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Biochemistry

एक सरल, मजबूत, और उच्च प्रवाह एकल अणु डीएनए के साथ अणुओं के परिवहन के अध्ययन के लिए परख कार्यांवयन खींच प्रवाह

Published: October 1, 2017 doi: 10.3791/55923
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Broad Institute, Massachusetts Institute of Technology and Harvard Medical School, 2Dept. of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

Summary

इस प्रोटोकॉल को दर्शाता है एक सरल, मजबूत और उच्च प्रवाह एकल अणु प्रवाह-डीएनए के साथ अणुओं की एक आयामी (1 डी) प्रसार के अध्ययन के लिए परख खींच ।

Abstract

हम वर्णन एक सरल, मजबूत और उच्च प्रवाह एकल अणु प्रवाह-डीएनए के साथ अणुओं के 1 डी प्रसार के अध्ययन के लिए परख खींच । इस परख में, ग्लास coverslips silane-खूंटी-बायोटिन के साथ एक एक कदम प्रतिक्रिया में कार्यात्मक हैं । प्रवाह कोशिकाओं एक कार्यात्मक coverslip और एक PDMS प्रवेश और आउटलेट छेद युक्त स्लैब के बीच पूर्व में कटौती चैनलों के साथ एक चिपकने वाला टेप सैंडविच द्वारा निर्माण कर रहे हैं । एकाधिक चैनल एक प्रवाह सेल में एकीकृत कर रहे है और प्रत्येक चैनल में रिएजेंट के प्रवाह पूरी तरह से स्वचालित है, जो काफी परख प्रवाह बढ़ जाती है और हाथ कम कर देता है परख प्रति समय पर कर सकते हैं । प्रत्येक चैनल के अंदर, बायोटिन-λ-DNAs सतह पर मैटीरियल होता है और DNAs को प्रवाहित करने के लिए एक लामिना प्रवाह लागू किया जाता है । डीएनए अणुओं को फैला रहे हैं & #62; उनके समोच्च लंबाई का ८०% और फ्लोरोसेंट लेबल अणुओं की बाध्यकारी और परिवहन गतिविधि का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से विस्तारित टेम्पलेट्स के रूप में सेवा. एकल अणुओं की गति समय चूक कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) इमेजिंग द्वारा ट्रैक किए जाते हैं । कच्चे छवियां सुव्यवस्थित कस्टम एकल कण सॉफ्टवेयर ट्रैकिंग का उपयोग कर रहे है स्वचालित रूप से एकल डीएनए के साथ फैलाना अणुओं के पथ की पहचान और उनके 1 डी प्रसार स्थिरांक का अनुमान है ।

Introduction

जीव विज्ञान में एक लंबे समय से चली आ रही समस्या कैसे अंतर्जात प्रोटीन है कि जीनोम में विशिष्ट साइटों पर कार्य अपने डीएनए लक्ष्यों को खोजने के लिए जल्दी पर्याप्त जीव जीवित रहने के लिए और अपने पर्यावरण के लिए प्रभावी ढंग से प्रतिक्रिया कर सकते हैं । पिछले ४० वर्षों में अध्ययन का प्रस्ताव है और मोटे तौर पर इस परिकल्पना का समर्थन है कि एक प्रोटीन द्वारा डीएनए लक्ष्य खोज के कैनेटीक्स में जो थोक और 1 डी प्रसार में 3d प्रसार के बीच प्रोटीन विकल्प द्वारा त्वरित किया जा सकता है (सहित फिसलने और प्रक्रियाओं hopping)1डीएनए के साथ । अब यह ज्ञात है कि कई प्रोटीन जीन विनियमन में शामिल, न्यूक्लिक एसिड चयापचय, और अन्य प्रक्रियाओं डीएनए पर फिसलने में सक्षम हैं2,3,4,5,6,7 ,8,9. इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से यह भी बताया कि छोटे पेप्टाइड्स और डीएनए पर स्लाइड करने के लिए एक कार्गो ले जाने की क्षमता के साथ बांध कर सकते हैं; उदाहरण के लिए, एक प्रोटीन अणु या पीसीआर प्राइमर, साथ डीएनए10,11,12,13,14।

पिछले 15 वर्षों में, एकल अणु प्रवाह-परख खींच व्यापक रूप से डीएनए2,15,16के साथ बाध्यकारी और अणुओं के प्रसार का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । परख के इस प्रकार में, biotinylated दोहरे असहाय डीएनए अणु सतह को स्थिर और एक लामिना प्रवाह के लिए डीएनए खिंचाव प्रवाह लागू किया जाता है । द & #62; ८०% तनी DNAs fluorophores के साथ लेबल किए गए अणुओं की बाध्यकारी और परिवहन गतिविधि का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से विस्तारित टेम्पलेट्स के रूप में सेवा करते हैं, जहां डीएनए के साथ एक अणु की गति को समय-चूक प्रतिदीप्ति इमेजिंग द्वारा ट्रैक किया जाता है । हमारे कार्यांवयन में, reproducibility और उपयोग में आसानी के लिए अनुकूलित, इस परख पांच प्रमुख कदम होते हैं: बायोटिन की तैयारी-λ-डीएनए, coverslip functionalization, फ्लो सेल निर्माण, प्रतिदीप्ति इमेजिंग और डेटा विश्लेषण । पिछले प्रोटोकॉल में17, ग्लास coverslips पहले (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) और फिर अमीन-प्रतिक्रियाशील पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) रिएजेंट (जैसे, एन एच-खूंटी-बायोटिन) के साथ प्रतिक्रिया द्वारा कार्यात्मक थे एक खूंटी परत है कि विरोध के रूप में coverslip सतह के लिए परख घटकों के विशिष्ट सोखना । कार्यात्मक coverslips की गुणवत्ता काफी हद तक हर कदम पर खूंटी रिएजेंट और प्रतिक्रिया शर्तों की गुणवत्ता पर निर्भर थे । हमारे प्रोटोकॉल का वर्णन एक सरलीकृत functionalization प्रोटोकॉल और मल्टीप्लेक्स प्रवाह सेल निर्माण जो कोई तरल चिपकने वाला या दिन प्रवाह कोशिकाओं पर समय के इलाज की आवश्यकता है इकट्ठे हुए हैं । हम यह भी एक सुव्यवस्थित और मजबूत डेटा विश्लेषण प्रक्रिया11 का वर्णन है कि केन्द्रक स्थानीयकरण18 और एक सहप्रसरण आधारित प्रसार के लिए एक रेडियल समरूपता विधि लागू करने से गणनात्मक गहन प्रतिगमन कदम समाप्त लगातार अनुमानक19.

यहां, हम रिपोर्ट एक सरल, मजबूत और उच्च प्रवाह एकल अणु महत्वपूर्ण coverslip functionalization, प्रवाह सेल निर्माण और डेटा विश्लेषण में किए गए सुधार के साथ परख कार्यांवयन खींच प्रवाह । विशेष रूप से, हम एक एक कदम coverslip functionalization प्रोटोकॉल, जिसमें साफ सूखी coverslips silane-खूंटी-बायोटिन के साथ सीधे प्रतिक्रिया विकसित की है । यह प्रोटोकॉल coverslip तैयारी को सरल करता है और मानक दो-चरणीय प्रतिक्रिया प्रोटोकॉल की तुलना में कार्यात्मक सतहों की गुणवत्ता की विश्वसनीयता को बेहतर बनाता है । हम बहु चैनल PDMS प्रवाह कोशिकाओं है कि मजबूत ट्यूबिंग कनेक्शन गोंद के बिना किया जा करने के लिए सक्षम के साथ तथाकथित कार्यात्मक coverslips के उपयोग का वर्णन । इन प्रवाह कोशिकाओं को और अधिक कंप्यूटर नियंत्रित प्रत्येक फ्लो चैंबर जो स्वचालित एजेंट प्रवाह सक्षम करने के लिए हाथ कम समय पर सेटअप और वृद्धि की परख प्रवाह के दौरान के लिए देता है शामिल हैं ।

Protocol

< p class = "jove_title" > 1. बायोटिन की तैयारी-& #955;-डीएनए

< p class = "jove_content" > नोट: बायोटिन-& #955;-डीएनए अणुओं को ligating द्वारा तैयार किया जाता है एक बायोटिन-लेबल oligonucleotide, 5 & #39;-AGGTCGCCGCCC (a) 20 -बायोटिन-3 & #39; to & #160; & #955;-डीएनए अणु 20 .

  1. तैयार ०.१ mM बायोटिन त्यसपछि oligo ते बफर.
  2. हीट ०.५ mg/मब & #955;-डीएनए स्टॉक at ६५ & #176; सी के लिए ६० एस, और गीला बर्फ में डुबकी सही दूर ।
    नोट: तेज शमन ठंडा कम कर देता है & #955;-DNA concatemerization.
  3. पिपेट १०० & #181; L द & #955;-डीएनए समाधान एक microcentrifuge ट्यूब में.
  4. Add 1 & #181; l का ०.१ mM oligo 9 & #181; l ते बफर.
  5. Add 2 & #181; L के oligo समाधान के microcentrifuge ट्यूब से युक्त & #955;-डीएनए. अच्छी तरह से मिलाएं ।
    नोट: Oligo लगभग एक 12 गुना दाढ़ अतिरिक्त पूरक पर मौजूद है & #955;-DNA end.
  6. हीट द & #955;-DNA/oligo मिक्सचर पर ६५ & #176; ग के लिए ६० s.
  7. धीरे कमरे के तापमान को मिश्रण ठंडा ।
    नोट: यह चरण oligo को एनएन पूरक & #955;-DNA end.
  8. मिश्रण को बर्फ पर लगाएं । जोड़ें 11 & #181; टी-4 डीएनए ligase प्रतिक्रिया बफर (अंतिम बफर एकाग्रता 1x) के एल । मिश्रण धीरे । फिर टी-4 डीएनए ligase एंजाइम के 2 & #181; L (८०० यूनिट) जोड़ें । मिश्रण लिएर.
  9. के मिश्रण को 2 ज पर 16 & #176; ग या रात भर 4 & #176; ग.
  10. १०० केडीए के एक नाममात्र आणविक भार सीमा के साथ केंद्रापसारक फिल्टर ट्यूबों का उपयोग उत्पाद शुद्ध । विशेष रूप से, एक केंद्रापसारक फ़िल्टर ट्यूब में कदम १.९ मिश्रण हस्तांतरण और 5 मिनट के लिए १४,००० x g पर केंद्रापसारक, ४०० & #181 के साथ धो; एल ते बफर दो बार, और शुद्ध उत्पाद इकट्ठा ।
    नोट: यथा-शुद्धि बायोटिन-& #955;-DNAs ते में बफर स्थिर होते हैं-20 & #176; C एक वर्ष तक के लिए ।
< p class = "jove_title" > 2. Coverslip functionalization

< p class = "jove_content" > नोट: ग्लास coverslips silane-खूंटी-बायोटिन के साथ प्रतिक्रिया द्वारा कार्यात्मक हैं । यह एक-चरणीय प्रतिक्रिया प्रोटोकॉल मानक दो-चरणीय रिएक्शन प्रोटोकॉल < सुप वर्ग = "xref" > 20 से हमारे अनुभव में सरल और अधिक विश्वसनीय है. Coverslip functionalization with silane-खूंटी-बायोटिन streptavidin के लिए बाइंडिंग साइटें बनाता है और सोखना सतह के लिए गैर-विशिष्ट डीएनए और प्रोटीन Coverslip को कम करता है ।

  1. Sonicate 10 मिनट के लिए एक धुंधला जार के अंदर ९५% इथेनॉल में पांच नंबर 1 coverslips और फिर तीन बार के लिए ultrapure पानी से कुल्ला ।
    नोट: पांचवें coverslip टूटना के मामले में एक अतिरिक्त प्रदान करता है ।
  2. 1 एम KOH, 10 मिनट के लिए sonicate और फिर ultrapure पानी के साथ तीन बार कुल्ला के साथ धुंधला जार भरें ।
  3. दोहराएं 2.1-2.2 चक्र दो बार ।
  4. ड्राय द coverslips क्लीन ड्राय एन 2 गैस फ्लो.
  5. आगे साफ और coverslips 5 min.
    6. के लिए ९०० mTorr दबाव में एयर प्लाज्मा उपचार लगाने के द्वारा शुष्क
  6. coverslips 25 मिलीग्राम/एमएल silane-खूंटी-बायोटिन के साथ 2 ज के लिए कमरे के तापमान पर ९५% इथेनॉल में भंग । विशेष रूप से, सैंडविच ५० & #181; L silane-खूंटी-बायोटिन समाधान दो स्वच्छ शुष्क coverslips के बीच, और मशीन coverslip & #34; सैंडविच & #34; नीचे पानी के बारे में 10 मिलीलीटर के साथ एक बंद पिपेट टिप बॉक्स के अंदर (coverslips के साथ संपर्क में नहीं) विलायक वाष्पीकरण को कम करने के लिए ।
  7. ultrapure पानी के साथ अतिरिक्त खूंटी अणुओं को दूर धोने और स्वच्छ सूखी N 2 गैस प्रवाह के तहत खूंटी लेपित coverslips सूखी ।
    नोट: कार्यात्मक coverslips परिवेश स्थितियों के तहत तीन दिनों तक संग्रहित किया जा सकता है ।
< p class = "jove_title" > 3. फ्लो सेल निर्माण

< p class = "jove_content" > नोट: प्रवाह कोशिकाओं एक खूंटी कार्यात्मक coverslip और एक PDMS स्लैब के बीच पूर्व कटौती चैनलों के साथ एक डबल चिपकने वाला टेप सैंडविच द्वारा निर्माण कर रहे है प्रवेश और आउटलेट छेद युक्त । एकाधिक चैनल फ्लो सेल प्रति एकीकृत कर रहे हैं ।

  1. डिजाइन एक सीएडी सॉफ्टवेयर में प्रवाह चैनलों और चैनलों में कटौती (चौड़ाई, गहराई और प्रत्येक चैनल की लंबाई है 1, ०.१३ और 12 मिमी, क्रमशः) एक टेप कटर का उपयोग करके डबल चिपकने वाला टेप पर (आमतौर पर आठ चैनलों प्रवाह सेल प्रति एकीकृत कर रहे हैं) । प्रवाह चैनलों के रूप में टेप अवशिष्ट निकालें ।
  2. PDMS स्लैब बनाने के लिए, अच्छी तरह से crosslinking रिएजेंट के 5 जी के साथ PDMS के ४५ ग्राम मिश्रण (पर्याप्त बारह 5 मिमी मोटी PMDS स्लैब जो परिवेश परिस्थितियों में अनिश्चित काल के लिए संग्रहीत किया जा सकता है बनाने के लिए) एक मिक्सर का उपयोग कर, मिश्रण में डाल २ १० सेमी पेट्री व्यंजन, और छोड़ एक निर्वात चैंबर के अंदर व्यंजन जब तक अनिवार्य रूप से सभी हवाई बुलबुले (मैंयुअल रूप से हवा के बुलबुले हटा अगर किसी भी रह जब बर्तन निर्वात चैंबर से हटा रहे हैं) चला रहे हैं । फिर व्यंजन को एक ८० & #176; C ओवन जब तक PDMS जम (लगभग 2 घंटे) में हस्तांतरण ।
  3. एक PDMS स्लैब है कि पूर्व के साथ डबल चिपकने वाला टेप के आकार से मेल खाती कटौती चैनलों काट दिया । छील एक संरक्षण डबल चिपकने वाला टेप से फिल्म और PDMS स्लैब का एक फ्लैट चेहरे पर फिल्म का पालन । पंच आउटलेट और PDMS स्लैब पर प्रवेश छेद एक बायोप्सी छेद का उपयोग कर-एक 23 गेज सुई के साथ पंच.
  4. डबल चिपकने वाला टेप से दूसरे संरक्षण फिल्म छील और coverslip की कार्यात्मक सतह के लिए PDMS टेप विधानसभा का पालन (सुनिश्चित करें कि coverslip फ्लैट है । < मज़बूत वर्ग में पूरी तरह से इकट्ठे फ्लो सेल का एक चित्र देखें = "xfig" > फिगर 1a ).
< p class = "jove_title" > 4. TIRF इमेजिंग

< p class = "jove_content" > नोट: बायोटिन-& #955;-DNAs एक प्रवाह चैनल सतह के लिए सीमित कर रहे हैं और लामिना प्रवाह डीएनए अणु खिंचाव प्रवाह करने के लिए लागू किया जाता है (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1b ). द & #62; ८०% तनी डीएनए अणुओं फ्लोरोसेंट लेबल अणुओं की बाध्यकारी और परिवहन गतिविधि को देख के लिए विशेष रूप से विस्तारित टेम्पलेट्स के रूप में सेवा करते हैं । एकल अणुओं के पथ समय-चूक TIRF इमेजिंग द्वारा ट्रैक किए जाते हैं (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 1c & #38; ई ).

  1. एक खुर्दबीन स्टेज पर फ्लो सेल फिक्स और लोड पूर्व degassed खाली बफर (10 मिमी सोडियम फॉस्फेट, 2 mm NaCl, ५० & #181; M EDTA, 20 mm इथेनॉल, 5% (v/v) ग्लिसरॉल, ०.०१% के बीच-20, 1% (v/v) & #946;-mercaptoethanol, pH ७.४), ०.२ mg/मब streptavidin सॉल्यूशन, 1 mg/ एमएल गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) समाधान और १०० pM बायोटिन-& #955;-चार जलाशयों में डीएनए समाधान है कि प्रत्येक एक Tygon टयूबिंग एक solenoid मूल्य और एक और Tygon छोटे झांकना टयूबिंग पर ढांकना टयूबिंग Tygon द्वारा एक तिरछी टयूबिंग से जुड़े ट्यूबिंग से जुड़ा है ( रिएजेंट्स की backflow रोकता है) । Degas वैक्यूम या कम जोखिम के लिए रात भर जोखिम से बफर की छोटी मात्रा में सरगर्मी के साथ निर्वात (जब तक बुलबुले अब दिखाई नहीं हैं).
  2. प्रवाह सेल के एक प्रवेश छेद में रिक्त बफर जलाशय की तिरछी टयूबिंग संमिलित करें । प्रधानमंत्री खाली बफर में बह रही द्वारा चैनल, और प्रवेश छेद में तीन अन्य तिरछी नज़र टयूबिंग डालने प्रत्येक एजेंट के हवा के दबाव चालित प्रवाह एक कंप्यूटर स्क्रिप्ट के माध्यम से solenoid वाल्व और पूरी तरह से स्वचालित द्वारा नियंत्रित किया जाता है । चैनल में हवा बुलबुला गठन प्रेरित करने के लिए नहीं सावधान रहना.
  3. एक अपशिष्ट कंटेनर के आउटलेट छेद से एक छोटी तिरछी नज़र टयूबिंग के साथ एक Tygon टयूबिंग कनेक्ट । आउटलेट पर लघु झांकना टयूबिंग चैनल के अंदर सकारात्मक दबाव को बनाए रखने से अर्क के दौरान हवा बुलबुला गठन को दबाने में मदद करता है ।
  4. tethering बायोटिन-& #955;-एक प्रवाह चैनल सतह के लिए डीएनए अणुओं.
    1. प्रवाह में ०.२ मिलीग्राम/एमएल streptavidin समाधान, 5 मिनट के लिए मशीन और फिर खाली बफर में प्रवाह को बाहर असीम streptavidin धो लो ।
    2. में प्रवाह 1 मिलीग्राम/एमएल BSA समाधान, 1 मिनट के लिए मशीन, और फिर खाली बफर में प्रवाह के लिए असीम BSA बाहर धोने ।
      नोट: BSA आगे डीएनए को रोकता है और सतह के लिए नमूना सोखना.
    3. प्रवाह में १०० बजे बायोटिन-& #955;-डीएनए समाधान, 10 मिनट के लिए मशीन और फिर खाली बफर में प्रवाह के लिए असीम DNAs बाहर धोने ।
      नोट: के बाद डीएनए सतह के लिए बाध्य है, तेजी से प्रवाह से बचने के लिए सीमित डीएनए अणुओं को नुकसान को रोकने के ।
  5. कार्यात्मक coverslip की गुणवत्ता की जांच करने के लिए, डीएनए धुंधला रंग में प्रवाह परख शर्तों के तहत Sytox ऑरेंज के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए (नीचे ४.६ पढ़ें), और ५३२ एनएम लेजर रोशनी के तहत प्रतिदीप्ति इमेजिंग शुरू ।
    नोट: कार्यात्मक coverslip की गुणवत्ता आमतौर पर अच्छा है और प्रवाह का घनत्व फैला डीएनए अणुओं उच्च हो जाएगा । यह प्रवाह का एक उच्च पर्याप्त घनत्व है डीएनए अणु फैला है ताकि डीएनए बाध्यकारी और फिसलने/1 डी प्रसार की घटनाओं को देखा जा सकता है आवश्यक है ।
  6. ठीक धुन TIRF कोण फैला डीएनए अणुओं की छवियों के शोर अनुपात के लिए सबसे अच्छा संकेत प्राप्त करने के लिए (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 डी ).
  7. एक डीएनए के साथ चलती अणुओं के रिकॉर्ड पथ को दोहराने के लिए, एक नए चैनल के अंदर कदम 4.2-4.4 (डीएनए धुंधला डाई) के बिना, तो पूर्व degassed उप-nanomolar fluorophore एक उच्च पर्याप्त प्रवाह दर पर अणुओं लेबल एक सिरिंज पंप का उपयोग करके और १०० हर्ट्ज के एक फ्रेम दर के साथ समय चूक प्रतिदीप्ति छवियों को इकट्ठा.
    नोट: एक प्रवाह दर एक Weissenberg संख्या के बराबर (Wi: सबसे लंबे समय तक बहुलक छूट समय का क्वांटिटी उत्पाद-लगभग ०.२ s for & #955;-डीएनए-और कतरनी दर-coverslip सतह से दूरी के साथ प्रवाह वेग में परिवर्तन) के अंदर ५०० के चैनल एकल अणु इमेजिंग के लिए १०० की एक फ्रेम दर के साथ सिफारिश की है हर्ट्ज < सुप वर्ग = "xref" > २१ .
    1. एक फिल्म का उत्पादन करने के लिए एक क्षेत्र के दृश्य (FOV) में १०,००० फ्रेम इकट्ठा, और नमूना प्रति FOVs एकाधिक (आम तौर पर दस) से इसी तरह की फिल्मों को इकट्ठा ।
      नोट: एक FOV में एकल कणों का घनत्व न तो बहुत अधिक होना चाहिए-जो डेटा विश्लेषण जटिल फ्रेम भर में वस्तु काम कर अस्पष्ट है, और न ही बहुत कम-जो डीएनए पर एकल अणु की घटनाओं की कम घटना को जंम दे सकता है ।
    2. रोशनी की तीव्रता का अनुकूलन इतना है कि coverslip सतह से बंधे अणुओं जल्दी फोटो प्रक्षालित कर रहे है पृष्ठभूमि को दबाने जबकि डीएनए पर प्रसार अणुओं ब्लीच भी जल्दी नहीं कर रहे है ताकि अब पथ का पता लगाया जा सकता है ।
      नोट: हम आम तौर पर उपयोग २००-८०० W/cm 2 पावर घनत्व में FOV.
    8. कदम ४.६ के अंत में
  8. , डीएनए धुंधला डाई को पुष्टि करने के लिए कि डीएनए अणु अभी भी प्रवाह किया जा सकता है बढ़ाया ।
  9. सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण नमूने दोनों चलाते हैं ।
    नोट: एक अच्छा सकारात्मक नियंत्रण एक tetrapeptide है, TetraMethylRhodamine (टीएमआर)-KRRR (टीएमआर एन-टर्मिनल अमीन के लिए युग्मित है) जो १०.५ & #177 का एक मतलब 1 डी प्रसार स्थिरांक है; ०.७ (मानक त्रुटि) M (बीपी 2 /तटस्थ पीएच < सुप क्लास = "xref" > 11 . एक अच्छा नकारात्मक नियंत्रण के लिए एक चैनल है कि कोई डीएनए सीमित है, जहां पर कोई डीएनए प्रसार गतिविधि का पता लगाया जाना चाहिए है में परख बफर में ब्याज की लेबल के नमूनों को मापने के लिए है ।
< p class = "jove_title" > 5. डेटा विश्लेषण:

< p class = "jove_content" > NOTE: & #160; एक कस्टम एकल कण ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर के साथ डीएनए और अनुमान प्रसार स्थिरांक फैलाना अणुओं के पथ की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस सॉफ्टवेयर पहले उच्च सटीकता के साथ एकल कणों के केन्द्रक पदों को निर्धारित करता है, coverslip सतह पर अटक कर रहे हैं कि कणों की पहचान, और फिर समय चूक पथ बनाने के लिए विभिन्न फ्रेम में कणों लिंक. इन पथ से, 1 डी प्रसार स्थिरांक अनुमानित हैं ।

  1. डेटा विश्लेषण शुरू करने के लिए, एक पटकथा सॉफ्टवेयर खोलें (सामग्री की तालिका देखें) और एक कण ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर की निर्देशिका में जाना । & #34 नाम की स्क्रिप्ट खोलें; largedataprocess3. m & #34;. एक महत्वपूर्ण पैरामीटर को परिभाषित किया जा करने के लिए एक कण का पता लगाने के लिए थ्रेशोल्ड मान है ।
  2. अधिकतम थ्रेशोल्ड मान निर्धारित करने के लिए, & #34;D etermine_threshold_value. m & #34; स्क्रिप्ट चलाएं । यह स्क्रिप्ट कैसे थ्रेशोल्ड मान एकल कण का पता लगाने को प्रभावित करता है इंगित करेगा । इष्टतम थ्रेशोल्ड मान निर्धारित करने के बाद, चलाएँ & #34; largedataprocess3 & #34; script.
  3. एकल कण ट्रैकिंग विश्लेषण के पूरा होने के बाद, कच्चे पथ फिल्टर & #34 को चलाकर; Trajectory_filtering. m & #34; लिपि. कोई ग्राफ़िक उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस (GUI) फ़िल्टरिंग चरण को विज़ुअलाइज़ करने के लिए अंतर्निहित है ।
    4. GUI पैनल पर
  4. , डीएनए के साथ न्यूनतम विस्थापन सेट, MinXDisp, 2 पिक्सल के लिए, डीएनए के लिए अधिकतम विस्थापन अनुप्रस्थ सेट, MaxYDisp, करने के लिए 2 पिक्सल; फ़्रेम, minFrames, 10 की ंयूनतम संख्या सेट करें; triplet, minTriplets, के लिए राज्यों की ंयूनतम संख्या सेट करें 10; डीएनए के साथ न्यूनतम प्रसार निरंतर सेट करें, D_par, 0 करने के लिए; अधिकतम अनुमानित प्रसार निरंतर अनुप्रस्थ डीएनए, D_trans करने के लिए सेट करें, 10 एम (बीपी 2 ) एस -1 ; न्यूनतम सांख्यिकीय पैरामीटर सेट करें, ची 2 _stat, को-5; डीएनए के लिए है कि अनुप्रस्थ डीएनए के साथ विस्थापन के ंयूनतम अनुपात सेट, ढीठ/ नोट: इन फ़िल्टरिंग पैरामीटर्स पास सभी अपुष्ट पथ तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं, और जो नहीं तालिका 3.
    5. में सूचीबद्ध नहीं है
  5. 1 तालिका में एक पथ संख्या पर क्लिक करें, पथ ग्राफिक्स 1 & #38; 2 में विस्थापित किया जाएगा । raw प्रतिदीप्ति images चलाने के लिए & #34;P िरे & #34; बटन पर क्लिक करें । पर क्लिक करें & #34; Add_to_Table2 & #34; एक एकल अणु फिसलने पथ के रूप में पथ की पहचान करने के लिए । अंत में, सभी पथ Table2 करने के लिए जोड़ा गया जब जीयूआई को बंद करने को बचाया जाएगा.
  6. अर्थ प्रसार स्थिरांक की गणना करने के लिए, स्क्रिप्ट चलाएं & #34; Calculate_mean_diffusion_constant. m & #34;. मतलब प्रसार लगातार पथ है कि सभी फ़िल्टरिंग कदम पारित कर दिया है और 2.
    7. तालिका में जोड़ा गया है के सेट से अनुमान लगाया गया है

Representative Results

चित्र 2a pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF का पता लगाया पथ दिखाता है; Cy3B cysteine अवशेषों को संयुग्मित है) 2 मिमी NaCl बफर में डीएनए पर पीएच ६.५ में फैलाना अणुओं । pVIc के प्रसार द्वि-दिशात्मक और परिवेश थर्मल ऊर्जा से प्रेरित है । इन पथ से, 1 डी प्रसार स्थिरांक (D1 मान) प्रत्येक पथ के लिए अनुमानित है ( चित्र bमें हिस्टोग्राम देखें) । इस pVIc संयुग्म का मतलब d1 मान २२.२ ± ०.९ (मानक त्रुटि) एम (बीपी2/4) के लिए प्रत्येक पथ में समाहित triplet लगातार स्थिति कॉल की संख्या से भारित पथ भर में प्रत्येक D1 मूल्य औसत द्वारा गणना की है ।

Figure 1
चित्र 1 : डीएनए के साथ एकल अणुओं की गति पर नज़र रखने के लिए उपकरण ।
क) एक आठ चैनल PDMS microfluidic चिप एक कार्यात्मक coverslip करने के लिए जो डीएनए (स्केल के लिए संयुक्त राज्य अमेरिका तिमाही सिक्का के साथ) सीमित किया जा सकता का पालन; ख) प्रवाह सेल ज़ूम योजनाबद्ध दिखा प्रवाह-तनी λ-डीएनए अणुओं; ग) डीएनए खींच के लिए TIRF माइक्रोस्कोप और प्रवाह प्रणाली की योजनाबद्ध; घ) एक प्रवाह-तनी λ-डीएनए की TIRF छवि; ङ) TIRF image of pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B cysteine अवशेषों को संयुग्मित है) एक प्रवाह-तनी λ-डीएनए से बंधे अणुओं । इस आंकड़े को अनुमति2,12के साथ संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : डीएनए के साथ pVIc (GVQSLKRRRCF) के एक आयामी प्रसार ।
a). pVIc के प्रसार के साथ प्रवाह λ-DNAs (१३७ पथ) में 2 मिमी NaCl बफर में पीएच ६.५ । एक्स (टी) और वाई (टी) के साथ विस्थापन कर रहे है और अनुप्रस्थ λ-डीएनए, क्रमशः । डॉटेड क्षैतिज रेखाएं डाई ब्लिंकिंग के परिणामस्वरूप अनुपलब्ध बिंदुओं को इंगित करती हैं । ख). प्रसार के हिस्टोग्राम लगातार, λ के साथ pVIc प्रसार के लिए D1-DNAs । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

जब पारंपरिक दो कदम coverslip functionalization प्रतिक्रिया प्रोटोकॉल से एक एक कदम प्रतिक्रिया प्रोटोकॉल के लिए स्विचन, हमने देखा है कि coverslip functionalization की विश्वसनीयता काफी सुधार हुआ है । के रूप में कुल हाथ coverslip तैयारी के लिए समय पर तीस मिनट से कम है, हम ताजा coverslips प्रत्येक दिन एकल अणु इमेजिंग की तैयारी की योजना बनाई है की सिफारिश । silane-खूंटी-बायोटिन की गिरावट को कम करने के लिए, रिएजेंट aliquoted किया जाना चाहिए और सूखी एन2 गैस के तहत-20 डिग्री सेल्सियस पर रसीद पर संग्रहीत । यहां हम खूंटी अणुओं है कि उत्पादन के सीओओ- या-CH3 टर्मिनल समूहों है कि पिछले20में इस्तेमाल किया गया है का उपयोग नहीं करते । -सीओओ- समूहों और hydrophobic-CH3 समूहों के नकारात्मक प्रभार के लिए डीएनए अणुओं और विशिष्ट प्रोटीन नमूनों की सतह के लिए गैर विशिष्ट सोखना को रोकने के लिए उपयोग किया गया, क्रमशः । हम पूरी तरह से बायोटिन-समाप्त खूंटी की सतह पर छोटे पेप्टाइड नमूनों द्वारा बहुत कम सतह सोखना का निरीक्षण, जबकि silane-खूंटी-COOH और/या silane-खूंटी-CH3 कुछ प्रोटीन नमूनों की परख के लिए उपयोगी हो सकता है या जब परख शर्तों (जैसे पीएच & #60; ७.५) डीएनए सतह बातचीत को बढ़ावा देने के ।

PDMS प्रवाह कोशिकाओं को ग्लास स्लाइड प्रवाह कोशिकाओं से बदलाव प्रवाह सेल निर्माण की गति और कई चैनलों के आसान एकीकरण की अनुमति देता है । हम अक्सर कार्यात्मक coverslip प्रति आठ स्वतंत्र प्रयोगों को सक्षम करने के लिए प्रवाह सेल प्रति आठ चैनलों इंजीनियर. coverslip प्रति प्रवाह को बढ़ाने के लिए, माइक्रो-गढ़े चैनलों की भी बड़ी संख्या का इस्तेमाल किया जा सकता है ।

यह प्रारंभिक भरने के बाद किसी भी बिंदु पर चैनल के अंदर हवा बुलबुला गठन को रोकने के लिए सलाह दी जाती है । आमतौर पर, हवा बुलबुले सीमित DNAs के नुकसान का कारण नहीं है (हालांकि यह संभव है), बल्कि प्रवाह को बाधित और संभवतः कारण DNAs coverslip करने के लिए छड़ी करने के लिए । बफर degassing और छोटे surfactant मात्रा के अलावा आमतौर पर टयूबिंग और फ्लो चैनल के भीतर बुलबुला गठन को रोकने में प्रभावी रहे हैं । मामलों में जहां हवा के बुलबुले टयूबिंग करने के लिए पेश कर रहे हैं, एक धीमी प्रवाह के तहत बाहर बुलबुले फ्लश और सुनिश्चित करें कि वे क्षेत्र जहां DNAs सीमित कर रहे है के माध्यम से प्रवाह नहीं है बनाने की कोशिश करो ।

एक सुव्यवस्थित और कुशल डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर महत्वपूर्ण है, उत्पंन डेटा की भारी मात्रा के कारण । हम आमतौर पर माप से एक फ्लो सेल पर ७००,००० उच्च संकल्प छवियों को इकट्ठा, जो एक quad-कोर प्रोसेसर और ३२ Gb स्मृति के साथ एक डेस्कटॉप कंप्यूटर पर एक दिन के भीतर हमारे कस्टम एकल कण ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग संसाधित किया जा सकता है । सॉफ्टवेयर द्वारा 1 डी प्रसार पथ का पता लगाने की झूठी सकारात्मक दर (५.५ कदम) नमूना निर्भर है और काफी कम दिया जा सकता है कि: 1) FOV में एक कणों का घनत्व काफी कम है इतना है कि वहाँ थोड़ा अस्पष्टता फ्रेम भर में कणों को जोड़ने है ( सामांय में प्रोटीन के नमूनों और अधिक से coverslip के लिए विशिष्ट सोखना के लिए प्रवण है पेप्टाइड नमूनों, और इस प्रकार, बफर और प्रत्येक प्रोटीन नमूने के लिए बिजली घनत्व को अनुकूलित करने की जरूरत है); 2) एकल कणों के शोर अनुपात करने के लिए संकेत पर्याप्त उच्च है ताकि कणों की झूठी पहचान की संभावना कम है । फिर भी, सॉफ्टवेयर सामयिक गलतियां कर सकते हैं, और हम प्रदान की जीयूआई का उपयोग करने सॉफ्टवेयर प्रदर्शन का मूल्यांकन डेटा के मैनुअल निरीक्षण की सिफारिश । एक आवेदन में विशेष रूप से झूठी-सकारात्मक पथ का पता लगाने के लिए संवेदनशील, थ्रेसहोल्ड मूल्य सहित प्रक्रिया मापदंडों, minFrames, minTriplets, और ची2_stat और अधिक इसरो सच बंधन के लिए कम संवेदनशीलता की कीमत पर सेट किया जा सकता है घटनाओं और संभावित अधिक से अधिक पथ पहचान में सांख्यिकीय पूर्वाग्रह । हम यहां शेयर और वर्णन हमारे एकल मानकीकरण डेटा विश्लेषण विधियों की मदद करने और सर्वोत्तम प्रथाओं के बारे में चर्चा को उत्तेजित करने की आशा के साथ सॉफ्टवेयर ट्रैकिंग कण ।

हमारे प्रोटोकॉल, जो इमेजिंग के दौरान सतत प्रवाह की आवश्यकता के लिए डीएनए टेंपलेट अणुओं की तनी स्थिति बनाए रखने के लिए, द्रव प्रवाह डीएनए के साथ कुछ प्रोटीन के परिवहन पूर्वाग्रह सकता है टेंपलेट्स अगर वे एक hopping तंत्र से फैलाना या यदि hydrodynamic लेबल fluorophore की त्रिज्या बड़ी22,23है । जबकि इस तरह के पूर्वाग्रह मापा और सबसे डेटासेट में सही किया जा सकता है, एक छोटे से fluorophore के साथ लेबल प्रोटीन के परिवहन और एक फिसलने तंत्र द्वारा फैलाना आम तौर पर प्रवाह द्वारा एक detectable हद तक पक्षपातपूर्ण नहीं है2,4, 24. विशेष रूप से, डीएनए के साथ प्रोटीन के परिवहन पर प्रवाह वेग का असर डीएनए के साथ फैलाना प्रोटीन के तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है23. एक बारीकी से संबंधित वैकल्पिक दृष्टिकोण है कि प्रवाह के अभाव में माप सक्षम बनाता है डीएनए दोनों टर्मिनी में बायोटिन के साथ टेंपलेट्स कि क्षणिक प्रवाह में फैला रहे है और दोनों coverslip को समाप्त होता है जैसे कि डीएनए अणुओं में रहने के लिए सीमित विस्तारित कॉन्फ़िगरेशन जब प्रवाह बंद कर दिया जाता है25,26,27,28। डबल तार दृष्टिकोण प्रवाह मुक्त परिवहन प्रयोगों की अनुमति का लाभ है, लेकिन डीएनए टेम्पलेट अणुओं के दोनों सिरों को संशोधित करने की आवश्यकता है, tethering के दौरान सावधान प्रवाह नियंत्रण, और निस्र्पक दो सीमित साइटों के बीच की दूरी. इसके अलावा, एक अणु परख पर विषम तनाव और डीएनए के अणुओं भर में संरचना गतिशीलता के प्रभाव का आकलन किया जाना चाहिए ।

कुल मिलाकर, डीएनए के साथ अणुओं के 1 डी प्रसार का अध्ययन करने के अलावा, के रूप में एक अणु परख रिपोर्ट में कई इन विट्रो जैव रासायनिक और शारीरिक अध्ययन डीएनए लक्ष्य खोज प्रक्रियाओं सहित एकल अणु के स्तर पर लाभ कर सकते है प्रोटीन, डीएनए पर एंजाइमी गतिविधियों, और अधिक ।

निवारण

समस्या 1: प्रवाह चैनल रिसाव ।

समाधान: सबसे पहले, सुनिश्चित करें कि प्रवाह चैनलों के डिजाइन के आसपास और चैनलों के बीच सील करने के लिए कम से १.५ mm मार्जिन की अनुमति देता है; और फिर, प्रवाह सेल के विधानसभा के दौरान, सुनिश्चित करें कि संपर्क coverslip के बीच सतहों, डबल चिपकने वाला टेप और PDMS स्लैब फ्लैट, सूखी और मलबे से मुक्त कर रहे हैं, कि दबाव सील फार्म वर्दी है लागू है, और है कि सीलिंग आपरेशन है कमरे के तापमान पर प्रदर्शन किया ।

समस्या 2: सीमित DNAs का घनत्व बहुत कम है ।

समाधान: यह समस्या पैदा होती है जब खूंटी functionalization दक्षता कम है या डीएनए अणुओं बायोटिन के साथ कार्यात्मक नहीं कर रहे हैं. हमारे अनुभव से, सीमित डीएनए के घनत्व के लिए उच्च होना चाहिए & #62; coverslips से तैयार की ९०% ताजा या ठीक से संग्रहीत silane-खूंटी-बायोटिन रिएजेंट । मामलों में जब सीमित डीएनए का घनत्व बायोटिन की एक सिद्ध बैच के साथ कम है-λ-डीएनए, डीएनए tethering के दौरान खूंटी functionalization और streptavidin और बायोटिन-λ-डीएनए की सांद्रता के दौरान silane-खूंटी-बायोटिन की सांद्रता बढ़ाने की कोशिश । यदि यह विफल रहता है, खूंटी और streptavidin रिएजेंट बदलें ।

समस्या 3: DNAs छड़ी करने के लिए coverslip एकd प्रवाह द्वारा नहीं बढ़ाया जा सकता है ।

समाधान: यह समस्या भी पैदा कर सकते है जब खूंटी functionalization क्षमता कम है, और कम परख पीएच से बढ़ रहा है । अधिक BSA में बहने की कोशिश करो या पीएच स्थापना (८.० के लिए उदा) के लिए मदद करने के लिए डीएनए सोखना को दबाने की सतह (step 4.3.2) । यदि डीएनए सोखना एक विशेष परख हालत के तहत एक लगातार मुद्दा है, अप करने के लिए ९०% silane-खूंटी functionalization के दौरान पेग-COOH सहित प्रयास करें ।

डेटा विश्लेषण नोट्स:

हम कस्टम एकल कण ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए एकल डीएनए के साथ फैलाना अणुओं के पथ की पहचान, जिसमें से उनके 1 डी प्रसार स्थिरांक, D1 अनुमान कर रहे हैं । डेटा विश्लेषण में सुधार करने के लिए, हम रेडियल समरूपता एल्गोरिथ्म18 लागू कणों और सहप्रसरण आधारित अनुमानक19 का अनुमान लगाने के लिए 1 डी प्रसार स्थिरांक, जो नाटकीय रूप से समझौता किए बिना डेटा विश्लेषण ऊपर उड़ सटीकता. हम पहले नकली डेटा का विश्लेषण करके कस्टम सॉफ्टवेयर को मान्य11. प्रमुख कदम नीचे बताए गए हैं ।

कण पहचान:

इस कदम का पता लगाने और विभाजन कणों-विवर्तन-सीमित स्थानों-पृष्ठभूमि से के लिए है । सबसे पहले, विशेष रूप से बैंड-पास फ़िल्टर छवियों 3-5 पिक्सेल रेंज में कणों के संकेत को बढ़ाने के लिए (जो हमारे सिस्टम पर बिंदु-प्रसार समारोह के आकार से मेल खाती है) और फिर तीव्रता पर आधारित दहलीज (स्क्रिप्ट देखें: spt2_SD_sandbox. मी) ।

केन्द्रक असाइनमेंट

छवि सेगमेंट केवल पिक्सेल-स्तर स्थानिक रिज़ॉल्यूशन के अणुओं को स्थानीयकृत कर रहा है । बहुत उच्च परिशुद्धता के अणुओं स्थानीयकरण करने के लिए, रेडियल समरूपता सुपर संकल्प एल्गोरिथ्म को रोजगार18 ऊपर के रूप में फ़िल्टर छवियों के लिए । (इस विधि एक विश्लेषणात्मक गणना पर आधारित है और इस प्रकार काफी गणना के बोझ को कम कर देता है अंय लोकप्रिय उच्च सटीकता तरीकों जैसे 2d गाऊसी फिटिंग के साथ तुलना में (देखें स्क्रिप्ट: spt2_SD_sandbox. m).)

कण ट्रैकिंग:

समय के माध्यम से एक कण की गति को ट्रैक करने के लिए, हम फिर से एक ही कणों की पहचान के रूप में वे फ्रेम के बीच ले जाना चाहिए । हम दीक्षा, निमिष, और समाप्ति चरणों पर विचार करने के लिए एक पथ के घटक हो । हम मौजूदा फ्रेम में कणों की सीमा के अनुसार अधिकतम विस्थापन की अनुमति दी पिछले फ्रेम में प्रदर्शित होने के लिए आरै संपर्क । ऐसे मामलों में जहां एकाधिक लिंकेज संभव हैं, Jonker-Volgenant एल्गोरिथ्म का उपयोग वैश्विक रूप से इष्टतम लिंकेज सेट (स्क्रिप्ट: traceTraj4_kx. 3. m) देखने के लिए किया जाता है ।

D1 अनुमान:

पथ से D1 मान का अनुमान लगाने के लिए, हम सहप्रसरण-आधारित अनुमानक (CVE)19का उपयोग करें । एक विश्लेषणात्मक गणना के आधार पर, इस विधि और अधिक गणना कुशल और सांख्यिकीय से कठोर है जैसे कि मतलब चुकता विस्थापन के प्रतिगमन के रूप में अंय आमतौर पर इस्तेमाल किया तरीकों (स्क्रिप्ट देखें: runspt5_SD. m) ।

पथ फ़िल्टरिंग:

कुछ पथ में सतह से बंधे अणुओं को संपर्क के रूप में कलाकृतियों होते है और हटाया जाना चाहिए । हम डीएनए, अधिकतम विस्थापन अनुप्रस्थ डीएनए, पथ की ंयूनतम लंबाई, triplet लगातार पता लगाया पदों की ंयूनतम संख्या, और ंयूनतम संभाव्यता स्कोर (देखें Xiong एट अल 11 के समानांतर के रूप में कई सुविधाओं को लागू किया परिभाषा के लिए) कि करने के लिए डीएनए पर फैलाना अणुओं का प्रतिनिधित्व करने की संभावना के लिए एक न्यूनतम पक्षपाती पथ के सेट को अलग करने के लिए फ़िल्टर किया जा सकता है (देखें स्क्रिप्ट: sptViewFig2_update3x. m) ।

Disclosures

व्यापक संस्थान पेटेंट आवेदन है कि यहां प्रस्तुत काम के पहलुओं को शामिल फ़ाइल का चुनाव कर सकते हैं ।

Acknowledgments

हम प्रारंभिक इंस्ट्रूमेंटेशन सेटअप और परीक्षण के साथ सहायता के लिए टोनी Kulesa, रॉबिन Kirkpatrick और Evangelos Gatzogiannis धंयवाद । हम आगे महत्वपूर्ण लेखन मदद के लिए टोनी Kulesa धंयवाद और अनुकूलित एक कण सॉफ्टवेयर ट्रैकिंग का मूल्यांकन । यह काम स्टार्टअप फंडिंग और बरोज वेलकम फाउंडेशन से (पीसीबी के लिए) वैज्ञानिक इंटरफेस में एक कैरियर पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biotin labeled oligo, 5’-AGGTCGCCGCCC(A)20-biotin-3’ IDT Custom oligo synthesis Standard desalting purification is sufficient
λ-DNA New England Biolabs Inc. N3011S Make aliquots and minimize freeze-thaw cycle number
T4 DNA ligase and ligation reaction buffer New England Biolabs Inc. M0202S
Amicon centrifugal filter tubes with NMWL of 100k Dalton EMD Millipore UFC510008
No. 1 glass coverslips VWR 48393-106
Pure ethanol VWR 89125-186
Potassium hydroxide pellets Fisher Scientific P250-500
Plasma cleaner, model No. PDC-32G Harrick Plasma
Silane-peg-biotin Nanocs PG2-BNSL-5k Store at -20oC in dry nitrogen gas
A CAD software Autodesk AutoCAD
Double-adhesive tape Adhesive Applications 8512-2-DP/DL
Tape cutter, model No. CE5000-40-CRP Graphtec America
PDMS and crosslink reagent kit R.S. Hughes RTV615 CLEAR 010
Degassing chamber, model No. F42010-0000 BEL-ART Products
Mixer, model No. ARV-310 Thinky
Hole puncher, Harris Uni-Cores, Size 0.5 mm Harris Uni-Cores This can be substituted with a manual biopsy punch with a similar needle size
Tygon tubing Cole Parmer EW-06420-02 0.020" ID, 0.060"OD
Peek tubing Western Analytical PK007-031-Y 0.007" ID, 0.031"OD
Streptavidin New England Biolabs Inc. N7021S
Bovine serum albumin (BSA) New England Biolabs Inc. B9000S
Sytox orange nucleic acid stain Invitrogen S11368
Ti-E Microscope Nikon Microscope, camera, objective, dichroic mirror and bandpass filter can be substituted for similar equipment
100x Objective, NA/1.49, CFI Apo TIRF Nikon
CMOS camera Hammamatsu Orca Flash 4.0
Dichroic mirror Semrock FF560/659-Di01-25x36
Bandpass filter Semrock FF01-577/690-25
532 nm laser Rayscience Innovation Limited, Shanghai OEMLL-FN-532nm-C Select wavelength to correspond to stain of choice
Syringe pump Chemxy Fusion 200
TMR-KRRR, >=85% purity MIT Biopolymer lab
pVIc-Cy3B, HPLC purified A gift from Dr. Walter Mangel at Brookhaven National lab
Script programming software MathWorks Matlab
* see parts list for solenoid valves, computer interface, and assembly instructions at: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers

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References

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जैव रसायन १२८ अंक एकल अणु इमेजिंग डीएनए प्रवाह खींच TIRF इमेजिंग एक कदम प्रतिक्रिया coverslip functionalization PDMS प्रवाह सेल उच्च प्रवाह क्षमता एकल कण ट्रैकिंग एक आयामी प्रसार 1 डी प्रसार लगातार
एक सरल, मजबूत, और उच्च प्रवाह एकल अणु डीएनए के साथ अणुओं के परिवहन के अध्ययन के लिए परख कार्यांवयन खींच प्रवाह
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Xiong, K., Blainey, P. C. A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA. J. Vis. Exp. (128), e55923, doi:10.3791/55923 (2017).

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