Summary
Aktiv autofagi er forbundet med produktiv muskelregenerering, hvilket er afgørende for aktivering af muskelstamceller (MuSC). Her tilvejebringer vi en protokol til in situ detektion af LC3, en autophagy markør i MyoD-positive MuSCs af muskelvævssektioner fra kontrol og skadede mus.
Abstract
Øget bevis peger på autofag som en afgørende reguleringsproces for at bevare vævshomostase. Det er kendt, at autofagi er involveret i udvikling af skeletmuskel og regenerering, og den autofagiske proces er blevet beskrevet i flere muskulære patologier og aldersrelaterede muskelforstyrrelser. En nyligt beskrevet blok af den autofagiske proces, der korrelerer med den funktionelle udtømning af satellitceller under muskelreparation, understøtter forestillingen om, at aktiv autofagi er koblet til produktiv muskelregenerering. Disse data afdækker den afgørende rolle autofagi i satellitcelleaktivering under muskelregenerering i både normale og patologiske tilstande, såsom muskeldystrofier. Her tilvejebringer vi en protokol til overvågning af autophagic-processen i voksen muskelstamceller (MuSC) under muskelregenerative betingelser. Denne protokol beskriver opsætningsmetoden til at udføre in situ immunofluorescensbilleddannelse af LC3, en aUtophagy markør og MyoD, en myogen linie markør, i muskelvæv sektioner fra kontrol og skadede mus. Den rapporterede metode muliggør overvågning af den autofagiske proces i et specifikt cellerum, MuSC-rummet, som spiller en central rolle i orkestrerende muskelregenerering.
Introduction
Skeletmuskleregenerering er resultatet af interaktionen mellem voksne stamceller (Muscle Satellite Cells, MuSCs) og andre celletyper, der er involveret i den regenerative proces. Muskel homeostase og funktionalitet opretholdes af de kombinerede signaler, der stammer fra muskel niche og systemiske tegn 1 , 2 . Gennem hele levetiden er der rapporteret om ændringer i MuSC-funktionaliteten, muskelnichen og de systemiske signaler, hvilket resulterer i tilbagegang i funktionelle kapaciteter hos ældre 3 . MuSCs er sat i en niche under basal lamina og ved muskelskade aktiveres for at reparere beskadigede muskler 4 , 5 . For at sikre et produktivt regenerativt respons er det afgørende, at MuSCs koordinerer forskellige processer, der er nødvendige for udgangen fra quiescence, selvfornyelsen og den proliferative ekspansionsstadium fulgtVed myogen differentiering 6 . Hos ældre og muskulære kroniske sygdomme er alle disse funktioner kompromitteret, hvilket fører til ændret muskelfunktionalitet 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 .
Makroautofagi (herefter omtalt som autofagi) fremkommer som en afgørende biologisk proces, der er afgørende for at bevare vævshomostase 14 . Den autophagiske proces omslutter menneskehandel mekanismer, hvor dele af cytoplasma, organeller og proteiner opsluges i vesikler, der til sidst nedbrydes via lysosomvejen, fremmer fjernelsen af toksiske molekyler og genanvendelse af makromolcules. Dette giver energirige forbindelser til understøttelse af celle- og vævsadaptation under stress eller andre ugunstige tilstande 15 , 16 . Sammen med sin celleoverlevelsesaktivitet kan autophagi også fungere som en celledødsinducer, afhængig af cellevævskontekst ( fx normalt versus kræftvæv) og typen af stress-stimulus 17 , 18 .
Nylige beviser tyder på, at autofagi er nødvendig for at opretholde muskelmasse og myofiberintegritet 19 , 20 og er blevet rapporteret at være svækket i forskellige muskeldystrofier 21 , 22 , 23 , inklusive Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30. På samme måde er en progressiv reduktion af den autofagiske proces observeret hos ældre 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , efter et tab af muskelmasse (henvist til sarkopi) 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 og i myofiber overlevelse 38 .
Et tæt samarbejde mellem autophagy og regenerativ potentialet af skeletsmuskler forventes ved en undersøgelse fra Wagers laboratorium, hvilket viste at en kaloriebegrænsning forbedrer MuSC-tilgængelighed og aktivitet 39 . Dette nrBlev yderligere understøttet af den nylige bemærkning, at Foxo3-Notch-aksen aktiverer den autofagiske proces under selvfornyelse 40 og MuSC-overgangen fra det hvile til proliferationstilstanden 41 . Disse data er i overensstemmelse med den progressive reduktion af basal autofagi fra unge til gamle og geriatriske MuSC'er i forbindelse med den numeriske og funktionelle nedgang af MuSCs under aldring 42 .
I et nyligt dokument viste vi et nært forhold mellem autophagy og kompenserende muskelregeneration, som skelner mellem de tidlige stadier af DMD-progression. Følgelig observerede vi en reduceret autofagisk flux ved senere stadier af sygdomsprogression, når muskelregenerering er kompromitteret, og fibrotisk vævsaflejring forekommer. Trængende viste vi, at autophagy i regenereringsbetingelser aktiveres i MuSC'er, og at den modulerende autofagiske proces påvirker MuSC-aktivering og fuNctionality 30 .
Samlet set fremhæver disse data, at det er uopsætteligt at undersøge den autofagiske proces i MuSCs under muskelregenerering under normale og patologiske forhold og i hele levetiden. Her tilvejebringer vi en protokol til overvågning af den autofagiske proces i MuSCs i muskelregenerative betingelser ved at udføre in situ immunfarvning for mikrotubulærassocieret protein 1A / 1B-let kæde 3 (LC3), en markør for autophagy 43 og MyoD, en markør for Myogen stamme, i muskelvævssektioner fra kontrol og skadede mus. Den rapporterede metode giver mulighed for at overvåge den autofagiske proces i et specifikt cellerum, MuSC, som spiller en central rolle i orkestrerende muskelregenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mus blev opdrættet og opretholdt i henhold til standard dyrefacilitetsprocedurer, og alle forsøgsprotokoller blev godkendt af Animal Welfare Assurance og den interne Animal Research Ethical Committee ifølge det italienske sundhedsministerium og fulgte NIH's guide til pleje og brug af Laboratoriedyr.
1. Muskelskader og In vivo Blokken af Autophagic Flux
- Muskelskade.
- For at fremkalde akut skelettmuskelskade injiceres 20 μl 10 μM kardiotoxin (CTX) stamme direkte i venstre tibialis anterior (TA) muskel af 2 måneder gamle C57BL / 6J mus, der vejer ca. 20 g. Brug et lige antal mænd og kvinder. Brug det uperturberede kontralaterale lem som kontrol.
BEMÆRK: 10 μM CTX i 0,9% natriumchloridopløsning bør filtreres (0,22 μm PVDF filter) og opbevares ved -20 ° C. Undgå gentagne fryse-optøningscykler. - Brug en iNsulin sprøjte med en 30 G nål, injicer CTX i midten af TA. For at fremkalde en nøjagtig skade i TA'en skal man sikre sig, at sprøjtens nål går tæt på den distale senet, 5 mm dyb, fra bunden til toppen af musklen ( figur 1A ).
- For at fremkalde akut skelettmuskelskade injiceres 20 μl 10 μM kardiotoxin (CTX) stamme direkte i venstre tibialis anterior (TA) muskel af 2 måneder gamle C57BL / 6J mus, der vejer ca. 20 g. Brug et lige antal mænd og kvinder. Brug det uperturberede kontralaterale lem som kontrol.
- Blokering af den autofagiske flux i uperturerede og skadede mus.
- For at vurdere den autofagiske flux, 24 timer efter skader (pi), administrere 50 mg / kg chloroquin (CLQ) hver 24 time til 4 d ved intraperitoneal (IP) injektion ( Figur 1B ).
- Opløs CLQ (10 mg / ml) i PBS 1X og filtrer det gennem en 0,2 μm membran. Vejer hver mus og beregner mængden af CLQ at injicere.
BEMÆRK: Klargør og brug CLQ-løsning samme dag. CLQ lagerbeholdningen kan opbevares i op til en måned ved -20 ° C. Da autofagi er en metabolisk relateret proces, skal du altid udføre CLQ-behandling altid på samme tid ( dvs. om morgenen befoKl 10:00).
- Opløs CLQ (10 mg / ml) i PBS 1X og filtrer det gennem en 0,2 μm membran. Vejer hver mus og beregner mængden af CLQ at injicere.
- For at vurdere den autofagiske flux, 24 timer efter skader (pi), administrere 50 mg / kg chloroquin (CLQ) hver 24 time til 4 d ved intraperitoneal (IP) injektion ( Figur 1B ).
2. Muskelvævssektioner
- Musofre.
- Euthanize musene 5 dage efter skaden.
- Udfør eutanasi ved cervikal dislokation eller ved CO 2 (efterfølges af cervikal dislokation til bekræftelse). Da autofagiprocessen er relateret til musens sovende / spisevaner, skal du altid ofre musene samtidig, helst om morgenen ( dvs. før kl. 10.00).
- TA isolering og inklusion.
- Før disseksionen sprøjtes musen med 70% ethanol.
- Brug saks til at lave en lille, vinkelret snit (3 mm lang) på musens dorsale hud på hofterne. Skær halen og fødderne for at forenkle fjernelsen af huden. Træk huden mod halen og fjern den for at udsætte de underliggende muskler; TA muskelen er let at lokalisere, som vist i figur 2A
- Ved hjælp af to tang, tag fat i de distale sener.
- Skær de distale sener TA og extensor digitorium longus (EDL) sener skæres ofte sammen og senere adskilt (se trin 2.2.6).
- Brug tang, hold TA musklerne ved senen og træk forsigtigt musklerne op mod den proximale ende (nær knæet, figur 2B ).
BEMÆRK: På dette tidspunkt er EDL- og TA-musklerne let genkendelige, TA er større og mere overfladisk end EDL. - Adskil TA fra EDL muskelen ved at trække de to distale sener i modsatte retninger ( figur 2C ).
- Skær den proximale senet.
- Brug tænger, fjern den tynde fascia, der dækker muskelen, uden at beskadige vævet.
- Fjern overskydende fugt i prøven ved hjælp af et papirhåndklæde. Sørg for, at musklerne hverken er våde eller overdrevent tørre, da overdreven fugt vil producere sigVæsentlig skade på musklerne og bringe den næste farvning i fare.
- Placer Optimal Skæringstemperatur (OCT) -forbindelse i bunden af en støbeform og læg musklen ind i den i retningen vist i figur 2D . Tilsæt 100% isopentan til et bæger, indtil det når en dybde på ca. 3-4 cm. Placer bægeret i kontakt med flydende nitrogen i en polystyrenkasse.
- Lad ikke det flydende kvælstof komme ind i bægeret, da det vil frembringe et boblende skum, som kan påvirke inklusionen og beskadige muskelsektionerne.
- Overhold isopentanen og vent til den når den rette temperatur (mellem -140 ° C og -150 ° C); Ved den passende temperatur krystalliseres et fast hvidt lag af frosset isopentan på bunden af bægeret.
- Hvis isopentanen helt fryser fast, smelter og afkøler det til frysetemperatur, inden du fortsætter til næste trin.
- Ved hjælp af forkølede pincetter sænkes formen letIsopentanen i ca. 20-30 s. Anbring den frosne prøve i en beholder med tøris, indtil den overføres til en fryser på -80 ° C.
BEMÆRK: Protokollen kan pauses her.
- Muskelvævskryosektioner.
- Efter mindst en nat ved -80 ° C udføres cryosectioning.
- Tag kryostatkniven og anti-rullepladen ud af -20 ° C fryseren og læg dem på de respektive støtter i kryostatskabet.
- Sæt en OCT-dråbe på stikprøven og læg den på den frosne prøve i lodret NS-orientering som vist i figur 2D .
- Placer stikprøven på chucken.
- Uden at trække anti-rullepladen ned på kniven, lav nogle nedskæringer på 40 μm for at slippe af med OCT, der ikke omfatter muskel. Når musklen bliver synlig, reducer skive tykkelsen til 7-8 μm.
- Træk anti-rullepladen ned, indtil den er justeret medKanten af kniven eller lidt over den.
- Skær tværsnit 7-8 μm tyk og monter 3-4 skiver pr. Histologisk glide.
BEMÆRK: Den foreslåede kryostat temperatur er mellem -15 ° C og -23 ° C. Tværsnit af prøverne er nødvendige for den efterfølgende analyse for at bestemme muskelstamcellerne i satellitnichepositionen. - For at maksimere vedhæftningen af sektionen skal du holde glidene ved stuetemperatur i 10-15 minutter for at forhindre deres frigørelse under antistofinkubation.
BEMÆRK: Lufttørringstrinnet kan påvirke immunfarvning, hvilket giver tvetydige resultater. Lysbilleder kan opbevares ublandet i flere måneder ved -80 ° C. Protokollen kan pauses her.
- Kontrol af muskelskade i cryosektioner af TA muskler ved at udføre hematoxylin Eosin (H & E) farvning.
- At evaluere muskelkvaliteten ( dvs. effektiviteten af skaden, muskelisolering og inklusivIon og cryosektioner), udfør en H & E-farvning. For hvert eksperimentelt tidspunkt skal du lave et lysbillede med 4% PFA i 10 minutter. Efter fiksering skal du glide gliderne godt i flere ændringer af 1x PBS.
BEMÆRK: Forsigtig. PFA er kræftfremkaldende og skal håndteres omhyggeligt. - Tag et dias til hvert forsøgspunkt og læg dem i en farveskærm.
- Fyld beholderen med 9 g / L hæmatoxylin, indtil sektionerne er dækket og inkuber i 8 minutter.
- Genbrug hematoxylin.
- Lad beholderen stå under rindende vand i 10 minutter for at fjerne overskuddet af hæmatoxylin.
BEMÆRK: Sørg for ikke at strømme vandet direkte til sektionerne. - Vask med steriliseret vand.
- Inkuber sektionerne med eosin 0,5% (vægt / volumen) i syrnet 90% ethanol i 1 min.
- Genbrug eosin.
- Vask to gange med sterilt vand i 3 min / vask.
BEMÆRK: Udfør følgende trin på en kemisk hætte. - Vask afsnittene med 70% ethanol.
- VaskSektionerne med 90% ethanol.
- Vask sektionerne med 100% ethanol.
- Inkuber sektionerne med 0,879 g / ml o-xylen.
BEMÆRK: Forsigtig. O-Xylen er brandfarlig og moderat toksisk. Manipuler det under kemisk hætte, iført beskyttelsesudstyr, herunder handsker, et lab coat og en maske. - Genbrug o-Xylen.
- Sæt lysbillederne over et stykke papir for at tørre.
- Luk gliderne ved hjælp af et hurtighærdende, xylenbaseret monteringsmedium.
- Kontroller kvaliteten af sektionerne under et optisk mikroskop ved 10X forstørrelse (se figur 3 )
BEMÆRK: Protokollen kan pauses her.
- At evaluere muskelkvaliteten ( dvs. effektiviteten af skaden, muskelisolering og inklusivIon og cryosektioner), udfør en H & E-farvning. For hvert eksperimentelt tidspunkt skal du lave et lysbillede med 4% PFA i 10 minutter. Efter fiksering skal du glide gliderne godt i flere ændringer af 1x PBS.
3. Immunostaining for LC3 og MyoD i injicerede muskelvævssektioner
- Fastgørelse af muskelvævssektioner.
- Klargør et inkubationskammer ved at væde et stykke papir og placere det på bunden af en lukkbar plastikasse for at opretholde en høj leFugtighed inde i kammeret. Fiks vævssektioner med 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS i 10 min.
BEMÆRK: Et vådt stykke papir bruges til at undgå tørring af prøven. Forbered frisk PFA eller brug PFA opbevaret ved -20 ° C. Advarsel. PFA er toksisk; Pulveret skal håndteres forsigtigt, når stamopløsningen gøres. Denne operation skal udføres på en kemisk hætte, med beskyttelsesudstyr, herunder handsker, en lab coat og en maske. Også i opløsning bør PFA manipuleres omhyggeligt. - Fjern PFA og vask sektionerne med 1x PBS i 5-7 minutter; Gentag dette trin 3 gange.
- Klargør et inkubationskammer ved at væde et stykke papir og placere det på bunden af en lukkbar plastikasse for at opretholde en høj leFugtighed inde i kammeret. Fiks vævssektioner med 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS i 10 min.
- Permeabilisering af muskelvævssektioner.
- Tegn en hydrofob barriere omkring vævssektionerne ved hjælp af en pap pen.
BEMÆRK: Dette trin definerer overfladen omkring vævssektionerne og minimerer mængden af antistoffer beskrevet i trin 3.4, 3.6, 3.7 og 3.9. - Dæk sektionerne med 200 μL kold (-20 ° C)Methanol og sæt inkubationskammeret vandret inde i en fryser ved -20 ° C i 5 minutter.
- Fjern inkubationskammeret fra fryseren, aspirer metanolen og vask sektionerne med1X PBS i 5-7 minutter ved stuetemperatur; Gentag dette trin 3x.
- Tegn en hydrofob barriere omkring vævssektionerne ved hjælp af en pap pen.
- Blokering
- Forbered en frisk blokopløsning af 4% bovint serumalbumin (BSA) i PBS 1x.
BEMÆRK: BSA-opløsningen kan opbevares i 1 uge ved 4 ° C. - Inkubér sektionerne med blokopløsning i mindst 60 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern blokeringsopløsningen.
- Forbered 100 μl anti-Fab-blanding ved at fortynde 20 μg / ml anti-Fab i 1x PBS. Inkuber sektionerne med et ukonjugeret affinitetsrenset F (ab) -fragment af anti-mus-IgG i 1 time ved RT.
- Forbered en frisk blokopløsning af 4% bovint serumalbumin (BSA) i PBS 1x.
- Primær antistofinkubation.
- Forbered 100 μl primær antistofblanding for hvert dias ved at opløse LC3- og MyoD-antistoffer i 4% BSA i 1x PBS. Brug 5 μg /Ml anti-LC3 (kanin polyklonalt antistof) og 10 mg / l anti-MyoD (musemonoklonalt antistof). Inkuber den primære antistofblanding natten over ved 4 ° C.
- Vasker.
- Fjern den primære antistofblanding.
- Vask afsnittene med 1% BSA i 1X PBS i 10 minutter; Gentag dette trin 3x.
- Sekundær antistofinkubation.
- Forbered 100 μL sekundært antistofmix til hvert dias. Opløs gede-anti-kanin 488 (5 μg / ml) og ged-anti-mus 594 (5 μg / ml) i 4% BSA i 1x PBS.
BEMÆRK: Undgå overdreven udsættelse for lys for at forhindre fluorokromblegning. Udfør følgende trin i mørket. - Inkubér sektionerne med sekundær antistofmix i 45 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern det sekundære antistofmix og vask sektionerne med 1x PBS i 5-7 minutter; Gentag dette trin 3x.
- Forbered 100 μL sekundært antistofmix til hvert dias. Opløs gede-anti-kanin 488 (5 μg / ml) og ged-anti-mus 594 (5 μg / ml) i 4% BSA i 1x PBS.
- Primær antistofinkubation.
- Fortynd laminiN-2 (a-2-kæde) monoklonalt antistof (0,33 μg / ml) i 4% BSA i 1x PBS ved anvendelse af 100 μl blanding for hvert dias. Inkubér sektionerne i den primære antistof-blanding i 1-2 timer ved stuetemperatur.
- Vasker.
- Fjern den primære antistofblanding.
- Vask afsnittene med 1% BSA i 1X PBS i 10 minutter; Gentag dette trin 3x.
- Sekundær antistofinkubation.
- Forbered 100 μL sekundær antistofblanding for hvert dias ved at fortynde gede-anti-rotte 647 (5 μg / ml) i 4% BSA i 1X PBS. Inkubér sektionerne i sekundær antistofblanding i 45 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern det sekundære antistofmix og vask sektionerne med 1x PBS i 5-7 minutter; Gentag dette trin 3x.
- 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) inkubation.
- Tilsæt 200 μL 300 nM DAPI-opløsning i 1x PBS til hvert dias. Inkubér i 5 minutter ved stuetemperatur. Opbevar DAPI-opløsningen ved 4 ° C imørk.
- Vask sektionerne med 1x PBS i 5-7 minutter; Gentag dette trin 3x.
- Montering af farvede muskelsektioner.
- Fjern overskydende vaskeopløsning fra sektionerne.
- Anbring 10 μl glycerol i 1x PBS (3: 1) på de farvede sektioner i midten af diaset og tilsæt en dæksel, der undgår dannelsen af luftbobler.
4. Konkok mikroskopi erhvervelse
- Få billederne ved hjælp af et fire-lasers konfokalmikroskop integreret med et billedoptagelsessystem og analytisk software.
BEMÆRK: MyoD er konjugeret med et 594 farvestof, der er et lyse rødt fluorescerende farvestof, med excitation ideel til 594 nm laser (excitation: 590 nm, emission: 617 nm). LC3 er konjugeret med et 488 farvestof, der er et lyst grønt fluorescerende farvestof, med excitation, der er ideel til 488 nm laserlinjen (excitation: 495 nm, emission: 519 nm). Laminin er konjugeret med et 647 farvestof, der erEt lyst farrødt fluorescerende farvestof med excitation, der er ideel til 647 nm laserlinjen (excitation: 650 nm, emission: 668 nm). - Placer diasene i mikroskopbakken og brug 63X forstørrelse til at detektere nukleare signaler. Man kan fokusere på de regenerative områder ved at centrere feltene for aktiv regenerering, der er afhængige af muskelmorfologi (se figur 4 ).
BEMÆRK: Selv om myofiber størrelse er næsten konstant ( figur 4A ), kan skadesmedieret muskelregenerering genkendes ved mindre myofibre, som er de nydannede fibre efter regenerering. Endvidere er muskelen i aktiv regenerering præget af et omfattende infiltrat, der er lavet af makrofager, fibroadipogene forstadier og celler, der er lokaliseret til de beskadigede muskler for at orkestre muskelregenerering ( figur 4B ). - Evaluer immunfluorescerende farvning i regenErative områder ved at fokusere på MuSCs, der er placeret under myofibers basale lamina.
- Fokus på MuSC'er, der er positive for MyoD-farvning og placeret inden for myofibre markeret med lamininfarvning (se Figur 4B , hvide pile).
- Brug mindst 3 mus / eksperimentelle gruppe og brug mikroskopet til at erhverve 63X forstørrelse billeder af mindst 7 felter for hver eksperimentelle gruppe.
- Når først de regenerative områder er identificeret, skal du fokusere ved hjælp af DAPI-farvning og derefter justere de andre enkeltkanaler.
- Brug følgende mikroskopindstillinger: Kanal A594 Pinhole 1.2 Airy Unit, Gain 791; Kanal A488 Pinhole 1,6 Airy Unit, Gain 659; Kanal A647 Pinhole 1.4 Airy Unit, Gain 719.
- Efter justering af de enkelte kanalers fokus, fortsæt til at erhverve billederne med en størrelse på 1.024 x 1.024 og en 12,61 μs pixel dwell.
- Tæl procentdelen af MyoD-positive celler (kontrol for tHan korrigerer placering under laminatet), der er LC3-negativ og procentdelen af MyoD-positive celler, der viser et LC3-signal.
BEMÆRK: Procentdelen af MyoD-positive celler, der udviser LC3-farvning, er udlæsningen af denne protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol beskriver en effektiv in situ- metode til at detektere autofagi i MuSC'er under muskelregenerering.
CTX In vivo Behandlinger:
Brug CTX til at fremkalde muskelskade i TA muskler og bruge ustyrede muskler som kontroller. Da autofagi er meget dynamisk, blokerer den autofagiske flux ved at udføre IP-injiceringer af CLQ ( figur 1 ). CLQ-behandling er afgørende for at vurdere, om den autofagiske flux er aktiv eller opbevares ved basale niveauer.
Tibialis forreste isolation:
Isolér TA muskler som beskrevet i figur 2 og anbring det i et formkammer i NS orientering for efterfølgende at opnå transversale muskelvævssektioner. Dette trinEr afgørende for at opnå sektioner og at identificere MuSC'er på den rette placering under myofiber basal lamina.
Hystologisk undersøgelse af CTX-induceret muskelskade
Bekræft at muskelskade opstod ved at udføre histologisk farvning. Udfør H & E-farvning og kontroller under 10X forstørrelse: Mens uperturerede muskler viser almindeligvis uforanderlige myofiberstørrelser, omfatter de typiske egenskaber ved skadede muskler forstyrrelsen af myofibere, der er forskellige i størrelse og rigeligt inflammatorisk infiltre. En anden parameter for at bekræfte, at den regenerative proces finder sted, er myofibers centro-nucleation, som er fraværende i uperturerede muskler og er et tegn på dannelsen af nye fibre i mus, som gennemgår aktiv regenerering ( figur 3 ).
Autophagy er koblet til MyoD-poSitive Celler Under Muskel Regeneration:
Udfør immunfluorescerende farvning for at detektere MuSC'er, identificeret som MyoD-positive, der viser et LC3-signal. Lamininfarvning hjælper med at lokalisere MuSC'er i den rigtige position i nichen under basal lamina ( Figur 4 ). Autophagic basale niveauer skelner uperturerede skeletmuskler og øger signifikant sammenfaldende med muskelregenerering 30 . Følgelig viser ikke-beskadigede mus nogen MuSC-aktivering, detekteret ved fraværet af MyoD-positive celler og intet LC3-signal. Omvendt bliver muskelskaderne MyoD-positive MuSC'er positive for LC3, hvilket viser, at den autophagiske proces aktiveres under muskelregenerering i aktiverede satellitceller.
Under de første trin af det regenerative respons lokaliseres forskellige celletyper til stedet for tHan læsion, herunder inflammatoriske celler og fibro-adipogene forstadier, hvilket gør det skadede område tæt overfyldt. Det er afgørende at skelne mellem alle forskellige celletyper, med fokus på MuSC-placeringen under myofiber-laminatet og stole på MyoD-positivitet.
I basale betingelser udtrykkes LC3 ubiquitøst og er næppe detekteret ved immunofluorescens. Som et resultat af forhøjet autofagi ændres dette farvningsmønster og bliver detekterbart hovedsageligt i cytoplasma. Når du vurderer MyoD / LC3-farvning, skal du overveje, at MuSC'er er små celler, og at den cytoplasmatiske region er begrænset; Dette hvorfor LC3 kan se perinuclear.
Figur 1: CTX In vivo Behandlinger. ( A ) For at inducere muskelskader, injicer 10 μL 10 μM CTX direcTly i venstre TA muskler af 2 måneder gamle WT mus. Brug kontralaterale lemmer som kontrol. ( B ) Skematisk repræsentation af cardiotoxin-induceret muskelskade. 24 timer efter skaden, behandl musene med intraperitoneale injektioner på 50 mg / kg CLQ hver 24 timer i 4 dage og dernæst ofre dyrene. Brug ubehandlede ubeskadigede og skadede mus som kontroller. Denne protokol tillader undersøgelse af involveringen af den autofagiske proces under muskelregenerering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: TA Isolation. ( A ) Repræsentativt billede af TA som det ser ud før isolering. ( B ) Efter skæring af den distale senet, hold TA musklerne ved senen og forsigtigLøft musklerne op mod den proximale ende (nær knæet). ( C ) Diskriminere EDL fra TA musklerne, som er større og mere overfladisk end EDL. Adskil TA fra EDL muskelen ved at trække de to distale sener i modsatte retninger. ( D ) Når TA er isoleret, anbring den i formkammeret som beskrevet i NS orientering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: CTX inducerer muskelskade. Repræsentative billeder af H & E-farvning på TA-transversale vævssektioner fra kontrol, uinjord ( A ) og 5 dpi ( B ) WT-mus. H & E-farvning afslører normal fibermorfologi i kontrolmus ( A ) og massivE muskelskader og infiltrere i skadede muskler ( B ), der viser en svækket morfologi ved CTX injektion. Målestang = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Autophagy er koblet til MyoD-positive celler under muskelregenerering. Repræsentative billeder af TA sektioner fra kontrol ( A ) og sårede ( B ) WT mus immunofarvede med LC3 (grøn) og MyoD (rød). Laminin (cyan) farvning markerer muskelfibre, og kerner modstryges med DAPI (hvid). De rigtige paneler viser repræsentative billeder af fusionssignalet. Hvide pile angiver satellitceller, der er under fiberbasens basale lamina, der er markeret med lamininfarvning. The followiNg-protokollen tillader måling af autofagi gennem LC3-farvning i muskelstamceller, der gennemgår myogen slægt, præget af MyoD. Målestang = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver, hvordan man overvåger autofagi i skeletmuskelstamceller under kompenserende muskelregenerering. Flere antistoffer til co-farvning af LC3 og MyoD blev forsøgt, og dem der arbejder i musevævsafsnit og skaber vellykkede resultater, er anført her (se Materialebord ). Permeabiliseringen med methanol (se trin 3.2.2) anbefales stærkt til succesfuld farvning.
Begrænsningen af denne protokol er forbundet med musens indre variabilitet, hvilket tvinger anvendelsen af mindst 3 mus / eksperimentelle gruppe. Denne metode afspejler et trin fremad i studiet af autophagy under skeletmuskleregenerering, da størstedelen af resultaterne op Til nu blev der lavet i isolerede celler. In situ- analysen tillades til undersøgelse af autofagi i det naturlige miljø uden behov for en celleisolering, der kunne påvirke metaboliske processer, såsom autofagi.
"> I betragtning af den autofagiske process højdynamiske karakter er CLQ-behandlingerne et afgørende skridt til at overvåge den autofagiske proces in vivo. CLQ blokerer de senere stadier af den autofagiske proces, hvilket fører til LC3-akkumulering, når autophagi opretholdes. Derfor er CLQ-behandling Gør LC3 detekterbar ved in situ- undersøgelse. I uperturerede skelettmuskler forøges den basale autophagiske proces ikke yderligere ved CLQ-behandling, som det fremgår af fraværet af detekterbar LC3-akkumulering. Imidlertid akkumuleres LC3 ved regenerering af muskler ved CLQ-behandling, hvilket demonstrerer autofag aktivering Et kritisk trin er at ofre musene samtidig om morgenen ( dvs. kl. 10 AM). Et andet kritisk trin i protokollen er identifikationen af MuSC, som ikke må byttes med en anden celletype, der befolker beskadiget muskel under Regenerativ respons. Identifikationen af MuSC'er under basal lamina, der viser MyoD positivitet er kØ for at fokusere på satellitceller.Sammenfattende præsenterer vi en egnet in situ- metode til at påvise involvering af den autofagiske proces i MuSCs. Denne teknik kan tjene som grundlag for test af farmakologiske metoder til autofagmodulering, som kan bruges til at forbedre skeletmuskleregenerering under normale og patologiske forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre
Acknowledgments
Dette arbejde blev understøttet af NIAMS AR064873, Epigen Project PB. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT til LL
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | WT mice |
| Cardiotoxin 1 | Latoxan | L8102 | |
| Millex-VV | Merck Millipore | SLVV033RS | Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Caution: Harmful if swallowed |
| BD Micro-Fine + 0.5 mL | BD | 324825 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Tissue-Tek Cryomold Intermediate | Sakura Finetek | 4566 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | 277258 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| o-Xylene | Sigma-Aldrich | X1040 | Caution: Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Caution: Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Eukitt - Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-007-003 | |
| LC3B Antibody | Cell signaling Technology | 2775 | |
| Monoclonal mouse anti-MyoD (concentrated) clone 5.8A |
DAKO - Agilent Pathology Solutions | M3512 | |
| Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody | Enzo Life Sciences | 4H8-2 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody | Life technologies | A21248 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 |
References
- Bentzinger, C. F., et al. Differential response of skeletal muscles to mTORC1 signaling during atrophy and hypertrophy. Skelet Muscle. 3 (1), (2013).
- Chakkalakal, J. V., et al. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490 (7420), 355-360 (2012).
- Jang, Y. C., et al. Skeletal muscle stem cells: effects of aging and metabolism on muscle regenerative function. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 101-111 (2011).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
- Collins, C. A., Partridge, T. A. Self-renewal of the adult skeletal muscle satellite cell. Cell Cycle. 4 (10), 1338-1341 (2005).
- Bentzinger, C. F., et al. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice. Nat Med. 20 (3), 265-271 (2014).
- Cosgrove, B. D., et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nat Med. 20 (3), 255-264 (2014).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Madaro, L., Latella, L. Forever young: rejuvenating muscle satellite cells. Front Aging Neurosci. 7, 37 (2015).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Tierney, M. T., et al. STAT3 signaling controls satellite cell expansion and skeletal muscle repair. Nat Med. 20 (10), 1182-1186 (2014).
- Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: collaborators or saboteurs? FEBS J. 280 (17), 4100-4108 (2013).
- Kroemer, G., Marino, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol Cell. 40 (2), 280-293 (2010).
- Marino, G., Madeo, F., Kroemer, G. Autophagy for tissue homeostasis and neuroprotection. Curr Opin Cell Biol. 23 (2), 198-206 (2011).
- Jiang, P., Mizushima, N. Autophagy and human diseases. Cell Res. 24 (1), 69-79 (2014).
- Eskelinen, E. L. Doctor Jekyll and Mister Hyde: autophagy can promote both cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12, Suppl 2. 1468-1472 (2005).
- Basile, V., et al. bis-Dehydroxy-Curcumin triggers mitochondrial-associated cell death in human colon cancer cells through ER-stress induced autophagy. PLoS One. 8 (1), e53664 (2013).
- Neel, B. A., Lin, Y., Pessin, J. E. Skeletal muscle autophagy: a new metabolic regulator. Trends Endocrinol Metab. 24 (12), 635-643 (2013).
- Sandri, M. Autophagy in skeletal muscle. FEBS Lett. 584 (7), 1411-1416 (2010).
- Grumati, P., et al. Autophagy is defective in collagen VI muscular dystrophies, and its reactivation rescues myofiber degeneration. Nat Med. 16 (11), 1313-1320 (2010).
- Chrisam, M., et al. Reactivation of autophagy by spermidine ameliorates the myopathic defects of collagen VI-null mice. Autophagy. 11 (12), 2142-2152 (2015).
- Grumati, P., et al. Autophagy induction rescues muscular dystrophy. Autophagy. 7 (4), 426-428 (2011).
- De Palma, C., et al. Autophagy as a new therapeutic target in Duchenne muscular dystrophy. Cell Death Dis. 3, e418 (2012).
- Hindi, S. M., et al. Distinct roles of TRAF6 at early and late stages of muscle pathology in the mdx model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (6), 1492-1505 (2014).
- Pauly, M., et al. AMPK activation stimulates autophagy and ameliorates muscular dystrophy in the mdx mouse diaphragm. Am J Pathol. 181 (2), 583-592 (2012).
- Spitali, P., et al. Autophagy is Impaired in the Tibialis Anterior of Dystrophin Null Mice. PLoS Curr. 5, (2013).
- Whitehead, N. P. Enhanced autophagy as a potential mechanism for the improved physiological function by simvastatin in muscular dystrophy. Autophagy. 12 (4), 705-706 (2016).
- Whitehead, N. P., et al. A new therapeutic effect of simvastatin revealed by functional improvement in muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (41), 12864-12869 (2015).
- Fiacco, E., et al. Autophagy regulates satellite cell ability to regenerate normal and dystrophic muscles. Cell Death Differ. 23 (11), 1839-1849 (2016).
- Lee, I. H., et al. A role for the NAD-dependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3374-3379 (2008).
- Rubinsztein, D. C., Mariño, G., Kroemer, G. Autophagy and aging. Cell. 146 (5), 682-695 (2011).
- Colman, R. J., et al. Caloric restriction delays disease onset and mortality in rhesus monkeys. Science. 325 (5937), 201-204 (2009).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132 (1), 27-42 (2008).
- Yang, L., et al. Long-Term Calorie Restriction Enhances Cellular Quality-Control Processes in Human Skeletal Muscle. Cell Rep. 14 (3), 422-428 (2016).
- Wenz, T., et al. Increased muscle PGC-1alpha expression protects from sarcopenia and metabolic disease during aging. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20405-20410 (2009).
- Carnio, S., et al. Autophagy Impairment in Muscle Induces Neuromuscular Junction Degeneration and Precocious Aging. Cell Rep. , (2014).
- Sandri, M., et al. Misregulation of autophagy and protein degradation systems in myopathies and muscular dystrophies. J Cell Sci. 126 (Pt 23), 5325-5333 (2013).
- Cerletti, M., et al. Short-term calorie restriction enhances skeletal muscle stem cell function. Cell Stem Cell. 10 (5), 515-519 (2012).
- Gopinath, S. D., et al. FOXO3 promotes quiescence in adult muscle stem cells during the process of self-renewal. Stem Cell Reports. 2 (4), 414-426 (2014).
- Tang, A. H., Rando, T. A. Induction of autophagy supports the bioenergetic demands of quiescent muscle stem cell activation. EMBO J. 33 (23), 2782-2797 (2014).
- Garcia-Prat, L., et al. Autophagy maintains stemness by preventing senescence. Nature. 529 (7584), 37-42 (2016).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
