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Biochemistry

Rastreamento em tempo real da separação de fragmentos de DNA por smartphone

Published: June 1, 2017 doi: 10.3791/55926

Summary

As experiências tradicionais de eletroforese em gel de laje (SGE) requerem um aparelho complicado e alto consumo químico. Este trabalho apresenta um protocolo que descreve um método de baixo custo para separar fragmentos de DNA dentro de um prazo curto.

Abstract

A eletroforese em gel de laje (SGE) é o método mais comum para a separação de fragmentos de DNA; Portanto, é amplamente aplicado ao campo da biologia e outros. No entanto, o protocolo SGE tradicional é bastante tedioso, e o experimento leva muito tempo. Além disso, o consumo químico em experimentos SGE é muito alto. Este trabalho propõe um método simples para a separação de fragmentos de DNA com base em um chip SGE. O chip é feito por uma máquina de gravura. São utilizadas duas folhas de plástico para os comprimentos de onda de excitação e emissão do sinal óptico. O sinal de fluorescência das bandas de DNA é coletado por smartphone. Para validar este método, as escadas de DNA de 50, 100 e 1000 pb foram separadas. Os resultados demonstram que uma escala de DNA menor que 5.000 pb pode ser resolvida dentro de 12 min e com alta resolução ao usar este método, indicando que é um substituto ideal para o método SGE tradicional.

Introduction

A eletroforese em gel de laje (SGE) é o método mais eficaz para a separação dos fragmentos de DNA 1 , 2 , 3 , 4 , 5 e, portanto, é considerada uma ferramenta versátil nas análises bioquímicas e biológicas 6 , 7 , 8 . No entanto, muitas experiências indicam que o SGE é restrito pelos seguintes quatro problemas: (1) as separações demoram muitas horas e até dias; (2) o consumo químico é muito alto; (3) requer um aparelho complicado ( por exemplo, célula de eletroforese 2D, fonte de energia de eletroforese e sistema de imagem em gel); (4) o sistema de imagem em gel só pode observar os fragmentos de DNA separados quando a experiência terminar. Além disso, o brometo de etídio (EtBr), que é comumente usado no SGE 9 ,Ass = "xref"> 10, é mutagênico e cancerígeno 11 , 12 . Assim, sempre devem ser usadas luvas ao entregar géis contendo EtBr.

A eletroforese capilar (CE) tem inúmeras vantagens 13 , 14 , 15 , 16 , 17 em comparação com SGE, como operação automática, tempo de separação curto e menor consumo. No entanto, o instrumento CE é bastante caro. Portanto, para superar essas limitações, um sistema foi desenvolvido ( Figura 1 ) para a separação do DNA. Tal sistema não só pode reduzir muito o consumo de produtos químicos e economizar no tempo de experiência de SGE (<8 min), mas também pode realizar rastreamento em tempo real do processo de separação de DNA no gel de agarose pelo smartphone. Seguindo os procedimentos descritos neste protocolo, os estudantes shouPoderia projetar e fabricar o chip SGE, preparar o gel de agarose no chip, configurar um sistema SGE simples com um smartphone e registrar o processo de migração do DNA no gel de agarose.

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Protocol

1. Projeto básico do chip SGE

  1. Use qualquer plástico transparente, como polimetilmetacrilato (PMMA) ou policarbonato.
    Nota: O chip SGE está demonstrado na Figura 1B . O chip SGE consiste em furos cilíndricos para o tampão TBE, canais para separação de DNA e duas pistas incorporadas ao longo dos orifícios para o eletrodo.
  2. Fabricação de matrizes de canais SGE no bloco PMMA usando uma máquina de gravura a laser.
    Nota: Os parâmetros geométricos do chip dependem do tamanho do DNA a ser separado. Por exemplo, os parâmetros de canal ótimos para o chip SGE são de 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (largura x profundidade x comprimento) se o fragmento de DNA for menor que 1.000 pb.
  3. Com base no design SGE, fabrica pentes para criar os poços no chip para carregar a amostra de DNA.

2. Preparação do Gel de Agarose

  1. Prepare 0,5 × TBE misturando 10 × TBE (1 × TBE =Tris 89 mM, ácido bórico 89 mM e EDTA 2 mM; PH 8,4) e água destilada numa proporção 1:19.
  2. Preparar 1,0% de gel de agarose para a separação de escadas de DNA de 100 pb.
    Nota: A concentração de agarose em tampão TBE 0,5x depende dos tamanhos dos fragmentos de DNA a serem separados.
  3. Colocar 0,1 g de agarose num balão e adicionar 10 mL de tampão TBE 0,5x.
    Nota: O volume da solução preparada deve ser inferior a 1/3 da capacidade do balão.
  4. Selar o balão com película conservante e depois aquecer a mistura de agarose / tampão em um microondas (meio, 1,0 min). Antes de colocar o balão no microondas, faça alguns orifícios no filme de conservação em caso de explosão.
  5. Despeje 2,7 mL de solução de agarose derretida em 4 canais do chip SGE. Coloque o pente na solução de agarose para criar os poços.
    Nota: A solução de agarose derretida arrefecerá para o estado de gel à temperatura ambiente 3 minutos depois.
  6. Remova o pente do gE adicionar 0,9 mL de tampão TBE 0,5x para cobrir o gel.

3. Correndo a eletroforese no chip SGE

  1. Ligue a fonte de luz LED e coloque um filtro de passagem de banda de 425 a 505 nm acima da fonte de luz.
  2. Misture 14,4 μL de uma escala de DNA de 100 pb e 1,6 μL de SYBR Green usando um vortexer.
  3. Carregar 4 μL de mistura em cada poço do gel de agarose no chip SGE ( Figura 2 ).
  4. Coloque o eletrodo nas duas faixas do chip SGE.
  5. Coloque um filtro de passagem de banda de 550 a 700 nm acima do chip SGE.
  6. Ligue a fonte de alimentação. Ajuste a tensão elétrica para 180 V (20 V / cm). Ligue o smartphone para gravar o processo de separação de fragmentos de DNA ( Figura 3 ).
  7. Quando a eletroforese terminar 10 minutos depois, desligue a fonte de energia e a luz LED.
  8. Limpe o chip SGE.

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Representative Results

A Figura 4 , Figura 5 , e a Figura 6 representam um resultado típico após a eletroforese em gel de 50, 100 e 1.000 pb de escadas de DNA. Após o experimento, os fragmentos de DNA estavam bem separados. Além disso, as mesmas amostras foram separadas nos 4 canais do chip SGE, mostrando que fragmentos de DNA do mesmo tamanho movem a mesma distância em cada experimento.

O desempenho de separação da escala de DNA pode ser avaliado através da análise da relação da distância de migração e do logaritmo do tamanho do DNA; Assim, o SGE pode ser aplicado para calcular o tamanho de fragmentos de DNA desconhecidos. Na Figura 3 , verificou-se que a distância de migração está linearmente relacionada ao logaritmo do tamanho do DNA quando o tamanho do DNA é menor que 700 pb.

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Figura 1 : Esquema e imagens. ( A ) Um diagrama esquemático do sistema de separação de DNA de rastreamento em tempo real. Inclui o conjunto de LEDs como a fonte de luz, o filtro óptico e o chip CGE. O smartphone pode registrar o processo de migração do DNA. ( B ) O chip SGE. ( C ) O dispositivo montado para eletroforese. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2 : Um estudante carregando o gel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3 : Um estudante que grava a migração em um smartphone. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4 : Separação de escadas de DNA de 50 pb no chip SGE. Os parâmetros geométricos para o canal no chip SGE são de 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (largura x profundidade x comprimento). A tensão de separação é de 120 V. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5 : Separação de escadas de DNA de 100 pb no chip SGE. O gParâmetros eométricos para o canal no chip SGE são 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (largura x profundidade x comprimento). A tensão de separação é de 120 V. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6 : Separação de escadas de DNA de 1000 pb no chip SGE. Os parâmetros geométricos para o canal no chip SGE são de 3,6 mm x 4,0 mm x 90 mm (largura x profundidade x comprimento). A tensão de separação é de 180 V. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

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Discussion

A eletroforese em gel de agarose é amplamente empregada para a separação de DNA, ARN e proteína. Este trabalho propõe um novo método para substituir o protocolo tradicional de eletroforese em gel. Os resultados demonstram que as escadas de DNA de 50, 100 e 1000 pb podem ser separadas bem em um dispositivo tão pequeno montado. A grande vantagem deste método é que não só pode separar os ácidos nucleicos com pouco consumo químico, mas também pode registrar o processo de separação. Embora os fragmentos de DNA sejam amplos na Figura 2 , os resultados podem ser melhorados ao otimizar os parâmetros do chip SGE e a concentração do gel de agarose. Além disso, o processo SGE total não leva mais de 10 min se os géis pré-fabricados forem usados ​​no chip.

O desempenho de separação da escada de DNA é bastante diferente se a largura do canal no chip for alterada. Por exemplo, quando uma escada de DNA de 1000 pb é separada, a banda de DNA parece mais ampla seA largura do canal é pequena. Isto é possivelmente porque o aquecimento de joule no gel de agarose é muito alto 18 , o que afeta o desempenho de separação.

O método SGE aqui proposto é muito simples. Um dispositivo mini-SGE portátil pode ser desenvolvido se o sistema estiver otimizado. Esse dispositivo pode ser aplicado a testes de laboratório de ponto de atendimento.

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Disclosures

Não são declarados conflitos de interesse.

Acknowledgments

Agradecemos o apoio da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 21205078) e do Fundo de Pesquisa para o Programa de Doutorado em Educação Superior da China (No.20123120110002). Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Chave da China (2016YFB1102303), o Programa Nacional de Pesquisa Básica da China (973Program, 2015CB352001) e a Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (61378060).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10×TBE Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. T1051
50 bp DNA ladder Takara Bio Inc. 3421A
100 bp DNA ladder Takara Bio Inc. 3422A
1 kbp DNA ladder Takara Bio Inc. 3426A
SYBR GREEN Takara Bio Inc. 5760A
Agarose Sigma-Aldrich Corporate V900510

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References

  1. Carle, G. F., Olson, M. V. Separation of chromosomal DNA molecules from yeast by orthogonal-field-alternation gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 12 (14), 5647-5664 (1984).
  2. McDonell, M. W., Simon, M. N., Studier, F. W. Analysis of restriction fragments of T7 DNA and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels. J. Mol. Biol. 110 (1), 119-146 (1977).
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  4. Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).
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Bioquímica Edição 124 Genética Eletroforese em gel Agarose separação de DNA SYBR Green I Fluorescência
Rastreamento em tempo real da separação de fragmentos de DNA por smartphone
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Tao, C., Yang, B., Li, Z., Zhang,More

Tao, C., Yang, B., Li, Z., Zhang, D., Yamaguchi, Y. Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone. J. Vis. Exp. (124), e55926, doi:10.3791/55926 (2017).

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