Summary
Aktiv autofagi är förknippad med produktiv muskelregenerering, vilket är väsentligt för aktivering av muskelstamceller (MuSC). Här tillhandahåller vi ett protokoll för in situ- detektering av LC3, en autofagmarkör i MyoD-positiva MuSCs av muskelvävnadssektioner från kontroll och skadade möss.
Abstract
Ökande bevis pekar på autofag som en avgörande lagstiftningsprocess för att bevara vävnadshomeostas. Det är känt att autofagi är inblandad i utveckling av skelettmuskler och regenerering, och den autofagiska processen har beskrivits i flera muskelpatologier och åldersrelaterade muskelstörningar. Ett nyligen beskrivet block av den autofagiska processen som korrelerar med den funktionella uttömningen av satellitceller under muskelreparation stöder tanken att aktiv autofagi är kopplad till produktiv muskelregenerering. Dessa data avslöjar den avgörande rollen som autofagi vid satellitcellaktivering under muskelregenerering i både normala och patologiska tillstånd, såsom muskeldystrofi. Här tillhandahåller vi ett protokoll för att övervaka den autofagiska processen i det vuxna Muscle Stem Cell (MuSC) facket under muskelregenerativa förhållanden. Detta protokoll beskriver installationsmetoden för att utföra in situ immunofluorescensavbildning av LC3, en aUtofagy markör och MyoD, en myogen linjemarkör, i muskelvävnadssektioner från kontroll och skadade möss. Den rapporterade metoden möjliggör övervakning av den autofagiska processen i ett specifikt cellfack, MuSC-facket, som spelar en central roll vid orkestrerande muskelregenerering.
Introduction
Skelettmuskleregenerering är resultatet av interaktionen mellan vuxna stamceller (Muscle Satellite Cells, MuSCs) och andra celltyper som är involverade i regenerativ processen. Muskelhemostasis och funktionalitet upprätthålls av de kombinerade signalerna som härrör från muskelnischen och systemiska signalerna 1 , 2 . Under hela livet har förändringar i MuSC-funktionaliteten, muskelnischen och de systemiska signalerna rapporterats, vilket leder till minskningen av funktionell förmåga hos äldre 3 . MuSCs sätts i en nisch under basal lamina och, vid muskelskada, aktiveras för att reparera skadade muskler 4 , 5 . För att säkerställa ett produktivt regenerativt svar är det avgörande att MuSCs samordnar olika processer som är nödvändiga för utgången från vila, självförnyelsen och det proliferativa expansionssteget följtGenom myogen differentiering 6 . Hos äldre och muskulösa kroniska sjukdomar komprometteras alla dessa funktioner, vilket leder till förändrad muskelfunktionalitet 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 .
Makroautofagi (här refererad till som autofag) framträder som en avgörande biologisk process som är väsentlig för att bevara vävnadshomostasis 14 . Den autofagiska processen omsluter smuggmekanismer, där delar av cytoplasma, organeller och proteiner sväller in i blåsor som i slutändan bryts ned via lysosomvägen, främjar avlägsnandet av toxiska molekyler och återvinning av makromolCules. Detta ger energirika föreningar för att stödja cell- och vävnadsanpassning under stress eller andra ogynnsamma tillstånd 15 , 16 . Tillsammans med sin cellöverlevnadsaktivitet kan autofag också fungera som en celldödsinducerare, beroende på cellvävnadssammanhang ( t ex normal mot cancervävnad) och typen av stressstimulans 17 , 18 .
Nya bevis tyder på att autofagi krävs för att upprätthålla muskelmassa och myofiberintegritet 19 , 20 och har rapporterats vara nedsatt i olika muskeldystrofi 21 , 22 , 23 , inklusive Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30. På samma sätt har en progressiv minskning av den autofagiska processen observerats hos äldre 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , efter en muskelmassa (hänvisad till som sarkopi) 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 och i myofiberöverlevnad 38 .
Ett nära samband mellan autophagy och regenerativ potential av skelettmuskler förväntades av en studie från Wagers laboratorium, vilket visade att en kaloribegränsning förbättrar MuSC tillgänglighet och aktivitet 39 . Detta nrTion stöddes ytterligare av den senaste observationen att Foxo3-Notch-axeln aktiverar den autofagiska processen under självförnyelse 40 och MuSC-övergången från det vilande till det prolifererade tillståndet 41 . Dessa data överensstämmer med den progressiva minskningen av basal autophagy från unga till gamla och geriatriska MuSCs, i samband med den numeriska och funktionella nedgången av MuSCs under åldrandet 42 .
I en nyligen publicerad tidning visade vi ett nära samband mellan autofagi och kompensationsmuskleregenerering som särskiljer de tidiga stadierna av DMD-progression. Följaktligen observerades ett minskat autofagiskt flöde vid senare stadier av sjukdomsprogression, när muskelregenerering äventyras och fibrotisk vävnadsavsättning uppträder. Intrångsvis visade vi att vid regenereringsförhållanden aktiveras autophagy i MuSCs och den modulerande autofagiska processen påverkar MuSC-aktivering och fuNionalitet 30 .
Sammantaget lyfter dessa uppgifter upp det brådska att utforska den autofagiska processen i MuSCs under muskelregenerering under normala och patologiska förhållanden och under hela livslängden. Här tillhandahåller vi ett protokoll för att övervaka den autofagiska processen i MuSCs i muskelregenerativa betingelser genom att utföra in situ immunostaining för mikrotubulär associerad protein 1A / 1B-lätt kedja 3 (LC3), en markör för autophagy 43 och MyoD, en markör för Myogen härkomst, i muskelvävnadssektioner från kontroll och skadade möss. Den rapporterade metoden möjliggör övervakning av den autofagiska processen i ett specifikt cellfack, MuSC, som spelar en nyckelroll vid orkestrerande muskelregenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mössen uppföddes och upprätthölls enligt standard djurfacilitetsprocedurer och alla försöksprotokoll godkändes av Animal Welfare Assurance och den inre djurforskningsetiska kommittén enligt det italienska hälsovårdsministeriet och följde NIH-guiden för vård och användning av Laboratoriedjur.
1. Muskelskada och In vivo- blocket av autofagisk flux
- Muskelsjukdom.
- För att inducera akut skelettmuskulärskada injiceras 20 μl 10 μM kardiotoxin (CTX) -lager direkt i vänster tibialis-främre (TA) -muskel av 2 månader gamla C57BL / 6J-möss som väger ca 20 g. Använd lika många män och kvinnor. Använd den obstruerade kontralaterala extremiteten som en kontroll.
OBS: 10 μM CTX i 0,9% natriumkloridlösning ska filtreras (0,22 μm PVDF filter) och förvaras vid -20 ° C. Undvik upprepade frys-tina cykler. - Använda en iNsulin spruta med en 30 G nål, injicera CTX i mitten av TA. För att inducera en korrekt skada i TA, se till att sprutans nål går in i den distala senan, 5 mm djup, från botten till toppen av muskeln ( Figur 1A ).
- För att inducera akut skelettmuskulärskada injiceras 20 μl 10 μM kardiotoxin (CTX) -lager direkt i vänster tibialis-främre (TA) -muskel av 2 månader gamla C57BL / 6J-möss som väger ca 20 g. Använd lika många män och kvinnor. Använd den obstruerade kontralaterala extremiteten som en kontroll.
- Blockad av det autophagiska flödet i ostörda och skadade möss.
- För att bedöma autofagflödet, 24 h efter skada (pi), administrera 50 mg / kg klorokin (CLQ) var 24: e timme vid 4 d genom intraperitoneal (IP) injektion ( Figur 1B ).
- Lös upp CLQ (10 mg / ml) i PBS 1X och filtrera det genom ett 0,2 μm membran. Väg varje mus och beräkna mängden CLQ att injicera.
OBS! Förbered och använd CLQ-lösning samma dag. CLQ-lager kan lagras i upp till en månad vid -20 ° C. Eftersom autophagy är en metabolisk relaterad process, utför alltid CLQ-behandling alltid samtidigt ( dvs. på morgonen befoKlockan 10:00).
- Lös upp CLQ (10 mg / ml) i PBS 1X och filtrera det genom ett 0,2 μm membran. Väg varje mus och beräkna mängden CLQ att injicera.
- För att bedöma autofagflödet, 24 h efter skada (pi), administrera 50 mg / kg klorokin (CLQ) var 24: e timme vid 4 d genom intraperitoneal (IP) injektion ( Figur 1B ).
2. Muskelvävnadssektioner
- Musoffer.
- Euthanize mössen 5 dagar efter skadan.
- Utför eutanasi genom cervikal dislokation eller med CO 2 (följt av cervikal dislokation för bekräftelse). Eftersom autofagiprocessen är relaterad till musens sovande / ätvanor, offrar du alltid mössen samtidigt, helst på morgonen ( dvs. före 10 AM).
- TA isolering och inkludering.
- Innan dissektionen sprutar musen med 70% etanol.
- Använda saxar gör en liten, vinkelrät snitt (3 mm lång) på musens dorsala hud vid nivån. Klipp svansen och fötterna för att förenkla hudavlägsnandet. Dra huden mot svansen och ta bort den för att exponera de underliggande musklerna; TA-muskeln är lätt att lokalisera, som visas i figur 2A
- Med hjälp av två tångar, ta tag i de distala senorna.
- Klipp de distala senorna; TA och extensor digitorium longus (EDL) senor skärs ofta ihop och separeras senare (se steg 2.2.6).
- Använd tångar, håll TA-muskeln genom senan och dra försiktigt muskeln upp mot den proximala änden (nära knäet, Figur 2B ).
OBS! Vid denna tidpunkt är EDL- och TA-musklerna lätt igenkända, TA är större och mer ytlig än EDL. - Separera TA från EDL-muskeln genom att dra de två distala senorna i motsatta riktningar ( Figur 2C ).
- Skär den proximala senan.
- Använd tång, ta bort den tunna fascia som täcker muskeln utan att skada vävnaden.
- Ta bort överdriven fukt i provet med hjälp av en pappershandduk. Se till att muskeln inte är våt eller överdriven torr, eftersom överdriven fukt kommer att producera sigVäsentlig skada på muskeln och äventyra nästa färgning.
- Placera Optimal Cutting Temperature (OCT) förening i botten av en form och placera muskeln i den, i orienteringen som visas i Figur 2D . Tillsätt 100% isopentan till en bägare tills den når ett djup av ca 3-4 cm. Placera bägaren i kontakt med flytande kväve i en polystyrenlåda.
- Låt inte det flytande kvävet komma in i bägaren, eftersom det kommer att producera ett bubblande skum, vilket kan påverka införandet och skada muskelsektionerna.
- Observera isopentanen och vänta tills den når rätt temperatur (mellan -140 ° C och -150 ° C); Vid lämplig temperatur kommer ett fast vitt skikt av fryst isopentan att kristallisera på botten av bägaren.
- Om isopentanen helt fryser fast, smälter och kyler det till frysningstemperaturen innan du går vidare till nästa steg.
- Använda förkylade tångar sänker mögelformen noggrantIsopentanen i ca 20-30 s. Placera det frysta provet i en behållare med torris tills den överförs till en -80 ° C frys.
OBS: Protokollet kan pausas här.
- Muskelvävnadskryosektioner.
- Efter minst en natt vid -80 ° C, utför cryosectioning.
- Ta kryostatkniven och valsplattan ut ur frysen på -20 ° C och placera dem på respektive stöd i kryostatkåpan.
- Sätt en droppe OCT på provstubben och sätt på det frusna provet, i vertikal NS-orientering, som visualiseras i Figur 2D .
- Placera provstubben på chucken.
- Utan att dra rullen mot rullen ner på kniven, gör några nedskärningar på 40 μm för att bli av med OCT som inte inkluderar muskler. När muskeln blir synlig, minska skivans tjocklek till 7-8 μm.
- Dra ner valsrullen tills den ligger i linje medKanten på kniven eller lite ovanför den.
- Skär transversala sektioner 7-8 μm tjocka och montera 3-4 skivor per histologisk glid.
OBS! Den föreslagna temperaturen för kryostat är mellan -15 ° C och -23 ° C. Tvärsnitt av proverna behövs för den efterföljande analysen för att bestämma muskelstamcellerna i satellitnischpositionen. - För att maximera vidhäftningen av sektionen, behåll glidorna vid rumstemperatur i 10-15 min så att förhindra deras avlägsnande under antikroppsinkubation.
OBS: Lufttorkningssteget kan påverka immunförstärkning, vilket ger tvetydiga resultat. Skivor kan förvaras fäst i flera månader vid -80 ° C. Protokollet kan pausas här.
- Kontrollerar muskelskador i krysosektioner av TA-muskler genom att utföra färgning av hematoxylin-Eosin (H & E).
- Att utvärdera muskelkvaliteten ( dvs. effektiviteten av skadan, muskelisolering och inklusivitetJon och kryosektioner), utför en H & E-färgning. För varje experimentell tidpunkt, fixa en bild med 4% PFA i 10 minuter. Efter fixering, tvätta glidbanorna bra i flera ändringar av 1x PBS.
OBS: Varning. PFA är cancerframkallande och måste hanteras noggrant. - Ta en bild för varje experimentpunkt och lägg dem i en färgkärl.
- Fyll burken med 9 g / L hematoxylin tills sektionerna är täckta och inkubera i 8 min.
- Återvinna hematoxylinet.
- Låt burken stå under rinnande vatten i 10 minuter för att avlägsna överskottet av hematoxylin.
OBS: Se till att inte flöda vattnet direkt på sektionerna. - Tvätta med steriliserat vatten.
- Inkubera sektionerna med eosin 0,5% (vikt / volym) i surgjord 90% etanol i 1 min.
- Återvinna eosin.
- Tvätta två gånger med sterilt vatten i 3 minuter / tvätt.
OBS: Gör följande steg vid en kemisk huva. - Tvätta sektionerna med 70% etanol.
- TvättaSektionerna med 90% etanol.
- Tvätta sektionerna med 100% etanol.
- Inkubera sektionerna med 0,879 g / ml o-xylen.
OBS: Varning. O-Xylen är brandfarligt och måttligt giftigt. Manipulera det under kemisk huva, bära skyddsutrustning, inklusive handskar, ett labbrock och en mask. - Återvinna o-Xylen.
- Lägg glidorna över en bit papper för att torka.
- Stäng bilderna med hjälp av ett snabbhärdande, xylenbaserat monteringsmedium.
- Kontrollera kvaliteten på sektionerna under ett optiskt mikroskop vid 10X förstoring (se Figur 3 )
OBS: Protokollet kan pausas här.
- Att utvärdera muskelkvaliteten ( dvs. effektiviteten av skadan, muskelisolering och inklusivitetJon och kryosektioner), utför en H & E-färgning. För varje experimentell tidpunkt, fixa en bild med 4% PFA i 10 minuter. Efter fixering, tvätta glidbanorna bra i flera ändringar av 1x PBS.
3. Immunostaining för LC3 och MyoD i skadade muskelvävnadssektioner
- Fixering av muskelvävnadssektioner.
- Förbered en inkubationskammare genom att väta en bit papper och placera den på botten av en sluten plastlåda för att upprätthålla en hög leFuktighet inuti kammaren. Fixa vävnadssektioner med 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS under 10 minuter.
OBS! En våt papper används för att undvika att torka provet. Förbered fräsch PFA eller använd PFA lagrad vid -20 ° C. Varning. PFA är giftigt; Pulvret måste hanteras med försiktighet när stamlösningen görs. Denna operation måste utföras på en kemisk huva, med skyddsutrustning, inklusive handskar, en lab coat och en mask. Även när det är i lösning, ska PFA hanteras noggrant. - Ta bort PFA och tvätta sektionerna med 1x PBS i 5-7 minuter; Upprepa detta steg 3 gånger.
- Förbered en inkubationskammare genom att väta en bit papper och placera den på botten av en sluten plastlåda för att upprätthålla en hög leFuktighet inuti kammaren. Fixa vävnadssektioner med 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS under 10 minuter.
- Permeabilisering av muskelvävnadssektioner.
- Rita en hydrofob barriär runt vävnadssektionerna med en pappenn.
OBS! Detta steg definierar ytan runt vävnadssektionerna och minskar volymen av antikroppar som beskrivs i steg 3.4, 3.6, 3.7 och 3.9. - Täck sektionerna med 200 μL kallt (-20 ° C)Metanol och sätt inkubationskammaren horisontellt inuti en frys med -20 ° C under 5 minuter.
- Ta bort inkubationskammaren från frysen, aspirera metanolen och tvätta sektionerna med 1 x PBS i 5-7 minuter vid RT; Upprepa detta steg 3x.
- Rita en hydrofob barriär runt vävnadssektionerna med en pappenn.
- Blockering
- Förbered en ny blocklösning av 4% bovint serumalbumin (BSA) i PBS 1x.
OBS: BSA-lösningen kan lagras i 1 vecka vid 4 ° C. - Inkubera sektionerna med blocklösning i minst 60 minuter vid RT.
- Ta bort blockeringslösningen.
- Bered 100 μl anti-Fab-blandning genom att späda 20 μg / ml anti-Fab i 1x PBS. Inkubera sektionerna med ett okonjugerat affinitetsrenat F (ab) -fragment av anti-mus-IgG under 1 timme vid RT.
- Förbered en ny blocklösning av 4% bovint serumalbumin (BSA) i PBS 1x.
- Primär antikroppsinkubation.
- Förbered 100 μl primär antikroppsblandning för varje bild genom att lösa LC3- och MyoD-antikroppar i 4% BSA i 1x PBS. Använd 5 μg /Ml anti-LC3 (kaninkolyklonal antikropp) och 10 mg / 1 anti-MyoD (musmonoklonal antikropp). Inkubera den primära antikroppsblandningen över natten vid 4 ° C.
- Tvättar.
- Ta bort den primära antikroppsmixen.
- Tvätta sektionerna med 1% BSA i 1X PBS under 10 minuter; Upprepa detta steg 3x.
- Sekundär antikroppsinkubation.
- Förbered 100 μL sekundär antikroppsblandning för varje bild. Lös anti-kanin 488 (5 μg / ml) och get-anti-mus 594 (5 μg / ml) i 4% BSA i 1x PBS.
OBS! Undvik överdriven exponering för ljus för att förhindra blekning av fluorokrom. Gör följande steg i mörkret. - Inkubera sektionerna med sekundär antikroppsblandning under 45 minuter vid RT.
- Ta bort den sekundära antikroppsmixen och tvätta sektionerna med 1x PBS i 5-7 minuter; Upprepa detta steg 3x.
- Förbered 100 μL sekundär antikroppsblandning för varje bild. Lös anti-kanin 488 (5 μg / ml) och get-anti-mus 594 (5 μg / ml) i 4% BSA i 1x PBS.
- Primär antikroppsinkubation.
- Torka laminiN-2 (a-2-kedjig) monoklonal antikropp (0,33 μg / ml) i 4% BSA i 1x PBS med användning av 100 | il blandning för varje bild. Inkubera sektionerna i den primära antikroppsblandningen i 1-2 h vid RT.
- Tvättar.
- Ta bort den primära antikroppsmixen.
- Tvätta sektionerna med 1% BSA i 1X PBS under 10 minuter; Upprepa detta steg 3x.
- Sekundär antikroppsinkubation.
- Förbered 100 μL sekundär antikroppsblandning för varje glid genom att späda get-anti-råtta 647 (5 μg / ml) i 4% BSA i 1X PBS. Inkubera sektionerna i sekundär antikroppsblandning i 45 min vid RT.
- Ta bort den sekundära antikroppsmixen och tvätta sektionerna med 1x PBS i 5-7 minuter; Upprepa detta steg 3x.
- 4 ', 6-Diamidino-2-fenylindol (DAPI) inkubation.
- Tillsätt 200 μL 300 nM DAPI-lösning i 1x PBS till varje bild. Inkubera i 5 min vid RT. Förvara DAPI-lösningen vid 4 ° C imörk.
- Tvätta sektionerna med 1x PBS i 5-7 minuter; Upprepa detta steg 3x.
- Montering av färgade muskelsektioner.
- Ta bort överskottet av tvättlösningen från sektionerna.
- Placera 10 μl glycerol i 1x PBS (3: 1) på de färgade sektionerna i mitten av glidbanan och lägg till en täckglas, vilket undviker bildandet av luftbubblor.
4. Förtroende för konfokal mikroskopi
- Skaffa bilderna med hjälp av ett fyra-lasers konfokalmikroskop integrerat med ett bildinspelningssystem och analytisk programvara.
ANMÄRKNING: MyoD är konjugerad med ett 594 färgämne som är ett ljusröd-fluorescerande färgämne, med excitation idealisk för 594 nm-lasern (excitation: 590 nm, emission: 617 nm). LC3 är konjugerad med ett 488 färgämne som är ett ljusgrönt fluorescerande färgämne med excitation idealisk för laserlinjen 488 nm (excitation: 495 nm, emission: 519 nm). Laminin är konjugerat med ett 647 färgämne som ärEn ljus farröd-fluorescerande färgämne med excitation idealisk för 647 nm laserlinjen (excitation: 650 nm, emission: 668 nm). - Placera diabilderna i mikroskopfacket och använd 63X förstoring för att detektera kärnvågssignaler. Man kan fokusera på de regenerativa områdena genom att centrera fälten för aktiv regenerering med utgångspunkt i muskelmorfologi (se figur 4 ).
OBSERVERA: Även om det är obestämd muskel, är myofiberstorleken nästan konstant ( Figur 4A ), kan skademedierad muskelregenerering erkännas genom utseendet av mindre myofibrer, vilka är de nybildade fibrerna efter regenerering. Dessutom kännetecknas muskeln vid aktiv regenerering av ett omfattande infiltrat som är tillverkat av makrofager, fibroadipogena prekursorer och celler som är lokaliserade till de skadade musklerna för att orkestrera muskelregenerering ( Figur 4B ). - Utvärdera immunfluorescerande färgning i regnErativa områden genom att fokusera på MuSCs som ligger under myofibers basala lamina.
- Fokusera på MuSCs som är positiva för MyoD-färgning och placerade inom myofibrer markerade med lamininfärgning (se Figur 4B , vita pilar).
- Använd minst 3 möss / experimentell grupp och använd mikroskopet för att förvärva 63X förstoringsbilder på minst 7 fält för varje experimentgrupp.
- När de regenerativa områdena är identifierade, fokusera med DAPI-färgning och justera sedan de andra enskilda kanalerna.
- Använd följande mikroskopinställningar: Kanal A594 Pinhole 1.2 Airy Unit, Gain 791; Kanal A488 Pinhole 1,6 Airy Unit, Gain 659; Kanal A647 Pinhole 1.4 Airy Unit, Gain 719.
- Efter justering av de enskilda kanalernas fokus fortsätter du att skaffa bilderna med en 1024 x 1024 ramstorlek och en 12,61 μs pixeluppehåll.
- Räkna procenttalet av MyoD-positiva celler (kontroll för tHan korrigerar plats under lamina) som är LC3-negativa och andelen MyoD-positiva celler som visar en LC3-signal.
OBS: Procentdelen av MyoD-positiva celler som uppvisar LC3-färgning är avläsningen av detta protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll beskriver en effektiv in situ- metod för att detektera autophagy i MuSCs under muskelregenerering.
CTX in vivo behandlingar:
Använd CTX för att inducera muskelsvikt i TA-muskler och använd ostoppade muskler som kontroller. Eftersom autophagy är mycket dynamisk, blockera det autophagiska flödet genom att utföra IP-injiceringar av CLQ ( Figur 1 ). CLQ-behandling är avgörande för att bedöma om det autofagiska flödet är aktivt eller hålls vid basala nivåer.
Tibialis främre isolering:
Isolera TA-muskeln, som beskrivs i Figur 2 , och placera den i en formkammare i NS-orientering för att därefter få transversala muskelvävnadssektioner. Detta stegÄr avgörande för att uppnå sektioner och för att identifiera MuSCs på rätt plats under myofibers basala lamina.
Hystologisk undersökning av CTX-inducerad muskelskada
Kontrollera att muskelskada inträffade genom att utföra histologisk färgning. Utför H & E-färgning och kontrollera under 10X förstoring: medan ostoppade muskler uppvisar allmänt oföränderliga myofiberstorlekar, innefattar de typiska egenskaperna hos skadade muskler störningen av myofibrer som skiljer sig åt i storlek och riklig inflammatorisk infiltration. En annan parameter för att bekräfta att den regenerativa processen äger rum är centro-nukleäringen av myofibrerna, som är frånvarande i ostoppade muskler och är ett tecken på bildandet av nya fibrer hos möss som genomgår aktiv regenerering ( Figur 3 ).
Autophagy är kopplad till MyoD-poSiva celler under muskelregenerering:
Utför immunofluorescerande färgning för att detektera MuSCs, identifierade som MyoD-positiva, som visar en LC3-signal. Lamininfärgning är till hjälp för att lokalisera MuSCs i rätt läge i nischen under basallamina ( Figur 4 ). Autofagiska basala nivåer skiljer ostörda skelettmuskler och ökar signifikant vid sammanträffande med muskelregenerering 30 . Följaktligen visar inte oinjorda möss någon MuSC-aktivering, detekterad genom frånvaron av MyoD-positiva celler och ingen LC3-signal. Omvänt blir muskelskador, MyoD-positiva MuSCs, positiva för LC3, vilket visar att den autophagiska processen aktiveras under muskelregenerering i aktiverade satellitceller.
Under de inledande stadierna av det regenerativa svaret lokaliseras olika celltyper till platsen för tHan lesion, inklusive inflammatoriska celler och fibroadipogena prekursorer, vilket gör det skadade området tätt överfullt. Det är avgörande att skilja mellan alla olika celltyper, med fokus på MuSC-platsen under myofiber-lamina och förlita sig på MyoD-positivitet.
Vid basala betingelser uttrycks LC3 allmänt och detekteras knappt av immunofluorescens. Som ett resultat av förhöjd autofag förändras detta färgmönster och blir detekterbart huvudsakligen i cytoplasman. Vid utvärdering av MyoD / LC3-färgning, anser att MuSCs är små celler och att den cytoplasmatiska regionen är begränsad; Detta varför LC3 kan se perinuclear.
Figur 1: CTX In vivo- behandlingar. ( A ) För att inducera muskelskada, injicera 10 μL 10 μM CTX direcTly i vänster TA muskler av 2 månader gamla WT möss. Använd den kontralaterala extremiteten som en kontroll. ( B ) Schematisk representation av kardiotoxin-inducerad muskelskada. 24 h efter skada, behandla mössen med intraperitoneala injektioner på 50 mg / kg CLQ var 24: e timme i 4 dagar och uppoffera sedan djuren. Använd obehandlade, oskadade och skadade möss som kontroller. Detta protokoll möjliggör studier av involveringen av den autofagiska processen under muskelregenerering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: TA-isolering. ( A ) Representativ bild av TA som den ser ut före isolering. ( B ) Efter att ha klippt den distala senan håller du TA-muskeln genom senan och försiktigtLyck muskeln upp mot den proximala änden (nära knäet). ( C ) Diskriminera EDL från TA-muskeln, som är större och mer ytlig än EDL. Separera TA från EDL-muskeln genom att dra de två distala senorna i motsatta riktningar. ( D ) När TA är isolerad, placera den i formkammaren, som beskrivet, i NS-riktning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: CTX inducerar muskelskador. Representativa bilder av H & E-färgning på TA-transversala vävnadssnitt från kontroll, oinjord ( A ) och 5 dpi ( B ) WT-möss. H & E-färgning avslöjar normal fibermorfologi i kontrollmöss ( A ) och massivE muskelskada och infiltrera i skadade muskler ( B ), vilket visar en nedsatt morfologi vid CTX-injektion. Skala bar = 50 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Autophagy är kopplad till MyoD-positiva celler under muskelregenerering. Representativa bilder av TA-sektioner från kontroll ( A ) och skadade ( B ) WT-möss immunfärgade med LC3 (grön) och MyoD (röd). Laminin (cyan) färgning markerar muskelfibrer, och kärnor är motsträckta med DAPI (vit). De högra panelerna visar representativa bilder på sammanslagningssignalen. Vita pilar indikerar satellitceller som ligger under fiberns basala lamina markerad med lamininfärgning. FöljandeNg-protokollet möjliggör mätning av autofagi genom LC3-färgning i muskelstamceller som genomgår myogena linjer, märkta med MyoD. Skala bar = 50 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver hur man övervakar autophagy i stamceller från skelettmuskel under kompensationsmuskleregenerering. Flera antikroppar för samfärgning av LC3 och MyoD försökades, och de som arbetar i musvävnadssektioner och skapar framgångsrika resultat finns här (se materialtabellen ). Permeabiliseringen med metanol (se steg 3.2.2) rekommenderas starkt för framgångsrik färgning.
Begränsningen av detta protokoll är kopplad till musens inneboende variabilitet, vilket tvingar användningen av minst 3 möss / experimentell grupp. Denna metod återspeglar ett steg framåt i studien av autofag under regenerering av skelettmuskler, eftersom majoriteten av resultaten uppstår Till nu gjordes i isolerade celler. In situanalysen tillåts för studier av autofagi i den naturliga miljön, utan behov av en cellisolering som kan påverka metaboliska processer, såsom autofagi.
"> Med tanke på den autofagiska processens högdynamiska karaktär är CLQ-behandlingarna ett kritiskt steg för att övervaka den autofagiska processen in vivo. CLQ blockerar de senare stadierna av den autofagiska processen, vilket leder till ackumulering av LC3 när autofag hålls. Gör LC3 detekterbar genom in situ- undersökning. I icke-perforerade skelettmuskler ökas den basala autofagiska processen inte längre genom CLQ-behandling, vilket avslöjas genom avsaknad av detekterbar LC3-ackumulering. I regenererande muskler ackumuleras LC3 vid CLQ-behandling, vilket visar autofag aktivering Ett kritiskt steg är att offra mössen samtidigt på morgonen ( dvs. klockan 10 AM). Ett annat kritiskt steg i protokollet är identifieringen av MuSC, som inte får bytas ut med en annan cellulär typ som fyller skadad muskel under Regenerativ respons. Identifieringen av MuSCs under den basala lamina som visar MyoD-positivitet är kÖga för att fokusera på satellitceller.Sammanfattningsvis presenterar vi en lämplig in situ- metod för att upptäcka involveringen av den autofagiska processen i MuSCs. Denna teknik kan tjäna som grund för test av farmakologiska förhållningssätt till autofagmodulering, som kan användas för att förbättra skelettmuskleregenerering under normala och patologiska förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIAMS AR064873, Epigen Project PB. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT till LL
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | WT mice |
| Cardiotoxin 1 | Latoxan | L8102 | |
| Millex-VV | Merck Millipore | SLVV033RS | Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Caution: Harmful if swallowed |
| BD Micro-Fine + 0.5 mL | BD | 324825 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Tissue-Tek Cryomold Intermediate | Sakura Finetek | 4566 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | 277258 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| o-Xylene | Sigma-Aldrich | X1040 | Caution: Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Caution: Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Eukitt - Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-007-003 | |
| LC3B Antibody | Cell signaling Technology | 2775 | |
| Monoclonal mouse anti-MyoD (concentrated) clone 5.8A |
DAKO - Agilent Pathology Solutions | M3512 | |
| Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody | Enzo Life Sciences | 4H8-2 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody | Life technologies | A21248 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 |
References
- Bentzinger, C. F., et al. Differential response of skeletal muscles to mTORC1 signaling during atrophy and hypertrophy. Skelet Muscle. 3 (1), (2013).
- Chakkalakal, J. V., et al. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490 (7420), 355-360 (2012).
- Jang, Y. C., et al. Skeletal muscle stem cells: effects of aging and metabolism on muscle regenerative function. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 101-111 (2011).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
- Collins, C. A., Partridge, T. A. Self-renewal of the adult skeletal muscle satellite cell. Cell Cycle. 4 (10), 1338-1341 (2005).
- Bentzinger, C. F., et al. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice. Nat Med. 20 (3), 265-271 (2014).
- Cosgrove, B. D., et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nat Med. 20 (3), 255-264 (2014).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Madaro, L., Latella, L. Forever young: rejuvenating muscle satellite cells. Front Aging Neurosci. 7, 37 (2015).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Tierney, M. T., et al. STAT3 signaling controls satellite cell expansion and skeletal muscle repair. Nat Med. 20 (10), 1182-1186 (2014).
- Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: collaborators or saboteurs? FEBS J. 280 (17), 4100-4108 (2013).
- Kroemer, G., Marino, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol Cell. 40 (2), 280-293 (2010).
- Marino, G., Madeo, F., Kroemer, G. Autophagy for tissue homeostasis and neuroprotection. Curr Opin Cell Biol. 23 (2), 198-206 (2011).
- Jiang, P., Mizushima, N. Autophagy and human diseases. Cell Res. 24 (1), 69-79 (2014).
- Eskelinen, E. L. Doctor Jekyll and Mister Hyde: autophagy can promote both cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12, Suppl 2. 1468-1472 (2005).
- Basile, V., et al. bis-Dehydroxy-Curcumin triggers mitochondrial-associated cell death in human colon cancer cells through ER-stress induced autophagy. PLoS One. 8 (1), e53664 (2013).
- Neel, B. A., Lin, Y., Pessin, J. E. Skeletal muscle autophagy: a new metabolic regulator. Trends Endocrinol Metab. 24 (12), 635-643 (2013).
- Sandri, M. Autophagy in skeletal muscle. FEBS Lett. 584 (7), 1411-1416 (2010).
- Grumati, P., et al. Autophagy is defective in collagen VI muscular dystrophies, and its reactivation rescues myofiber degeneration. Nat Med. 16 (11), 1313-1320 (2010).
- Chrisam, M., et al. Reactivation of autophagy by spermidine ameliorates the myopathic defects of collagen VI-null mice. Autophagy. 11 (12), 2142-2152 (2015).
- Grumati, P., et al. Autophagy induction rescues muscular dystrophy. Autophagy. 7 (4), 426-428 (2011).
- De Palma, C., et al. Autophagy as a new therapeutic target in Duchenne muscular dystrophy. Cell Death Dis. 3, e418 (2012).
- Hindi, S. M., et al. Distinct roles of TRAF6 at early and late stages of muscle pathology in the mdx model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (6), 1492-1505 (2014).
- Pauly, M., et al. AMPK activation stimulates autophagy and ameliorates muscular dystrophy in the mdx mouse diaphragm. Am J Pathol. 181 (2), 583-592 (2012).
- Spitali, P., et al. Autophagy is Impaired in the Tibialis Anterior of Dystrophin Null Mice. PLoS Curr. 5, (2013).
- Whitehead, N. P. Enhanced autophagy as a potential mechanism for the improved physiological function by simvastatin in muscular dystrophy. Autophagy. 12 (4), 705-706 (2016).
- Whitehead, N. P., et al. A new therapeutic effect of simvastatin revealed by functional improvement in muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (41), 12864-12869 (2015).
- Fiacco, E., et al. Autophagy regulates satellite cell ability to regenerate normal and dystrophic muscles. Cell Death Differ. 23 (11), 1839-1849 (2016).
- Lee, I. H., et al. A role for the NAD-dependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3374-3379 (2008).
- Rubinsztein, D. C., Mariño, G., Kroemer, G. Autophagy and aging. Cell. 146 (5), 682-695 (2011).
- Colman, R. J., et al. Caloric restriction delays disease onset and mortality in rhesus monkeys. Science. 325 (5937), 201-204 (2009).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132 (1), 27-42 (2008).
- Yang, L., et al. Long-Term Calorie Restriction Enhances Cellular Quality-Control Processes in Human Skeletal Muscle. Cell Rep. 14 (3), 422-428 (2016).
- Wenz, T., et al. Increased muscle PGC-1alpha expression protects from sarcopenia and metabolic disease during aging. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20405-20410 (2009).
- Carnio, S., et al. Autophagy Impairment in Muscle Induces Neuromuscular Junction Degeneration and Precocious Aging. Cell Rep. , (2014).
- Sandri, M., et al. Misregulation of autophagy and protein degradation systems in myopathies and muscular dystrophies. J Cell Sci. 126 (Pt 23), 5325-5333 (2013).
- Cerletti, M., et al. Short-term calorie restriction enhances skeletal muscle stem cell function. Cell Stem Cell. 10 (5), 515-519 (2012).
- Gopinath, S. D., et al. FOXO3 promotes quiescence in adult muscle stem cells during the process of self-renewal. Stem Cell Reports. 2 (4), 414-426 (2014).
- Tang, A. H., Rando, T. A. Induction of autophagy supports the bioenergetic demands of quiescent muscle stem cell activation. EMBO J. 33 (23), 2782-2797 (2014).
- Garcia-Prat, L., et al. Autophagy maintains stemness by preventing senescence. Nature. 529 (7584), 37-42 (2016).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
