Summary
Dette værk beskriver en protokol for chromatinimmunpræcipitation (ChIP) ved anvendelse af en moden mus-T-cellelinie. Denne protokol er egnet til at undersøge fordelingen af specifikke histonmærker på specifikke promotorsteder eller genom-bred.
Abstract
Signalveje regulerer genekspressionsprogrammer via modulering af chromatinstrukturen på forskellige niveauer, såsom ved post-translationelle modifikationer (PTM'er) af histonehaler, udveksling af canoniske histoner med histonvarianter og nukleosomudsættelse. En sådan regulering kræver bindingen af signal-følsomme transkriptionsfaktorer (TF'er), der rekrutterer chromatinmodificerende enzymer ved regulatoriske elementer defineret som forstærkere. Forståelse af, hvordan signaleringskaskader regulerer enhanceraktivitet kræver en omfattende analyse af bindingen af TF'er, chromatinmodificerende enzymer og beslaglæggelsen af specifikke histonmærker og histon-varianter. Chromatinimmunpræcipitation (ChIP) assays udnytter stærkt specifikke antistoffer til immunpræcipitering af specifikke protein / DNA-komplekser. Den efterfølgende analyse af det oprensede DNA tillader identifikationen den region, der optages af proteinet genkendt af antistoffet. Dette værk beskriver en protokol til effektivt at peRform ChIP af histonproteiner i en moden T-cellelinie af mus. Den præsenterede protokol tillader udførelse af ChIP-analyser inden for en rimelig tidsramme og med høj reproducerbarhed.
Introduction
Udvikling, differentiering og homeostase afhænger af specifikke genekspressionsprogrammer, der er etableret ved signalering af hændelser, som modulerer chromatinstrukturen og derfor bestemmer, om et specifikt gen aktiveres eller undertrykkes på en celle- og tidsspecifik måde. Under T-celleudvikling skal specifikke genekspressionsprogrammer etableres for korrekt at bestemme modningen af T-celleprecursorer fra den dobbelt-negative (DN) til den enkelt-positive (SP) tilstand, der passerer gennem flere mellemliggende trin 1 . Hvordan genekspressionsprogrammet er dynamisk reguleret under T-celleudvikling er blevet undersøgt bredt i tidligere år af flere laboratorier 2 , 3 , 4 , 5 , 6 .
Ved post-translationelle modifikationer (PTM) af histoner, udveksling afKanoniske histoner med histon-varianter, nukleosomudkastning og DNA-methylering regulerer ON / OFF-omskifteren af gener. Flere grupper har undersøgt den genombredde fordeling af PTM'er og histonvarianter til bestemmelse af mærker, som er forbundet med forskellige chromatintilstande i både proksimale og distale reguleringsområder 7 , 8 , 9 , 10 . Signalkaskader orkestrerer dynamisk kromatinregulering via udveksling af positive og negative kromatinmodificerende enzymer (også kendt som chromatinmodifikatorer) ved specifikke enhancerelementer. Disse chromatinmodifikatorer regulerer kromatinstrukturen og således transkriptionelle output ved for eksempel dynamisk histon-methylering og acetylering. Dette er tilfældet i Notch-signalvejen 11 , 12 , 13 ,14.
Dynamiske histon PTM'er; Udvekslinger med histon-varianter; Og den dynamiske belægning af histoner, transkriptionsfaktorer og cofaktorer kan undersøges ved chromatinimmunpræcipitation (ChIP) assays. Meget specifikke antistoffer anvendes til oprensning af specifikke DNA-proteinkomplekser, og det oprensede DNA analyseres ved hjælp af kvantitativ PCR (qPCR); Dyb-sekventering (ChIP-Seq); Eller mindre hyppigt i dag hybridisering til microarray (ChIP-ChIP).
ChIP-assays er nogle gange udfordrende på grund af komplikationer med lysis af cellerne, forskydning af chromatin og / eller lav specificitet af antistofferne. Flere strategier er blevet vedtaget for at forbedre protokollen, som det er tilfældet for NEXSON 15 . Anvendelsen af kølevandbad-sonikatorer undgår prøveopvarmning, som kan skade epitoperne, der er til stede på det undersøgte protein, men den energi, der kræves til afskæring af prøverne, dispergeres i vandet.En anden forbedring blev foretaget med udviklingen af fokuserede ultralydningsindretninger, der forhindrer spredningen af energien. Derfor tillader fokuserede ultralydningsindretninger forbedringer i cellelys og chromatinafskæring, hvilket eliminerer operatørinducerede variationer og signifikant øger reproducerbarheden.
Dette arbejde beskriver en protokol (skematisk overblik i figur 1 ) for effektivt at udføre ChIP af histonproteiner i en moden mus T-cellelinie kaldet E2-10HA 16 , 17 . T-celler er sædvanligvis vanskelige at lyse, og afskæringen af deres chromatin har vist sig at være ineffektiv. I denne protokol, der anvender en kølefokuseret ultralydapparat, blev antallet af celler, lysisbufferen og skæringsindstillingen optimeret til E2-10HA-mus-T-cellelinjen. Denne protokol gør det muligt for en at udføre ChIP med høj reproducerbarhed og inden for en rimelig tid. Faktisk kræver detEr ca. to dage for at skære kromatinet og at evaluere skærekvaliteten og tre dage til at udføre immunopræcipitationen, reversere tværbindingen og rense DNA'et.
Protocol
BEMÆRK: Alle buffere og mediet, der anvendes i denne protokol, er angivet i tabel 1 .
Dag 1 og 2
1. Tværbindende celler
- Overfør mus T-celler fra en 6-brønds plade til et 50 ml rør og centrifuger i 5 minutter ved 4 ° C og ~ 271 x g. Resuspender cellepelleten i 30 ml IMDM-celledyrkningsmedium og tæl cellerne under anvendelse af et Neubauer-kammer.
- Saml alikvoter af 20 x 106 celler i nye 50 ml rør.
- Tilsæt formaldehyd (FMA) til en 1% slutkoncentration direkte til cellekulturmediet og inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter.
Forsigtig: FMA er giftig ved indånding, så arbejde under en dampkåle og brug passende beskyttelsesudstyr. Du må også håndtere FMA-affald i overensstemmelse med værtsinstitutionens regler. - Tilsæt 1/8-volumen 1 M glycin, pH 7,0, og inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter.
- Pellet cellerne ved centrifugering for 5Min ved 4 ° C og ~ 271 xg og vaskes med 10 ml phosphatpufret saltopløsning (PBS).
- Vask cellepellet med 1 ml PBS og overfør til 1,5 ml rør.
2. Cell Lysis og Chromatin Shearing
- Resuspender cellepelleten i 1 ml SDS lysis buffer og inkuber på is i 10 minutter.
- Overfør hver prøve til et sonikationsrør og udfør klippe ved hjælp af en fokuseret ultralydapparat i henhold til indstillingerne angivet i tabel 2.
- Efter skæring overføres prøverne til 1,5 ml rør og centrifuger i 10 minutter ved 4 ° C og ~ 18.000 x g.
- Overfør supernatanten til nye rør.
- Saml 50 μL for at bestemme klippeffektiviteten ifølge trin 3 og snapfryse det skårede lysat i flydende nitrogen. Opbevar lysatet i alikvoter med engangsbrug ved -80 ° C.
3. Bestemmelse af skæringseffektivitet
- Tilsæt 50 μl elueringsbuffer til 50 & #181; L af hvert skæret lysat og inkuber ved 65 ° C natten over med omrystning.
- Tilsæt 100 μl TE-buffer og 4 μl 10 mg / ml RNase A (0,2 μg / μl slutkoncentration). Bland og inkuber i 2 timer ved 37 ° C med omrystning.
- Tilsæt 2 μl 20 mg / ml proteinase K (0,2 μg / μl slutkoncentration) til hver prøve og inkuber i 2 timer ved 55 ° C under omrystning.
- Overfør hver prøve til et gelrør egnet til phenol / chloroform / isoamylalkoholekstraktion; Håndteres i henhold til producentens anvisninger.
- Tilsæt 200 μl phenol / chloroform / isoamylalkohol (25: 24: 1) og ryst rørene. Centrifuge i 5 minutter ved 24 ° C og ~ 16.000 xg og overfør den øvre fase til nye rør.
Forsigtig: Fenol, chloroform og isoamylalkohol er giftige ved indånding og ætsende; Arbejde under en kåle og brug passende personlige værnemidler. Også håndtere phenol, chloroform og isoamylalkohol affald acI henhold til værtsinstitutionens regler.- Gentag en gang.
- Rens DNA'et ved hjælp af rensekolonner i henhold til producentens instruktion med følgende ændringer:
- Vask membranen to gange. Efter den sidste vask skal røret være åbent i 2 minutter ved stuetemperatur for at fordampe den resterende ethanol.
- Til elueringen tilsættes 50 μl H20, inkuberes ved stuetemperatur i 1 min, roterer røret i 1 s for korrekt vådning af membranen og inkuberes ved stuetemperatur i 1 minut, inden der elueres DNA ved centrifugering i 1 min ved 24 ° C og ~ 17,900 x g.
- Kvantificer det oprensede DNA på et fluorometer ved brug af et højfølsomhedssæt ifølge producentens anvisninger.
- Analyser ca. 500 ng af det oprensede DNA på en 1,8% agarosegel og ca. 1 ng på et elektroforesystem ved anvendelse af et højfølsomhedssæt.
BEMÆRK: Den forventede sizE af DNA-fragmenterne er mellem 200 og 500 bp.
Dag 3 og 4
4. Immunpræcipitation
- Fortynd 1 volumen skåret lysat med 5 volumener fortyndingsbuffer.
- Preclear med 30 μl / ml protein En agarosekugle (fremstillet ifølge tillæg A ) i 30 minutter under rotering i det kolde rum.
- Centrifuger ved 4 ° C i 5 minutter ved ~ 750 x g.
- Saml 10% af indgangen og opbevar den ved 4 ° C.
- Aliquot den ønskede mængde lysat i nye rør (se tabel 3 for detaljer). Tilsæt de ønskede antistoffer til hvert rør (se tabel 3 for detaljer) og drej natten over ved 4 ° C.
- Tilsæt 40 μl protein En perler og inkuber i 1 time ved 4 ° C under rotering.
- Vask perlerne med 1 ml lavsaltbuffer, højsaltbuffer, LiCl-buffer og TE-buffer (for hver vask inkuberes i 5 minutter ved 4 ° C under rotering og centrifugeringI 3 minutter ved 4 ° C og ~ 950 xg). Se tabel 3 for detaljer.
- Tilsæt 110 μl elueringsbuffer og inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur, hvirvle hver 2 min.
- Centrifuger i 3 minutter ved 4 ° C og ~ 950 xg og overfør 100 μL supernatant til et nyt 1,5 ml rør.
- Gentag trin 4.7-4.8 med 100 μl elueringsbuffer og kombiner eluaterne. Tilsæt elueringsbuffer op til 200 μL for at indsætte prøverne.
- Inkuber alle prøver natten over ved 65 ° C under omrystning.
Dag 5
5. DNA-oprensning
- Tilsæt 200 μl TE-buffer til hvert eluat og 8 μl 10 mg / ml RNase A (0,2 μg / μl slutkoncentration). Bland og inkuber i 2 timer ved 37 ° C med omrystning.
- Tilsæt 4 μL 20 mg / ml proteinase K (0,2 μg / μl slutkoncentration) til hvert eluat og inkuber i 2 timer ved 55 ° C under omrystning.
- Overfør hver prøve til en gelRør egnet til phenol / chloroform / isoamylalkoholekstraktion; Håndteres i henhold til producentens anvisninger.
- Tilsæt 400 μl phenol / chloroform / isoamylalkohol (25: 24: 1) og ryst rørene. Centrifuge i 5 minutter ved 24 ° C og ~ 16.000 x g. Overfør den øvre fase til nye rør.
Forsigtig: Fenol, chloroform og isoamylalkohol er giftige ved indånding og ætsende; Arbejde under en kåle og brug passende personlige værnemidler. Håndter også phenol-, chloroform- og isoamylalkoholaffald i overensstemmelse med værtsinstitutionens regler.- Gentag en gang.
- Rens DNA'et ved hjælp af rensekolonner i henhold til producentens anvisninger, med følgende ændringer:
- Vask membranen to gange. Efter den sidste vask skal rørene være åbne i 2 minutter ved stuetemperatur for at fordampe den resterende ethanol.
- Til elueringen tilsættes 50 μl H20, inkuberes ved stuetemperaturRe i 1 minut, drej rørene i 1 s for korrekt vådning af membranen og inkuber ved stuetemperatur i 1 minut, før eluering af DNA'et ved centrifugering i 1 min ved 24 ° C og ~ 17,900 x g.
Representative Results
Modne murine T-celler blev underkastet ChIP-analyse for at undersøge berigelsen af histonmark-monomethyleringen af lysin 4 på histone 3 (H3K4me1), trimethylering af lysin 4 på histone 3 (H3K4me3) og acetylering af lysin 27 på Histone 3 (H3K27ac) såvel som nukleosombelægningen, som afsløret af panH3 ChIP. Skærekvaliteten blev evalueret ved analyse på en 1,8% agarosegel ( figur 2A ) og på et elektroforesystem ( figur 2B ). H3K4me1 og H3K4me3 anvendes generelt til at identificere enhancer-sites og promotorer henholdsvis ( figur 3A ). Faktisk er H3K4me3 fremtrædende, men ikke udelukkende beriget ved promotorer 5 , 8 , 14 . Et kendetegn ved aktive forstærkere skal være stærkt beriget for H3K4me1 og H3K27ac og dårligt beriget for H3K4me3 (<Stærk klasse = "xfig"> Figur 3A, øverste panel), mens inaktive forstærkere præsenterer lave niveauer af H3K4me3 og H3K27ac, men høje niveauer af H3K4me1 ( Figur 3A , nedre panel). Som vist i figur 3B er Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase-genet ( Gapdh ) -genet repræsentativt for analysen af aktive genpromotorer ( Gapdh-promotor ). Faktisk viser det høje niveauer af H3K4me3 og H3K27ac og lave niveauer af H3K4me1. I figur 3B er Deltex1 ( Dtx1 ) repræsentativ for inaktive enhancere ( Dtx1 forstærker ), da den er stærkt beriget for H3K4me1 og dårligt beriget for H3K4me3 og H3K27ac. Gen-ørken er repræsentativ for en region, der mangler kodende gener, og saksøges sædvanligvis som en negativ kontrol for aktive chromatinmærker. Observationen om, at H3K4me1, en vel accepteret forstærker markerer 4 , 5 , 7 , 14 , 18 , ikke beriget ved Gene-ørkenen antyder, at denne region mangler forstærkere.
Figur 1: Skematisk oversigt over den præsenterede ChIP-protokol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skærende kvalitetskontrol af den modne mus T-cellelinie. ( A ) To forskellige alikvoter af modent mus T-cellelinie E2-10HA blev skåret, og ca. 500 ng renset DNA blev analyseret på en 1,8% agarosegel for at evaluere deres forskydningKvalitet. ( B ) 1 ng oprenset DNA fra prøve 2 blev analyseret ved elektroforese for at evaluere dens skærekvalitet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Kromatinmærker, der karakteriserer forstærkere og promotorer. ( A ) Aktive forstærkere (øverste panel) er præget af høj H3K4me1, lav H3K4me3 og høj H3K27ac, mens inaktive forstærkere (nederste panel) er til stede høje H3K4me1, lave H3K4me3 og lave H3K27ac. ( B ) Prøverne præsenteret i figur 2A blev samlet sammen og anvendt til ChIP-analyse versus histonmærker H3K4me1, H3K4me3 og H3K27ac og histonbelægning, som afsløret af panH3 ChIP. Denne analyse viser, at thE-promotor af housekeeping genet Glyceraldehyd 3-phosphat dehydrogenase ( Gapdh promotor ) er stærkt beriget for H3K4me3 og H3K27ac og lavt beriget for H3K4me1. På den anden side er forstærkeren af det inaktive gen Deltex1 ( Dtx1 enhancer ) stærkt beriget for H3K4me1 men dårligt beriget for H3K4me3 og H3K27ac. ChIP ved anvendelse af et panH3-antistof blev anvendt til at undersøge nukleosombelægning. Gen-ørken blev anvendt som en negativ kontrol. Et repræsentativt eksperiment er vist. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Navn på buffer | Reagens | Slutkoncentration |
| Fortyndingsbuffer | NatriumdodecYl sulfat (SDS) | 0,01% (vægt / volumen) |
| Triton X-100 | 1,1% (vol / vol) | |
| Ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) pH 8,0 | 1,2 mM | |
| Tris-HCI pH 8,1 | 16,7 mM | |
| Natriumchlorid (NaCl) | 167 mM | |
| DMA-opløsning | Dimethyladipimidat (DMA) | 10 mM |
| Fosfatbufret saltvand (PBS) | 1x | |
| Elueringsbuffer | Natriumdodecylsulfat (SDS) | 1% (vægt / volumen) |
| Ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) pH 8,0 | 10 mM | |
| Tris-HCI pH 8,0 | 50 mM | |
| Høj saltbuffer | Natriumdodecylsulfat (SDS) | 0,1% (vægt / volumen) |
| Triton X-100 | 1% (vol / vol) | |
| EthylenediamiNetto-eddikesyre (EDTA) pH 8,0 | 2 mM | |
| Tris-HCI pH 8,1 | 20 mM | |
| Natriumchlorid (NaCl) | 500 mM | |
| IMDM medium | Iscove's modificerede Dulbecco's medium (IMDM) | 1x |
| Fetal bovint serum (FBS) | 2% (vol / vol) | |
| Penicillin / streptomycin | 1x | |
| Pepton primatone | 0,3 mg / ml | |
| Insulinopløsning menneske | 4,8 mg / ml | |
| Minimum essentielle ikke-essentielle aminosyrer (MEM NEAA) | 1x | |
| LiCl salt buffer | Lithiumchlorid (LiCl) | 0,25 M |
| IGEPAL-CA630 | 1% (vol / vol) | |
| Ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) pH 8,0 | 1 mM | |
| Tris-HCI pH 8.1 | 10 mM | |
| Lav saltbuffer | Natriumdodecylsulfat (SDS) | 0,1% (vægt / volumen) |
| Triton X-100 | 1% (vol / vol) | |
| Ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) pH 8,0 | 2 mM | |
| Tris-HCI pH 8,1 | 20 mM | |
| Natriumchlorid (NaCl) | 150 mM | |
| Protein A Sepharose perler vaskebuffer | Tris-HCI pH 8,0 | 20 mM |
| Natriumchlorid (NaCl) | 500 mM | |
| Ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) pH 8,0 | 2 mM | |
| Natriumdodecylsulfat (SDS) | 0,1% (vægt / volumen) | |
| IGEPAL-CA630 | 1% (vol / vol) | |
| SDS Lysis buffer | Natriumdodecylsulfat (SDS) | 1% (vægt / volumen) |
| ethylendiAminetetraeddikesyre (EDTA) pH 8,0 | 10 mM | |
| Tris-HCI pH 8,1 | 50 mM | |
| TE buffer | Tris-HCI pH 8,0 | 10 mM |
| Ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) pH 8,0 | 1 mM |
Tabel 1: Liste over buffere og mediet anvendt i denne protokol.
| PÅ | AF | |
| Peak power | 150,0 | 2.5 |
| Toldfaktor | 15,0 | 15,0 |
| Cykler / burst | 500 | 500 |
| Antal cykler | 28 | |
Tabel 2: Skæreindstillinger, der anvendes i denne protokol. Disse betingelser er blevet optimeret for en moden T-cellelinie af mus.
| antistof | Leverandør | Mængde antistof / immunopræcipitation | Mængde celler / immunudfældning | Vaskeforhold |
| H3 | Abcam (ab1791) | 2,5 mg | 5 x 10 6 | En gang i lav saltbuffer, to gange i høj saltbuffer, to gange i LiCl-saltbuffer og tre gange i TE-buffer |
| H3K4me1 | Abcam (ab8895) | 2,5 mg | 5 x 10 6 | En gang i lav saltbuffer, to gange i høj saltbuffer, to gange i LiCl-saltbuffer og tre gange i TE-buffer |
| H3K4me3 | Diagenode (pAb-003-050) | 2,5 mg | 5 x 10 6 | En gang i lav saltbuffer, to gange i høj saltbuffer, to gange i LiCl-saltbuffer og tre gange i TE-buffer |
| H3K27ac | Diagenode (pAb-174-050) | 2,5 mg | 5 x 10 6 | Oc i lav saltbuffer, to gange i høj saltbuffer, to gange i LiCl-saltbuffer og tre gange i TE-buffer |
| IgG | Diagenode (C15410206) | Variabel * | Variabel * | Variabel * |
| * I tilfælde af IgG-kontrollen skal mængden af både antistof og celler såvel som vaske trinene afspejle betingelserne for de andre immunopræcipitationer. | ||||
Tabel 3: Antistoffer og vaskebetingelser anvendt i denne undersøgelse.
| Gene | Fremadrettede primer | Omvendt primer | sonde |
| Gapdh-promotor (0 kb) | 5'-GGG TTC CTA TAA ATA CGG ACT GC-3 ' | 5'-CTG GCA CTG CAC AAG AAG A-3 ' | 68 |
| Dtx1 forstærker (+26 kb) | 5'-CTC TGG GTT GTA GGG GAC AG-3 ' | 5'-GCA TGG GAA CTG TGT TAC AGA A-3 ' | 27 |
| Gene ørken | 5'-CAA TGC ATG GGT CCA GAT TT-3 ' | 5'-ATT GGC ACG GAA GTA GTG CT-3 ' | 94 |
Tabel 4: Primers og prober anvendt til qPCR i denne undersøgelse.
| Problem | Årsager | Løsning |
| Kromatin er under skåret og fragmenter er for store. | For mange celler er blevet brugt. | Reducer antallet af celler. |
| Skæringen er for lav. | Forøg antallet af skærecykler. | |
| Forøg klippe spidseffekt, toldfaktor og / eller cyklusser / udbrud. | ||
| Kromatin er overskåret, og fragmenterne er for små. | For få celler er blevet brugt. | Forøg antallet af celler. |
| Skæringen er for høj. | Reducer antallet af skærecykler. | |
| Reducer klippe-spidseffekten, arbejdsfaktoren og / eller cyklusserne / udbruddet. | ||
| For lavt opsving over jegGG kontrol og / eller negativ kontrol (høj baggrund). | Ikke nok chromatin anvendt til eksperimentet. | Forøg mængden af chromatin. |
| Mængden af antistof er for lavt. | Forøg mængden af antistof. | |
| Antistofmængden er for høj. | Reducer mængden af antistof. | |
| Antistoffet har lav specificitet. | Ændre antistoffet. | |
| Vaskeforholdene er for strenge. | Reducer antallet af vask. | |
| Reducer strækningen af vaskebufferne. | ||
| Vaskeforholdene er ikke strenge nok. | Forøg antallet af vask. | |
| Forøg strækningen af vaskebufferne. | ||
| For meget DNA blev pipetteret i qPCR. | Reducer mængden af DNA, der pipetteres i qPCR. | |
| QPCR betingelser er ikke optimale. | Optimer qPCR betingelserne. | |
| Reducer antallet af cyklusser. | ||
| Intet produkt eller produkt er for lavt i qPCR-reaktionen af indgangsprøven. | Ikke nok DNA blev pipetteret i qPCR. | Forøg mængden af DNA, der pipetteres i qPCR. |
| QPCR betingelser er ikke optimale. | Optimer qPCR betingelserne. | |
| Forøg antallet af cyklusser. | ||
| Ikke nok chromatin anvendt til eksperimentet. | Forøg mængden af chromatin. | |
| Intet signal i den positive kontrol og / eller panH3 ChIP. | Ikke nok chromatin anvendt til eksperimentet. | Forøg mængden af chromatin. |
| Mængden af antistof er for lavt. | Forøg mængden af antistof. | |
| AntiKrop har lav specificitet. | Ændre antistoffet. | |
| Eluering er suboptimal. | Sørg for at vortex prøverne ofte for at opretholde perlerne i opløsning. |
Tabel 5: Fejlfinding.
Discussion
ChIP er en gyldig teknik til at undersøge, om proteiner eller deres PTM'er beriges ved specifikke genomiske områder. ChIP-analyseresultater er ofte udfordrende at fortolke på grund af biologiske eller tekniske grunde. De biologiske årsager er mangefoldige og omfatter svag eller indirekte binding af proteiner til DNA. Der er også tekniske begrænsninger, såsom begrænset antistofspecificitet og ineffektiv cellelys eller kromatinskæring. En fejlfindingsvejledning ( tabel 5 ) kan hjælpe læseren til at løse de problemer, der kan opstå med ChIP-analyser.
Denne protokol, der gør brug af en kølefokuseret ultralydningsanordning, gør det muligt at skære chromatinet effektivt af en moden T-cellelinie fra mus. Protokollens vigtigste kritiske trin er repræsenteret ved skæring af chromatinet, som altid skal optimeres for hver celletype. Det foreslås at variere antallet af celler og antallet af sonikationscyklusser. Desuden er hun Aring effektivitet er negativt påvirket af tilstedeværelsen af SDS præcipitater i prøverne, som kan danne under lysis af cellerne på is med SDS lysis buffer. I dette tilfælde er det bedst at inkubere prøven efter lysis ved stuetemperatur i nogle få minutter for at reducere forekomsten af SDS-bundfald. Det anbefales at optimere protokollen for at opnå skårede fragmenter mellem 200 og 500 bp og til altid at evaluere skærekvaliteten af prøverne, inden de fortsætter med immunopræcipitationen. Endvidere skal fixeringstiden, mængden af antistof og / eller celler og vaskebetingelserne optimeres for hvert antistof.
Et yderligere kritisk trin i at gøre en ChIP-procedure vellykket er valget af antistoffet, da antistoffer med lav specificitet signifikant reducerer effektiviteten af immunpræcipitationen. Tidligere var en samlet kvalitetsprocedure tilladt til vurdering af specificiteten af flere antistoffer, der var tilgængelige på markedet Ss = "xref"> 19. Screeningsrørledningen var baseret på dot blot, Western blot og ChIP, hvilket gav en liste over reagenser af høj kvalitet, der passer til ChIP 19 . Mere for nylig blev specificiteten af adskillige kommercielt tilgængelige antistoffer evalueret under anvendelse af histonpeptid-mikroarrayplatforme med høj densitet, hvilket muliggør etablering af en database om antistofspecificitet 20 . Læseren kan bruge dette nyttige værktøj til at identificere de mest specifikke antistoffer, som kan anvendes til ChIP-eksperimenter.
Denne protokol er ikke blevet testet for primære T-celler, og i dette tilfælde skal læseren henvise til andre offentliggjorte protokoller, der med succes udfører ChIP på primære T-celler 3 , 4 , 21 . Denne protokol har især været anvendt til at udføre ChIP på en T-cellelinie med mus-stamceller, såvel som på en musendotelcellelinie.
Ove_content "> 5 x 10 6 celler bør anvendes til hver immunpræcipitation til analyse af histon mærker. Fordi denne protokol også kan være egnet med en vis optimering til at udføre ChIP på TF'er eller cofaktorer, er det bedst at øge antallet af celler Anvendt til immunpræcipitationen i disse tilfælde. For at nå det krævede antal celler for hvert forsøg kan flere alikvoter af skæret lysat samles sammen før fortynding af chromatinet i fortyndingsbufferen.Denne protokol kan også ændres til at udføre ChIP på endogene proteiner, der ikke binder direkte til DNA'et. I dette tilfælde kan præfixering med protein-protein tværbindere ( fx dimethyl adipimidat, DMA) være påkrævet (se bilag B for mere information). Den succesfulde udførelse af ChIP på cofactorer blev tidligere udført ved overudtrykning af proteiner, der er fusioneret til et biotin-tag. I dette tilfælde blev proteinet oprenset med streptavidin-conjugaTede magnetiske perler, og en præ-fiksering med DMA blev udført 22 .
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for P. Käse og T. Schmidt-Wöll for fremragende teknisk assistance. Dette arbejde blev støttet af samarbejdsforskningstilskuddet TRR81 og Heisenberg-programmet (BO 1639 / 5-1) fra DFG (German Research Foundation), Max Planck Society og EXC 294 i Freiburg og Excellence Cluster for Cardio Pulmonary System (ECCPS) i Giessen til TB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent High Sensitivity D5000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5593 | |
| Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5592 | |
| Agilent Tapestation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | |
| Covaris S220 AFA System | Covaris | 500217 | |
| dimethyl adipimidate (DMA) | Thermo Fisher Scientific | 20660 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Pan-Biotech | 1502-P121301 | |
| Formaldehyde (FMA) | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21980-032 | |
| Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| nProtein A Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5280-02 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) |
Gibco | 15140-122 | |
| Peptone primatone | Sigma-Aldrich | P4963-100G | |
| Phase Lock Gel Heavy 2 mL | 5 Prime | 2302830 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Roth | A156.2 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO | 14190-094 | |
| Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| Tube AFA Fiber & Cap | Covaris | 520081 |
References
- Rothenberg, E. V. The chromatin landscape and transcription factors in T cell programming. Trends Immunol. 35 (5), 195-204 (2014).
- Zhang, J. A., Mortazavi, A., Williams, B. A., Wold, B. J., Rothenberg, E. V. Dynamic transformations of genome-wide epigenetic marking and transcriptional control establish T cell identity. Cell. 149 (2), 467-482 (2012).
- Cauchy, P., et al. Dynamic recruitment of Ets1 to both nucleosome-occupied and -depleted enhancer regions mediates a transcriptional program switch during early T-cell differentiation. Nucl Acids Res. 44 (8), 3567-3585 (2016).
- Koch, F., et al. Transcription initiation platforms and GTF recruitment at tissue-specific enhancers and promoters. Nat Struct Mol Biol. 18 (8), 956-963 (2011).
- Pekowska, A., et al. H3K4 tri-methylation provides an epigenetic signature of active enhancers. EMBO J. 30 (20), 4198-4210 (2011).
- Vanhille, L., et al. High-throughput and quantitative assessment of enhancer activity in mammals by CapStarr-seq. Nat Commun. 6, 6905 (2015).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
- Ostuni, R., et al. Latent enhancers activated by stimulation in differentiated cells. Cell. 152 (1-2), 157-171 (2013).
- Giaimo, B. D., Oswald, F., Borggrefe, T. Dynamic chromatin regulation at Notch target genes. Transcription. 8 (1), 61-66 (2017).
- Liefke, R., et al. Histone demethylase KDM5A is an integral part of the core Notch-RBP-J repressor complex. Genes Dev. 24 (6), 590-601 (2010).
- Jung, C., Mittler, G., Oswald, F., Borggrefe, T. RNA helicase Ddx5 and the noncoding RNA SRA act as coactivators in the Notch signaling pathway. Biochim Biophys Acta. 1833 (5), 1180-1189 (2013).
- Oswald, F., et al. A phospho-dependent mechanism involving NCoR and KMT2D controls a permissive chromatin state at Notch target genes. Nucl Acids Res. 44 (10), 4703-4720 (2016).
- Arrigoni, L., et al. Standardizing chromatin research: a simple and universal method for ChIP-seq. Nucl Acids Res. 44 (7), e67 (2016).
- Essen, D., Dullforce, P., Brocker, T., Gray, D. Cellular interactions involved in Th cell memory. J Immunol. 165 (7), 3640-3646 (2000).
- White, J., et al. Two better cell lines for making hybridomas expressing specific T cell receptors. J Immunol. 143 (6), 1822-1825 (1989).
- Ghisletti, S., et al. Identification and characterization of enhancers controlling the inflammatory gene expression program in macrophages. Immunity. 32 (3), 317-328 (2010).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Rothbart, S. B., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
- Fenouil, R., et al. CpG islands and GC content dictate nucleosome depletion in a transcription-independent manner at mammalian promoters. Genome Res. 22 (12), 2399-2408 (2012).
- Hein, K., et al. Site-specific methylation of Notch1 controls the amplitude and duration of the Notch1 response. Sci Signal. 8 (369), ra30 (2015).
