Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

EN Published: July 26, 2017 doi: 10.3791/55939
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Biology, Queen's University, 2Centre for Neuroscience, Queen's University

Summary

Her presenterer vi en Caenorhabditis elegans- spesifikke analyse designet for å evaluere endringer i kobberavviksadferd og muligheten til å lokalisere en felles matkilde, ettersom organismen utvikler seg fra en velfødt til sulten ernæringsmessig tilstand.

Abstract

For å sikre overlevelse må organismer være i stand til å unngå ugunstige habitater samtidig som det sikres en konsekvent matkilde. Caenorhabditis elegans endrer deres lokomotivsmønstre ved påvisning av ulike miljøstimuli og kan modulere deres pakke med atferdsrespons som svar på sultforhold. Nematoder utviser vanligvis en redusert aversiv respons når de fjernes fra en matkilde i over 30 minutter. Observasjon av atferdsendringer som svar på en forandret ernæringsstatus kan gi innsikt i mekanismene som regulerer overgangen fra en velmattet til sultet tilstand.

Vi har utviklet en analyse som måler en nematode evne til å krysse en aversive barriere ( dvs. kobber) og nå en matkilde over en lengre periode. Denne protokollen bygger på tidligere arbeid ved å integrere flere variabler på en måte som muliggjør fortsatt datainnsamling når organismer skifter mot aN stadig sultet tilstand. Videre tillater denne analysen en økt prøvestørrelse slik at større populasjoner av nematoder kan evalueres samtidig.

Organer som er defekte for evnen til å oppdage eller reagere på kobber, krysser straks kjemisk barriere, mens wild type nematoder i utgangspunktet avstøtes. Som vill type ormer blir stadig sultet, begynner de å krysse barrieren og nå matkilden. Vi utformet denne analysen for å evaluere en mutant som ikke er i stand til å reagere på ulike miljømessige tegn, inkludert matopplevelse eller påvisning av aversive kjemikalier. Når de ble evaluert via denne protokollen, krysset de defekte organismene straks barrieren, men var heller ikke i stand til å oppdage en matkilde. Derfor krysser disse mutantene gjentatte ganger kjemisk barriere til tross for at de nå en matkilde. Denne analysen kan rett og slett teste populasjoner av ormer for å evaluere potensielle banefeil relatert til aversjon og sult.

Introduction

Caenorhabditis elegans har blitt brukt som en modell for studiet av nevrobiologi i flere tiår på grunn av den relative lettheten ved å analysere kretsen av et nervesystem som består av bare 302 nevroner 1 . Forutsatt at organismen er avhengig av å reagere på miljømessige tegn, er mye av nervesystemet dedikert til å regulere integrasjonen av miljøsignaler 2 . Til tross for enkelheten i nervesystemet, kan C. elegans oppdage og reagere på ulike miljøsignaler, inkludert repellenter 3 , attractants 4 , temperatur 5 og til og med fuktighet 6 . En unnlatelse av å integrere miljøsignaler har blitt knyttet til en rekke av adferdsforstyrrelser og nevrodegenerative tilstander i pattedyrmodellsystemer 7- 9. Med en rekke tilgjengelige neurale sykdomsmodeller 10 i C. elegans og utviklingen av nematode farmasøytiske skjermer 11 , har denne organismen vist seg å være et nyttig system for studiet av neurobiologi. Gitt tilgjengeligheten av en kartlagt nematode-forbindelse 1 og mutasjoner til nesten hvert gen i nematodegenomet 12 , er vår forståelse for nematode-nervesystemet, og i forlengelse vår egen, delvis begrenset av utformingen av kreativt hensiktsmessige analyser.

En rekke kjemotaksanalyser har blitt utviklet de siste 40 årene for å evaluere nematoderesponsivitet til forskjellige aversive stimuli 3 , 4 , 13 , 14 , 15 . Førstegangsforsøk involverte innføringen av en akutt miljøstimulus mens en enkelt orm gikk på en agarplate= "Xref"> 3 , 14 , 16 . Umiddelbare endringer i lokomotivsvar ble registrert. For eksempel kan den flyktige luktende oktanol påføres et hår og vevet foran en nematods nese for å stimulere initieringen av bakover-bevegelse i vildtype ormer 17 . Flere komplekse analyser er også utviklet for å inkorporere flere variabler som et middel til å vurdere atferdsvalg 18 . En variant av denne analysen innebærer bruk av en kobberløsning for å skape en aversiv midterbarriere 4 . Et attraktivt middel, nemlig diacetyl, ble plassert på den ene siden av den kjemiske barrieren med ormer overført fra diacetylkilden. Ormer som er defekte for kobber aversive responser krysset straks barrieren for å nå diacetylen, mens villtype ormer ble opprinnelig avstøt av barrieren. Respons ble scoret da ormer først nærmet seg kobberbarrierenUten langsiktige observasjoner.

Når ormer vurderes etter å ha gjennomgått sultevilkår, blir deres følsomhet for miljøstimuli redusert 19 . Når den aversive kjemiske oktanolen er ventet foran nematodnosen, stimulerer villtype organismer bakoverbevegelse innen 3 - 5 s når de er på mat. Etter at disse organismene er fjernet fra mat i 10 minutter, utviser de en forsinket respons på 8 - 10 s 20 . Således med økt sult, viser nematoder en redusert aversiv respons på skadelige miljøsignaler, ettersom søket etter mat blir mer avgjørende for overlevelse. Omvendt reagerer ikke nematoder som overtrykkende nevropeptidreseptor 9 ( npr-9) på oktanol på eller av mat og viser manglende evne til å reagere på en rekke aversive stimuli 21 . Disse npr-9 (GF) organismer modulerer heller ikke deres reverseringsfrekvens i nærvær av mat, men kanOmvendt som svar på sterke berøringsstimulasjoner som indikerer at de er i stand til bakover-bevegelse 21 . Vi har også vurdert npr-9 (LF) mutanter gitt at de utviser en unormalt redusert reverseringsfrekvens av mat, men kan modulere deres oppførsel i nærvær av mat 21 . Kobling av ormens næringsstatus med innføring av akutte ytre stimuli har hjulpet til å belyse mekanismene ved hvilke en matrelatert vei i stor grad kan modulere sensoriske signalveier 22 , 23 . Tilstedeværelsen av mat i nematode-miljøet har også blitt brukt til å evaluere etanol-tilbaketaksreaksjoner 24 . I dette forsøket ble ormer inkubert i varierende konsentrasjoner av etanol og deretter plassert på en agarplate med en lapp av mat kjent som et "mat-race-assay". Maten lapp ble plassert på en kant av platen mens nematoder wEre plassert vekk fra matkilden. Etanoluttak ble evaluert ved å måle varigheten av tiden som er nødvendig for ormer for å nå maten.

Denne næringsbaserte kobberaversjonstesten bygger på mat-raseanalysen for å integrere ytterligere miljøvariabler, nemlig mat og kobber, mens man vurderer atferdsendringer over tid. Dette er en tilpasning av en vanlig bruk protokoll i hele C. elegans samfunnet 4 . Denne protokollen har blitt brukt til å evaluere aversive responser og påvisning av mat over en fire-timers periode 21 . Siden ormen utviser sultedrag etter 30 minutter med matmangel 25 , kan vi også vurdere hvordan endringer i ernæringsstatus kan påvirke miljøresponsene. Forholdene i denne analysen måler hvordan eksperimentelle organismer forandrer responsiviteten til aversive stimuli over tid, og derfor vurderer det atferdsendringer somOrganismers fremgang mot en sultet tilstand (og fortsatte målinger av langvarig sult). Siden npr-9 (GF) dyrene ikke endrer sin oppførsel som svar på mat eller mange aversive signaler, søkte vi å identifisere om disse beteendeunderskuddene vil fortsette i sammenheng med sult. Til slutt er denne analysesignalet formulert for å spesifikt vurdere npr-9 (GF) mutanter, men kan videre tilpasses til å også karakterisere nye stammer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling av eksperimentelle organismer

  1. Velg 10 L4 iscenesatte nematoder pr. Belastning 24 timer før analysen starter for å sikre at organismer er unge voksne når de testes. For hver mutant eller kontroll nematode testet, velg 10 L4s (10 for kontrollen og 10 for analysen).
    1. Opprettholde L4 organismer ved bruk av standardmetoder 26 , 27 i 24 timer på standard agarplater frøet med OP50 Escherichia coli . Hvis organismer går tapt under de etterfølgende vaskestrinnene, kompensere ved å øke startprøvestørrelsen ( dvs. velg 20 ormer i stedet for 10).
      Merk: Oppførsel er en innativ variabel fenotype. Utfør metoden i tre eksemplarer for hver belastning på tre separate dager. Inkluder ekstra kontrollstammer og betingelser for nye stammer, som fremhevet i diskusjonsseksjonen.
  2. Umiddelbart før analysen, overfør eksperimentell orgaNismer til en agarplate uten bakterier og la nematoder bevege seg fritt i 1 min for å fjerne overflødige bakterier.
    1. Hvis eksperimentelle organismer opplevde forurensningsforhold i løpet av 24 timer før analysen, kast dem.
  3. Pipetter 1 ml M9 på den bakteriefrie platen for å vaske ormer inn i et mikrocentrifugerør.
  4. Sentrifuger ved 3000 xg i 1 min. Ormer skal danne en pellets på bunnen av røret. Aspirer M9-oppløsning uten å forstyrre ormpellet. Tilsett 1 ml M9 til ormpellet, invert rør for å blande ormer med løsningen.
  5. Gjenta trinn 1.4 tre ganger.
    1. Hvis overskytende bakterier ble overført med ormer, gjentas i totalt 5 ganger. Ingen bakterier bør overføres til kobbermatraserplater. Hvis mat overføres til analyseplate, vil det forstyrre nøyaktig datainnsamling.
  6. Etter den endelige vasken, aspirer supernatanten til 10081; L av M9 og ormpellet forblir.
    Forsiktig: Sårrelatert oppførsel blir tydelig etter 30 minutter. Følgelig skal ormer umiddelbart overføres fra løsningen når vaske trinnene er fullført.

2. Fremstilling av analyseplater

  1. Forbered standard NGM agarplater to dager før analysen.
    1. Hvis platene holdes i et fuktig miljø, lager agarplater 3 dager før analysen. Alternativt fjern lokket på platen i 3 - 6 timer for å sikre riktig tørrhet (hvis det er sterilt).
  2. Med en tykk permanent markør, legg en linje på undersiden av platen langs ytterkanten og en annen for å danne en midterlinjebarriere ( figur 1 ). Midtlinjebarrieren skal være like langt fra hver kant av platen. Bruk en linjal for å sikre nøyaktige mål. Disse linjene vil tjene som en guide når man overfører bakterier og kobberløsningen. Forutsatt atE. coli overføres før kobberoppløsningen, disse linjene vil fungere som indikatorer.
  3. Frøplaten med 50 μl OP50 E. coli på kun en side av kobberbarrieren for å skape en jevn plen ( Figur 2 ). Bakteriell konsentrasjon bør forbli konsistent på tvers av analyser; Imidlertid er liten variabilitet observert som følge av milde forskjeller i konsentrasjon.
    1. Bruk de merkede linjene på undersiden av platen for å sikre at bakteriene ikke kommer i kontakt med kobberoppløsningen. Forutsatt at kobberløsningen leder kanten av platen og danner en midterlinjebarriere, overfør bakteriene slik at kobberløsningen ikke kommer i kontakt med matkilden.
  4. Merk et annet sett med plater og overfør ingen OP50 E. coli til dem ( Figur 2 ). Disse platene vil tjene til å evaluere den negative kontrollen. Disse platene skal også ha enMerking på den ene halvdelen av platen for å betegne den opprinnelige overføringsopprinnelsen.
  5. La bakteriene tørke og inkuber plater ved 37 ° C over natten. Sørg for at bakterielle flekker ikke forstyrres ved overføring til 37 ° C inkubator eller rom. Overdreven forstyrrelse kan endre plasseringen av maten på maten.

3. Chemotaxis Assay

  1. Frisk tilbered en 0,5 M kobber (II) sulfatløsning før analysestarttid. Forutsatt at 125 μl av oppløsningen blir brukt per plate, skal du oppskalere dette volumet, avhengig av antall analyserte plater som brukes ( f.eks. 5 analyseplater, 625 μL).
  2. Pipetter 100 μL av kobber (II) sulfatløsning på kant av agar for å skape en ytre kobberbarriere. Den markerte undersiden av platen skal tjene som en guide.
  3. Pipetter 25 μL av kobber (II) sulfatoppløsningen for å skape en midtlinjebarriere.
    1. Sørg for at kobber (II) sulfatoppløsningen gjørIkke komme i kontakt med bakteriell lapp. Bruk en flekkete teknikk som strekk kan påvirke bevegelsen på grunn av indrykk / riper på agar.
  4. La kobberoppløsningen tørke på platen. Tidsperioden kan variere avhengig av platen og laboratorieforholdene. Vis sjekk for tørrhet hvert 5. minutt etter overføring.
    Merk: Kobberløsningen viser en blåaktig fargetone og er lett identifiserbar. Bruk et laboratorievev for å løsne løsningen nær kanten av platen for å oppdage tørrhet.
  5. Pipetter 20 μl av ormpellet fra bunnen av røret på den bakteriefrie halvparten av analyseplaten.
    1. Sørg for at 10 ormer overføres til analyseplaten. Hvis ekstra ormer ble tatt med ved et uhell, fjern dem ved å plukke med halokarbonolje for å sikre at ingen bakterier legges til platen. Hvert assay bør ha et konsistent antall nematoder under analysen.
      MERK: Hvis for få ormer er transfFeilt under analyser, vil økning av opprinnelig prøvestørrelse redusere potensielle tap under vasker og overføringer.
  6. Fjern overskytende M9 fra platen med et laboratorievev. M9 bør ikke komme i kontakt med kobber (II) sulfatoppløsningen.
    Forsiktig: Pass på at ormer og agarflaten forblir upåvirket når du utfører dette trinnet. Hvis det brukes for hardt, kan laboratorievævet skape innrykk i agarflaten på platen og kan fjerne ormer. Ormer som ved et uhell er fjernet via KimWipe, må kasseres.
  7. Når M9-løsningen er fjernet, og alle ormer har påbegynt ikke-flytende lokomotormønstre, starter analyseklokkeuret.
    1. Fjern M9-løsningen optimalt innen en min. Den viktige parameteren er identifikasjon av sinusformet lokomotiv. Worms lokomote annerledes, for eksempel thrashing heller enn sinusformet, når i væske. Start analysen stopp stoppet en gang hver av eksperimentell organIsms stopper thrashing.
  8. Kontroller testplater hver 30 min.
    1. For assayplater med bakterielle flekker, positivt score organismer hvis de når maten lapp over en 4 h periode. For de negative kontrollplattene, score positivt organismer hvis de har krysset barrieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi benyttet villtype (N2), npr-9 (tm1652) og en npr-9 overekspresjonstamme, dvs. npr-9 (GF) (IC836 - npr-9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; odr -1 :: rfp), for å evaluere respons på sult og kobberaversjon. Vildtyporganismer er i stand til å detektere og reagere på den aversive kobberbarrieren, mens npr-9 (GF) -mutanter ikke initierer en aversiv respons på kobberet over 4 h-analysen 21 . Etter 30 minutter av sult krysser omtrent 50 - 60% av vildtype (N2) -organismer kobberbarrieren og når maten. Ved 2 h-merket når 75% av vildtype nematoder matkilden. Ved slutten av analysen har 100% av N2 organismer flyttet til matkilden. I motsetning til dette modulerer flertallet av npr-9 (GF) organismer ikke lokomotivmønstre som svar på mat og vil fortsette å krysse aversive barriere selv etter at de kommer i kontakt med matkilde. Npr-9 (GF) ormene mislykkes kontinuerlig i å endre deres fremdrift som respons på mat over 4-h-analysen, og bare 30% av testorganismer er funnet på maten til enhver tid. Npr-9 (LF) dyrene utfører ikke så vel som N2-organismer, men modulerer deres lokomotivsmønstre etter hvert som sulten øker for å nå matoppdateringen ( figur 3 ). Når N2 eller npr-9 (LF) organismer evalueres via denne analysen uten mat, krysser de sjelden kobberbarrieren. Npr-9 (GF) mutanter krysse gjentatte ganger barrieren frem og tilbake ( figur 4 ).

Figur 1
Figur 1 : En visuell representasjon av markeringer for å angi kobberoppløsningsplassering på undersiden av en 5 cm petriskål. Disse indikasjonene brukes til å sikre atDelene av platen er blitt målt riktig og tjener som en veiledning når overføring av bakteriell lapp og deretter kobberoppløsning på agaroverflaten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2 : Petriskålen på 5 cm er delt inn i to seksjoner for på og av matanalyseplater og en bakteriell plen er dannet i midten av en av disse seksjonene for matplaten. Maten lapp skal ikke komme i kontakt med testforbindelsen som linjer kantene på platen og danner en midterbarriere. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

<P class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Figur 3
Figur 3 : Prosent av N2, npr-9 (tm1652) og npr-9 (GF) ormer som når matkilden over en fire-timers periode som svar på næringsstatusbasert kobber-aversjonsanalyse. Datapunkter er gjennomsnitt på minst tre eksperimenter (n> 30 ormer) utført på separate dager for begge stammene. Data presenteres som gjennomsnittlig ± standardfeil og analyseres med toveis gjentatte tiltak ANOVA. ** p <0,01, vesentlig forskjellig fra N2 dyr under identiske forhold. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4 : Prosent av N2, npr-9 (tm1652) og npr-9 (GF) W orms som krysser kobberbarrieren uten matkilde over en fire timers analyse. De nevnte stammer ble evaluert for kobberaversjon i fravær av mat. Positive svar blir scoret som krysser kobberbarrieren og gjenstår på halvparten av platen uten opprinnelse. Datapunkter er gjennomsnitt på minst tre eksperimenter (n> 30 ormer) utført på separate dager for begge stammene. Data presenteres som gjennomsnittlig ± SE og minst 10 dyr ble analysert i tre uavhengige eksperimenter analysert med toveis gjentatte tiltak ANOVA. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne analysesignal modifiserer matkjøringsanalysen 24 for å inkludere en kobberløsning for å skape en aversiv midterbarriere og rundt kanten av platen for å forhindre tap av nematoder. Organer testes for deres evne til å krysse aversive barriere og nå en matrett i løpet av en 4 h periode. I sammenheng med npr-9 (GF) har vi benyttet denne analysen for å vurdere hvordan sultningsforholdene kan påvirke aversive responser og påvisning av mat. Forutsatt at vi tidligere hadde karakterisert npr-9 (GF) som defekt for følsomhet mot mat og aversive signaler, kombinerte vi multipliser miljøveiledninger med næringsstatus for å vurdere om sult kunne modulere den defekte npr-9 (GF) atferd. Denne analysen er avhengig av en orms evne til å detektere og reagere på kjemiske stimuli og matvaresignaler 3 , 4 . Gitt de forskjellige variablene som analyseres, vil betingelsene for exPerimental organismer må kontrolleres nøye for å eliminere forstyrrende faktorer. For ukarakteriserte mutanter, det vil si de med ukjent aversive eller matresponsivitet, vil det bli behov for ytterligere kontrollstammer. Aversive defekte stammer, for eksempel che-2 eller odr-3 28 , og mutanter som ikke endrer lokomotivsmønstre av mat, f.eks. Tph-1 29 , bør også evalueres parallelt for å sikre at kobber- og sultningsforholdene styres på riktig måte. Videre, for å mer direkte fremheve bidraget av sult til den evaluerte oppførselen, kan separate analysevilkår også utvikles for ytterligere kontroller. For eksempel kan nematoderne sultes umiddelbart før analysen og overføres til analyseplaten (med mat) for å identifisere hvor raskt en organisme i en sultet tilstand vil reagere på kobber og nå matoppdateringen. Vår nåværende analyse fremhever avErstatningsresponser som de eksperimentelle organismene utvikler seg fra en velmattet til sultet tilstand.

Vår analyse er en modifisering av den brukte C. elegans chemotaxis-analysen 4 der en sterkere stimulus ( dvs. høy konsentrasjon) er innarbeidet for å evaluere atferd over en lengre tidsperiode. I stedet for å evaluere øyeblikkelige svar, kan denne analysen benyttes til å måle endringer i aversive responser når organismer går videre mot en sultet tilstand (hvis nødvendige kontroller er inkludert). Liknende evalueringer har blitt brukt i mangel av kobber for å evaluere etanol-tilbaketaksresponser, dvs. nematoder som lokaliserer mat over tid 24 .

Som det er tilfelle med en hvilken som helst adferdsanalyse i C. elegans, er kontroll av miljøvariabler avgjørende for å sikre konsekvent reproducerbare resultater. Organismer må alle være av samme agE, gitt at atferdsresponsene kan variere med alder. Videre kan variabiliteten i ormestatusenes næringsstatus endre akklimatisering til sultforhold. Derfor bør de eksperimentelle ormene ikke gjennomgå sult på noe tidspunkt før denne protokollen. Hjerteopplevelsen av foreldrenes generasjon kan også påvirke avkomferd 30 ; Det er derfor tilrådelig å sikre at de eksperimentelle organismene er godt matet i minst to generasjoner. Videre bør antall organismer som overføres til analyseplatene forbli konsistente, gitt at lokalbefolkningens tetthet kan påvirke dispergeringshastighetene 31 . Når ormer er blitt overført til platene, er det avgjørende å fjerne overflødig M9-løsning med et laboratorievev uten å skade agaroverflaten. Endring til overflaten kan forstyrre spontane lokomotormønstre. Overflødig løsning må fjernes på riktig måte før den offisielle starten påAnalysen for å sikre at thrashing oppførsel, det vil si et nematode lokomotory mønster observert i væske, er ikke til stede. En klar indikator er å lete etter gjennomsøkingsadferd.

Analyseplater må styres slik at platen og bakterietørrheten er konsistente. Altfor friske plater kan forårsake lokomotivfeil og kan også forstyrre gjenkjenning av miljøstimuler 6 . Anvendelsen av kobberløsninger må være så konsekvent som mulig, slik at aversive barrierer er passende tykke og de kommer ikke i kontakt med matkilden. Anvendelse av for lite kobberoppløsning kan redusere villetypens aversive responstid, mens for mye kan være dødelig for nematoder. Målet for en jevn tykkelse på kobberoppløsningen gir de beste resultatene. Hvis innrykk er opprettet i agar under kobberoppløsningsapplikasjon, må analyseplaten kasseres. Ormer kan komme gjennom slike hull 32, Spesielt når de står overfor en aversiv substans eller sult. For å sikre plateuniformitet blant prøver, kunne blandede populasjoner av ormer ( dvs. en mutant og vilt type) måles på samme plate hvis man var tydelig merket ( f.eks. Via GFP).

Selv om denne analysen ble utført på agarplater av standard størrelse, kan større plater brukes ( f.eks. 100 mm diameter). I dette scenariet bør analysens varighet forlenges til 6 timer for å gi tilstrekkelig tid til ormbevegelse. Større plater kan muliggjøre testing av større populasjoner og kunne brukes til å undersøke hvordan befolkningstetthet påvirker aversive responser over lengre tidsperioder. Mer teknisk avanserte prosedyrer kan også innarbeides ved bruk av ormsporingsutstyr koblet til et bevegelig stadium 33 . Ormsporing vil muliggjøre mer nøyaktige målinger og tillate innsamling av flere variabler ( f.eks

Analysen kan lett tilpasses for å muliggjøre måling av alternative fenotyper. Alderen på ormen kan varieres for å muliggjøre målinger på aldersrelaterte sult-inducerte aversive forandringer. Videre kan variasjoner i næringsstatusen til de eksperimentelle ormene også muliggjøre analyse av habituasjon til sult i sammenheng med mat og kjemisk aversjon. Så lenge protokollene er konsistente blant sammenlignbare datasett, kan nesten hvilken som helst forkondisjonering av eksperimentelle organismer evalueres via kjemotaksanalysen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Naturvitenskaps- og ingeniørforskningsrådet i Canada Discovery Grant RGPIN36481-08 til William G. Bendena.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.] Produced in lab
Cupric Sulfate Sigma C-1297 Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314 (1165), 1-340 (1986).
  2. Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans (October 25, 2006). The C. elegans Research Community, WormBook. , wormbook.1.123.1, http://www.wormbook.org (2006).
  3. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
  4. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 70 (3), 817-821 (1973).
  5. Ramot, D., MacInnis, B. L., Goodman, M. B. Bidirectional temperature-sensing by a single thermosensory neuron in C. elegans. Nat. Neurosci. 11 (8), 908-915 (2008).
  6. Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (22), 8269-8274 (2014).
  7. van Campen, J. S., et al. Sensory modulation disorders in childhood epilepsy. J. Neurodev. Disord. 7 (34), (2015).
  8. Festa, E. K., et al. Neocortical disconnectivity disrupts sensory integration in Alzheimer's disease. Neuropsych. 19 (6), 728-738 (2005).
  9. Boecker, H., et al. Sensory processing in Parkinson's and Huntington's disease: investigations with 3D H(2)(15)O-PET. Brain. 122 (9), 1651-1665 (1999).
  10. Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human disease in Caenorhabditis elegans. Biotechnol. J. 5 (12), 1261-1276 (2010).
  11. O'Reilly, L. P., Luke, C. J., Perlmutter, D. H., Silverman, G. A., Pak, S. C. C. elegans in high-throughput drug discovery. Adv. Drug Deliv. Rev. 0, 247-253 (2014).
  12. Thompson, O. The million mutation project: a new approach to genetics in Caenorhabditis elegans. Genome Res. 23 (10), 1749-1762 (2013).
  13. Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (43), 15512-15517 (2004).
  14. Maricq, A. V., Peckol, E., Driscoll, M., Bargmann, C. I. Mechanosensory signaling in C. elegans mediated by the GLR-1 glutamate receptor. Nat. 378 (6552), 78-81 (1995).
  15. Chalasani, S. H., et al. Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans. Nat. 450 (7166), 63-70 (2007).
  16. Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail. Curr. Biol. 12 (9), 730-734 (2002).
  17. Hart, A. C., Kass, J., Shapiro, J. E., Kaplan, J. M. Distinct signaling pathways mediate touch and osmosensory responses in a polymodal sensory neuron. J. Neurosci. 19 (6), 1952-1958 (1999).
  18. Ishihara, T., et al. HEN-1, a secretory protein with an LDL receptor motif, regulates sensory integration and learning in Caenorhabditis elegans. Cell. 109 (5), 639-649 (2002).
  19. Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. J. Exp. Biol. 204 (10), 1757-1764 (2001).
  20. Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (43), 15512-15517 (2004).
  21. Campbell, J. C., Polan-Couillard, L. F., Chin-Sang, I. D., Bendena, W. G. NPR-9, a Galanin-Like G-Protein Coupled Receptor, and GLR-1 Regulate Interneuronal Circuitry Underlying Multisensory Integration of Environmental Cues in Caenorhabdities elegans. PLoS Genet. 12 (5), (2016).
  22. Harris, G. P., et al. Three distinct amine receptors operating at different levels within the locomotory circuit are each essential for the serotonergic modulation of chemosensation in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 29 (5), 1446-1456 (2009).
  23. Harris, G., et al. Dissecting the serotonergic food signal stimulating sensory-mediated aversive behavior in C. elegans. PLoS One. 6 (7), (2011).
  24. Mitchell, P., et al. A differential role for neuropeptides in acute and chronic adaptive responses to alcohol: behavioural and genetic analysis in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5 (5), (2010).
  25. Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learn Mem. 4 (2), 179-191 (1997).
  26. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genet. 77 (1), 71-71 (1974).
  27. Behavior (July 3, 2006). The C. elegans Research Community, WormBook. Hart, A. C. , wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org (2006).
  28. Sambongi, Y., et al. Sensing of cadmium and copper ions by externally exposed ADL, ASE, ASH neurons elicits avoidance response in Caenorhabditis elegans. NeuroReport. 10 (4), 753-757 (1999).
  29. Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102 (9), 3184-3191 (2004).
  30. Rechavi, O., et al. Starvation-Induced Transgenerational Inheritance of Small RNAs in C. elegans. Cell. 158 (2), 277-287 (2014).
  31. Gloria-Soria, A., Azevedo, R. B. R. npr-1 Regulates Foraging and Dispersal Strategies in Caenorhabditis elegans. Cell. 18 (21), 1694-1699 (2008).
  32. Beron, C., et al. The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: A new assay for the study of neuromuscular disorders. Genes Brain Behav. 14 (4), 357-368 (2015).
  33. Wang, S. J., Wang, Z. W. Track-A-Worm, An Open-Source System for Quantitative Assessment of C. elegans Locomotory and Bending Behavior. PLoS One. 8 (7), (2013).

Tags

Neurobiologi utgave 125, Kjemosensasjon kobber sult aversjon kjemotaks mat
EN<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Næringsstatusbasert kobber-aversjonsanalyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Campbell, J. C., Chin-Sang, I. D.,… More

Campbell, J. C., Chin-Sang, I. D., Bendena, W. G. A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay. J. Vis. Exp. (125), e55939, doi:10.3791/55939 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter