Summary
פרוטוקול זה מדגים תפוקה גבוהה, עמיד ופשוט מולקולה בודדת מתיחה-זרימה assay עבור לומדת מימדי דיפוזיה (1 ד) של מולקולות לאורך הדנ א.
Abstract
אנו מתארים של תפוקה גבוהה, עמיד ופשוט מולקולה בודדת מתיחה-זרימה assay לימוד 1 י דיפוזיה של מולקולות לאורך הדנ א. ב הזה assay, coverslips זכוכית דקה הם functionalized בתגובה בשלב אחד עם silane-פג-ביוטין. תאים זרימה נבנות על ידי sandwiching של סרט דביק עם ערוצי חתוכות מראש בין coverslip functionalized של לוח PDMS המכיל חורים כניסת ו עודפים. ערוצים מרובים משולבים לתוך תא אחד זרימה, הזרימה של ריאגנטים לתוך כל ערוץ יכול להיות מלא אוטומטי, אשר באופן משמעותי מגדילה את התפוקה assay ומפחית הפעם תרגולים לכל וזמינותו. בתוך כל ערוץ, ביוטין-λ-DNAs הם ותשמרו על פני השטח, זרימה שכבתית מוחל על זרימה-מתיחה DNAs. מולקולות DNA נמתחים עד > 80% שלהם אורך מתאר ומגישים גם במרחב מורחב תבניות לימוד הפעילות מחייב ותעבורה של מולקולות fluorescently עם תוויות. מסלולים של מולקולות יחיד מתבצע על ידי הדמיה הכולל פנימי השתקפות קרינה פלואורסצנטית (TIRF) זמן לשגות. בתמונות raw ניתוח שימוש יעיל חלקיק יחיד מותאמות אישית תוכנת מעקב אוטומטית לזהות מסלולים של מולקולות יחיד לשדר לאורך הדנ א של אומדן קבועי דיפוזיה שלהם 1 י.
Introduction
בעיה ארוכת שנים בביולוגיה היא איך אנדוגני חלבונים שפועלים ב ספציפי אתרי הגנום יכול לאתר את המטרות הדנ א שלהם מספיק מהר על האורגניזם לשרוד ולהגיב באופן יעיל את הסביבה. מחקרים ארבעים השנים האחרונות הציע והנחה תמיכה במידה רבה ההשערה כי קינטיקה של ה-DNA מקד חיפוש על-ידי חלבון יכול להיות מואץ על ידי דיפוזיה שבה החלבון חלופות בין דיפוזיה 3D בכמויות 1 י דיפוזיה (כולל הזזה וסיבוב תהליכים) לאורך הדנ א1. כיום ידוע כי רבים החלבונים המעורבים הכונה, מטבוליזם חומצות גרעין ותהליכים אחרים מסוגלים מחליק על ה-DNA2,3,4,5,6,7 8, ,9. יתר על כן, מחקרים שנעשו לאחרונה דיווחו כי פפטידים קטן אפילו ניתן לאגד שקופיות על ה-DNA, עם היכולת לשאת מטען; לדוגמה, מולקולת חלבון או פריימר PCR, לאורך הדנ א10,11,12,13,14.
במהלך 15 השנים האחרונות, וזמינותו מתיחה-זרימה מולקולה בודדת כבר בשימוש נרחב ללמוד האיגוד לבין דיפוזיה של מולקולות לאורך הדנ א2,15,16. בסוג זה של assay, biotinylated כפול גדילי DNA מולקולות הם ותשמרו על פני השטח, זרימה שכבתית מוחל על זרימה למתוח את ה-DNA. > 80% נמתח DNAs משמשים כתבניות במרחב המורחבת לימוד פעילות איגוד ותעבורה של מולקולות המסומנת fluorophores איפה מסלולים של מולקולות יחיד לאורך ה-DNA מסומנים על-ידי קרינה פלואורסצנטית זמן לשגות הדמיה. במימוש שלנו, אופטימיזציה עבור הפארמצבטית וקלות השימוש, וזמינותו הזה מורכב חמישה שלבים עיקריים: הכנה של ביוטין-λ-DNA, coverslip functionalization, זרימה תא הבנייה, קרינה פלואורסצנטית הדמיה וניתוח נתונים. הפרוטוקולים הקודמים17, coverslips זכוכית דקה היו functionalized על ידי הראשון מגיבים עם (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) ולאחר מכן עם ריאגנטים אמין-תגובתי פוליאתילן גליקול (PEG) (למשל, NHS-פג-ביוטין) כדי ליצור שכבת פג המתנגד ספיחה לא ספציפית של רכיבים assay השטח coverslip. איכות functionalized coverslips היו תלויים במידה רבה איכות ריאגנטים פג ועל תנאי ריאקציה בכל שלב. פרוטוקול שלנו מתאר של פרוטוקול functionalization מפושטת ובנייה זרימה מולטיפלקס תא המחייב לא דבק נוזלי או לרפא את הזמן על תאי זרימה הימים הם מורכבים. נתאר גם על נתונים יעיל וחזק ניתוח הליך11 המבטל צעדים רגרסיה שהמפתחות אינטנסיבית על-ידי החלת שיטת סימטריה מוקדית centroid לוקליזציה18 ו דיפוזיה מבוססי המשותפת משערך קבוע19.
כאן, אנחנו מדווחים פשוטה, חזקים, מולקולה בודדת תפוקה גבוהה לזרום יישום assay מתיחה עם שיפורים משמעותיים שנעשו coverslip functionalization, זרימה תא בנייה וניתוח נתונים. בפרט, פיתחנו פרוטוקול functionalization coverslip בשלב אחד, שבו coverslips נקי. יבש להגיב ישירות עם silane-פג-ביוטין. פרוטוקול זה מפשט את ההכנה coverslip, משפר את המהימנות של איכות functionalized משטחים לעומת פרוטוקול תגובת סטנדרטי בן שני שלבים. אנו מתארים את השימוש coverslips אז-functionalized עם תאי זרימה PDMS מרובה ערוצים המאפשרים חיבורים לצנרת חזקים להתבצע ללא דבק. תאים זרימה אלה נוספות כוללות מרובים מבוקר-מחשב אינלטס עבור כל תא זרימה אשר מאפשרים זרימה מגיב אוטומטית לצמצם את זמן על הידיים במהלך ההתקנה ואת וזמינותו מוגברת התפוקה.
Protocol
1. הכנה של ביוטין-λ-DNA
הערה: ביוטין-λ-DNA מולקולות מוכנים על ידי נבדק התווית על-ידי ביוטין oligonucleotide, 5 '-AGGTCGCCGCCC(A) 20 - ביוטין - 3 ' כדי Λ-DNA מולקולות 20-
- הכנת 0.1 מ מ ביוטין שכותרתו oligo במאגר טה.
- חום 0.5 מ"ג/מ"ל λ-DNA מניות ב 65 ° C 60 s, ו לצלול לתוך קרח רטוב מיד.
הערה: כיבוי מהיר קירור מפחית λ-DNA concatemerization. - µL 100 פיפטה של הפתרון λ-DNA לתוך צינור microcentrifuge.
- 1 להוסיף µL של oligo 0.1 מ מ לתוך µL 9 מאגר טה.
- להוסיף 2 µL של הפתרון oligo הצינור microcentrifuge המכיל את λ-ה-DNA. לערבב ביסודיות.
הערה: Oligo קיים כ עודף טוחנת 12-fold מעל לקצה λ משלימים-DNA- - מחממים את התערובת λ-DNA/oligo-65 ° C 60 ס
- מגניב לאט את התערובת לטמפרטורת החדר.
הערה: שלב זה מאפשר את oligo anneal עד הסוף λ משלימים-DNA- - מניחים את התערובת על קרח. להוסיף µL 11 T4 DNA ליגאז התגובה מאגר (מאגר הסופי ריכוז 1 x). מערבבים בעדינות. לאחר מכן להוסיף 2 µL (800 יחידות) של האנזים ליגאז T4 DNA. מערבבים בעדינות.
- דגירה התערובת כבר שעתיים ב 16 ° C או ללון ב- 4 מעלות צלזיוס
- לטהר את המוצר באמצעות צינורות צנטריפוגלי מסנן עם הגבלת משקל מולקולרי הנומינלי של 100 kDa. באופן ספציפי, להעביר את התערובת שלב 1.9 לתוך צינור צנטריפוגלי מסנן צנטריפוגה ב 14,000 x g במשך 5 דקות, לשטוף עם מאגר טה µL 400 פעמיים, לאסוף את המוצר מטוהרים.
הערה: כמו לטהר ביוטין-λ-DNAs במאגר טה יציבים ב-20 ° C עד שנה אחת.
2. Coverslip functionalization
הערה: coverslips זכוכית דקה הם functionalized על ידי מגיבים silane-פג-ביוטין. פרוטוקול תגובת זה צעד אחד הוא פשוט יותר ואמינה יותר מהניסיון שלנו מאשר פרוטוקול תגובת שני שלבים תקן 20. Coverslip functionalization עם silane-פג-ביוטין יוצרת אתרי קישור עבור streptavidin וצמצום DNA לא ספציפית ו חלבון ספיחה השטח coverslip.
- Sonicate חמש coverslips מס ' 1 ב- 95% אתנול בפנים צביעת צנצנת 10 דקות, ואז לשטוף עם מים הנדסה גנטית עבור שלוש פעמים.
הערה: coverslip החמישי מספק רזרבי במקרה של שבירה. - למלא את הצנצנת מכתימים 1 מ' KOH, sonicate 10 דקות, ואז לשטוף עם מים הנדסה גנטית שלוש פעמים.
- חוזר מחזור 2.1-2.2 פעמיים.
- יבש על coverslips תחת יבש נקי וזרימת הגז 2 N.
- יותר נקי ויבש על coverslips על-ידי החלת טיפול פלזמה אוויר בלחץ 900 mTorr עבור 5 דק.
- דגירה coverslips עם 25 מ"ג/מ"ל silane-פג-ביוטין מומס באתנול 95% בטמפרטורת החדר במשך ה 2 במיוחד, כריך µL 50 silane-פג-ביוטין פתרון בין שני coverslips יבש ונקי, דגירה של coverslip " כריכים " בתוך קופסא עצה פיפטה סגור עם-10 מ"ל של מים בתחתית (לא בקשר עם coverslips) כדי למזער את אידוי הממס.
- לשטוף את עודף מולקולות פג עם יבש יתדות מצופה coverslips תחת נקי והמים הנדסה גנטית יבש זרימת גז 2 N.
הערה: coverslips functionalized ניתן לאחסן שלושה ימים בתנאים אמביינט.
3. זרימה הבנייה תא
הערה: זרימה תאים בנויים על-ידי sandwiching קלטת דבק כפול עם ערוצי חתוכות מראש בין יתד functionalized coverslip, לוח PDMS המכיל חורים כניסת ו עודפים. ערוצים מרובים משולבים לכל הזרימה תא.
- עיצוב ערוצי זרימת תוכנה CAD ולחתוך את הערוצים (רוחב, עומק ואורך כל הערוצים הם 1, 0.13 ו- 12 מ מ בהתאמה) בקלטת דבק כפול על-ידי שימוש בחותך הקלטת (בדרך כלל שמונה ערוצי משולבים בכל תא זרימה). להסיר שאריות הקלטת כדי ליצור את ערוצי זרימה.
- כדי להפוך לוחות PDMS, לערבב ביסודיות 45 גר' PDMS עם 5 g של ריאגנט crosslinking (מספיק להכנת 12 5 מ מ עבה כרונית לוחות יכול להיות מאוחסן באופן בלתי מוגבל בתנאים אמביינט) באמצעות מערבל, שופכים את התערובת לתוך שתי צלחות פטרי 10 ס מ, ולהשאיר מנות בתוך תא ואקום עד למעשה כל אוויר בועות נעלמו (באופן ידני להסיר בועות אוויר אם יישארו כאשר הכלים יוסרו מן החדר ואקום). ואז להעביר את הכלים לתנור 80 ° C עד PDMS עפור (כ ח 2).
- לגזור לוח PDMS התואם לגודל כפול-דבק עם ערוצי חתוכות מראש. סרט הגנה אחד קליפת לדבוק הסרט על פרצוף שטוח של לוח PDMS לסירוגין כפול-דבק. ניקוב החורים outlet, מפרץ צר על שולחן הניתוחים PDMS באמצעות ביופסיה-צעצועים עם מחט מד 23.
- לקלף סרט הגנה השני תוריד את המדבקה כפול-דבק וציות מכלול קלטת PDMS השטח functionalized של coverslip (ודא coverslip הוא שטוח. ראה תמונה של תא זרימה שהרכבתם איור 1a).
4. הדמיה TIRF
הערה: ביוטין-λ-DNAs הם קשור משטח ערוץ הזרימה, זרימה שכבתית מוחל על זרימה למתוח את מולקולות ה-DNA ( איור 1b). > 80% נמתח לשרת מולקולות DNA כתבניות במרחב מורחבת עבור התבוננות בפעילות האיגוד ותעבורה של מולקולות fluorescently עם תוויות. מסלולים של מולקולות יחיד מתבצע על ידי הדמיה TIRF בצילום מואץ ( איור 1 c & e).
- לתקן התא זרימה על מיקרוסקופ הבמה ואת עומס מראש degassed ריק מאגר (10 מ מ סודיום פוספט, 2 מ מ NaCl, 50 מיקרומטר EDTA, אתנול 20 מ מ 5% (v/v) גליצרול, 0.01% Tween-20, 1% (v/v) β-mercaptoethanol, pH 7.4), פתרון streptavidin 0.2 מ"ג/מ"ל, 1 מ ג / mL שור אלבומין (BSA) פתרון והפתרון 100 pM ביוטין-λ-DNA לתוך ארבעה מאגרים בכך אחד שיש אבובים Tygon מחובר ערך סולנואיד ו אבובים Tygon עוד מחובר לצנרת הצצה מאת sleeving הצנרת Tygon מעל (צינורות קטנים יותר הצצה מונע זרם אחורי של ריאגנטים). דגה כרכים קטנים של המאגר על ידי חשיפה לילה ואקום או חשיפה קצרה ואקום עם ערבוב (עד בועות אינן גלויות).
- מכניס הצנרת הצצה של המאגר המאגר ריק חור כניסה אחד של התא זרימה. פריים בערוץ מאת זורם במאגר ריק ולאחר הכנס שלושה צינורות אחרים להציץ לתוך חורים כניסת לחץ האוויר מונע זרימה של כל מגיב הוא נשלט על ידי ברזים, ולגמרי אוטומטית באמצעות סקריפט המחשב. להיזהר לא לגרום היווצרות בועות אוויר בערוץ.
- התחבר עם אבובים Tygon אבובים הצצה קצרה מן החור עודפים במיכל אשפה. הצנרת הצצה קצרה משקע החשמל עוזר לדכא היווצרות בועות אוויר במהלך העירוי על ידי שמירה על לחץ אוויר חיובי בתוך הערוץ.
- קשירת מולקולות ביוטין-λ-DNA על משטח ערוץ הזרימה.
- זרימה בפתרון streptavidin 0.2 מ"ג/מ"ל, תקופת דגירה של 5 דקות, ואז לזרום במאגר ריק לשטוף את streptavidin לא מאוגד.
- זרימה בפתרון 1 מ"ג/מ"ל BSA, תקופת דגירה של 1 דקות, וזרימה ואז במאגר ריק לשטוף את BSA לא מאוגד.
הערה: BSA נוסף מדכאת את ה-DNA, דוגמת ספיחה אל פני השטח. - זרימה בפתרון 100 pM ביוטין-λ-DNA, תקופת דגירה של 10 דקות, ואז לזרום במאגר ריק לשטוף את DNAs לא מאוגד.
הערה: לאחר ה-DNA מאוגדת אל פני השטח, למנוע זורם מהירה כדי למנוע נזק מולקולות DNA קשור.
- כדי לבדוק את איכות coverslip functionalized, זרימה ב- DNA צביעת צבע כגון Sytox כתום בתנאים assay כדי לשמש (קריאה 4.6 להלן), ולהתחיל פלורסצנטיות הדמיה מתחת 532 ננומטר לייזר תאורה.
הערה: איכות coverslip functionalized טובה בדרך כלל, הצפיפות של מולקולות DNA זרימה נמתח יהיה גבוה. זה חיוני כדי יש צפיפות גבוהה מספיק של מולקולות DNA זרימה נמתח כך יכול להיות שנצפו איגוד ה-DNA ואירועים דיפוזיה הזזה/1 יח. - פיין לכוון את זווית TIRF כדי להשיג את האות הטוב ביותר ליחס רעש של תמונות של מולקולות DNA נמתח ( איור 1 d).
- להקליט מסלולים של מולקולות יחיד נע לאורך ה-DNA, חזור על שלבים 4.2-4.4 בתוך ערוץ חדש (ללא DNA מכתימה את צבען), ולאחר מכן להשרות sub טרום degassed-nanomolar fluorophore שכותרתו מולקולות בספיקה גבוהה מספיק באמצעות מזרק משאבה ו לאסוף תמונות בצילום מואץ זריחה עם קצב מסגרות של 100 הרץ-
הערה: קצב זרימה שווה ערך למספר ויסנברג (אינטרנט: המוצר שהוא של הזמן הארוך ביותר פולימר הרפיה - כ 0.2 s עבור λ-DNA - וקצב הטיה - שינוי מהירות זרימה עם המרחק מפני הקרקע coverslip) של 500 בפנים ערוץ מומלץ עבור הדמיה מולקולה בודדת עם קצב מסגרות של 100 הרץ 21.- 10,000 לאסוף מסגרות באחד שדה-Of-View (FOV) כדי לייצר סרט, לאסוף סרטים דומים מן FOVs (בדרך כלל 10) מרובים עבור דגימה.
הערה: צפיפות החלקיקים יחיד FOV אחד צריך להיות אף גבוה מדי - אשר תגרום לסיבוך ניתוח נתונים על-ידי הפיכת הקצאה אובייקט מעבר מסגרות רב-משמעי, וגם לא נמוכה מדי - אשר עלול להוביל נמוך התרחשות של אירועים מולקולה בודדת על ה-DNA- - לייעל את עוצמת תאורה כך מולקולות שמאוגד אל פני השטח coverslip הם במהירות צילום קשה לדכא את הרקע בזמן הם מולקולות לשדר על ה-DNA לא מולבן מהר מדי, כך שניתן לאתר מסלולים ארוכים יותר.
הערה: אנחנו בדרך כלל משתמשים 200-800 W/cm 2 כוח צפיפות FOV.
- 10,000 לאסוף מסגרות באחד שדה-Of-View (FOV) כדי לייצר סרט, לאסוף סרטים דומים מן FOVs (בדרך כלל 10) מרובים עבור דגימה.
- בסוף שלב 4.6, להחדיר DNA צביעת צבע כדי לאשר במולקולות דנ א עדיין ניתן נמתח-זרימה.
- להפעיל שתי דוגמאות חיוביות ושליליות שליטה.
הערה: פקד חיובי טוב הוא tetrapeptide, TetraMethylRhodamine (TMR)-מעניין (TMR הוא מצמידים את N-מסוף amine) אשר יש קבוע דיפוזיה 1 י רשע של 10.5 ± 0.7 (שגיאה סטנדרטית) M (bp 2/s) ב- pH נייטרלי 11. פקד שלילית טובה היא למדוד דגימות שכותרתו עניין במאגר וזמינותו של ערוץ בעל אין דנ א קשורה, שבו אין פעילות ב- DNA דיפוזיה שיזוהו.
5. ניתוח נתונים:
הערה: חלקיק יחיד מותאמות אישית תוכנת מעקב זה המשמש לזיהוי מסלולים של מולקולות יחיד לשדר לאורך הדנ א מעריכים דיפוזיה קבועים. תוכנה זו קובע תחילה העמדות centroid של חלקיקים יחיד עם רמת דיוק גבוהה, מזהה חלקיקים התקועות בקרקע coverslip, וקישורים ואז חלקיקים במסגרות שונות כדי ליצור מסלולים זמן לשגות. מכל אלה מסלולים, מוערך הקבועים דיפוזיה 1 י.
- כדי להפעיל את ניתוח נתונים, פתח את תוכנת ה-scripting (ראה טבלה של חומרים), ללכת לספרייה של החלקיק בודד תוכנת מעקב. פתח את קובץ ה-script בשם " largedataprocess3.m ". פרמטר חשוב אחד יוגדר הוא ערך הסף לגילוי חלקיק בודד.
- כדי לקבוע את ערך הסף האופטימלי, להפעיל " Determine_threshold_value.m " ה-script. קובץ script זה יציין כיצד משפיעה על הסף גילוי חלקיק יחיד. לאחר קביעת הסף האופטימלי, להפעיל " largedataprocess3.m " script.
- לאחר סיום של חלקיק בודד עוקב אחרי ניתוח, לסנן את מסלולי raw על-ידי הפעלת " Trajectory_filtering.m " ה-script. ממשק משתמש גרפי (GUI) בנוי כדי להמחיש את השלב הסינון. לוח
- -GUI, מוגדר העקירה מינימלי לאורך ה-DNA, MinXDisp, 2 פיקסלים להגדיר העקירה מקסימלי רוחבי ל- DNA, MaxYDisp, ל- 2 פיקסלים; להגדיר את מספר מינימלי של מסגרות, minFrames, 10; להגדיר מספר מינימלי של מצבים של שלישיה, minTriplets, 10; הגדר את קבוע דיפוזיה מינימלית לאורך ה-DNA, D_par, 0; הגדר את קבוע דיפוזיה מקסימלי משוער רוחבי ל- DNA, D_trans, S 10 מ' (bp 2) -1; הגדר את פרמטר סטטיסטי מינימלי, צ'י _stat 2,-5; הגדר את יחס מינימלי של עקירה לאורך הדנ א הזה רוחבי ל- DNA, חוצפנית ש ל- 2-
הערה: כל מסלולי raw לעבור סינון פרמטרים אלה מפורטים בטבלה 1, ואת אלה שאינן מפורטות בטבלה 3. - לחץ על מסלול מספר 1 בטבלה, המסלול יהיה שנעקרו גרפיקה 1 & 2. לחץ על " משחק " לחצן לשחק את תמונות raw זריחה. לחץ על " Add_to_Table2 " כדי לזהות את המסלול כמו מולקולה בודדת הזזה מסלול. בסופו של דבר, כל מסלולי נוספו Table2 יישמרו בעת סגירת GUI.
- לחישוב הקבועים דיפוזיה מתכוון להריץ את הסקריפט " Calculate_mean_diffusion_constant.m ". קבוע דיפוזיה רשע מוערך של הסט של מסלולים אשר יש עבר את כל השלבים סינון נוסף שולחן 2-
Representative Results
איור 2a מציגה את מסלולי שזוהו של pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B היא מצומדת את השאריות ציסטאין) מולקולות לשדר על ה-DNA ב- 2 מ מ NaCl מאגר ב- pH 6.5. פעפוע של pVIc הוא דו כיווני, מונעים ע י הסביבה אנרגיה תרמית. מכל אלה מסלולים, מוערך הקבועים דיפוזיה 1 י (D1 ערכים) עבור כל מסלול (ראה ההיסטוגרמה באיור 2b). הממוצע D1 הערך של המספר הזה pVIc המשלים מחושבת להיות 22.2 ± 0.9 (תקן שגיאה) M (bp2/s) לפי ממוצע של כל ערך D1 לאורך מסלולים משוקלל על ידי מספר הקריאות עמדה רצופים שלישיה הכלול בכל מסלול.
איור 1 : מכשירי מעקב תנועה של מולקולות יחיד לאורך הדנ א.
a) PDMS שמונה ערוצים microfluidic שבב דבקה coverslip functionalized אשר דנ א יכולה להיות קשורה (עם מטבע רבע בארה על סולם); b) זורמים תא זום מפרטים טכניים מראה מתוח-זרימה λ-DNA מולקולות; ג) תיאור סכמטי של מיקרוסקופ TIRF ומערכת זרימת למתיחת DNA; ד) TIRF דימוי זרימה-נמתח λ-DNA; ה) TIRF תמונה של pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B היא מצומדת את השאריות ציסטאין) מולקולות מאוגדים נמתח-זרימה λ-DNA. איור זה השתנה עם הרשאה2,12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : דיפוזיה חד-ממדי של pVIc (GVQSLKRRRCF) לאורך הדנ א.
a). דיפוזיה של pVIc לאורך הזרימה נמתח λ-DNAs (137 מסלולים) במאגר NaCl 2 מ מ ב- pH 6.5. x(t) ו- y(t) הן displacements לאורך, רוחבי כדי λ-DNA, בהתאמה. קווים אופקיים מנוקד מצביעים על נקודות חסר הנובע לצבוע מהבהב. b). היסטוגרמה של קבוע דיפוזיה, D1 עבור pVIc לשדר לאורך λ-DNAs. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
כאשר מחליפים שני שלבים מסורתי coverslip functionalization התגובה פרוטוקול פרוטוקול תגובת בשלב אחד, הבחנו כי המהימנות של coverslip functionalization חל שיפור משמעותי. כמו הפעם תרגולים הכולל הכנה coverslip הוא פחות מ 30 דקות, אנו ממליצים על הכנת coverslips טריים הדמיה מולקולה בודדת בכל יום מתוכנן. כדי למזער את ההתדרדרות של silane-פג-ביוטין, הכימית צריך להיות aliquoted מאוחסנת מתחת יבש גז2 N ב-20 ° C עם קבלת. כאן אנחנו לא משתמשים מולקולות פג המייצרים -קו– או -CH3 קבוצות מסוף שימשו בעבר20. המטענים השליליים של -קו– קבוצות וקבוצות של הידרופובי -CH3 נוצלו כדי למנוע ספיחה לא ספציפית של מולקולות DNA ודוגמאות חלבון ספציפי אל פני השטח, בהתאמה. נתבונן ספיחה משטח נמוך מאוד על ידי דגימות פפטיד קטן על פני השטח פג באופן מלא המסתיימת ביוטין, בעוד silane-פג-COOH ו/או silane-פג-CH3 עשוי להיות שימושי עבור מבחני דגימות חלבון מסוים או כאשר assay תנאים (כגון pH < 7.5) לקדם את ה-DNA-פני אינטראקציות.
משמרת מתאי זרימה שקופיות זכוכית PDMS זרימת תאי האצת הבנייה תא זרימה ומאפשר אינטגרציה קלה של ערוצים מרובים. אנחנו לעיתים קרובות מהנדס שמונה ערוצי בכל תא תזרים ולאפשר 8 ניסויים עצמאית לכל functionalized coverslip. להמשיך להגדיל את תפוקת לכל coverslip, מספרים גדול עוד יותר של מיקרו-מפוברק ערוצים יכול לשמש.
מומלץ כדי למנוע היווצרות בועות אוויר בתוך הערוץ בשלב כלשהו לאחר מילוי הראשונית. בדרך כלל, בועות אוויר לא לגרום לאבדן קשור DNAs (למרות שזה אפשרי), אבל מעדיף לשבש את הזרימה, לגרום DNAs לדבוק coverslip. מאגר degassing, על התוספת של כמויות חומרים פעילי שטח קטן הם בדרך כלל יעיל במניעת היווצרות בועה בתוך התעלה אבובים וזרימה. במקרים בו בועות אוויר מוצגים בפני הצנרת, נסה לשטוף את הבועות תחת זרם איטי. ולוודא כי הן אינן זורמות דרך האזור שבו הם קשורה DNAs.
תוכנת ניתוח נתונים מפושטת ויעילה היא קריטית, בגלל הכמות העצומה של הנתונים נוצר. אנו אוספים בדרך כלל 700,000 תמונות ברזולוציה גבוהה של מדידות על זרימה אחד התא, אשר יכול להיות מעובד באמצעות שלנו חלקיק יחיד מותאמות אישית תוכנת מעקב תוך יום אחד במחשב שולחני עם ליבות מעבד ו 32 Gb זיכרון. שיעור חיובי כוזב של זיהוי 1 י דיפוזיה מסלולים על-ידי התוכנה (שלב 5.5) מדגם תלויות, יכולים להיות נמוכה למדי בהתחשב בכך: 1) צפיפות החלקיקים יחיד FOV הוא נמוך מספיק כך אי-בהירות הקטן קישור חלקיקים מעבר מסגרות ( דגימות חלבון באופן כללי נוטים יותר ספיחה ספציפי כדי coverslip מפפטיד דגימות, וטעמו לפיכך, המאגר ואת הצפיפות הכוח של כל חלבון צריך להיות מותאם); 2) את האות לרעש יחס של חלקיקים יחיד הוא מספיק גבוה כך הסבירות שווא-זיהוי החלקיקים היא נמוכה. ובכל זאת, התוכנה יכול לטעות מדי פעם, אנו ממליצים על בדיקה ידנית של נתונים באמצעות GUI שסופקו כדי להעריך את ביצועי התוכנה. ביישום של רגישות גבוהה במיוחד זיהוי חיובי-false מסלול, פרמטרים תהליך כולל את ערך הסף, minFrames, minTriplets _stat2צ'י ניתן להגדיר יותר והטכני במחיר של רגישות נמוכה יותר עבור איגוד אמיתי אירועים, הטיה סטטיסטית פוטנציאל גדול בזיהוי המסלול. . אנחנו כאן לחלוק. ומתארות שלנו חלקיק יחיד מעקב תוכנה עם תקווה לסייע לתקנן שיטות ניתוח הנתונים ולעורר דיון אודות שיטות עבודה מומלצות.
בפרוטוקול שלנו, אשר דורש זרימה רציפה במהלך הדימות לשמירה על מצב מתוח של מולקולות תבנית ה-DNA, זרימת הנוזלים יכולת הטיה התעבורה של חלבונים מסוימים לאורך תבניות DNA אם הם לפזר ע י מנגנון hopping או אם hydrodynamic רדיוס של fluorophore שכותרתו הוא גדול22,23. בזמן כזה הטיה ולהשוואה תוקנה ב- datasets רוב, התעבורה של חלבונים המסומנת fluorophore קטן, לשדר באמצעות מנגנון הזזה הוא לא בדרך כלל מוטה במידה לזיהוי על ידי זרימה2,4, 24. ראוי לציין, ההשפעה של מהירות הזרימה בטרנספורט של חלבונים לאורך הדנ א שימש כדי לחקור את המנגנונים של חלבון לשדר לאורך הדנ א23. A מקרוב הקשורים גישה חלופית המאפשר מדידות בהיעדרו של זרימה מנצל תבניות DNA עם ביוטין-שניהם טרמיני (termini) אשר נמתחים transiently זרימת ו קשורה על ידי שני הקצוות כדי coverslip כזה כי מולקולות DNA להישאר בבית תצורת מורחב כאשר הזרם כבויה25,26,27,28. הגישה כפול-הקשר יש את היתרון של ומאפשר ניסויים ללא זרימת התחבורה אך דורש שינוי בשני הקצוות של מולקולות תבנית ה-DNA, בקרת זרימה זהיר במהלך tethering, ואפיון של המרחקים בין שני האתרים עגינה. בנוסף, השפעת הטרוגניות המתחים ואת הדינמיקה הסתגלותי DNA מעבר מולקולות הדנ א על מולקולה בודדת וזמינותו חייב להיות מוערך.
כליל, בנוסף לומד 1 י דיפוזיה של מולקולות לאורך הדנ א, וזמינותו דיווח כמו מולקולה בודדת יכולים להפיק תועלת רבים במבחנה הביוכימי של מחקרים biophysical ברמת מולקולה בודדת כולל ה-DNA והתמקד תהליכי החיפוש על-ידי חלבונים, פעילויות אנזימטיות על ה-DNA ועוד.
פתרון בעיות
בעיה 1: הדליפה ערוצי זרימה.
פתרון: ראשית, ודא כי העיצוב של ערוצי זרימה מאפשר לפחות 1.5 מ מ שוליים עבור איטום מסביב ובין ערוצי; ואז, במהלך ההרכבה של התא זרימה, ודא כי משטחי מגע בין את coverslip, את כפול-דבק המתים PDMS הם שטוחים, יבש, ללא פסולת, כי הלחץ שהופעל כדי ליצור את החותם הוא אחיד, כי פעולת האטימה לבצע בטמפרטורת החדר.
בעיה 2: הצפיפות של DNAs קשור הוא נמוך מדי.
פתרון: בעיה זו מתעוררת כאשר פג functionalization יעילות נמוכה או מולקולות הדנ א הם לא functionalized עם ביוטין. מהניסיון שלנו, הצפיפות של DNA קשור צריך להיות גבוה עבור > 90% coverslips המוכן טרי או נשמרת כראוי ריאגנט silane-פג-ביוטין. במקרים כאשר הצפיפות של DNA קשור נמוך עם אוסף מוכחת של ביוטין-λ-DNA, לנסות להגביר ריכוז של silane-פג-ביוטין במהלך functionalization פג, ריכוזי streptavidin ביוטין-λ-DNA במהלך קשירת דנ א. ואם זה ייכשל, החלף את ריאגנטים פג ו- streptavidin.
בעיה 3: DNAs לדבוק coverslipלא יכול להיות מתח d על ידי זרימת.
פתרון: בעיה זו יכול גם להתעורר כאשר פג functionalization יעילות נמוכה, מועצמת על ידי pH וזמינותו נמוכה. נסה שתזרים BSA יותר או העלאת ה-pH (למשל ל- 8.0) לעזור לדכא את ה-DNA ספיחה אל פני השטח (שלב 4.3.2). אם ספיחה הדנ א הוא נושא מתמיד בתנאי מסוים assay, נסה כולל עד כדי 90% silane-פג-COOH במהלך functionalization פג.
הערות ניתוח נתונים:
אנו משתמשים מותאמות אישית חלקיק יחיד תוכנת מעקב לזיהוי מסלולים של מולקולות יחיד לשדר לאורך הדנ א, מ אשר קבועים דיפוזיה שלהם 1 י, D1 מוערך. כדי לשפר את ניתוח הנתונים, אנו ליישם אלגוריתם סימטריה מוקדית18 עבור לוקליזציה חלקיקי, מבוסס המשותפת משערך19 עבור הערכת 1 י דיפוזיה קבועים, אשר באופן דרמטי האיץ את ניתוח הנתונים מבלי להתפשר דיוק. אנחנו קודם לכן לאמת את התוכנה מותאמת אישית על-ידי ניתוח נתונים מדומה11. הצעדים העיקריים שיפורטו להלן.
זיהוי החלקיקים:
השלב זה עבור איתור של הממיין חלקיקים - מקומות מוגבל עקיפה - רקע. ראשית, במרחב הלהקה לעבור לסנן את התמונות כדי להגביר את האות של חלקיקים 3-5 טווח הפיקסלים (התואם לגודל של הפונקציה בנקודה-התפשטות במערכת שלנו) ואז סף בהתבסס על עוצמת (ראה קובץ script: spt2_SD_sandbox.m).
הקצאה centroid
רק הממיין את התמונה. רגישה מולקולות ברמת פיקסל רזולוציה מרחבית. כדי להתאים לשפה מולקולות רב ברמת דיוק גבוהה יותר, מעסיקים את סימטריה מוקדית אלגוריתם סופר רזולוציה18 תמונות מסונן כמפורט לעיל. (בשיטה זו מבוסס על חישוב אנליטיות, ובכך מפחית במידה רבה נטל חישובית לעומת שיטות אחרות-דיוק גבוהה פופולריים כגון התאמה לפי עקומת גאוס 2D (ראה קובץ script: spt2_SD_sandbox.m).)
חלקיק מעקב:
כדי לעקוב אחר המסלול של חלקיק דרך הזמן, אנו חייבים מחדש לזהות החלקיקים אותו כפי שהם מעבר בין מסגרות. אנו רואים בשלבים חניכה מהבהב, הפסקת להיות רכיבים של מסלול. אנחנו להגביל הצמדה של חלקיקים במסגרות הנוכחי לאלה המופיעים במסגרות קודמות על ידי המנוע המירבי המותר עבור כל מסגרת. במקרים בהם אפשר קישורים מרובים, האלגוריתם יונקר-Volgenant משמש להניב ערכות הצמדה באופן גלובלי אופטימלית (ראה קובץ script: traceTraj4_kx.3.m).
שערוך D1:
כדי להעריך D1 ערכים ממסלולים, אנו משתמשים משערך מבוססי השונות המשותפת (CVE)19. מבוסס על חישוב אנליטיות, שיטה זו יעילה יותר שהמפתחות, מבחינה סטטיסטית קפדני אחר נפוץ שיטות כמו רגרסיה של רשע displacements בריבוע (ראה קובץ script: runspt5_SD.m).
מסלול סינון:
מסלולים מסוימים מכילים פריטים כגון הצמדה משטח מכורך מולקולות ויש להסירו. אנחנו ליישם מספר תכונות כגון מקביל ל- DNA, רוחבי ל- DNA, אורך מינימלי של מסלול, מספר מינימלי של עמדות שלישיה רצופים זוהה, ואת הציון המינימלי הסתברות (ראה Xiong ואח11 המרבי תזוזה מינימלית הזחה להגדרת) אשר ניתן לסנן כדי לבודד ערכה מינימלית משוחד של מסלולים עשוי לייצג את מולקולות לשדר על ה-DNA (ראה קובץ script: sptViewFig2_update3x.m).
Disclosures
מכון רחבה עשויה לבחור קובץ לפטנטים הכוללים היבטי העבודה המוצגת כאן.
Acknowledgments
אנו מודים טוני Kulesa, רובין קירקפטריק, Gatzogiannis אוונגלוס לקבלת סיוע עם ההתקנה הראשונית מכשור ובדיקות. אנו מודים נוספים טוני Kulesa לעזרה משמעותית בכתיבה של הערכת החלקיק בודד מותאם אישית תוכנת מעקב. עבודה זו נתמכה על ידי אתחול מימון, פרס את הקריירה ב מדעי ממשק (PCB) של הקרן Wellcome בורוז.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotin labeled oligo, 5’-AGGTCGCCGCCC(A)20-biotin-3’ | IDT | Custom oligo synthesis | Standard desalting purification is sufficient |
| λ-DNA | New England Biolabs Inc. | N3011S | Make aliquots and minimize freeze-thaw cycle number |
| T4 DNA ligase and ligation reaction buffer | New England Biolabs Inc. | M0202S | |
| Amicon centrifugal filter tubes with NMWL of 100k Dalton | EMD Millipore | UFC510008 | |
| No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-106 | |
| Pure ethanol | VWR | 89125-186 | |
| Potassium hydroxide pellets | Fisher Scientific | P250-500 | |
| Plasma cleaner, model No. PDC-32G | Harrick Plasma | ||
| Silane-peg-biotin | Nanocs | PG2-BNSL-5k | Store at -20oC in dry nitrogen gas |
| A CAD software | Autodesk | AutoCAD | |
| Double-adhesive tape | Adhesive Applications | 8512-2-DP/DL | |
| Tape cutter, model No. CE5000-40-CRP | Graphtec America | ||
| PDMS and crosslink reagent kit | R.S. Hughes | RTV615 CLEAR 010 | |
| Degassing chamber, model No. F42010-0000 | BEL-ART Products | ||
| Mixer, model No. ARV-310 | Thinky | ||
| Hole puncher, Harris Uni-Cores, Size 0.5 mm | Harris Uni-Cores | This can be substituted with a manual biopsy punch with a similar needle size | |
| Tygon tubing | Cole Parmer | EW-06420-02 | 0.020" ID, 0.060"OD |
| Peek tubing | Western Analytical | PK007-031-Y | 0.007" ID, 0.031"OD |
| Streptavidin | New England Biolabs Inc. | N7021S | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs Inc. | B9000S | |
| Sytox orange nucleic acid stain | Invitrogen | S11368 | |
| Ti-E Microscope | Nikon | Microscope, camera, objective, dichroic mirror and bandpass filter can be substituted for similar equipment | |
| 100x Objective, NA/1.49, CFI Apo TIRF | Nikon | ||
| CMOS camera | Hammamatsu | Orca Flash 4.0 | |
| Dichroic mirror | Semrock | FF560/659-Di01-25x36 | |
| Bandpass filter | Semrock | FF01-577/690-25 | |
| 532 nm laser | Rayscience Innovation Limited, Shanghai | OEMLL-FN-532nm-C | Select wavelength to correspond to stain of choice |
| Syringe pump | Chemxy | Fusion 200 | |
| TMR-KRRR, >=85% purity | MIT Biopolymer lab | ||
| pVIc-Cy3B, HPLC purified | A gift from Dr. Walter Mangel at Brookhaven National lab | ||
| Script programming software | MathWorks | Matlab | |
| * see parts list for solenoid valves, computer interface, and assembly instructions at: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers |
References
- Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. 1. Models and theory. Biochemistry. 20, 6929-6948 (1981).
- Blainey, P. C., van Oijen, A. M., Banerjee, A., Verdine, G. L., Xie, X. S. A base-excision DNA-repair protein finds intrahelical lesion bases by fast sliding in contact with DNA. P Natl Acad Sci USA. 103, 5752-5757 (2006).
- Leith, J. S., et al. Sequence-dependent sliding kinetics of p53. P Natl Acad Sci USA. 109, 16552-16557 (2012).
- Blainey, P. C., et al. Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space IV. Viral proteinase slides along DNA to locate and process its substrates. J Biol Chem. 288, 2092-2102 (2013).
- Graziano, V., et al. Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space II. Adenovirus proteinase is activated in an unusual one-dimensional biochemical reaction. J Biol Chem. 288, 2068-2080 (2013).
- Graziano, V., et al. Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: I. binding to DNA and to hexon of the precursor to protein VI, pVI, of human adenovirus. J Biol Chem. 288, 2059-2067 (2013).
- Baniecki, M. L., McGrath, W. J., Mangel, W. F. Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: III. atomic resolution structure of the nascent form of the adenovirus proteinase. J Biol Chem. 288, 2081-2091 (2013).
- Kabata, H., et al. Visualization of single molecules of RNA polymerase sliding along DNA. Science. 262, 1561-1563 (1993).
- Harada, Y., et al. Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time. Biophysical journal. 76, 709-715 (1999).
- Mangel, W. F., McGrath, W. J., Xiong, K., Graziano, V., Blainey, P. C. "Molecular sled"- vehicle of 11-amino acids that facilitates biochemical interactions via sliding components along DNA. Nature Communications. , (2016).
- Xiong, K., Blainey, P. C. Molecular sled sequences are common in mammalian proteins. Nucleic Acids Res. 44, 2266-2273 (2016).
- Xiong, K., Erwin, G. S., Ansari, A. Z., Blainey, P. C. Sliding on DNA: from peptides to small molecules. Angew. Chem. Int. Ed. 55, 15110-15114 (2016).
- Turkin, A., et al. Speeding up biomolecular interactions by molecular sledding. Chem Sci. 7, 916-920 (2016).
- Zhang, L., Zheng, L., Meng, Z., Balinin, K., Loznik, M., Herrmann, ,A. Accelerating chemical reactions by molecular sledding. Chem Commun (Camb). 47, 6331-6334 (2017).
- van Oijen, A. M., et al. Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder. Science. 301, 1235-1238 (2003).
- Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging. Langmuir. 24, 10524-10531 (2008).
- Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., Oijen, A. M. V. Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay. J Vis. Expt. , e1689 (2010).
- Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nat Methods. 9, 724 (2012).
- Vestergaard, C. L., Blainey, P. C., Flyvbjerg, H. Optimal estimation of diffusion coefficients from single-particle trajectories. Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 89, 022726 (2014).
- Schroeder, C. M., Blainey, P. C., Kim, S., Xie, X. S. Hydrodynamic Flow-stretching Assay for Single-Molecule Studies of Nucleic Acid-Protein Interactions. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
- Blainey, P. C. Single-Molecule Studies of Protein-DNA Interaction: Diffusive Search and Sequence-Dependent Motors. , Harvard University. (2007).
- Gorman, J., Greene, E. C. Visualizing one-dimensional diffusion of proteins along DNA. Nat Struct Mol Biol. 15, 768-774 (2008).
- Lin, Y. H., et al. Using the Bias from Flow to Elucidate Single DNA Repair Protein Sliding and Interactions with DNA. Biophysical journal. 96, 1911-1917 (2009).
- Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nat Struct Mol Biol. 16, 1224-1234 (2009).
- Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H., Schroeder, C. M. Direct observation of TALE protein dynamics reveals a two-state search mechanism. Nat Commun. 6, 7277 (2015).
- Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H. M., Schroeder, C. M. TALE proteins search DNA using a rotationally decoupled mechanism. Nat Chem Biol. 12, 831-837 (2016).
- Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57, 179-186 (2012).
- Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Method Enzymol. 472, 293-315 (2010).
