Acids Res. 44 (8), 3567-3585 (2016).
- Koch, F., et al. Transcription initiation platforms and GTF recruitment at tissue-specific enhancers and promoters. Nat Struct Mol Biol. 18 (8), 956-963 (2011).
- Pekowska, A., et al. H3K4 tri-methylation provides an epigenetic signature of active enhancers. EMBO J. 30 (20), 4198-4210 (2011).
- Vanhille, L., et al. High-throughput and quantitative assessment of enhancer activity in mammals by CapStarr-seq. Nat Commun. 6, 6905 (2015).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
- Ostuni, R., et al. Latent enhancers activated by stimulation in differentiated cells. Cell. 152 (1-2), 157-171 (2013).
- Giaimo, B. D., Oswald, F., Borggrefe, T. Dynamic chromatin regulation at Notch target genes. Transcription. 8 (1), 61-66 (2017).
- Liefke, R., et al. Histone demethylase KDM5A is an integral part of the core Notch-RBP-J repressor complex. Genes Dev. 24 (6), 590-601 (2010).
- Jung, C., Mittler, G., Oswald, F., Borggrefe, T. RNA helicase Ddx5 and the noncoding RNA SRA act as coactivators in the Notch signaling pathway. Biochim Biophys Acta. 1833 (5), 1180-1189 (2013).
- Oswald, F., et al. A phospho-dependent mechanism involving NCoR and KMT2D controls a permissive chromatin state at Notch target genes. Nucl Acids Res. 44 (10), 4703-4720 (2016).
- Arrigoni, L., et al. Standardizing chromatin research: a simple and universal method for ChIP-seq. Nucl Acids Res. 44 (7), e67 (2016).
- Essen, D., Dullforce, P., Brocker, T., Gray, D. Cellular interactions involved in Th cell memory. J Immunol. 165 (7), 3640-3646 (2000).
- White, J., et al. Two better cell lines for making hybridomas expressing specific T cell receptors. J Immunol. 143 (6), 1822-1825 (1989).
- Ghisletti, S., et al. Identification and characterization of enhancers controlling the inflammatory gene expression program in macrophages. Immunity. 32 (3), 317-328 (2010).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Rothbart, S. B., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
- Fenouil, R., et al. CpG islands and GC content dictate nucleosome depletion in a transcription-independent manner at mammalian promoters. Genome Res. 22 (12), 2399-2408 (2012).
- Hein, K., et al. Site-specific methylation of Notch1 controls the amplitude and duration of the Notch1 response. Sci Signal. 8 (369), ra30 (2015).
