Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

bir Published: July 26, 2017 doi: 10.3791/55939
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Biology, Queen's University, 2Centre for Neuroscience, Queen's University

Summary

Burada, organizmanın iyi beslenmiş bir beslenme durumundan aç kalmış beslenme durumuna geçmesiyle bakırdan kaçınma davranışındaki ve ortak bir besin kaynağını bulma yeteneğini değerlendirmek için tasarlanmış Caenorhabditis elegans spesifik bir analiz sunuyoruz.

Abstract

Canlılığı sağlamak için organizmalar, tutarlı bir gıda kaynağı temin ederken, olumsuz habitatlardan kaçınabilmelidir. Caenorhabditis elegans , çeşitli çevresel uyarıların saptanması üzerine lokomotif kalıplarını değiştirir ve açlık koşullarına cevaben davranışsal tepkiler setini modüle edebilir. Nematodlar tipik olarak, bir gıda kaynağından 30 dakika boyunca çıkarıldığında azaltılmış aversive yanıtı sergiler. Değişen bir beslenme durumuna yanıt olarak davranış değişikliklerinin gözlenmesi, iyi beslenmiş bir durumdan aç bırakılan bir duruma geçişi düzenleyen mekanizmalara dair bilgiler sağlayabilir.

Nematodun caydırıcı bir bariyerden ( mesela bakır) geçme yeteneğini ölçen bir deney geliştirdik ve daha sonra uzunca bir süre bir gıda kaynağına ulaştık. Bu protokol, önceki çalışmalara, organizmaların bir aya doğru kaymasıyla devam eden veri toplamanın yapılmasına izin verecek şekilde çoklu değişkenleri entegre ederek oluşturmaktadırGiderek açlık çeken durum. Dahası, bu tahlil, daha büyük popülasyon nematodların eşzamanlı olarak değerlendirilebilmesi için, numune sayısının arttırılmasına izin verir.

Bakır tespit etme veya tepki verme yeteneğine sahip olmayan organizmalar, kimyasal bariyerden geçerler, vahşi tip nematodlar başlangıçta itilir. Vahşi tip solucanlar giderek açlığa kavuştuğundan bariyerini aşmaya ve besin kaynağına ulaşmaya başlarlar. Bu tahlil, gıda sansasyonu veya caydırıcı kimyasalların saptanması da dahil olmak üzere çeşitli çevresel ipuçlarına cevap veremeyen bir mutantı değerlendirmek üzere tasarlandı. Bu protokol aracılığıyla değerlendirildiğinde, kusurlu organizmalar hemen engelden geçtiler, ancak bir gıda kaynağını bulamıyorlardı. Dolayısıyla, bu mutantlar geçici olarak bir besin kaynağına ulaşmalarına rağmen kimyasal bariyerini tekrar tekrar aşar. Bu tahlil, kaçınma ve açlık ile ilgili potansiyel yol hatalarını değerlendirmek için solucan popülasyonlarını basitçe test edebilir.

Introduction

Caenorhabditis elegans , sadece 302 nöron 1'den oluşan bir sinir sisteminin devresini analiz etmede göreli kolaylık nedeniyle onlarca yıldır nörobiyolojinin çalışması için bir model olarak kullanılmıştır. Organizmanın çevresel ipuçlarına tepki vermeye güvenmesi koşuluyla, sinir sisteminin büyük bir kısmı çevresel sinyallere entegrasyonu düzenlemekle yükümlüdür 2 . Sinir sisteminin sadeliğine rağmen, C. elegans , kovucular 3 , cezbediciler 4 , sıcaklık 5 ve hatta nem 6 da dahil olmak üzere çeşitli çevresel sinyaller algılar ve bunlara cevap verebilir. Doğru çevreye sinyalleri entegre bir başarısızlık memeli model sistemlerinde 7 9 davranışsal bozukluklar ve nörodejeneratif hastalıklardan bir dizi ile bağlantılı olmuştur. Bir dizi mevcut nevral hastalık modeli ile 10 C. elegans'da ve nematod farmasötik eleklerinin 11 gelişiminde, bu organizmanın nörobiyolojinin çalışması için yararlı bir sistem olduğu kanıtlanmıştır. Nematod genomu 12'de eşlenen bir nematod bağlantı 1 ve mutasyonların neredeyse her bir geninin varlığı göz önüne alındığında, nematod sinir sistemini ve kendi uzantımızı anlayışımız kısmen yaratıcı uygun tahliller tasarlamakla sınırlıdır.

Çeşitli caydırıcı uyaranlara nematod tepkilerini değerlendirmek için son 40 yılda bir dizi kemotaks testi geliştirildi 3 , 4 , 13 , 14 , 15 . İlk deneme, akut bir çevresel uyaranın ortaya çıkmasına neden olurken, tek bir solucan bir agar plakasında gezindi= "Xref"> 3 , 14 , 16 . Lokomotif cevaplardaki ani değişiklikler kaydedildi. Örneğin, uçucu koku oktanol bir saç teline uygulanabilir ve yabani tip solucanlarda geriye doğru hareket hareketini başlatmak için bir nematodun burnunun önüne fırlayabilir 17 . Daha karmaşık tahlilleri de davranışsal seçim 18 değerlendiren bir araç olarak birden çok değişkeni birleştirmek için geliştirilmiştir. Bu tahlilin bir varyasyonu, caydırıcı bir orta hat bariyeri 4 oluşturmak için bir bakır solüsyonunun kullanılmasını gerektirir. Bir çekici, yani diasetil, kimyasal bariyerin bir tarafına kondu ve solucanlar diasetil kaynağından uzaklaştırıldı. Kurşunsuz yanıt için arızalı solucanlar hemen diasetil ulaşmak için engel geçti, vahşi tip solucanlar başlangıçta bariyer tarafından itildi. Solucanlar ilk önce bakır bariyere yaklaştığında tepkiler alındıUzun süreli gözlem olmadan.

Açlık koşullarından sonra solucanlar değerlendirildiğinde çevresel uyaranlara olan duyarlılığı azaltılır 19 . Caner oktanol, nematod burununun önüne savurulduğunda, yabani tip organizmalar gıdaya çıktığında 3-5 saniye içinde geriye doğru harekete neden olurlar. Bu organizmalar 10 dakika süreyle gıdalardan çıkarıldıktan sonra 8-10 s'lik bir gecikmeli yanıt veriyorlar 20 . Böylece, açlıktan arttıkça, nematodlar zararlı çevresel sinyallere karşı azaltılmış aversive bir yanıt sergilemektedir; çünkü gıda araması hayatta kalmak için daha önemli hale gelir. Tersine, nöropeptid reseptör 9'u ( npr-9) aşırı miktarda eksprese eden nematodlar, gıda üzerindeki veya dışı oktanol üzerine cevap vermez ve birtakım aversif uyaranlara cevap vermede yetersizlik sergiler 21 . Bu npr-9 (GF) organizmaları aynı zamanda, gıda varlığında reversal frekanslarını modüle etmezler, ancakSert dokunuş uyarılarına karşılık olarak geriye doğru hareket etme yeteneğine sahip olduklarını gösterir 21 . Ayrıca npr-9 (LF) mutantlar, gıda 21 varlığında davranışlarını modüle edebilir ancak gıda dışı bir anormal seviyede azalmış ters frekans sergileyen verilen değerlendirilmiştir. Akut dış uyaranların tanıtımıyla solucanının beslenme durumunu bağlanması, bir gıda ile ilgili yol genel olarak duyu sinyallemesini modüle hangi mekanizma ile açıklık destekli olan 23, 22 geçiş yolu. Nematod ortamında gıdaların varlığı da etanol geri çekilme yanıtlarını değerlendirmek için kullanılmıştır 24 . Bu deneyde, solucanlar çeşitli konsantrasyonlarda etanol içinde kuluçkalanır ve daha sonra bir "gıda yarış tahlili" olarak bilinen bir gıda yamasına sahip bir agar plakası üzerine yerleştirilir. Yemek yaması plakanın bir kenarına yerleştirilirken nematodlar wYiyecek kaynağından uzak durdu. Etanol çekimi, solucanların yiyecek yamasına ulaşmaları için gereken süreyi ölçerek değerlendirildi.

Bu beslenme esasına dayanan bakır kaçınma analizi, zaman içindeki davranış değişikliklerini değerlendirirken ek çevre değişkenlerini (gıda ve bakır) entegre etmek için gıda yarış testine dayanıyor. Bu C. elegans topluluğu genelinde yaygın olarak kullanılan bir protokolün uyarlanmasıdır 4 . Bu protokol, caydırıcı tepkiler ve dört saatlik bir süre üzerinde 21 gıda saptanmasını değerlendirmek için kullanılmıştır. Solucan, 30 dakika gıda yoksunluğundan 25 sonra açlık davranışları sergilediğinden, beslenme durumundaki değişikliklerin çevresel cevapları nasıl etkileyebileceğini de değerlendirebiliyoruz. Bu deneyin koşulları, deneysel organizmaların zaman içinde aversive uyaranlara yanıt verme şeklini ölçer, bu nedenle davranış değişiklikleri şu şekilde değerlendirilir:Organizmalar açlık durumuna doğru ilerledikçe (ve uzun süren açlık ölçümlerine devam ederler). Npr-9 (GF) hayvanları, besin ya da birçok caydırıcı ipucu karşısında davranışlarını değiştirmediğinden, bu davranış açıklarının açlık bağlamında devam edip etmeyeceğini tespit etmeye çalıştık. Sonuçta, bu tahlil tasarımı npr-9 (GF) mutantlarını spesifik olarak değerlendirmek üzere formüle edilmiştir, ancak yeni suşları karakterize etmek için daha da uyarlanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Deneysel Organizmaların Hazırlanması

  1. Test yapılan organizmaların genç erişkin olmasını sağlamak için tahlile başlamadan 24 saat önce 10 L4 safhalı nematod seçin. Test edilen her mutant veya kontrol nematodu için 10 L4s seçin (kontrol için 10, test için 10).
    1. L4 organizmalarını standart yöntemler 26 , 27 kullanarak 24 saat süreyle OP50 Escherichia coli ile tohumlanan standart agar plakaları üzerinde muhafaza edin. Organizmalar sonraki yıkama adımlarında kaybolursa, başlangıç ​​örneği boyutunu arttırarak telafi edin ( örn . 10'dan çok 20 solucan alın).
      Not: Davranış doğuştan değişken fenotiptir. Her bir suş için üç ayrı gün içinde yöntemi üç kez gerçekleştirin. Tartışma bölümünde vurgulandığı gibi, yeni soylar için ek kontrol soyları ve koşulları ekleyin.
  2. Testten hemen önce deneysel orgaBakteri içermeyen bir agar plakasına yerleştirin ve aşırı miktarda bakteri çıkarmak için nematodların 1 dakika boyunca serbestçe hareket etmesine izin verin.
    1. Deney organizmaları deneyden 24 saat önce kontaminasyon koşullarına maruz kaldıysa onları atın.
  3. Mikrosantrifüj tüpüne solucanlar yıkamak için bakteri içermeyen plaka üzerine 1 mL M9 pipetle.
  4. 1 dakika 3,000 xg'de santrifüjleyin. Solucanlar tüpün altına bir pelet oluşturmalıdır. Solucan peletini bozmadan M9 solüsyonunu aspire. Solucan topağına 1 mL M9 ilave edin, solucanları çözeltiyle karıştırmak için tübü tersine çevirin.
  5. Adımları 1.4 üç kez tekrarlayın.
    1. Aşırı bakteri başlangıçta solucanlarla nakledilirse, toplam 5 kez tekrarlayın. Bakır yiyecek yarışı plakalarına hiçbir bakteri aktarılmamalıdır. Gıda, tahlil plakasına aktarılırsa, doğru veri toplanmasını engelleyecektir.
  6. Nihai yıkamadan sonra, yüzer maddeyi 100'e kadar aspire edin81, L of M9 ve solucan peleti kalır.
    Dikkat: Açlık ile ilgili davranışlar 30 dakika sonra belirginleşti. Sonuç olarak yıkama adımları tamamlandıktan sonra solucanlar çözeltiden hemen aktarılacaktır.

2. Deney Tabakalarının Hazırlanması

  1. Testten iki gün önce standart NGM agar plakaları hazırlayın.
    1. Plakalar nemli bir ortamda muhafaza edildiyse, deneyden 3 gün önce agar plakaları yapın. Alternatif olarak, düzgün bir kuruluğun sağlanması için (steril bir ortamda ise) 3-6 saat plakanın kapağını çıkarın.
  2. Kalın bir kalıcı işaretleyiciyle, dış kenar boyunca plakanın alt tarafında bir çizgi oluşturun ve bir orta hat bariyeri oluşturmak için bir başka çizgi oluşturun ( Şekil 1 ). Orta hat bariyeri plakanın her kenarından eşit mesafede olmalıdır. Kesin ölçümler yapmak için bir cetvel kullanın. Bu çizgiler, bakteri ve bakır çözeltisini transfer ederken bir rehber görevi görecektir. ŞartıylaE. coli bakır solüsyonundan önce transfer edilir, bu hatlar göstergeler olarak görev yapar.
  3. Düzgün çim oluşturmak için bakır bariyerin sadece bir tarafında 50 μL OP50 E. coli tohum plakası ( Şekil 2 ). Bakteriyel konsantrasyon deneyler arasında tutarlı olmalıdır; Bununla birlikte, konsantrasyonda hafif farklılıklara yanıt olarak küçük değişkenlik gözlemlenmiştir.
    1. Bakterilerin bakır çözeltisiyle temas etmemesini sağlamak için plakanın altındaki işaretli çizgileri kullanın. Bakır solüsyonun plakanın kenarını çizmesi ve orta hat bariyeri oluşturması koşuluyla, bakteri transferini yaparak bakır solüsyonu gıda kaynağı ile temas etmemelidir.
  4. İkinci bir tabak tabakasını işaretleyin ve onlara hiçbir OP50 E. coli aktarmayın ( Şekil 2 ). Bu plakalar negatif kontrolü değerlendirmeye yarayacak. Bu plakaların da birPlakanın yarısına başlangıç ​​transferini bildirmek için işaretleme.
  5. Bakterilerin kurutulmasına izin verin ve plakaları 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin. 37 ° C inkübatör veya odaya transfer ederken bakteri lekelerinin rahatsız edilmemesine dikkat edin. Aşırı rahatsızlık yiyecek yamasının yerini veya şeklini değiştirebilir.

3. Kemotaksis Deneyi

  1. Deney başlama saatinden önce 0.5 M bakır (II) sülfat solüsyonu hazırlayın. Tablet başına 125 μL solüsyon kullanılıyorsa, bu hacmi kullanılan tahlil plakalarının sayısına bağlı olarak ölçeklendirin ( örn. 5 deney plakası, 625 μL).
  2. Bir dış bakır bariyer oluşturmak için agar kenarında bakır (II) sülfat çözeltisi 100 mcL Pipet. Tabağın işaretli alt kısmı bir rehber görevi görmelidir.
  3. Orta hat bariyeri oluşturmak için 25 μL bakır (II) sülfat solüsyonu pipetleyin.
    1. Bakır (II) sülfat çözeltisinin,Bakteriyel yama ile temasa girmez. Çizgi, agara girinti / çiziklerden dolayı hareketleri etkileyebileceğinden lekeli bir teknik kullanın.
  4. Bakır solüsyonunun tabağa kurutulmasına izin verin. Süre plaka ve laboratuvar koşullarına bağlı olarak değişebilir. Aktarımdan sonra her 5 dakikada bir kuruluk olup olmadığını gözle kontrol edin.
    Not: Bakır çözeltisi mavimsi renk tonunu gösterir ve kolaylıkla teşhis edilebilir. Kuru- luğu ayırt edebilmek için çözeltiyi plakanın kenarına hafifçe vurmak için bir laboratuar dokusu kullanın .
  5. Tüpün altından tahlil plakasının bakteri içermeyen yarısına 20 mL'lik solucan peleti pipetleyin.
    1. Tahlil plakasına 10 solucanın aktarılmasını sağlayın. İlave solucanlar yanlışlıkla içerildiyse, plakaya hiçbir bakteri eklenmediğinden emin olmak için halokarbon yağı ile toplayarak çıkarın. Her tahlil, tahlil sırasında tutarlı bir sayıda nematod içermelidir.
      NOT: Çok az solucan transferseDenemeler sırasında yanlış olan, başlangıç ​​örneği boyutunun arttırılması, yıkama ve aktarımlar sırasında ortaya çıkabilecek olası kayıpları azaltacaktır.
  6. Fazla M9'yu bir laboratuar dokusu ile plakadan çıkarın. M9 bakır (II) sülfat solüsyonuyla temas etmemelidir.
    Dikkat: Bu adımı gerçekleştirirken solucanların ve agar yüzeyinin etkilenmediğinden emin olun. Çok sert kullanıldığında, laboratuar dokusu plakanın agar yüzeyine girinti oluşturabilir ve solucanları kaldırabilir. Yanlışlıkla KimWipe yoluyla ayrılmıştır solucanlar atılmalıdır.
  7. M9 çözümü kaldırıldıktan ve tüm solucanlar sıvı olmayan lokomotif kalıplara başladıktan sonra, test kronometresini başlatın.
    1. Optimum olarak, M9 solüsyonunu bir dakika içinde çıkarın. Temel parametre, sinüzoidal hareketin tanımlanmasıdır. Kurtlar lokomotasyondan farklı, örn. Sinüzoidal olmaktan ziyade, sıvı olduğunda. Deney durdurma saatini deney organının her birine bir kez başlatınIsms parçalanmayı bırakır.
  8. Tahliller plakaları her 30 dakikada bir kontrol edin.
    1. Bakteriyel yamalı tahlil plakaları için, 4 saatlik bir süre zarfında yiyecek yamasına ulaşırsa, organizmaları pozitif olarak puanlayın. Negatif kontrol plakaları için, bariyerden geçtiyse organizmaları pozitif olarak puanlayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Biz vahşi tip (N2), npr-9 (tm1652) ve bir npr-9 aşırı sentezleme soy, yani npr-9 (GF) (IC836- npr-9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; odr -1 :: rfp), açlık ve bakır kaçınma yanıtlarını değerlendirmek için. Vahşi tipli organizmalar aversive bakır bariyerini algılama ve yanıt verme yeteneğine sahiptirler, buna karşın npr-9 (GF) mutantları, 4 saatlik test 21 üzerinden bakırdan aversive tepki başlatmaz. 30 dakika aç bırakıldıktan sonra kabaca% 50 - 60 vahşi tipli (N2) organizmalar bakır bariyerden geçerler ve yemeğe ulaşırlar. 2 saat sonra, vahşi tipli nematodların% 75'i besin kaynağına ulaşır. Testin sonunda, N2 organizmalarının% 100'ü besin kaynağına yerleştirildi. Buna karşılık, npr-9 (GF) organizmalarının çoğunluğu gıdaya yanıt olarak lokomotif kalıpları modüle etmez ve bir gıda ile temasa girdikten sonra dahi caydırıcı bariyerden geçmeye devam edecektirkaynak. Npr-9 (GF) solucanları, 4 saatlik testte yemeklere yanıt olarak hareketlerini sürekli olarak değiştirmez ve test organizmalarının yalnızca% 30'u herhangi bir zamanda yiyecek üzerinde bulunur. Npr-9 (LF) hayvanlar, N2 organizmaları kadar iyi performans göstermezler, ancak yiyecek yamacına ulaşmak için açlık arttıkça lokomotif kalıplarını modüle ederler ( Şekil 3 ). N2 veya npr-9 (LF) organizmaları, bu deney yoluyla gıda olmadan değerlendirildiğinde nadiren bakır bariyerini geçerler. Npr-9 (GF) mutantları arka arkaya ve bariyerin üst üste geçmiş haldedir ( Şekil 4 ).

Şekil 1
Şekil 1 : 5 cm Petri Tabağının Altındaki Bakır Solüsyon Yerleştirme İşaretini Gösteren İşaretlerin Görsel Temsili. Bu endikasyonlar şunları sağlamak için kullanılır:Plakanın kesitleri uygun bir şekilde ölçülmüş ve bakteriyel yama ve sonra bakır solüsyonu agar yüzeyine aktarılırken kılavuz olarak görev yapmıştır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2 : 5 cm'lik Petri Tabağı, Açma ve Kapama Gıda Testi Plakaları için İki Bölüme ayrılır ve Gıda Üzerindeki Plaka İçin Bu Bölümlerden Birinin Merkezinde Bir Bakteriyel Çim oluşturulur. Yiyecek parçası, plakanın kenarlarını çizen ve orta hat bariyeri oluşturan test bileşiği ile temas etmemelidir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

<P class = "jove_content" fo: keep-together.within-sayfa = "1"> Şekil 3
Şekil 3 : Beslenme durumuna Dayalı Bakır Kaçınma Deneyine Yanıt olarak Dört Saatlik Bir Sürede Besin Kaynaklarına Ulaşan N2, Npr-9 (tm1652) ve Npr -9 (GF) Solucanlarının Yüzdesi. Veri noktaları, her iki suş için ayrı günlerde gerçekleştirilen en az üç deneyin (n> 30 solucan) ortalamalardır. Veriler, ortalama ± standart hata olarak sunuldu ve iki yönlü tekrarlanan ölçümler ANOVA ile analiz edildi. ** p <0.01, özdeş koşullar altında N2 hayvanlarından önemli ölçüde farklıdır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 4
Şekil 4 : Dört Saatlik Bir Deney Üzerinde Besin Kaynağı Olan Olmayan Bakır Bariyeri Aşan N2, npr-9 (tm1652) ve npr-9 (GF) Oranlarının Yüzdesi. Bahsedilen suşlar gıda yokluğunda bakırdan kaçınma açısından değerlendirildi. Pozitif tepkiler bakır bariyeri geçtiği ve plakanın orijinal olmayan yarısında kaldığı şeklinde puanlanır. Veri noktaları, her iki suş için ayrı günlerde gerçekleştirilen en az üç deneyin (n> 30 solucan) ortalamalardır. Veriler, ortalama ± SE olarak sunuldu ve en azından 10 hayvan, üçlü bağımsız deneylerde, iki yönlü tekrarlanan ölçümler ANOVA ile analiz edildi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu tahlil tasarımı, gıda yarış tahlilini 24 , nefis bir orta hat bariyeri oluşturmak için bir bakır solüsyonu ve nematodların kaybını önlemek için plakanın kenarı etrafında değiştirir. Canlılar, caydırıcı bariyerden geçme ve 4 saatlik bir sürede bir yemeğe erişme yetenekleri açısından test edilir. Npr-9 (GF) bağlamında, açlığın aversive yanıtları nasıl etkilediğini ve gıdanın tespitini değerlendirmek için bu tahlilden yararlandık. Daha önce npr-9'u (GF) yiyecek ve caydırıcı ipuçlarına yanıt vermemek için bozuk olarak tanımlamış olsak, açlığın arızalı npr-9 (GF) davranışları modüle edip etmeyeceğini değerlendirmek için katların çevresel ipuçlarını beslenme durumuyla birleştirdik. Bu tahlil, bir solucanın kimyasal uyarıları ve gıda ipuçlarını tespit etme ve yanıt verme yeteneğine dayanır 3 , 4 . Analiz edilen çeşitli değişkenler göz önüne alındığında, eskiÇevreci organizmalar, karıştırıcı faktörleri ortadan kaldırmak için titizlikle kontrol edilmelidir. Değiştirilmemiş mutantlar için, yani aversive veya gıda cevap verme bilinmeyenleri, ek kontrol soylarının kullanılmasına ihtiyaç duyulacaktır. Bakır ve açlık koşullarının uygun bir şekilde kontrol edilmesini sağlamak için, caydırıcı kusurlu suşlar, örneğin che-2 veya odr-3 28 ve gıda üzerindeki lokomotif kalıpları değiştirmeyen mutantlar, örn., Tph-1 29 da paralel olarak değerlendirilmelidir. Ayrıca, açlığın değerlendirilen davranışa olan katkısını daha doğrudan vurgulamak için ek kontroller için ayrı tahlil koşulları geliştirilebilir. Örneğin, nematodlar tahlilden hemen önce boşaltılabilir ve açlık koşullarındaki bir organizmanın bakıra ne kadar hızlı tepki vereceğini ve yeme ürününe ne kadar çabuk cevap vereceğini tanımlamak için (gıda ile birlikte) tahlil plakasına aktarılabilir. Mevcut tahlilimiz avDeneysel organizmalar iyi beslenmiş bir durumdan aç bırakılmış bir duruma ilerledikçe ergen tepkileri verirler.

Bizim tahlil, daha yaygın bir C. elegans kemotaksis tahlil 4 daha güçlü bir uyaran ( yani yüksek konsantrasyon) davranışları daha uzun bir süre boyunca değerlendirmek için dahil edilmiştir bir modifikasyonudur. Anlık yanıtları değerlendirmek yerine bu tahliller, organizmalar açlık durumuna doğru ilerledikçe (eğer gerekli kontroller dahil edilirse), aversive tepkilerdeki değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir. Benzer değerlendirmeler etanol geri çekilme yanıtlarını, yani zamanla 24 nolu gıdayı yerleştiren nematodları değerlendirmek için bakır yokluğunda kullanılmıştır.

C. elegans'daki herhangi bir davranış testinde olduğu gibi, çevresel değişkenlerin kontrol edilmesi, sürekli tekrarlanabilir sonuçların sağlanması için gereklidir. Organizmalar hep aynı olmalıdırE, davranış tepkilerinin yaşa göre değişebileceği göz önüne alındığında. Ayrıca, solucanların beslenme durumundaki değişkenlik, açlık koşullarına alışkınlığı değiştirebilir. Bu nedenle, deneysel solucanlar bu protokolden herhangi bir noktada açlıktan ölmemelidir. Ebeveyn kuşağının açlık deneyimi aynı zamanda yavru davranışını da etkileyebilir 30 ; Bu nedenle, deneysel organizmaların en az iki nesil boyunca iyi beslenmesini sağlamak tavsiye edilir. Dahası, yerel popülasyon yoğunluğunun dağılım oranlarını 31 etkileyebileceği için, tahlil plakalarına aktarılan organizmaların sayısı tutarlı olmalıdır. Solucanlar plakalara aktarıldıktan sonra, agar yüzeyine zarar vermeden fazla bir M9 solüsyonunu bir laboratuvar dokusu ile çıkarmak önemlidir. Yüzeye yapılan değişiklik, kendiliğinden lokomotif kalıplara müdahale edebilir. Aşırı çözümün resmi başlama işlemine başlamadan önce uygun bir şekilde kaldırılması gerekir.Yani sıvıda gözlemlenen bir nematod lokomotif paterninin bulunmadığından emin olma deneyi mevcut değildir. Açık bir gösterge, tarama davranışını aramaktır.

Tahlil plakaları, plakanın ve bakteri kuruluğunun tutarlı olması için kontrol edilmelidir. Aşırı taze olan plakalar lokomotif kusurlara neden olabilir ve ayrıca çevresel uyaranlara 6 müdahale edebilir. Bakır solüsyonlarının uygulanması, mümkün olduğu kadar tutarlı olmalı, böylece caydırıcı bariyerler uygun kalınlaşmalı ve gıda kaynağı ile temasa girmemelidir. Çok az bakır çözeltisi uygulandığında, vahşi tip aversive tepki süresinin azalması çok fazla olurken nematodların ölümcül olabileceği kanıtlandı. Bakır solüsyonuna homojen bir kalınlık sağlamak amacı ile en iyi sonucu verir. Agarda bakır çözeltisi uygulaması sırasında girintiler oluşursa, tahlil plakası atılmalıdır. Solucanlar bu deliklerden delebilir 32, Özellikle de caydırıcı bir madde veya açlıkla karşı karşıya kaldıklarında. Örnekler arasında plakanın tekdüzeliğini sağlamak için, solucanların karışık popülasyonları ( örn. Bir mutant ve vahşi tip), eğer birisi belirgin şekilde etiketlenmişse ( örn . GFP aracılığıyla ) aynı plakada ölçülebilir.

Bu tahliller standart boyutlu agar plakaları üzerinde yapılmış olsa da, daha büyük plakalar kullanılabilir ( örn. 100 mm çap). Bu senaryoda, solucan hareketi için yeterli süre sağlamak için tahlil süresi 6 saate çıkarılmalıdır. Daha büyük plakalar daha büyük popülasyonların test edilmesine izin verebilir ve popülasyon yoğunluğunun aversive yanıtları uzun süreler boyunca nasıl etkilediğini araştırmak için kullanılabilir. Daha teknik olarak ileri prosedürler, hareketli bir kademe 33'e bağlanmış solucan izleme ekipmanının kullanımı ile birleştirilebilir. Solucan takibi, daha hassas ölçümler yapmaya ve ek değişkenlerin toplanmasına izin verecektir ( örn.

Test, alternatif fenotiplerin ölçülmesine izin vermek için kolayca adapte edilebilir. Solucanın yaşı, yaşla ilişkili açlıktan kaynaklanan aversive değişikliklerde ölçüm yapılmasına izin verecek şekilde değiştirilebilir. Dahası, deneysel solucanlardaki beslenme durumundaki değişiklikler, açlıktan beslenmeye karşı gıda ve kimyasal kaçınma bağlamında analiz yapılmasına da olanak sağlayabilir. Bu yüzden, uzun protokoller karşılaştırılabilir veri kümeleri arasında tutarlı olarak, deney organizmaların hemen hemen herhangi bir ön-şartlandırma kemotaksi deneyi ile değerlendirilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Açıklayacak bir şeyimiz yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından Discovery Grant RGPIN36481-08 tarafından William G. Bendena'ya desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.] Produced in lab
Cupric Sulfate Sigma C-1297 Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314 (1165), 1-340 (1986).
  2. Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans (October 25, 2006). The C. elegans Research Community, WormBook. , wormbook.1.123.1, http://www.wormbook.org (2006).
  3. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
  4. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 70 (3), 817-821 (1973).
  5. Ramot, D., MacInnis, B. L., Goodman, M. B. Bidirectional temperature-sensing by a single thermosensory neuron in C. elegans. Nat. Neurosci. 11 (8), 908-915 (2008).
  6. Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (22), 8269-8274 (2014).
  7. van Campen, J. S., et al. Sensory modulation disorders in childhood epilepsy. J. Neurodev. Disord. 7 (34), (2015).
  8. Festa, E. K., et al. Neocortical disconnectivity disrupts sensory integration in Alzheimer's disease. Neuropsych. 19 (6), 728-738 (2005).
  9. Boecker, H., et al. Sensory processing in Parkinson's and Huntington's disease: investigations with 3D H(2)(15)O-PET. Brain. 122 (9), 1651-1665 (1999).
  10. Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human disease in Caenorhabditis elegans. Biotechnol. J. 5 (12), 1261-1276 (2010).
  11. O'Reilly, L. P., Luke, C. J., Perlmutter, D. H., Silverman, G. A., Pak, S. C. C. elegans in high-throughput drug discovery. Adv. Drug Deliv. Rev. 0, 247-253 (2014).
  12. Thompson, O. The million mutation project: a new approach to genetics in Caenorhabditis elegans. Genome Res. 23 (10), 1749-1762 (2013).
  13. Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (43), 15512-15517 (2004).
  14. Maricq, A. V., Peckol, E., Driscoll, M., Bargmann, C. I. Mechanosensory signaling in C. elegans mediated by the GLR-1 glutamate receptor. Nat. 378 (6552), 78-81 (1995).
  15. Chalasani, S. H., et al. Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans. Nat. 450 (7166), 63-70 (2007).
  16. Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail. Curr. Biol. 12 (9), 730-734 (2002).
  17. Hart, A. C., Kass, J., Shapiro, J. E., Kaplan, J. M. Distinct signaling pathways mediate touch and osmosensory responses in a polymodal sensory neuron. J. Neurosci. 19 (6), 1952-1958 (1999).
  18. Ishihara, T., et al. HEN-1, a secretory protein with an LDL receptor motif, regulates sensory integration and learning in Caenorhabditis elegans. Cell. 109 (5), 639-649 (2002).
  19. Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. J. Exp. Biol. 204 (10), 1757-1764 (2001).
  20. Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (43), 15512-15517 (2004).
  21. Campbell, J. C., Polan-Couillard, L. F., Chin-Sang, I. D., Bendena, W. G. NPR-9, a Galanin-Like G-Protein Coupled Receptor, and GLR-1 Regulate Interneuronal Circuitry Underlying Multisensory Integration of Environmental Cues in Caenorhabdities elegans. PLoS Genet. 12 (5), (2016).
  22. Harris, G. P., et al. Three distinct amine receptors operating at different levels within the locomotory circuit are each essential for the serotonergic modulation of chemosensation in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 29 (5), 1446-1456 (2009).
  23. Harris, G., et al. Dissecting the serotonergic food signal stimulating sensory-mediated aversive behavior in C. elegans. PLoS One. 6 (7), (2011).
  24. Mitchell, P., et al. A differential role for neuropeptides in acute and chronic adaptive responses to alcohol: behavioural and genetic analysis in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5 (5), (2010).
  25. Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learn Mem. 4 (2), 179-191 (1997).
  26. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genet. 77 (1), 71-71 (1974).
  27. Behavior (July 3, 2006). The C. elegans Research Community, WormBook. Hart, A. C. , wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org (2006).
  28. Sambongi, Y., et al. Sensing of cadmium and copper ions by externally exposed ADL, ASE, ASH neurons elicits avoidance response in Caenorhabditis elegans. NeuroReport. 10 (4), 753-757 (1999).
  29. Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102 (9), 3184-3191 (2004).
  30. Rechavi, O., et al. Starvation-Induced Transgenerational Inheritance of Small RNAs in C. elegans. Cell. 158 (2), 277-287 (2014).
  31. Gloria-Soria, A., Azevedo, R. B. R. npr-1 Regulates Foraging and Dispersal Strategies in Caenorhabditis elegans. Cell. 18 (21), 1694-1699 (2008).
  32. Beron, C., et al. The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: A new assay for the study of neuromuscular disorders. Genes Brain Behav. 14 (4), 357-368 (2015).
  33. Wang, S. J., Wang, Z. W. Track-A-Worm, An Open-Source System for Quantitative Assessment of C. elegans Locomotory and Bending Behavior. PLoS One. 8 (7), (2013).

Tags

Nörobiyoloji Sayı 125, Kemozensiyon bakır açlık nefret kemotaksi gıda
bir<emCaenorhabditis elegans</emBeslenme Durumuna Dayalı Bakır Kaçınma Deneyi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Campbell, J. C., Chin-Sang, I. D.,… More

Campbell, J. C., Chin-Sang, I. D., Bendena, W. G. A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay. J. Vis. Exp. (125), e55939, doi:10.3791/55939 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter