Summary

Suivi en temps réel de la séparation des fragments d'ADN par téléphone intelligent

Published: June 01, 2017
doi:

Summary

Les expériences traditionnelles d'électrophorèse sur gel en dentelle (SGE) nécessitent un appareil compliqué et une forte consommation chimique. Ce travail présente un protocole qui décrit une méthode peu coûteuse pour séparer les fragments d'ADN dans un court laps de temps.

Abstract

L'électrophorèse sur gel de dalle (SGE) est la méthode la plus commune pour la séparation des fragments d'ADN; Ainsi, il est largement appliqué au domaine de la biologie et d'autres. Cependant, le protocole SGE traditionnel est assez fastidieux, et l'expérience prend beaucoup de temps. De plus, la consommation chimique dans les expériences SGE est très élevée. Ce travail propose une méthode simple pour la séparation des fragments d'ADN basée sur une puce SGE. La puce est fabriquée par une machine à gravure. Deux feuilles de plastique sont utilisées pour les longueurs d'onde d'excitation et d'émission du signal optique. Le signal de fluorescence des bandes d'ADN est collecté par un smartphone. Pour valider cette méthode, des échelles d'ADN de 50, 100 et 1000 pb ont été séparées. Les résultats démontrent qu'une échelle d'ADN inférieure à 5 000 pb peut être résolue en 12 min et à haute résolution lors de l'utilisation de cette méthode, ce qui indique qu'il est un substitut idéal de la méthode SGE traditionnelle.

Introduction

L'électrophorèse sur gel de dalle (SGE) est la méthode la plus efficace pour la séparation des fragments d'ADN 1 , 2 , 3 , 4 , 5 et est donc considéré comme un outil polyvalent dans les analyses biochimiques et biologiques 6 , 7 , 8 . Cependant, de nombreuses expériences indiquent que SGE est restreinte par les quatre problèmes suivants: (1) les séparations prennent beaucoup d'heures et même des jours; (2) la consommation chimique est très élevée; (3) il nécessite un appareil compliqué ( par exemple, cellule électrophorèse 2D, alimentation électrique et système d'imagerie en gel); (4) le système d'imagerie en gel ne peut observer que les fragments d'ADN séparés lorsque l'expérience est terminée. En outre, le bromure d'éthidium (EtBr), qui est couramment utilisé dans le SGE 9 ,Ass = "xref"> 10, est mutagène et cancérogène 11 , 12 . Ainsi, les gants doivent toujours être portés lors de la distribution de gels contenant EtBr.

L'électrophorèse capillaire (CE) présente de nombreux avantages 13 , 14 , 15 , 16 , 17 par rapport au SGE, comme le fonctionnement automatique, le temps de séparation court et la consommation réduite. Cependant, l'instrument CE est assez coûteux. Par conséquent, pour surmonter ces limitations, un système a été développé ( Figure 1 ) pour la séparation de l'ADN. Un tel système peut non seulement réduire considérablement la consommation de produits chimiques et économiser sur le temps de l'expérience SGE (<8 min), mais il peut également effectuer un suivi en temps réel du processus de séparation de l'ADN dans le gel d'agarose par un smartphone. En suivant les procédures décrites dans ce protocole, les étudiants shouLd pourrait concevoir et fabriquer la puce SGE, préparer le gel d'agarose dans la puce, mettre en place un système SGE simple avec un smartphone et enregistrer le processus de migration de l'ADN dans le gel d'agarose.

Protocol

1. Conception de base de la puce SGE Utilisez n'importe quel plastique transparent, tel que le polyméthylméthacrylate (PMMA) ou le polycarbonate. Remarque: La puce SGE est démontrée à la figure 1B . La puce SGE comprend des trous cylindriques pour le tampon TBE, des canaux pour la séparation de l'ADN et deux voies intégrées le long des trous de l'électrode. Fabriquer des réseaux de chaînes SGE dans le bloc PMMA à l'aide d'une machi…

Representative Results

La figure 4 , la figure 5 , et la figure 6 représentent un résultat typique après l'électrophorèse sur gel d'échelles d'ADN de 50, 100 et 1000 pb. Après l'expérience, les fragments d'ADN étaient bien séparés. En outre, les mêmes échantillons ont été séparés dans les 4 canaux de la puce SGE, montrant que les fragments d'ADN de même taille se déplacent à la même distance dans chaque …

Discussion

L'électrophorèse sur gel d'agarose est largement utilisée pour la séparation de l'ADN, de l'ARN et de la protéine. Ce travail propose une nouvelle méthode pour remplacer le protocole traditionnel d'électrophorèse sur gel. Les résultats démontrent que des échelles d'ADN de 50, 100 et 1000 pb peuvent être bien séparées dans un tel dispositif assemblé. Le grand avantage de cette méthode est que non seulement il peut séparer les acides nucléiques avec peu de consommation chimique, m…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous reconnaissons le soutien de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n ° 21205078) et du Fonds de recherche pour le programme de doctorat de l'enseignement supérieur de la Chine (n ° 0031 3120110002). Ce travail a été partiellement soutenu par le Programme national de recherche et de développement clé de Chine (2016YFB1102303), le Programme national de recherche fondamentale de Chine (973Program, 2015CB352001) et la National Natural Science Foundation of China (61378060).

Materials

10×TBE Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. T1051
50bp DNA ladder Takara Bio Inc. 3421A
100bp DNA ladder Takara Bio Inc. 3422A
1kbp DNA ladder Takara Bio Inc. 3426A
SYBR GREEN Takara Bio Inc. 5760A
Agarose Sigma-Aldrich Corporate V900510

References

  1. Carle, G. F., Olson, M. V. Separation of chromosomal DNA molecules from yeast by orthogonal-field-alternation gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 12 (14), 5647-5664 (1984).
  2. McDonell, M. W., Simon, M. N., Studier, F. W. Analysis of restriction fragments of T7 DNA and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels. J. Mol. Biol. 110 (1), 119-146 (1977).
  3. Fangman, W. L. Separation of very large DNA molecules by gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 5 (3), 653-665 (1978).
  4. Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).
  5. Gödde, R., et al. Electrophoresis of DNA in human genetic diagnostics-state-of-the-art, alternatives and future prospects. Electrophoresis. 27 (5-6), 939-946 (2006).
  6. Studier, F. W. Analysis of bacteriophage T7 early RNAs and proteins on slab gels. J. Mol. Biol. 79 (2), 237-248 (1973).
  7. Sugden, B., De Troy, B., Roberts, R. J., Sambrook, J. Agarose slab-gel electrophoresis equipment. Anal. Biochem. 68 (1), 36-46 (1975).
  8. Rabilloud, T., Chevallet, M., Luche, S., Lelong, C. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: Past, present and future. J. Proteomics. 73 (11), 2064-2077 (2010).
  9. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
  10. Gasser, R. B., et al. Single-strand conformation polymorphism (SSCP) for the analysis of genetic variation. Nat. Protoc. 1 (6), 3121-3128 (2006).
  11. Matselyukh, B. P., Yarmoluk, S. M., Matselyukh, A. B., Kovalska, V. B., Kocheshev, I. O., Kryvorotenko, D. V., Lukashov, S. S. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids: XXXI. Using of polymethine cyanine dyes for the visualization of DNA in agarose gels. J. Biochem. Biophys. Methods. 57 (1), 35-43 (2003).
  12. Lunn, G., Sansone, E. B. Ethidium bromide: destruction and decontamination of solutions. Anal. Biochem. 162 (2), 453-458 (1987).
  13. Li, Z., Liu, C., Zhang, D., Luo, S., Yamaguchi, Y. Capillary electrophoresis of RNA in hydroxyethylcellulose polymer with various molecular weights. J. Chormatogr. B. 1011, 114-120 (2016).
  14. Li, Z., Liu, C., Ma, S., Zhang, D., Yamaguchi, Y. Analysis of the inhibition of nucleic acid dyes on polymerase chain reaction by capillary electrophoresis. Anal. Methods-UK. 8 (11), 2330-2334 (2016).
  15. Liu, F., et al. Developing a fluorescence-coupled capillary electrophoresis based method to probe interactions between QDs and colorectal cancer targeting peptides. Electrophoresis. 37 (15-16), 2170-2174 (2016).
  16. Wang, J., et al. A capillary electrophoresis method to explore the self-assembly of a novel polypeptide ligand with quantum dots. Electrophoresis. 37 (15-16), 2156-2162 (2016).
  17. Miao, P., et al. Nuclease assisted target recycling and spherical nucleic acids gold nanoparticles recruitment for ultrasensitive detection of microRNA. Electrochim. Acta. 190, 396-401 (2016).
  18. Heller, C. Principles of DNA separation with capillary electrophoresis. Electrophoresis. 22 (4), 629-643 (2001).

Play Video

Cite This Article
Tao, C., Yang, B., Li, Z., Zhang, D., Yamaguchi, Y. Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone. J. Vis. Exp. (124), e55926, doi:10.3791/55926 (2017).

View Video