Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

א Published: July 26, 2017 doi: 10.3791/55939
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Biology, Queen's University, 2Centre for Neuroscience, Queen's University

Summary

כאן, אנו מציגים assay Caenorhabditis elegans- Specific שנועד להעריך שינויים התנהגות הנטייה נחושת ואת היכולת לאתר מקור מזון משותף, כמו האורגניזם מתקדמת ממצב תזונה רעב עד כדי רעב.

Abstract

כדי להבטיח הישרדות, אורגניזמים חייבים להיות מסוגלים להימנע בתי גידול שלילי תוך הבטחת מקור מזון עקבי. Caenorhabditis elegans לשנות את דפוסי locomotory שלהם על זיהוי של גירויים סביבתיים שונים והוא יכול לווסת את חבילת תגובות התנהגותיות בתגובה לתנאי רעב. נמטודות בדרך כלל התערוכה תגובה מרתיעה ירידה כאשר הוסרו ממקור מזון במשך 30 דקות. התבוננות בשינויים התנהגותיים בתגובה למעמד תזונתי משתנה יכולה לספק תובנה לגבי המנגנונים המסדירים את המעבר ממצב של רעב עד רעב.

פיתחנו assay אשר מודד יכולת של נמטודות לעבור מחסום מרתיע ( כלומר נחושת) ואז להגיע למקור מזון על פני תקופה ממושכת של זמן. פרוטוקול זה בונה על עבודה קודמת על ידי שילוב משתנים מרובים באופן המאפשר איסוף נתונים המשיך כמו האורגניזמים לנוע לעברמצב יותר ויותר מורעב. יתר על כן, assay זה מאפשר הגדלת גודל המדגם, כך אוכלוסיות גדולות יותר של נמטודות ניתן להעריך בו זמנית.

אורגניזמים פגומים ביכולת לזהות או להגיב לנחושת מיד לחצות את המכשול הכימי, בעוד נמטודות סוג בר בתחילה דחו. כמו תולעים סוג בר הם יותר ויותר מורעבים, הם מתחילים לחצות את המכשול ולהגיע למקור המזון. עיצבנו assay זה כדי להעריך מוטציה כי הוא מסוגל להגיב על רמזים סביבתיים מגוונים, כולל תחושת מזון או זיהוי של כימיקלים מרתיעה. כאשר מוערכים באמצעות פרוטוקול זה, אורגניזמים פגומים מיד חצה את המכשול, אבל גם לא היו מסוגלים לאתר מקור מזון. לפיכך, מוטציות אלה שוב ושוב לחצות את המכשול הכימי למרות להגיע באופן זמני למקור מזון. Assay זה יכול בקלות לבדוק אוכלוסיות של תולעים להעריך פגמים פוטנציאליים המסלול הקשורים סלידה והרעב.

Introduction

Caenorhabditis elegans שימש מודל לחקר הנוירוביולוגיה במשך עשרות שנים בשל הקלות היחסית בניתוח המעגל של מערכת העצבים המורכבת רק 302 נוירונים 1 . בתנאי שהאורגניזם מסתמך על תגובה לרמזים סביבתיים, חלק גדול ממערכת העצבים מוקדש לוויסות השילוב של אותות סביבתיים 2 . למרות הפשטות של מערכת העצבים שלה, C. elegans יכול לזהות ולהגיב על אותות סביבתיים מגוונים כולל repellents 3 , 4 , 5 טמפרטורות 5 , ואפילו לחות 6 . כישלון לשלב אותות סביבתיים כמו שצריך נקשר מספר הפרעות התנהגותיות תנאים ניווניות במערכות מודל יונקים 7- 9. עם מגוון של מודלים של מחלות עצביות זמינות 10 ב C. elegans ופיתוח של nematode מסכי התרופות 11 , אורגניזם זה הוכיח להיות מערכת שימושית לחקר נוירוביולוגיה. בהתחשב בזמינות של מיפוי nematode connectome 1 ומוטציות כמעט כל גן בגנום nematode 12 , ההבנה שלנו של מערכת העצבים nematode, ועל ידי הארכה שלנו, מוגבל חלקית על ידי העיצוב של מבחני המתאים מבחינה יצירתית.

מספר מבחני chemotaxis פותחו במהלך 40 השנים האחרונות כדי להעריך היענות nematode לגירויים מגוונים שונים 3 , 4 , 13 , 14 , 15 . הניסוי הראשוני כלל את ההקדמה של גירוי סביבתי חריף בעוד תולעת בודדת משוטטת על צלחת אגר= "Xref"> 3 , 14 , 16 . נרשמו שינויים מיידיים בתגובות קטריות. לדוגמה, octorol ריחניים נדיפים ניתן להחיל על השיער ו wafted מול האף nematode כדי לעורר את החניכה של תנועה לאחור בתולעים סוג בר 17 . מבחנים מורכבים יותר פותחו גם כדי לשלב משתנים מרובים כאמצעי להערכת בחירה התנהגותית 18 . וריאציה של assay זה כרוך בשימוש של פתרון נחושת כדי ליצור מחסום midline מרתיע 4 . אטרקציה, כלומר דיאכטיל, הונחה על צד אחד של המכשול הכימי עם תולעים שהועברו ממקור הדיאצטיל. תולעים פגומות לתגובות נחושת נחפזות חצו מיד את המכשול כדי להגיע לדיאצטיל, בעוד שתולעים מסוג בר נדחקו בתחילה על ידי המכשול. התגובות נצבעו כאשר התולעים התקרבו לראשונה למחסום הנחושתללא תצפיות לטווח ארוך.

כאשר תולעים מוערכים לאחר עוברים תנאי רעב, הרגישות שלהם לגירויים סביבתיים הוא ירד 19 . כאשר octanol כימית מרתיעה הוא wfted מול האף nematode, אורגניזמים סוג בר לעורר תנועה לאחור בתוך 3 - 5 s כאשר על מזון. לאחר אורגניזמים אלה הוסרו מן המזון במשך 10 דקות, הם מפגינים תגובה מאוחרת של 8 - 10 s 20 . לכן, עם רעב מוגבר, נמטודות להציג תגובה מרתיעה מופחתת אותות סביבתיים מזיקים כמו החיפוש אחר מזון הופך חיוני יותר להישרדות. לעומת זאת, נמטודות כי over-express קולטן neuropeptide 9 ( npr-9) , לא מגיבים אוקטנול על או ביטול מזון ולהציג חוסר היכולת להגיב על מספר גירויים מרתיעה 21 . אלה npr-9 (GF) אורגניזמים גם לא לשנות את תדירות היפוך שלהם בנוכחות מזון, אבל יכולהפוך בתגובה לגירויים מגע קשים המציין כי הם מסוגלים תנועה לאחור 21 . יש לנו גם העריכו npr-9 (LF) מוטציות בהתחשב בכך שהם מפגינים תדירות היפוך ירד באופן חריג את האוכל עדיין יכול לווסת את התנהגותם בנוכחות מזון 21 . צימוד המצב התזונתי של התולעת עם ההקדמה של גירויים חיצוניים חריפים סייעה בבירור המנגנונים שבאמצעותם מסלול הקשור למזון יכול לשנות את מסלולי האיתות החושי 22 , 23 . הנוכחות של מזון בסביבה נמטודות שימש גם כדי להעריך תגובות אתנול הנסיגה 24 . בניסוי זה, תולעים הודגרו בריכוזים שונים של אתנול ולאחר מכן הונחו על צלחת אגר עם כתם של מזון המכונה "assay גזע מזון". תיקון המזון הונח על קצה אחד של הצלחת בעוד נמטודות wEre הניח ממקור המזון. נסיגה אתנול הוערך על ידי מדידת משך הזמן הנדרש עבור תולעים להגיע חתיכת מזון.

זה מבוסס תזונת נחושת assay מבוסס בונה על assay גזע מזון לשלב משתנים סביבתיים נוספים, כלומר מזון ונחושת, תוך הערכת שינויים התנהגותיים לאורך זמן. זוהי הסתגלות של פרוטוקול שימוש נפוץ ברחבי הקהילה elegans C. 4 . פרוטוקול זה נעשה שימוש כדי להעריך תגובות מרתיעה ואיתור מזון על פני תקופה של ארבע שעות 21 . מאז התולעת של התנהגויות רעב התערוכה לאחר 30 דקות של מניעת מזון 25 , אנחנו גם מסוגלים להעריך כיצד שינויים במצב התזונתי יכול להשפיע על תגובות סביבתיות. התנאים של assay זה למדוד כיצד אורגניזמים ניסיוני לשנות את התגובה לגירויים מרתיעה לאורך זמן, ומכאן זה מעריך שינויים התנהגותיים כמואורגניזמים מתקדמים לעבר מדינה מורעבת (והמשיכו מדידות של רעב ממושך). מאחר שחיות ה- NF-9 (GF) אינן משנות את התנהגותן בתגובה לאוכל או לרמזים מרתיעים רבים, ביקשנו לזהות אם הגירעונות ההתנהגותיים הללו ימשיכו להתקיים בהקשר של רעב. בסופו של דבר, זה עיצוב assay כבר ניסח במיוחד כדי להעריך את npr-9 (GF) מוטציות אבל יכול להיות מותאם נוספת גם לאפיין זנים חדשניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת אורגניזמים ניסיוניים

  1. בחר 10 L4 מבוימות נמטודות לכל זן 24 שעות לפני תחילת assay כדי להבטיח כי אורגניזמים הם צעירים כאשר נבדק. עבור כל נמטודות מוטציה או שליטה נבדק, לבחור 10 L4s (10 עבור שליטה 10 עבור assay).
    1. תחזק L4 אורגניזמים בשיטות סטנדרטיות 26 , 27 במשך 24 שעות על לוחות אגר סטנדרטי seeded עם OP50 Escherichia coli . אם אורגניזמים אבדו במהלך הצעדים הבאים לשטוף, לפצות על ידי הגדלת גודל המדגם החל ( כלומר לבחור 20 תולעים במקום 10).
      הערה: התנהגות היא פנוטיפ משתנה באופן פנימי. בצע את השיטה בשלושה עותקים עבור כל זן על שלושה ימים נפרדים. כלול זנים נוספים שליטה ותנאים עבור זנים הרומן, כפי שמוצג בסעיף הדיון.
  2. מיד לפני assay, העברת אורגה ניסיוניNisms על צלחת אגר ללא חיידקים ולאפשר נמטודות לנוע בחופשיות במשך 1 דקות כדי להסיר חיידקים עודפים.
    1. אם אורגניזמים ניסיוני חווה תנאי זיהום במהלך 24 שעות לפני assay, להשליך אותם.
  3. פיפטה 1 מ"ל של M9 על צלחת ללא חיידקים לשטוף תולעים לתוך צינור microcentrifuge.
  4. צנטריפוגה ב XG 3000 במשך 1 דקות. תולעים צריך ליצור גלולה בחלק התחתון של הצינור. לשאוב M9 פתרון מבלי לשבש את גלולה תולעת. הוסף 1 מ"ל של M9 כדי גלולה תולעת, להפוך צינור לערבב תולעים עם הפתרון.
  5. חזור על שלבים 1.4 שלוש פעמים נוספות.
    1. אם חיידקים עודפים הועבר בתחילה עם תולעים, לחזור על סך של 5 פעמים. אין חיידקים צריכים להיות מועברים צלחות גזע מזון נחושת. אם המזון מועבר צלחת assay, זה יפריע איסוף נתונים מדויקים.
  6. לאחר לשטוף הסופי, לשאוב supernatant עד 10081, L של M9 ואת גלולה תולעת נשאר.
    זהירות: התנהגויות הקשורות רעב להתברר לאחר 30 דקות. כתוצאה מכך תולעים צריך להיות מועבר מיד מן הפתרון לאחר השלבים השלמה הושלמו.

2. הכנת לוחות Assay

  1. הכנת לוחות אגר NGM סטנדרטי יומיים לפני assay.
    1. אם הצלחות נשמרות בסביבה לחה, לעשות צלחות אגר 3 ימים לפני assay. לחלופין, להסיר את המכסה של הצלחת במשך 3-6 שעות כדי להבטיח יובש נאות (אם בסביבה סטרילית).
  2. עם סמן קבוע עבה, לעשות קו על החלק התחתון של הצלחת לאורך הקצה החיצוני ועוד כדי ליצור מחסום קו באמצע ( איור 1 ). מחסום קו אמצע צריך להיות שווה מכל קצה של הצלחת. השתמש בסרגל כדי להבטיח מדידות מדויקות. קווים אלה ישמשו כמדריך בעת העברת חיידקים פתרון נחושת. ובלבדE. coli מועבר לפני הפתרון נחושת, שורות אלה ישמשו אינדיקטורים.
  3. צלחת זרע עם 50 μL של OP50 E. coli על צד אחד בלבד של המכשול נחושת כדי ליצור דשא אחיד ( איור 2 ). ריכוז בקטריאלי צריך להישאר עקבי על פני מבחני; עם זאת, השתנות מעט נצפתה בתגובה להבדלים מתונים בריכוז.
    1. השתמש בקווים מסומנים על החלק התחתון של הצלחת כדי להבטיח את החיידקים לא באים במגע עם פתרון נחושת. בתנאי שתמיסת הנחושת תוחמת את קצה הצלחת ותיצור מחסום של קו אמצע, תעביר את החיידקים כך שפתרון הנחושת לא יבוא במגע עם מקור המזון.
  4. סמן קבוצה שנייה של צלחות ולהעביר OP50 E. coli להם ( איור 2 ). לוחות אלה ישמשו להעריך את השליטה השלילית. צלחות אלה צריך גם להיותסימון על מחצית הצלחת כדי לציין את מקור ההעברה הראשונית.
  5. אפשר חיידקים לייבש ואז צלחות דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. ודא כי תיקוני בקטריאלי לא מופרעים בעת העברת לחממה 37 מעלות צלזיוס או בחדר. הפרעה מוגזמת יכולה לשנות את המיקום או הצורה של תיקון המזון.

3. Chemotaxis Assay

  1. טרי להכין 0.5 M נחושת (II) סולפט פתרון לפני זמן ההתחלה assay. בתנאי 125 μL של הפתרון משמש לכל צלחת, בהיקף עד נפח זה תלוי במספר צלחות assay בשימוש ( למשל 5 צלחות assay, 625 μL).
  2. פיפטה 100 μL של נחושת (II) סולפט פתרון על קצה של אגר כדי ליצור מחסום נחושת החיצוני. הצד המסומן של הצלחת צריך לשמש כמדריך.
  3. פיפטה 25 μL של נחושת (II) סולפט פתרון ליצור מחסום קו האמצע.
    1. ודא כי הפתרון נחושת (II) סולפט לעשותלא לבוא במגע עם תיקון חיידקי. השתמש בטכניקה מנוקדת כפי streaking עשוי להשפיע על תנועה עקב חריצים / שריטות על אגר.
  4. אפשר פתרון נחושת להתייבש על צלחת. פרק הזמן יכול להשתנות בהתאם לתנאי הצלחת ולמעבדה. בדיקה ויזואלית עבור יובש כל 5 דקות לאחר ההעברה.
    הערה: פתרון הנחושת מציג גוון כחלחל וניתן לזיהוי בקלות. השתמש רקמות מעבדה כדי לטפטף קלות הפתרון ליד קצה הצלחת להבחין יובש.
  5. פיפטה 20 μL של גלולה תולעת מהחלק התחתון של הצינור על חצי חיידקים חינם של צלחת assay.
    1. ודא כי 10 תולעים מועברים צלחת assay. אם תולעים נוספות נכללו בטעות, להסיר אותם על ידי בחירה עם שמן הלוקרבון על מנת להבטיח כי אין חיידקים מתווספים לצלחת. Assay כל צריך להיות מספר עקבי של נמטודות במהלך assay.
      הערה: אם תולעים מעטות מדי הן transfטעה במהלך מבחני, הגדלת גודל המדגם הראשוני יקטין הפסדים פוטנציאליים במהלך שוטף והעברות.
  6. הסר עודף M9 מן הצלחת עם רקמת מעבדה. M9 לא צריך לבוא במגע עם נחושת (II) סולפט פתרון.
    זהירות: ודא כי תולעים משטח אגר להישאר מושפע בעת ביצוע שלב זה. אם משתמשים בחומרה רבה מדי, רקמת המעבדה יכולה ליצור חריצים למשטח אגר של הצלחת והוא יכול להסיר תולעים. תולעים שהוסרו בטעות באמצעות KimWipe צריך להיות מושלך.
  7. לאחר פתרון M9 הוסר וכל התולעים החלו דפוסי קטר לא נוזלי, להתחיל את stopwatch assay.
    1. אופטימלי, להסיר את הפתרון M9 בתוך דקות. הפרמטר החיוני הוא זיהוי התנועה הסינוסואידית. תולעים מקוטעות באופן שונה, למשל מחבט ולא סינוסי, כאשר בנוזל. הפעל את assay להפסיק לצפות פעם אחת של איבר ניסיוניאיסמס מפסיק לחבוט.
  8. בדוק צלחות assay כל 30 דקות.
    1. לקבלת צלחות assay עם תיקונים חיידקיים, ציון חיובי אורגניזמים אם הם מגיעים תיקון מזון על פני 4 שעות. עבור לוחות שליטה שלילית, חיובי ציון אורגניזמים אם הם חצו את המכשול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השתמשנו סוג בר (N2), npr-9 (tm1652), ואת npr-9 overexpression זן, כלומר npr-9 (GF) (IC836 - npr-9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; odr ), כדי להעריך תגובות לרעב ודחיקת נחושת. אורגניזמים מסוג בר מסוגלים לזהות ולהגיב על מחסום נחושת מרתיעה, ואילו מוטציות npr-9 (GF) אינן יוזמות תגובה מרתיעה לנחושת מעל assay 4 שעות 21 . לאחר 30 דקות של רעב, בערך 50 - 60% של סוג בר (N2) אורגניזמים לחצות את מחסום הנחושת ולהגיע תיקון מזון. ב 2 שעה סימן, 75% של סוג בר נמטודות להגיע למקור המזון. עד סוף assay, 100% של אורגניזמים N2 יש relocated למקור מזון. לעומת זאת, רוב האורגניזמים של ה- NF-9 (GF) אינם מווסתים דפוסי קטרה בתגובה למזון וימשיכו לחצות את המחסום המרתיע גם לאחר שבא במגע עם מזוןמָקוֹר. Npr-9 (GF) תולעים ברציפות נכשלים לשנות את התנועה שלהם בתגובה למזון על assay 4 שעות ו רק 30% של אורגניזמים הבדיקה נמצאים על האוכל בכל זמן נתון. Npr-9 (LF) בעלי חיים אינם מבצעים כמו גם אורגניזמים N2, אבל לעשות לווסת את דפוסי קטר כמו הרעב מגביר להגיע תיקון מזון ( איור 3 ). כאשר N2 או npr-9 (LF) אורגניזמים מוערכים באמצעות assay זה ללא מזון, הם רק לעתים נדירות לחצות את המכשול נחושת. NPR-9 (GF) מוטציות שוב ושוב לחצות את המכשול הלוך ושוב ( איור 4 ).

איור 1
איור 1 : ייצוג חזותי של סימונים כדי להצביע על מיקום נחושת מיקום על החלק התחתון של צלחת פטרי 5 ס"מ. סימנים אלה משמשים כדי להבטיח את זהחלקים של הצלחת נמדדו כראוי לשמש כקו מנחה בעת העברת תיקון חיידקי ולאחר מכן פתרון נחושת על פני אגר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2 : צלחת פטרי 5 ס"מ מחולק לשני חלקים עבור לסירוגין פלטות Assay מזון דשא חיידקי נוצרת במרכז אחד של חלקים אלה עבור צלחת על מזון. תיקון מזון לא צריך לבוא במגע עם המתחם הבדיקה אשר שורות את הקצוות של הצלחת ויוצר מחסום קו האמצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

<P class = "jove_content" עבור: keep-together.within-page = "1"> איור 3
איור 3 : אחוז התולעים של N2, npr-9 (tm1652) ו- npr-9 (GF) שמגיעות אל מקור המזון במשך תקופה של ארבע שעות בתגובה לאסוציאציה של מצב נחושת המבוסס על תזונה תזונתית. נקודות הנתונים הן ממוצעים של לפחות שלושה ניסויים (n> 30 תולעים) שבוצעו בימים נפרדים עבור שני זנים. הנתונים מוצגים כ ממוצע ± שגיאת תקן ונותחו עם שני צעדים חוזרים אמצעים ANOVA. ** p <0.01, שונה משמעותית מחיות N2 בתנאים זהים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4 : אחוז של N2, npr-9 (tm1652) ו- npr-9 (GF) או wms כי לחצות את המכשול נחושת ללא מקור מזון במשך Assay ארבע שעות. הזנים הנ"ל הוערכו עבור רתיעה נחושת בהעדר מזון. תגובות חיוביות הם הבקיע כמו חציית מחסום נחושת הנותרים על חצי הלא מקור של הצלחת. נקודות הנתונים הן ממוצעים של לפחות שלושה ניסויים (n> 30 תולעים) שבוצעו בימים נפרדים עבור שני זנים. הנתונים מוצגים כממוצע ± SE ו לפחות 10 בעלי חיים היו assayed בשלושה ניסויים עצמאיים נותחו עם שני צעדים חוזרים אמצעים ANOVA. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עיצוב assay זה משנה את assay גזע מזון 24 לכלול פתרון נחושת כדי ליצור מחסום midline מרתיע סביב קצה הצלחת כדי למנוע אובדן של נמטודות. אורגניזמים נבדקים על יכולתם לחצות את מחסום מרתיע ולהגיע תיקון מזון על פני 4 שעות. בהקשר של npr-9 (GF) , יש לנו ניצלו assay זה כדי להעריך כיצד תנאי רעב יכול להשפיע על תגובות מרתיעה ואיתור מזון. בהינתן שהיינו מאופיינים בעבר ב- Npr-9 (GF) כעל פגמים בהיענות למזון ורמזים מרתיעים, שילבנו רמזים סביבתיים של כפולות עם מצב תזונתי כדי להעריך אם רעב יכול לשנות את התנהגויות ה- NF-9 הפגומות. Assay זה מסתמך על היכולת של תולעת לזהות ולהגיב לגירויים כימיים רמזים מזון 3 , 4 . בהתחשב במשתנים מגוונים לנתח, את התנאים של לשעבריש לשלוט בקפידה על אורגניזמים טרום-ימיים כדי למנוע גורמים מעורפלים. עבור מוטציות uncharacterized, כלומר אלה עם תגובה בלתי מוכרת מרתיעה או מזון, זנים נוספים שליטה צריך להיות מנוצל. יש להעריך גם את הזנים הפגומים, כגון cha -2 או odr-3 28 , ומוטנטים שאינם משנים דפוסי קטר מהאוכל, כגון tph-1 29 , במקביל כדי להבטיח שתנאי הנחושת והרעב מבוקרים כראוי. יתר על כן, כדי להדגיש באופן ישיר יותר את התרומה של רעב להתנהגות המוערך, התנאים assay נפרדים ניתן גם לפתח עבור בקרות נוספות. לדוגמה, נמטודות ניתן להרעיב מיד לפני assay והועברו צלחת assay (עם מזון) כדי לזהות כמה מהר אורגניזם במצב רעב יגיב נחושת להגיע תיקון מזון. Assay הנוכחי שלנו מדגיש avתגובות עזות כמו האורגניזמים הניסוי התקדמות ממצב טוב עד רעב.

Assay שלנו הוא שינוי של C נפוץ cayotaxis ג elegans 4 שבו גירוי חזק יותר ( כלומר ריכוז גבוה) כבר שולבו על מנת להעריך התנהגויות על פני תקופה ארוכה יותר. במקום להעריך תגובות מיידיות, assay זה יכול להיות מנוצל כדי למדוד שינויים תגובות מרתיעה כמו התקדמות אורגניזמים לעבר מדינה מורעבת (אם שולטת הדרושים כלולים). הערכות דומות שימשו בהעדר נחושת על מנת להעריך תגובות אתנול נסיגה, כלומר נמטודות איתור מזון, לאורך זמן 24 .

כמו במקרה עם assay התנהגותי ב C. elegans, שליטה על משתנים סביבתיים חיוני כדי להבטיח תוצאות לשחזור באופן עקבי. אורגניזמים חייבים להיות כולם מאותה אגE, בהתחשב בכך שהתגובות ההתנהגותיות יכולות להשתנות עם הגיל. יתר על כן, השתנות במצב התזונתי של התולעים יכולה לשנות את ההתאמה לתנאי רעב. לכן, תולעים ניסיוני לא צריך לעבור רעב בכל נקודה לפני פרוטוקול זה. חוויית הרעב של דור ההורים יכולה גם להשפיע על התנהגות הצאצאים 30 ; לכן, רצוי להבטיח כי אורגניזמים ניסיוני הם ניזון היטב במשך לפחות שני דורות. יתר על כן, מספר אורגניזמים שהועברו צלחות assay צריך להישאר עקבית בהתחשב בכך צפיפות האוכלוסייה המקומית יכולה להשפיע על שיעורי פיזור 31 . לאחר תולעים הועברו הצלחות, חשוב להסיר את הפתרון M9 עודף עם רקמת מעבדה מבלי לפגוע את פני אגר. שינוי פני השטח עלול להפריע לדפוסי קטר ספונטני. עודף הפתרון צריך להיות הוסר כראוי לפני תחילת רשמי שלAssay כדי להבטיח התנהגות מחבקת, כלומר דפוס קטר nematode שנצפה נוזל, אינו נוכח. מחוון ברור הוא לחפש התנהגות סריקה.

צלחות Assay חייב להיות נשלט כך צלחת יובש חיידקי הם עקביים. צלחות טרי מדי יכול לגרום ליקויים קטרים ​​יכול גם להפריע גילוי של גירויים סביבתיים 6 . היישום של פתרונות נחושת צריך להיות עקבי ככל האפשר, כך מחסומים מרתיעים הם עבים כראוי והם לא באים במגע עם מקור המזון. החלת מעט מדי נחושת פתרון יכול להפחית את סוג בר תגובה תגובה מרתיעה, בעוד יותר מדי יכול להוכיח קטלני נמטודות. מכוון לעובי אחיד לפתרון הנחושת מניב את התוצאות הטובות ביותר. אם החריצים נוצרים אגר במהלך יישום פתרון נחושת, צלחת assay צריך להיות מושלך. תולעים עלולים לחדור דרך חורים כאלה 32, במיוחד כאשר הוא מתמודד עם חומר מרעב או רעב. כדי להבטיח אחידות צלחת בין דגימות, אוכלוסיות מעורבות של תולעים ( כלומר מוטציה סוג בר) ניתן למדוד על צלחת אותו אם אחד היו מסומנים בבירור ( למשל באמצעות GFP).

למרות assay זה בוצע על לוחות בגודל אגר בגודל רגיל, צלחות גדול יותר ניתן להשתמש ( למשל 100 מ"מ קוטר). בתרחיש זה, משך assay צריך להיות המורחבת ל 6 שעות כדי לספק מספיק זמן תנועה תולעת. צלחות גדולות יותר יכולות לאפשר בדיקה של אוכלוסיות גדולות יותר וניתן להשתמש בהן כדי לחקור כיצד צפיפות האוכלוסייה משפיעה על תגובות מרתיעה על פני תקופות זמן ממושכות. יותר טכניקות מתקדמות יכול גם להיות משולב עם השימוש בציוד מעקב תולעת מצמידים לשלב מוביילי 33 . מעקב תולעת יאפשר מדידות מדויקות יותר ולאפשר איסוף של משתנים נוספים ( למשל

Assay ניתן להתאים בקלות לאפשר מדידה של פנוטיפים חלופיים. הגיל של התולעת יכול להיות מגוונות כדי לאפשר מדידות על גיל רעב- induced שינויים מרעישים. יתר על כן, וריאציות למצב התזונתי של התולעים הניסוייות יכולות גם לאפשר ניתוח של הרגלה לרעב בהקשר של מזון ודחייה כימית. כל עוד פרוטוקולים הם עקביים בין ערכות נתונים דומים, כמעט כל מיזוג מראש של אורגניזמים ניסיוני יכול להיות מוערך באמצעות assay chemotaxis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין לנו מה לגלות.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מדעי הטבע והנדסה מועצת המחקר של קנדה גילוי מענק RGPIN36481-08 כדי ויליאם ג 'בנדנה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.] Produced in lab
Cupric Sulfate Sigma C-1297 Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314 (1165), 1-340 (1986).
  2. Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans (October 25, 2006). The C. elegans Research Community, WormBook. , wormbook.1.123.1, http://www.wormbook.org (2006).
  3. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
  4. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 70 (3), 817-821 (1973).
  5. Ramot, D., MacInnis, B. L., Goodman, M. B. Bidirectional temperature-sensing by a single thermosensory neuron in C. elegans. Nat. Neurosci. 11 (8), 908-915 (2008).
  6. Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (22), 8269-8274 (2014).
  7. van Campen, J. S., et al. Sensory modulation disorders in childhood epilepsy. J. Neurodev. Disord. 7 (34), (2015).
  8. Festa, E. K., et al. Neocortical disconnectivity disrupts sensory integration in Alzheimer's disease. Neuropsych. 19 (6), 728-738 (2005).
  9. Boecker, H., et al. Sensory processing in Parkinson's and Huntington's disease: investigations with 3D H(2)(15)O-PET. Brain. 122 (9), 1651-1665 (1999).
  10. Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human disease in Caenorhabditis elegans. Biotechnol. J. 5 (12), 1261-1276 (2010).
  11. O'Reilly, L. P., Luke, C. J., Perlmutter, D. H., Silverman, G. A., Pak, S. C. C. elegans in high-throughput drug discovery. Adv. Drug Deliv. Rev. 0, 247-253 (2014).
  12. Thompson, O. The million mutation project: a new approach to genetics in Caenorhabditis elegans. Genome Res. 23 (10), 1749-1762 (2013).
  13. Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (43), 15512-15517 (2004).
  14. Maricq, A. V., Peckol, E., Driscoll, M., Bargmann, C. I. Mechanosensory signaling in C. elegans mediated by the GLR-1 glutamate receptor. Nat. 378 (6552), 78-81 (1995).
  15. Chalasani, S. H., et al. Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans. Nat. 450 (7166), 63-70 (2007).
  16. Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail. Curr. Biol. 12 (9), 730-734 (2002).
  17. Hart, A. C., Kass, J., Shapiro, J. E., Kaplan, J. M. Distinct signaling pathways mediate touch and osmosensory responses in a polymodal sensory neuron. J. Neurosci. 19 (6), 1952-1958 (1999).
  18. Ishihara, T., et al. HEN-1, a secretory protein with an LDL receptor motif, regulates sensory integration and learning in Caenorhabditis elegans. Cell. 109 (5), 639-649 (2002).
  19. Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. J. Exp. Biol. 204 (10), 1757-1764 (2001).
  20. Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (43), 15512-15517 (2004).
  21. Campbell, J. C., Polan-Couillard, L. F., Chin-Sang, I. D., Bendena, W. G. NPR-9, a Galanin-Like G-Protein Coupled Receptor, and GLR-1 Regulate Interneuronal Circuitry Underlying Multisensory Integration of Environmental Cues in Caenorhabdities elegans. PLoS Genet. 12 (5), (2016).
  22. Harris, G. P., et al. Three distinct amine receptors operating at different levels within the locomotory circuit are each essential for the serotonergic modulation of chemosensation in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 29 (5), 1446-1456 (2009).
  23. Harris, G., et al. Dissecting the serotonergic food signal stimulating sensory-mediated aversive behavior in C. elegans. PLoS One. 6 (7), (2011).
  24. Mitchell, P., et al. A differential role for neuropeptides in acute and chronic adaptive responses to alcohol: behavioural and genetic analysis in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5 (5), (2010).
  25. Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learn Mem. 4 (2), 179-191 (1997).
  26. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genet. 77 (1), 71-71 (1974).
  27. Behavior (July 3, 2006). The C. elegans Research Community, WormBook. Hart, A. C. , wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org (2006).
  28. Sambongi, Y., et al. Sensing of cadmium and copper ions by externally exposed ADL, ASE, ASH neurons elicits avoidance response in Caenorhabditis elegans. NeuroReport. 10 (4), 753-757 (1999).
  29. Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102 (9), 3184-3191 (2004).
  30. Rechavi, O., et al. Starvation-Induced Transgenerational Inheritance of Small RNAs in C. elegans. Cell. 158 (2), 277-287 (2014).
  31. Gloria-Soria, A., Azevedo, R. B. R. npr-1 Regulates Foraging and Dispersal Strategies in Caenorhabditis elegans. Cell. 18 (21), 1694-1699 (2008).
  32. Beron, C., et al. The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: A new assay for the study of neuromuscular disorders. Genes Brain Behav. 14 (4), 357-368 (2015).
  33. Wang, S. J., Wang, Z. W. Track-A-Worm, An Open-Source System for Quantitative Assessment of C. elegans Locomotory and Bending Behavior. PLoS One. 8 (7), (2013).

Tags

נוירוביולוגיה גליון 125, Chemosensation נחושת רעב סלידה chemotaxis מזון
א<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; מצב תזונתיים מבוססי Assay Assersion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Campbell, J. C., Chin-Sang, I. D.,… More

Campbell, J. C., Chin-Sang, I. D., Bendena, W. G. A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay. J. Vis. Exp. (125), e55939, doi:10.3791/55939 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter