Summary
Denne protokollen demonstrerer en enkel, robust og høy gjennomstrømning ett molekyl flyt-stretching analysen for å studere endimensjonal (1D) spredning av molekyler langs DNA.
Abstract
Vi beskriver en enkel, robust og høy gjennomstrømning ett molekyl flyt-stretching analysen for å studere 1D spredningen av molekyler langs DNA. I denne analysen, er glass coverslips functionalized i en ettrinns reaksjon med silane-PEG-biotin. Flyt celler er konstruert av sandwiching et limbånd med pre-cut kanaler mellom en functionalized dekkglassvæske og en PDMS plate som inneholder innløp og utløp hull. Flere kanaler er integrert i en flyt celle og flyten av reagenser i hver kanal kan være fullt automatisert, noe som vesentlig øker analysen og reduserer hands-on tid per analysen. Innenfor hver kanal, biotin-λ-DNAs er immobilized på overflaten og en laminær strømning brukes flyt strekke DNAs. DNA-molekyler er strukket til > 80% av sine omkrets og tjene som romlig utvidet maler for å studere og transport og aktiviteten til fluorescently merket molekyler. Baner av enkelt molekyler spores av time-lapse Total intern refleksjon fluorescens (TIRF) tenkelig. Rå bildene analyseres ved hjelp strømlinjeformet egendefinerte enkelt partikkel sporing automatisk identifisere baner enkelt molekyler spre langs DNA og beregne sine 1D diffusjon konstanter.
Introduction
Et langvarig problem i biologi er hvordan endogene proteiner som fungerer på spesifikke områder i genomet finner deres DNA mål raskt nok for organismen overleve og reagere effektivt omgivelsene. Studier de siste førti årene foreslått og i stor grad støtte hypotesen at the kinetics av DNA målet søk av et protein kan akselereres ved tilrettelagt diffusjon som protein veksler mellom 3D spredning i bulk og 1D diffusjon (inkludert skyve og hopper prosesser) langs DNA1. Det er nå kjent at mange proteiner involvert i genet regulering, nukleinsyre metabolisme og andre prosesser kan skyve på DNA2,3,4,5,6,7 ,8,9. Videre rapportert studier at selv små peptider kan binde til og skyv på DNA, muligheten til å bære en Last; for eksempel en protein molekyl eller PCR primer, langs DNA,10,,11,,12,,13,,14.
De siste 15 årene, har ett molekyl flyt-stretching analysen vært mye brukt bindende og spredningen av molekyler langs DNA2,15,16. I denne analysen, biotinylated double-strandet DNA molekyler er immobilisert til overflaten og en laminær strømning gjelder flyt strekke DNA. Den > 80% strukket DNAs tjene som romlig utvidet maler for å studere og transport og aktivitet av molekyler merket med fluorophores hvor baner av enkelt molekyler langs DNA spores av time-lapse fluorescens tenkelig. I gjennomføringen, optimalisert for reproduserbarhet og brukervennlighet, denne analysen består av fem hovedtrinn: utarbeidelse av biotin-λ-DNA, dekkglassvæske functionalization, flyt celle konstruksjon, fluorescens bildebehandling og dataanalyse. I tidligere protokoller17, var glass coverslips functionalized av første reagerer med (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) og deretter med Amin-reaktive polyetylenglykol (PEG) reagenser (f.eks NHS-PEG-biotin) å danne et PEG-lag som motstår Uspesifisert adsorpsjon analysen komponenter til dekkglassvæske overflaten. Kvaliteten på functionalized coverslips er i stor grad avhengig av kvaliteten på pinne reagenser og reaksjonen forhold på hvert trinn. Våre protokollen beskriver en forenklet functionalization protokollen og multiplex flyt celle konstruksjon som krever ingen flytende lim eller herding tid på dagen flyt cellene er samlet. Vi beskriver også en strømlinjeformet og robust analyse prosedyren11 som eliminerer beregningsmessig intensiv regresjon trinn ved å bruke en radial symmetri metode for centroid lokalisering18 og en kovariansen-baserte diffusjon konstant estimator19.
Her rapporterer vi en enkel, robust og høy gjennomstrømning ett molekyl flyte strekker analysen implementering med betydelige forbedringer i dekkglassvæske functionalization, flyt celle konstruksjon og dataanalyse. Spesielt utviklet vi en ettrinns dekkglassvæske functionalization protokoll, som ren tørr coverslips reagere direkte med silane-PEG-biotin. Dette forenkler dekkglassvæske utarbeidelse og forbedrer stabiliteten til kvaliteten på functionalized overflater sammenlignet med standard totrinns reaksjon protokollen. Vi beskriver bruken av slik functionalized coverslips med flerkanals PDMS flyt celler som aktiverer robust rør tilkoblinger gjøres uten lim. Disse flyt cellene ytterligere inkluderer flere datastyrt viker for hvert flyt kammer som aktiverer Automatiske reagens flyt redusere hands-on tid under Oppsett og økt analysen gjennomstrømming.
Protocol
1. utarbeidelse av biotin-λ-DNA
Merk: Biotin-λ-DNA molekyler er utarbeidet av ligating en biotin-merket oligonucleotide, 5 '-AGGTCGCCGCCC(A) 20 - biotin - 3 ' til Λ-DNA molekyler 20.
- Forberede 0,1 mM biotin merket oligo TE buffer.
- Varme 0,5 mg/mL λ-DNA lager på 65 ° C for 60 s, og styrter til våt is umiddelbart.
Merk: Rask quench kjøling reduserer λ-DNA concatemerization. - Pipetter 100 µL λ-DNA løsningen i et microcentrifuge rør.
- Legge til 1 µL av 0,1 mM oligo i 9 µL TE bufferen.
- Legge 2 µL av oligo løsningen microcentrifuge røret som inneholder λ-DNA. Bland godt.
Merk: Oligo finnes i ca en 12-fold molar overkant over utfyllende λ-DNA slutten. - Varme λ-DNA/oligo blandingen på 65 ° C 60 s.
- Sakte avkjøle blandingen til romtemperatur.
Merk: Dette trinnet lar oligo å anneal til utfyllende λ-DNA slutten. - Sett blandingen på is. Legge til 11 µL av T4 DNA ligase reaksjon buffer (endelig buffer konsentrasjon 1 x). Bland forsiktig. Deretter Legg 2 µL (800 enheter) av T4 DNA ligase enzym. Bland forsiktig.
- Ruge blandingen for 2 h på 16 ° C eller over natten på 4 ° C.
- Rense produktet bruker sentrifugal filter rør med en nominell molekylvekt begrensning på 100 kDa. Spesielt overføre trinn 1,9 blandingen i en sentrifugal filter rør og sentrifuge 14.000 x g for 5 min, vaske med 400 µL TE buffer to ganger, og samle renset produktet.
Merk: De som-renset biotin-λ-DNAs TE buffer er stabilt på 20 ° C i opptil ett år.
2. Dekkglassvæske functionalization
Merk: Glass coverslips er functionalized av reagerer med silane-PEG-biotin. Denne ettrinns reaksjon protokollen er enklere og mer pålitelig i vår erfaring enn standard totrinns reaksjon protokollen 20. Dekkglassvæske functionalization med silane-PEG-biotin oppretter bindende områder for streptavidin og minimerer uspesifikke DNA og proteiner adsorpsjon til dekkglassvæske overflaten.
- Sonicate fem nr. 1 coverslips i 95% etanol inne en flekk jar i 10 minutter og skyll med ultrapure vann for tre ganger.
Merk: Den femte dekkglassvæske gir en ekstra i tilfelle brudd. - Fylle flekker glasset med 1 M KOH, sonicate i 10 minutter og skyll med ultrapure vann tre ganger.
- Gjenta 2.1-2.2 syklusen to ganger.
- Tørr coverslips under ren tørr N 2 gasstrømmen.
- Videre ren og tørr coverslips ved å bruke air plasma behandling på 900 mTorr press for 5 min.
- Ruge coverslips med 25 mg/mL silane-peg-biotin oppløst i 95% etanol ved romtemperatur for 2 h. spesielt sandwich 50 µL silane-peg-biotin løsning mellom to ren tørr coverslips og ruge dekkglassvæske " smørbrød " i en lukket pipette tips boks med ca 10 mL vann nederst (ikke i kontakt med coverslips) å minimere løsemiddel fordampning.
- Vaske bort overflødig PEG molekyler med ultrapure vann og tørr PINNEN belagt coverslips under ren tørr N 2 gasstrømmen.
Merk: Functionalized coverslips kan lagres opp til tre dager under rombetingelser *.
3. Flow celle konstruksjon
Merk: flyt celler er konstruert av sandwiching en dobbel-tapen med pre-cut kanaler mellom en pinne functionalized dekkglassvæske og en PDMS plate som inneholder innløp og utløp hull. Flere kanaler er integrert per flyt celle.
- Design flyten kanaler i en CAD-programvare og kutte kanalene (bredde, dybde og lengde på hver kanaler er 1, 0,13 og 12 mm, henholdsvis) på en dobbel-teip ved hjelp av en tape cutter (vanligvis åtte kanaler er integrert per flyt celle). Fjern tape rest å danne strømmen kanalene.
- å gjøre PDMS plater, grundig blande 45 g PDMS med 5 g av crosslinking reagens (nok til å lage tolv 5 mm tykk PMDS plater som kan lagres på ubestemt tid under forholdene) bruker en mikser, Hell blandingen i to 10 cm Petri retter, og la den i et vakuum kammer til hovedsak alle luftbobler er borte (manuelt fjerne luftbobler hvis noen forblir når rettene fjernes fra vakuum kammer). Deretter overføres retter til 80 ° C ovn til PDMS stivner (ca 2t).
- Kuttet ut en PDMS plate som tilsvarer den dobbel-tapen med pre-cut kanaler. Peel en beskyttelse film av dobbel-teip og følge filmen et flatt ansikt av PDMS skive. Hull i stikkontakten og vik på PDMS skive med en biopsi hull-puncher med en 23 Gauge nål.
- Skrell andre beskyttelse filmen av dobbel-teip og overholde samlingen PDMS-tape på functionalized overflaten av dekkglassvæske (pass på at dekkglassvæske er flat. Se et bilde av en fullstendig montert flyt celle i figur 1a).
4. TIRF Imaging
Merk: Biotin-λ-DNAs er bundet til en flyt kanal overflate og laminær strømning gjelder flyt strekke DNA molekyler ( figur 1b). Den > 80% strukket DNA molekyler tjene som romlig utvidet maler for å observere og transport og aktiviteten til fluorescently merket molekyler. Baner av enkelt molekyler spores av tidsinnstilt TIRF bildebehandling ( figur 1 c & e).
- Fastsette flyt cellen på et mikroskop scenen og laste pre degassed tomt buffer (10 mM natrium fosfat, 2 mM NaCl, 50 µM EDTA, 20 mM etanol, 5% (v/v) glyserol, 0,01% Tween-20, 1% (v/v) β-mercaptoethanol, pH 7.4) 0,2 mg/mL streptavidin løsning, 1 mg / mL Bovine Serum Albumin (BSA) løsning og 100 pM biotin-λ-DNA løsning i fire reservoarer som hver har et Tygon rør koblet til en magnetventil verdi og en annen Tygon rør koblet til en titt presisjonsrør med sleeving Tygon slangen over mindre titt rør ( hindrer tilbakestrømming reagenser). Degas små mengder buffer av natten eksponering for vakuum eller kortere eksponering for vakuum med røring (til boblene vises ikke lenger).
- Inn en påfyllingshullet flyt cellen titt slangen av Tom buffer reservoaret. Prime kanalen av flytende tomt buffer, og tre andre titt rør inn innløp hull lufttrykket drevet flyten av hver reagens er kontrollert av magnetventilene og helautomatisk via et datamaskiner. Vær forsiktig med å skape luft boble i kanalen.
- Koble et Tygon rør med en kort titt slangen uttaket hullet til en avfallsbeholderen. Kort titt slangen på utsalgsstedet hjelper undertrykke luft boble formasjon under infusjon ved å opprettholde positivt trykk inne kanalen.
- Tethering biotin-λ-DNA molekyler til en flyt kanal overflate.
- Flyt i 0,2 mg/mL streptavidin løsning, ruge i 5 min og deretter flyte tomt buffer bleke ubundet streptavidin.
- Flyt i 1 mg/mL BSA løsningen ruge for 1 min, og deretter strømme tomt buffer bleke ubundet BSA.
Merk: BSA ytterligere undertrykker DNA og prøve adsorpsjon til overflaten. - Flyt i 100 pM biotin-λ-DNA løsning, ruge på 10 min og deretter flyte tomt buffer bleke de ubundne DNAs.
Merk: Etter DNA er bundet til overflaten, unngå raske strømmer for å forhindre skade bundet DNA molekyler.
- å sjekke kvaliteten på den functionalized dekkglassvæske, flyt i DNA flekker fargestoff som Sytox oransje under analysen betingelser brukes (Les 4.6 nedenfor), og starte fluorescens imaging under 532 nm laser lys.
Merk: Kvaliteten på den functionalized dekkglassvæske er vanligvis god og tettheten av flyt strukket DNA molekyler blir høy. Det er viktig å ha en høy nok tetthet av flyt strukket DNA molekyler slik at DNA bindende og skyve / 1D diffusjon hendelser kan observeres. - Fininnstilling TIRF vinkelen å oppnå beste signal / støyforhold bilder av strukket DNA molekyler ( figur 1 d).
- Til posten baner enkelt molekyler beveger seg langs DNA, Gjenta trinn 4.2-4,4 inne en ny kanal (uten DNA flekker fargestoff), så sette mot pre degassed sub-nanomolar fluorophore merket molekyler på en høy nok flow rate ved hjelp av en sprøytepumpe og samle time-lapse fluorescens bilder med en bildefrekvens på 100 Hz.
Merk: En flow rate tilsvarende Weissenberg flere (Wi: dimensjonsløs produktet av polymer avslapning lengst - lag 0,2 s λ-DNA- og skjær rate - endringen i flyten hastighet med avstand fra dekkglassvæske overflaten) 500 inne det kanalen er anbefalt for ett molekyl bildebehandling med en bildefrekvens på 100 Hz 21.- Samle 10.000 rammer i ett felt-Of-View (FOV) å produsere en film, og samle lignende filmer fra flere (vanligvis ti) FOVs per prøve.
Merk: Tettheten av enkelt partikler i en FOV bør være verken for høy - som vil komplisere dataanalyse ved å gjøre objektet tildelingen over rammer tvetydig, eller for lav - som kan føre til lav forekomst av ett molekyl hendelser på DNA. - Optimalisere belysning intensitet slik at molekyler bundet til dekkglassvæske overflaten er raskt Foto-bleket å undertrykke bakgrunn mens molekyler spre på DNA ikke er bleket for raskt slik at lengre baner kan oppdages.
Merk: Vi vanligvis bruker 200-800 W/cm 2 tetthet i FOV.
- Samle 10.000 rammer i ett felt-Of-View (FOV) å produsere en film, og samle lignende filmer fra flere (vanligvis ti) FOVs per prøve.
- På slutten av trinn 4.6, tilfører DNA flekker fargestoff for å bekrefte at DNA molekyler kan fortsatt flyt-strakte.
- Kjøre både positive og negative kontroll prøver.
Merk: En god positive kontroll er en tetrapeptide, TetraMethylRhodamine (TMR)-KRRR (TMR er koplet til N-terminal Amin) som har en mening 1D diffusjon konstant 10,5 + 0.7 (standardfeilen) M (bp 2/s) på nøytral pH 11. En god negativ kontroll er å måle merket prøver av interesse analysebuffer i en kanal som har ingen DNA tjoret, der ingen på DNA diffusjon aktivitet skal oppdages.
5. Dataanalyse:
Merk: en egendefinert enkelt partikkel sporing brukes til å identifisere baner enkelt molekyler spre langs DNA og beregne diffusjon konstanter. Denne programvaren bestemmer først centroid plasseringen av enkelt partikler med høy nøyaktighet, identifiserer partikler som er fast på dekkglassvæske overflaten, og kobler deretter partikler i forskjellige rammer til time-lapse baner. Fra disse baner, 1D diffusjon konstantene er beregnet.
- å starte dataanalyse, åpne en skripting programvare (se tabell av materialer) og gå til katalogen av én partikkel sporing. Åpne skriptet " largedataprocess3.m ". En viktig parameter defineres er terskelverdien for én partikkel gjenkjenning.
- å bestemme optimale terskelverdien, kjøre den " Determine_threshold_value.m " skript. Dette skriptet angir hvordan terskelverdien påvirker enkelt partikkel gjenkjenning. Etter fastsettelsen optimal terskelverdien, kjøre den " largedataprocess3.m " scriptet
- Etter én partikkel sporing analyse, filtrere rå baner ved å kjøre den " Trajectory_filtering.m " skript. Et grafisk brukergrensesnitt (GUI) er bygget i å visualisere Filtreringstrinnet.
- På GUI panel, angi minimalt forskyvningsverdien langs DNA, MinXDisp, 2 piksler, angi maksimal forskyvning tverrgående DNA, MaxYDisp, 2 piksler, angi minimalt antall rammer, minFrames, 10, angi minimalt antall stater trilling, minTriplets, 10; Angi minimalt diffusjon konstant langs DNA, D_par, til 0. Angi maksimal anslått spredning konstant tverrgående DNA, D_trans, til 10 M (bp 2) S -1; Angi minimalt flygninger parameteren, Chi 2 _stat, å-5; Angi minimalt forholdet mellom forskyvning langs DNA til at tverrstilt til DNA, MinX/Y, 2.
Merk: Alle rå baner som passerer dette filtrering parametre, vises i tabell 1, og som er oppført i tabell 3. - Klikk på en bane nummer i tabell 1, banen vil bli fortrengt i grafikk 1 & 2. Klikk på den " spille " knappen for å spille rå fluorescens bildene. Klikk på den " Add_to_Table2 " å identifisere banen som et eneste molekyl skyve bane. Til slutt, alle baner til Tabell2 lagres når du lukker GUI.
- Til å beregne gjennomsnittlig diffusjon konstanter, kjøre skriptet " Calculate_mean_diffusion_constant.m ". Mener diffusjon konstant anslås fra settet med baner som har bestått alle filtrering skritt og lagt til tabell 2.
Representative Results
Figur 2a viser oppdagede baner av pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B er konjugert til cystein rester) molekyler spre på DNA i 2 mM NaCl buffer ved pH 6,5. Spredningen av pVIc er toveis og drevet av ambient termisk energi. Fra disse baner, 1D diffusjon konstanter (D1 verdier) er beregnet for hver bane (se histogrammet i figur 2b). Gjennomsnittet D1 verdien av denne pVIc konjugert beregnes til 22,2 ± 0,9 (standard feil) M (bp2/s) av gjennomsnittlig hver D1 verdi over baner vektet etter antall trilling påfølgende posisjon samtaler i hver bane.
Figur 1 : Apparater for sporing bevegelse av enkelt molekyler langs DNA.
en) en åtte-kanals PDMS microfluidic chip overholdt en functionalized dekkglassvæske som DNA kan bli bundet (med USA kvartal mynt for skala); b) strømme celle zoom skjematisk viser flyt-strakte λ-DNA molekyler; c) skjematisk av TIRF mikroskop og flyt system for strekking DNA; d) TIRF bildet av en flyt-strakte λ-DNA; e) TIRF bilde av pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B er konjugert til cystein rester) molekyler er bundet til en flyt-strakte λ-DNA. Dette tallet er endret med tillatelse2,12. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Endimensjonal spredningen av pVIc (GVQSLKRRRCF) langs DNA.
a). spredningen av pVIc langs flyt strukket λ-DNAs (137 baner) 2 mM NaCl buffer ved pH 6,5. x(t) og y(t) er forskyvningene langs og tverrstilt til λ-DNA, henholdsvis. Prikket vannrette linjer angir manglende punkter som følge av fargestoff blinker. b). Histogram av diffusjon konstant, D1 for pVIc spre langs λ-DNAs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Når du bytter fra tradisjonelle to-trinns dekkglassvæske functionalization reaksjon protokollen til en ettrinns reaksjon protokoll, la vi merke til at påliteligheten av dekkglassvæske functionalization er forbedret. Når den totale hands-on dekkglassvæske forberedelse er mindre enn 30 min, anbefaler vi forbereder frisk coverslips hver dag ett molekyl imaging er planlagt. For å minimere forverring av silane-PEG-biotin, skal reagensen aliquoted og lagret under N2 gassen på 20 ° C ved mottak. Her bruker vi ikke PEG molekyler som produserer -COO- eller -CH3 terminal grupper som er brukt i de siste20. Negative kostnadene av -COO- og de hydrofobe -CH3 gruppene ble benyttet for å hindre uspesifikke adsorpsjon av DNA molekyler og bestemt protein prøver til overflaten, henholdsvis. Vi observerer svært lav overflaten adsorpsjon ved liten peptid eksempler på fullt biotin slutter PEG overflaten, mens silane-PEG-COOH og/eller silane-PEG-CH3 kan være nyttig for analyser av visse protein prøver eller når analysen forhold (for eksempel pH < 7.5) fremme DNA-overflate interaksjoner.
Skiftet fra glass lysbilde flyt celler til PDMS flyt cellene raskere flyt celle konstruksjon og gir enkel integrasjon av flere kanaler. Vi ingeniør ofte åtte kanaler per flyt celle aktivere åtte uavhengig eksperimenter per functionalized dekkglassvæske. For å øke gjennomstrømming per dekkglassvæske, kan enda større antall mikro-fabrikkert kanaler brukes.
Det anbefales å unngå luft boble dannes inne kanalen når som helst etter første utfyllingen. Vanligvis luftbobler ikke forårsaker tap av bundet DNAs (selv om dette er mulig), men heller avbryte flyt og skape DNAs å holde seg til dekkglassvæske. Buffer avgassing og tillegg av små surfactant mengder er vanligvis effektivt i å forebygge boble formasjon i kanalen rør og flyt. I tilfeller hvor luftbobler er introdusert til slangen, prøve å skylle bobler ut under en treg flyten og sørge for at de ikke flyter gjennom regionen der DNAs er bundet.
En strømlinjeformet og effektiv analyseprogramvare er kritisk, på grunn av den enorme mengden data som er generert. Vi samler vanligvis 700.000 høyoppløselige bilder fra målinger på en flyt cellen, som kan behandles ved hjelp av våre tilpassede enkelt partikkel sporing innen en dag på en stasjonær datamaskin med en quad-core prosessor og 32 Gb minne. Falske positive oppdage 1 D diffusjon baner av programvaren (trinn 5.5) er eksempel avhengige og kan være lav gitt at: 1) tettheten av enkelt partikler i FOV er lav nok slik at det er liten tvetydighet koble partikler på tvers av rammer ( protein prøver er generelt mer utsatt for uspesifikke adsorpsjon til dekkglassvæske enn peptid prøver, og dermed bufferen og tetthet for hvert protein sample må optimaliseres); 2) signalet til støyforhold enkelt partikler er høy nok slik at sannsynligheten for USANN-identifikasjon av partikler er lav. Likevel programvaren kan gjøre tilfeldige feil, og vi anbefaler manuell inspeksjon av dataene med den angitte GUI for å evaluere programvareytelse. I et program som er spesielt følsomme for falske positive bane gjenkjenning, kan prosessen parametere inkludert terskelverdien, minFrames, minTriplets og Chi2_stat angis mer strengt på bekostning av lavere følsomhet for ekte bindingen hendelser og potensielt større statistiske skjevhet i bane identifikasjon. Vi her deler og beskrive våre enkelt partikkel sporing med håp om å hjelpe standardisere dataanalyse metoder og stimulere diskusjonen om beste praksis.
I vår protokollen, som krever kontinuerlig under å opprettholde strukket staten av DNA mal molekyler, flytende flyt kan skjevhet transport av noen proteiner langs DNA maler hvis de diffus ved en hopper ordning eller den etter radius av merket fluorophore er store22,23. Mens slike skjevheter kan måles og korrigert i de fleste datasett, transport av proteiner merket med en liten fluorophore og spre ved en vektskivemekanisme ikke vanligvis er forutinntatt synlig grad av flyt2,4, 24. Spesielt har virkningen av er flyten hastighet på transport av proteiner langs DNA blitt brukt til å studere mekanismer for protein spre langs DNA23. A nært knyttet alternativ tilnærming som gjør at målinger i fravær av benytter DNA maler med biotin på begge termini som er transiently strukket i flyt og bundet av begge ender dekkglassvæske slik at DNA-molekyler forblir i en utvidet konfigurasjon når strømmen er slått av25,26,27,28. Dobbel-tjore tilnærming har fordelen at flyt-fri transport eksperimenter men krever endre begge ender av DNA mal molekyler, forsiktig flytkontroll under tethering og karakterisere avstanden mellom to bundet områder. I tillegg må virkningen av heterogene spenninger og DNA conformational dynamics over DNA molekyler på enkelt-molekylet analysen vurderes.
Helt, i tillegg til studere 1 D spredningen av molekyler langs DNA, som rapporterte ett molekyl analysen kan ha nytte mange i vitro biokjemiske og Biofysiske studier på ett molekyl nivå inkludert DNA målrette søkeprosess av proteiner, enzymatisk aktiviteter på DNA og mer.
Feilsøking
Problem 1: Flyt kanaler lekkasjen.
Løsning: Kontroller først at utformingen av flyt kanaler gir minst 1,5 mm margin for tetting rundt og mellom kanaler; og, under montering av flyt cellen, kontroller at kontakten overflater mellom dekkglassvæske, dobbel-teip og PDMS skive er flatt, tørt og ledig av debris, at stort trykk som brukes for å danne forseglingen er uniform, og at forsegling operasjonen er utført ved romtemperatur.
Problem 2: Tettheten av bundet DNAs er for lavt.
Løsning: Dette problemet oppstår når PINNEN functionalization effektivitet er lav eller DNA-molekyler er ikke functionalized med biotin. Fra vår erfaring, tetthet av bundet DNA bør være høy for > 90% av coverslips forberedt fra friske eller riktig lagret silane-PEG-biotin reagens. I tilfeller når tettheten av bundet DNA er lav med en bevist bakst av biotin-λ-DNA, prøve øker konsentrasjonen av silane-PEG-biotin PEG functionalization og konsentrasjoner av streptavidin og biotin-λ-DNA i DNA tethering. Hvis dette mislykkes, erstatte pinne og streptavidin reagenser.
Problem 3: DNAs holde seg til dekkglassvæske end kan strekkes av flyt.
Løsning: Dette problemet kan også oppstå når PINNEN functionalization effektivitet er lav, og er forverret av lav analysen pH. Prøv flyter i flere BSA eller heve pH (f.eks å 8.0) for å undertrykke DNA adsorpsjon til overflaten (trinn 4.3.2). Hvis DNA adsorpsjon er en vedvarende sak under en bestemt analysen tilstand, kan du prøve å inkludert opp til 90% silane-PEG-COOH under pinne functionalization.
DATA analyse notater:
Vi bruker egendefinerte enkelt partikkel sporing for å identifisere baner enkelt molekyler spre langs DNA, fra som deres 1D diffusjon konstanter, D1 estimeres. For å forbedre dataanalyse, implementert vi radial symmetri algoritmen18 for lokalisere partikler og kovariansen-baserte estimator19 for å estimere 1 D diffusjon konstanter, som dramatisk sped opp dataanalyse uten at nøyaktighet. Vi har tidligere validert av tilpasset programvare ved å analysere simulert data11. De viktigste trinnene er beskrevet nedenfor.
Partikkel identifikasjon:
Dette er for å oppdage og segmentere partikler - Diffraksjon-begrenset flekker - fra bakgrunnen. Først romlig båndpass filtrere bildene for å styrke signalet fra partikler i 3-5 piksler rekke (som tilsvarer størrelsen på spilltilbud funksjonen på vårt system) og deretter terskelen basert på intensitet (se skript: spt2_SD_sandbox.m).
Centroid tildeling
Segmentering bildet bare regionaliserer molekyler pikselnivå romlig oppløsning. For å lokalisere molekyler til mye høyere presisjon, ansette Radial symmetri super oppløsning algoritmen18 bilder filtrert som ovenfor. (Denne metoden er basert på en analytisk beregning og dermed reduserer vesentlig beregningsorientert byrden sammenlignet med populære høy nøyaktighet som 2D Gaussian montering (se skript: spt2_SD_sandbox.m).)
Partikkel sporing:
For å spore banen til en partikkel gjennom tid, må vi å identifisere den samme partikler som de beveger seg mellom rammer. Vi anser innvielsen, blinker og oppsigelse etappene å være komponenter i en bane. Vi begrense sammenhengen av partikler i gjeldende rammer de vises i tidligere rammer ved maksimal forskyvning hver ramme. I tilfeller der flere sammenhengene er mulig Jonker-Volgenant algoritmen brukes til å gi globalt optimal sammenhengen sett (se skript: traceTraj4_kx.3.m).
D1 estimering:
Hvis du vil beregne D1 verdier fra baner, bruker vi kovariansen-baserte Estimator (CVE)19. Basert på en analytisk beregning, denne metoden er mer beregningsmessig effektiv og statistisk strenge enn andre vanlige metoder som regresjon av gjennomsnittlig kvadrat forskyvninger (se skript: runspt5_SD.m).
Bane filtrering:
Noen baner inneholder gjenstander som kobling til overflaten-bundet molekyler og må fjernes. Vi implementert flere funksjoner som minimum forskyvning parallelt DNA, maksimal forskyvning tverrstilt til DNA, minimal lengden på banen, minimalt antall trilling påfølgende oppdaget posisjoner, og minimum sannsynligheten poengsum (se Xiong et al11 definisjon) som kan filtreres for å isolere et minimalt partisk antall baner sannsynlig representerer molekyler spre på DNA (se skript: sptViewFig2_update3x.m).
Disclosures
Bred instituttet kan velge å filen patentsøknader med aspekter av arbeidet presentert her.
Acknowledgments
Vi takker Tony Kulesa, Robin Kirkpatrick og Evangelos Gatzogiannis for hjelp med første instrumentering oppsett og testing. Vi takker ytterligere Tony Kulesa betydelig hjelp skriving og vurdere den tilpassede enkelt partikkelen sporing. Dette arbeidet ble støttet av oppstart finansiering og en Career-pris på det vitenskapelige grensesnittet (PCB) fra Burroughs Wellcome Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotin labeled oligo, 5’-AGGTCGCCGCCC(A)20-biotin-3’ | IDT | Custom oligo synthesis | Standard desalting purification is sufficient |
| λ-DNA | New England Biolabs Inc. | N3011S | Make aliquots and minimize freeze-thaw cycle number |
| T4 DNA ligase and ligation reaction buffer | New England Biolabs Inc. | M0202S | |
| Amicon centrifugal filter tubes with NMWL of 100k Dalton | EMD Millipore | UFC510008 | |
| No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-106 | |
| Pure ethanol | VWR | 89125-186 | |
| Potassium hydroxide pellets | Fisher Scientific | P250-500 | |
| Plasma cleaner, model No. PDC-32G | Harrick Plasma | ||
| Silane-peg-biotin | Nanocs | PG2-BNSL-5k | Store at -20oC in dry nitrogen gas |
| A CAD software | Autodesk | AutoCAD | |
| Double-adhesive tape | Adhesive Applications | 8512-2-DP/DL | |
| Tape cutter, model No. CE5000-40-CRP | Graphtec America | ||
| PDMS and crosslink reagent kit | R.S. Hughes | RTV615 CLEAR 010 | |
| Degassing chamber, model No. F42010-0000 | BEL-ART Products | ||
| Mixer, model No. ARV-310 | Thinky | ||
| Hole puncher, Harris Uni-Cores, Size 0.5 mm | Harris Uni-Cores | This can be substituted with a manual biopsy punch with a similar needle size | |
| Tygon tubing | Cole Parmer | EW-06420-02 | 0.020" ID, 0.060"OD |
| Peek tubing | Western Analytical | PK007-031-Y | 0.007" ID, 0.031"OD |
| Streptavidin | New England Biolabs Inc. | N7021S | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs Inc. | B9000S | |
| Sytox orange nucleic acid stain | Invitrogen | S11368 | |
| Ti-E Microscope | Nikon | Microscope, camera, objective, dichroic mirror and bandpass filter can be substituted for similar equipment | |
| 100x Objective, NA/1.49, CFI Apo TIRF | Nikon | ||
| CMOS camera | Hammamatsu | Orca Flash 4.0 | |
| Dichroic mirror | Semrock | FF560/659-Di01-25x36 | |
| Bandpass filter | Semrock | FF01-577/690-25 | |
| 532 nm laser | Rayscience Innovation Limited, Shanghai | OEMLL-FN-532nm-C | Select wavelength to correspond to stain of choice |
| Syringe pump | Chemxy | Fusion 200 | |
| TMR-KRRR, >=85% purity | MIT Biopolymer lab | ||
| pVIc-Cy3B, HPLC purified | A gift from Dr. Walter Mangel at Brookhaven National lab | ||
| Script programming software | MathWorks | Matlab | |
| * see parts list for solenoid valves, computer interface, and assembly instructions at: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers |
References
- Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. 1. Models and theory. Biochemistry. 20, 6929-6948 (1981).
- Blainey, P. C., van Oijen, A. M., Banerjee, A., Verdine, G. L., Xie, X. S. A base-excision DNA-repair protein finds intrahelical lesion bases by fast sliding in contact with DNA. P Natl Acad Sci USA. 103, 5752-5757 (2006).
- Leith, J. S., et al. Sequence-dependent sliding kinetics of p53. P Natl Acad Sci USA. 109, 16552-16557 (2012).
- Blainey, P. C., et al. Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space IV. Viral proteinase slides along DNA to locate and process its substrates. J Biol Chem. 288, 2092-2102 (2013).
- Graziano, V., et al. Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space II. Adenovirus proteinase is activated in an unusual one-dimensional biochemical reaction. J Biol Chem. 288, 2068-2080 (2013).
- Graziano, V., et al. Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: I. binding to DNA and to hexon of the precursor to protein VI, pVI, of human adenovirus. J Biol Chem. 288, 2059-2067 (2013).
- Baniecki, M. L., McGrath, W. J., Mangel, W. F. Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: III. atomic resolution structure of the nascent form of the adenovirus proteinase. J Biol Chem. 288, 2081-2091 (2013).
- Kabata, H., et al. Visualization of single molecules of RNA polymerase sliding along DNA. Science. 262, 1561-1563 (1993).
- Harada, Y., et al. Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time. Biophysical journal. 76, 709-715 (1999).
- Mangel, W. F., McGrath, W. J., Xiong, K., Graziano, V., Blainey, P. C. "Molecular sled"- vehicle of 11-amino acids that facilitates biochemical interactions via sliding components along DNA. Nature Communications. , (2016).
- Xiong, K., Blainey, P. C. Molecular sled sequences are common in mammalian proteins. Nucleic Acids Res. 44, 2266-2273 (2016).
- Xiong, K., Erwin, G. S., Ansari, A. Z., Blainey, P. C. Sliding on DNA: from peptides to small molecules. Angew. Chem. Int. Ed. 55, 15110-15114 (2016).
- Turkin, A., et al. Speeding up biomolecular interactions by molecular sledding. Chem Sci. 7, 916-920 (2016).
- Zhang, L., Zheng, L., Meng, Z., Balinin, K., Loznik, M., Herrmann, ,A. Accelerating chemical reactions by molecular sledding. Chem Commun (Camb). 47, 6331-6334 (2017).
- van Oijen, A. M., et al. Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder. Science. 301, 1235-1238 (2003).
- Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging. Langmuir. 24, 10524-10531 (2008).
- Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., Oijen, A. M. V. Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay. J Vis. Expt. , e1689 (2010).
- Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nat Methods. 9, 724 (2012).
- Vestergaard, C. L., Blainey, P. C., Flyvbjerg, H. Optimal estimation of diffusion coefficients from single-particle trajectories. Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 89, 022726 (2014).
- Schroeder, C. M., Blainey, P. C., Kim, S., Xie, X. S. Hydrodynamic Flow-stretching Assay for Single-Molecule Studies of Nucleic Acid-Protein Interactions. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
- Blainey, P. C. Single-Molecule Studies of Protein-DNA Interaction: Diffusive Search and Sequence-Dependent Motors. , Harvard University. (2007).
- Gorman, J., Greene, E. C. Visualizing one-dimensional diffusion of proteins along DNA. Nat Struct Mol Biol. 15, 768-774 (2008).
- Lin, Y. H., et al. Using the Bias from Flow to Elucidate Single DNA Repair Protein Sliding and Interactions with DNA. Biophysical journal. 96, 1911-1917 (2009).
- Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nat Struct Mol Biol. 16, 1224-1234 (2009).
- Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H., Schroeder, C. M. Direct observation of TALE protein dynamics reveals a two-state search mechanism. Nat Commun. 6, 7277 (2015).
- Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H. M., Schroeder, C. M. TALE proteins search DNA using a rotationally decoupled mechanism. Nat Chem Biol. 12, 831-837 (2016).
- Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57, 179-186 (2012).
- Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Method Enzymol. 472, 293-315 (2010).
