Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

EEN Published: July 26, 2017 doi: 10.3791/55939
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Biology, Queen's University, 2Centre for Neuroscience, Queen's University

Summary

Hier presenteren we een Caenorhabditis elegans -specifieke test die is ontworpen om veranderingen in het koperen aversiegedrag te evalueren en het vermogen om een ​​gemeenschappelijke voedingsbron te lokaliseren, als het organisme zich voortbrengt van een goed gevoed aan hongerige voedingswaarde.

Abstract

Om overleving te waarborgen, moeten organismen ongunstige habitats kunnen vermijden, terwijl er een consistente voedingsbron wordt gewaarborgd. Caenorhabditis elegans veranderen hun bewegingspatronen bij het opsporen van uiteenlopende milieu-stimuli en kunnen hun suite van gedragsresponsen moduleren in reactie op de hongersnoodstoestanden. Nematodes vertoonden typisch een verminderde aversieve reactie wanneer ze verwijderd worden uit een voedingsbron gedurende meer dan 30 minuten. Observatie van gedragsveranderingen als reactie op een veranderende voedingsstatus kan inzicht geven in de mechanismen die de overgang regelen van een goed gevoed tot hongerige toestand.

We hebben een test ontwikkeld die het vermogen van een nematode om een ​​aversieve barrière ( dwz koper) te overtreffen, dan een voedingsbron over een langere periode bereikt. Dit protocol bouwt voort op eerdere werkzaamheden door meerdere variabelen te integreren op een manier die de continuïteit van gegevensverzameling mogelijk maakt, aangezien de organismen verschuiven naar aN steeds meer hongerige toestand. Bovendien maakt deze bepaling een verhoogde steekproefgrootte mogelijk, zodat grotere populaties nematoden tegelijk kunnen worden geëvalueerd.

Organen die defect zijn voor het detecteren of reageren op koper, kruisen de chemische barrière direct door, terwijl wildtype nematoden aanvankelijk afstoten. Omdat wilde worms steeds meer honger krijgen, beginnen ze de barrière over te gaan en de voedselbron te bereiken. We hebben deze analyse ontworpen om een ​​mutant te beoordelen die niet in staat is om te reageren op diverse milieueisen, waaronder voedselenspanning of detectie van aversieve chemicaliën. Bij het evalueren via dit protocol stonden de defecte organismen onmiddellijk door de barrière, maar waren ook niet in staat om een ​​voedingsbron te detecteren. Daarom kruisen deze mutanten de chemische barrière herhaaldelijk ondanks het tijdelijk bereiken van een voedingsbron. Deze test kan rechtstreeks testen populaties van wormen om potentiële wegdefecten in verband met afkeer en hongersnood te evalueren.

Introduction

Caenorhabditis elegans is al decennia gebruikt als model voor de studie van neurobiologie door het relatieve gemak bij het analyseren van de circuits van een zenuwstelsel dat uit slechts 302 neuronen 1 bestaat . Met dien verstande dat het organisme afhankelijk is van het reageren op milieu-signalen, is veel van het zenuwstelsel gewijd aan het regelen van de integratie van milieu-signalen 2 . Ondanks de eenvoud van het zenuwstelsel kan C. elegans detecteren en reageren op diverse milieusignalen, waaronder afweermiddelen 3 , attractants 4 , temperatuur 5 en zelfs luchtvochtigheid 6 . Een niet omgevingssignalen goed geïntegreerd is gekoppeld aan een aantal gedrags- stoornissen en neurodegeneratieve ziekten in zoogdieren modelsystemen 7- 9. Met een reeks beschikbare neurale ziekte modellen 10 in C. elegans en de ontwikkeling van nematode farmaceutische schermen 11 , dit organisme heeft bewezen een nuttig systeem te zijn voor de studie van neurobiologie. Gezien de beschikbaarheid van een toegekende nematode Connectome 1 en mutaties voor bijna elk gen in het nematode genoom 12 , is ons begrip van het nematode zenuwstelsel, en door onszelf zelf, gedeeltelijk beperkt door het ontwerpen van creatief passende analyses.

In de afgelopen 40 jaar zijn een aantal chemotaxis-analyses ontwikkeld om de respons van de nematoden op diverse afersieve stimuli 3 , 4 , 13 , 14 , 15 te evalueren. Aanvankelijke experimenten betroffen de introductie van een acute milieustimulus terwijl een enkele worm op een agarplaat stond= "Xref"> 3 , 14 , 16 . Onmiddellijke veranderingen in de locomotorische reacties werden geregistreerd. Bijvoorbeeld, kan de vluchtige geurstof octanol op een haar worden aangebracht en wafted voor een neus van de nematode om de initiëring van achterwaartse beweging in wilde worms 17 te stimuleren. Meer complexe analyses zijn ook ontwikkeld om meerdere variabelen op te nemen als middel om gedragskeuze te beoordelen 18 . Een variatie van deze analyse houdt in dat er een koperoplossing wordt gebruikt om een ​​aversive midline barrier 4 te creëren. Een attractant, namelijk diacetyl, werd aan één kant van de chemische barrière geplaatst met worms die van de diacetylbron werden overgebracht. Worms defect voor koperen aversieve reacties kwamen direct over de barrière om de diacetyl te bereiken, terwijl wilde worms aanvankelijk door de barrière werden afgestoten. Reacties werden behaald toen worms de koperbarrière eerst naderdenZonder lange termijn waarnemingen.

Wanneer wormen worden geëvalueerd na het hebben van hongerstoestanden, is hun gevoeligheid voor milieu-stimuli afgenomen 19 . Wanneer de aversieve chemische octanol wafted voor de nematode neus, wild-type organismen stimuleren terugwaartse beweging binnen 3 - 5 s bij het eten. Nadat deze organismen gedurende 10 minuten uit voedsel zijn verwijderd, vertoonden ze een vertraagde respons van 8 - 10 s 20 . Dus met verhoogde hongersnood vertoont nematoden een afgenomen respons op schadelijke milieudesignen, aangezien de zoektocht naar voedsel essentieel is voor overleving. Omgekeerd reageren nematoden die overexpressieve neuropeptide receptor 9 ( npr-9) niet reageren op octanol op of uit eten en tonen het onvermogen om te reageren op een aantal aversieve stimuli 21 . Deze npr-9 (GF) organismen moduleren ook hun omkeerfrequentie niet in aanwezigheid van voedsel, maar kanOmgekeerd in reactie op harde aanraakstimulaties die aanwijzen dat zij in staat zijn om achteruit voortbewegen 21 . We hebben ook npr-9 (LF) mutanten geëvalueerd, aangezien zij een abnormaal verminderde omkeerfrequentie vertoonden uit voedsel, maar hun gedrag kunnen moduleren in aanwezigheid van voedsel 21 . Het koppelen van de voedingsstaat van de worm met de introductie van acute externe stimuli heeft geholpen bij het uitleggen van de mechanismen waardoor een voedingsgerelateerde pathway de sensorische signaleringsbanen 22 , 23 breed kan moduleren. De aanwezigheid van voedsel in de nematodeomgeving is ook gebruikt om ethanol-terugtrekkingsreacties te evalueren 24 . In dit experiment werden worms geïncubeerd in verschillende concentraties ethanol en vervolgens op een agarplaat geplaatst met een flardje voedsel dat bekend staat als een "voedselrace-assay". Het etenstapje werd op één rand van de plaat geplaatst terwijl de nematoden wEr is weggelegd van de voedselbron. Ethanol-terugtrekking werd geëvalueerd door het meten van de tijdsduur die nodig is voor wormen om de patch van voedsel te bereiken.

Deze voedingsgebaseerde kopersaversie-analyse bouwt voort op de voedselrace-analyse om extra milieu-variabelen, namelijk voedsel en koper, te integreren, terwijl gedragsveranderingen in de loop van de tijd worden beoordeeld. Dit is een aanpassing van een algemeen gebruik protocol in de C. elegans community 4 . Dit protocol is gebruikt om aversieve reacties en de detectie van voedsel over een periode van vier uur 21 te beoordelen . Aangezien worm's honger gedrag na 30 minuten voedselafbraak 25 is , kunnen we ook evalueren hoe veranderingen in de voedingsstatus de milieueffecten kunnen beïnvloeden. De condities van deze analyse bepalen hoe experimentele organismen de responsiviteit van de aversieve stimuli over de tijd veranderen, waardoor dit gedragsveranderingen alsOrganismen vorderen naar een hongerde toestand (en voortdurende metingen van langdurige hongersnood). Aangezien de npr-9 (GF) dieren hun gedrag niet veranderen in verband met voedsel of veel aversieve signalen, trachten we te identificeren of deze gedragsmatige tekorten zouden voortzetten in het kader van hongersnood. Uiteindelijk is dit assay ontwerp geformuleerd om de npr-9 (GF) mutanten specifiek te evalueren, maar kan verder aangepast worden om ook nieuwe stammen te karakteriseren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereiding van experimentele organismen

  1. Kies voor de aanvang van de test 24 uur per week op 10 L4-aalwurms per stam 24 uur om ervoor te zorgen dat organismen jong volwassen zijn bij het testen. Voor elke mutant of controle nematode getest, kies 10 L4s (10 voor de controle en 10 voor de analyse).
    1. L4-organismen onderhouden met behulp van standaardmethoden 26 , 27 gedurende 24 uur op standaard agarplaten die met OP50 Escherichia coli zaaien. Als organismen tijdens de daaropvolgende wasstapjes verloren raken, compenseren door de beginmonstergrootte te vergroten ( dwz 20 wormen in plaats van 10 kiezen).
      Opmerking: Gedrag is een eigenlijk variabel fenotype. Voer de methode in triplicaat uit voor elke stam op drie aparte dagen. Inclusief aanvullende controle stammen en voorwaarden voor nieuwe stammen, zoals gemarkeerd in de discussie sectie.
  2. Onmiddellijk voorafgaand aan de test, overdracht van experimentele orgaNijmt op een agarplaat zonder bacteriën en laat nematoden vrij om 1 minuut te bewegen om overtollige bacteriën te verwijderen.
    1. Als experimentele organismen gedurende de 24 uur voor de analyse de verontreinigingsomstandigheden ondervonden, moet u ze weggooien.
  3. Pipetteer 1 ml M9 op de bacteriënvrije plaat om worms in een microcentrifugebuis te wassen.
  4. Centrifugeer bij 3.000 xg gedurende 1 min. Worms dienen een pellet te vormen onderaan de buis. Aspirate M9 oplossing zonder de wormpelletje te verstoren. Voeg 1 ml M9 toe aan de wormpelletje, omgekeerde buis om worms met de oplossing te mengen.
  5. Herhaal stappen 1.4 nog drie keer.
    1. Als de overmatige bacteriën aanvankelijk met de wormen werden overgebracht, herhaal dit voor een totaal van 5 keer. Er mogen geen bacteriën worden overgebracht naar de kopervoerplaten. Als voedsel naar de analyseplaatje wordt overgedragen, zal het de juiste gegevensverzameling bemoeien.
  6. Na de laatste was, suig supernatant tot 10081; L van M9 en de wormpelletje blijft.
    Voorzichtigheid: Hongersnood gerelateerd gedrag wordt na 30 minuten duidelijk. Bijgevolg moeten wormen onmiddellijk van de oplossing worden overgebracht zodra de wasstappen zijn voltooid.

2. Bereiding van assayplaten

  1. Bereid standaard NGM agarplaten twee dagen voor de test op.
    1. Als platen in een vochtige omgeving gehouden worden, maak agarplaten 3 dagen voor de test. Als alternatief, verwijder het deksel van de plaat gedurende 3 tot 6 uur om de droogheid te waarborgen (indien in een steriele omgeving).
  2. Met een dikke permanente marker, maak een lijn aan de onderzijde van de plaat langs de buitenrand en een ander om een ​​middelste barrière te vormen ( Figuur 1 ). De middelste barrière moet evenwijdig zijn van elke rand van de plaat. Gebruik een liniaal om nauwkeurige metingen te waarborgen. Deze lijnen dienen als een handleiding bij het overbrengen van bacteriën en de koperoplossing. MitsE. coli wordt overgedragen voor de koperoplossing, deze lijnen dienen als indicatoren.
  3. Zaadplaat met 50 μL OP50 E. coli op slechts één kant van de koperen barrière om een ​​uniforme gazon te creëren ( Figuur 2 ). De bacterieconcentratie moet consistent blijven met de analyses; Echter is weinig variatie waargenomen in reactie op milde verschillen in concentratie.
    1. Gebruik de gemarkeerde lijnen op de onderzijde van de plaat om ervoor te zorgen dat de bacteriën niet in aanraking komen met de koperoplossing. Met dien verstande dat de koperoplossing de rand van de plaat leidt en een middelgrensbarrière vormt, overdragen de bacteriën zodat de koperoplossing niet in contact komt met de voedingsbron.
  4. Markeer een tweede set platen en geef geen OP50 E. coli aan hen ( Figuur 2 ). Deze platen zullen dienen om de negatieve controle te evalueren. Deze platen moeten ook eenMarkeren op de helft van de plaat om de initiële overdracht oorsprong te geven.
  5. Laat bacteriën drogen en incubateer platen bij 37 ° C overnacht. Zorg ervoor dat bacteriële patches niet worden gestoord bij overdracht naar een 37 ° C incubator of kamer. Een overmatige storing kan de locatie of vorm van de food patch veranderen.

3. Chemotaxis Assay

  1. Bereid eerst een 0,5 M koper (II) sulfaatoplossing voor de starttijd van de assay. Met dien verstande dat 125 μl van de oplossing per plaat wordt gebruikt, schaal dit volume op, afhankelijk van het aantal gebruikte gebruiksplaten ( bijv. 5 analyseplaatjes, 625 μl).
  2. Pipet 100 μL van de koper (II) sulfaatoplossing op de rand van de agar om een ​​buitenste koperbarrière te vormen. De gemarkeerde onderkant van de plaat dient als een gids te dienen.
  3. Pipetteer 25 μL van de koperen (II) sulfaatoplossing om een ​​middellijnsparrière te creëren.
    1. Zorg ervoor dat de koper (II) sulfaatoplossing doetNiet in contact komen met de bacteriële patch. Gebruik een gevlekte techniek, omdat strepen de voortbeweging kunnen beïnvloeden door indentaties / krassen op de agar.
  4. Laat de koperoplossing op de plaat drogen. De periode kan variëren afhankelijk van de plaat- en laboratoriumomstandigheden. Visueel controleer op droogheid elke 5 minuten na overdracht.
    Opmerking: De koperoplossing toont een blauwachtige tint en is gemakkelijk te herkennen. Gebruik een laboratoriumweefsel om de oplossing dicht bij de rand van de plaat te druppelen om droogheid te onderscheiden .
  5. Pipetteer 20 μL van de wormpelletje vanaf de bodem van de buis op de bacteriënvrije helft van de analyseplaat.
    1. Zorg ervoor dat er 10 wormen op de assayplaat worden overgebracht. Als extra worms per ongeluk zijn opgenomen, verwijder ze door te kiezen met halogeenolie om ervoor te zorgen dat er geen bacteriën aan de plaat worden toegevoegd. Elke test moet een consistent aantal nematoden hebben tijdens de test.
      OPMERKING: als er te weinig wormen worden getransformeerdMislukt tijdens de testen, zal het verhogen van de initiële steekproefgrootte mogelijke verliezen verminderen tijdens het wassen en overbrengen.
  6. Verwijder overtollige M9 uit de plaat met een laboratoriumweefsel. M9 mag niet in contact komen met de koper (II) sulfaatoplossing.
    Voorzichtigheid: Zorg ervoor dat de wormen en het agaroppervlak onaangetast blijven tijdens het uitvoeren van deze stap. Als het te hard gebruikt wordt, kan het laboratoriumweefsel indentaties maken aan het agaroppervlak van de plaat en kan wormen verwijderen. Worms die per ongeluk via KimWipe verwijderd zijn, moeten weggegooid worden.
  7. Zodra de M9-oplossing is verwijderd en alle wormen zijn begonnen met niet-vloeibare bewegingspatronen, start de assay stopwatch.
    1. Verwijder de M9-oplossing optimaal binnen een min. De essentiële parameter is de identificatie van sinusvormige locomotie. Worms locomote anders, bijv. Thrashing in plaats van sinusvormige, wanneer in vloeistof. Begin met de test eenmaal elk van het experimentele orgaanIsmiën stopt met spatten.
  8. Controleer de analyseplaatjes elke 30 minuten.
    1. Voor de assayplaten met bacteriële patches, positief scoren organismen als ze de voedingspatch over een periode van 4 uur bereiken. Voor de negatieve controleplaten, positief scoren organismen als ze de barrière hebben gekruist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

We gebruikten wild type (N2), npr-9 (tm1652) en een npr-9 overexpressie stam, dwz npr-9 (GF) (IC836 - npr-9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; odr -1 :: rfp), om reacties op hongersnood en koperaversie te evalueren. Wild-type organismen kunnen detecteren en reageren op de aversieve koperbarrière, terwijl npr-9 (GF) mutanten geen afkeerlijke reactie op het koper over de 4 uur analyse 21 initiëren. Na 30 minuten hongersnood overschrijden ongeveer 50-60% van de wilde type (N2) organismen de koperen barrière en bereiken de voedingspatch. Bij het 2 uur merk bereikt 75% van wild-type nematoden de voedingsbron. Aan het einde van de test zijn 100% van de N2-organismen verplaatst naar de voedingsbron. Daarentegen modificeren de meerderheid van de npr-9 (GF) organismen geen locomotieve patronen in reactie op voedsel en zullen ze de aversieve barrière doorgaan, zelfs nadat ze in contact komen met een voedselbron. De npr-9 (GF) wormen blijven voortdurend hun locomotie niet veranderen in reactie op voedsel gedurende de 4-u-test en er wordt op elk moment slechts 30% van de testorganen gevonden op het voedsel. De npr-9 (LF) dieren presteren niet zo goed als N2-organismen, maar moduleren hun locomotiepatronen naarmate de hongersnood toeneemt om de voedingspatch te bereiken ( Figuur 3 ). Wanneer N2 of npr-9 (LF) organismen door deze analyse zonder voedsel worden geëvalueerd, zitten ze zelden de koperbarrière. De npr-9 (GF) mutanten herhalen de barrière herhaaldelijk heen en weer ( Figuur 4 ).

Figuur 1
Figuur 1 : Een visuele representatie van markeringen om de oplossing van de koperoplossing aan te geven aan de onderzijde van een 5 cm petrischaaltje. Deze indicaties worden gebruikt om ervoor te zorgen datDe afdelingen van de plaat zijn op passende wijze gemeten en dienen als een richtlijn bij het overbrengen van de bacteriële patch en vervolgens koperoplossing op het agaroppervlak. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2 : De 5 cm Petri Schotel is verdeeld in twee afdelingen voor aan- en uitvoedselbeoordelingsplaten en een bacteriegras wordt gevormd in het middelpunt van één van deze secties voor de On-Food Plate. De voedingspatch mag niet in aanraking komen met de testverbinding die de randen van de plaat loodt en een middelste barrière vormt. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

<P class = "jove_content" voor: keep-together.within-page = "1"> Figuur 3
Figuur 3 : Percentage N2, npr-9 (tm1652) en npr-9 (GF) Worms die de voedingsbron bereiken over een periode van vier uur in reactie op de nutritionele status gebaseerde Koper Aversion Assay. Gegevenspunten zijn gemiddelden van ten minste drie experimenten (n> 30 wormen) die op afzonderlijke dagen voor beide stammen worden uitgevoerd. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaard fout en geanalyseerd met een tweeweg herhaalde maatregelen ANOVA. ** p <0,01, significant verschillend van N2 dieren onder identieke omstandigheden. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4 : Percentage N2, npr-9 (tm1652) en npr-9 (GF) W orms die de Koperbarrière overschrijden zonder voedselbron over een vier uur-test. De bovengenoemde stammen werden geëvalueerd voor koperaversie bij afwezigheid van voedsel. Positieve reacties worden als kruispunt van de koperen barrière gescoord en overblijven op de niet-afkomstige helft van de plaat. Gegevenspunten zijn gemiddelden van ten minste drie experimenten (n> 30 wormen) die op afzonderlijke dagen voor beide stammen worden uitgevoerd. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SE en ten minste 10 dieren werden getest in drie onafhankelijke experimenten geanalyseerd met een tweeweg herhaalde maatregelen ANOVA. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit assayontwerp wijzigt de voedselrace-analyse 24 om een ​​koperoplossing op te nemen om een ​​aversieve middenlijnbarrière en rond de rand van de plaat te creëren om verlies van nematoden te voorkomen. Organismen worden getest op hun vermogen om de aversieve barrière over te halen en een voedsel patch te bereiken over een periode van 4 uur. In het kader van npr-9 (GF) hebben we deze test gebruikt om te beoordelen hoe hongersnoodsituaties afkeerbare reacties en de detectie van voedsel kunnen beïnvloeden. Met dien verstande dat we voorheen npr-9 (GF) gekenmerkt hadden als defect voor de responsiviteit op voedsel en aversive cues, combineren we veelvouden milieutechnieken met voedingsstatus om te beoordelen of hongersnood het defecte npr-9 (GF) gedrag kan moduleren. Deze test is gebaseerd op het vermogen van een worm om chemische stimuli en voedselcues 3 , 4 te detecteren en te reageren. Gezien de diverse variabelen die zijn geanalyseerd, zijn de voorwaarden van de exPerimale organismen moeten nauwlettend worden gecontroleerd om confounderende factoren te elimineren. Voor ongecharacteriseerde mutanten, dat wil zeggen die met onbekende aversieve of voedselreacties, zouden aanvullende controle stammen moeten worden gebruikt. Aversieve defecte stammen, bijv. Che-2 of odr-3 28 , en mutanten die geen locomotiepatronen uit eten veranderen, bijv. Tph-1 29 , moeten ook parallel geëvalueerd worden om ervoor te zorgen dat de koper- en hongervoorwaarden adequaat worden gecontroleerd. Bovendien, om de bijdrage van hongersnood naar het geëvalueerde gedrag rechtstreeks te benadrukken, kunnen ook aparte testvoorwaarden worden ontwikkeld voor aanvullende controles. Bijvoorbeeld, de nematoden kunnen onmiddellijk voorafgaand aan de test worden uitgehongerd en overgebracht naar de analyseplaatje (met voedsel) om vast te stellen hoe snel een organisme in een hongerige toestand op koper reageert en de voedingspatch bereikt. Onze huidige analyse highlights avVervangende reacties als de experimentele organismen voortkomen van een goed gevoed naar hongerige toestand.

Onze analyse is een wijziging van de algemeen gebruikte C. elegans chemotaxis assay 4 waarin een sterkere stimulus (dat wil zeggen hoge concentratie) is opgenomen om gedrag te beoordelen over een langere periode. In plaats van het evalueren van onmiddellijke reacties, kan deze analyse worden gebruikt om veranderingen in aversieve responsen te meten als de organismen zich vooruitgang maken naar een hongerige toestand (indien de nodige controles zijn opgenomen). Vergelijkbare evaluaties zijn gebruikt bij afwezigheid van koper om de terugtrekkingsreacties van ethanol te evalueren, dwz nematoden die voedsel in de loop van de tijd 24 lokaliseren.

Zoals bij een gedragsonderzoek in C. elegans is, is het belangrijk om te controleren op omgevingsvariabelen om consistente reproduceerbare resultaten te waarborgen. Organismen moeten allemaal hetzelfde zijnE, gezien dat de gedragsreacties kunnen veranderen met de leeftijd. Bovendien kan variatie in de voedingsstatus van de wormen acclimatie veranderen in hongersnoodstoestanden. Daarom moeten de experimentele wormen op elk moment voorafgaand aan dit protocol geen honger ondergaan. Stervingservaring van de ouderlijke generatie kan ook invloed hebben op het nageslachtgedrag 30 ; Daarom is het raadzaam ervoor te zorgen dat de experimentele organismen gedurende ten minste twee generaties goed worden gevoed. Bovendien moet het aantal organismen die aan de assayplaten worden overgedragen, consistent blijven, aangezien de plaatselijke bevolkingsdichtheid de verspreidingssnelheden 31 kan beïnvloeden. Zodra wormen zijn overgebracht op de platen, is het van cruciaal belang om de overmaat M9 oplossing met een laboratoriumweefsel te verwijderen zonder het agaroppervlak te beschadigen. Verandering aan het oppervlak kan interfereren met spontane bewegingspatronen. Overmaat oplossing moet op passende wijze verwijderd worden voordat u begint met de officiële start vanDe test om ervoor te zorgen dat het drasgedrag, dat wil zeggen een nematode-bewegingspatroon waargenomen in vloeistof, niet aanwezig is. Een duidelijke indicator is om te zoeken naar kruipgedrag.

De analyseplaatjes moeten zodanig worden geregeld dat de plaat en de bacteriële droogheid consistent zijn. Te frisse platen kunnen locomotorische defecten veroorzaken en kunnen ook de opsporing van milieu-stimuli beïnvloeden 6 . De toepassing van de koperoplossingen moet zo consistent mogelijk zijn, zodat de aversieve barrières behoorlijk dik zijn en niet in contact komen met de voedingsbron. Het toepassen van te weinig koperoplossing kan de wildtype aversieve responstijd verminderen, terwijl te veel dodelijk kan zijn voor de nematoden. Het streven naar een gelijkmatige dikte voor de koperoplossing levert de beste resultaten op. Als er sprake is van inkepingen in de agar tijdens de koperoplossing, moet de assayplaat weggegooid worden. Worms kunnen door dergelijke gaten begraven 32, Vooral wanneer ze geconfronteerd worden met een aversieve stof of hongersnood. Om de uniformiteit van de plaat tussen monsters te waarborgen, kunnen gemengde populaties van wormen ( dwz een mutant en wildtype) op dezelfde plaat gemeten worden als men duidelijk gemerkt had ( bijvoorbeeld via GFP).

Hoewel deze analyse werd uitgevoerd op agarplaten van standaard grootte, kunnen grotere platen worden gebruikt ( bijv. 100 mm diameter). In dit scenario moet de testduur verlengd worden tot 6 uur om voldoende tijd voor wormbeweging te geven. Grotere platen kunnen het testen van grotere bevolkingen toestaan ​​en kunnen worden gebruikt om te onderzoeken hoe de bevolkingsdichtheid over langere tijd de aversieve responsen beïnvloedt. Meer technisch geavanceerde procedures zouden ook kunnen worden opgenomen met het gebruik van worm tracking apparatuur gekoppeld aan een beweegbaar stadium 33 . Worm tracking zou het mogelijk maken om nauwkeuriger metingen te maken en het mogelijk maken extra verzamelingen te verzamelen ( bijv

De test kan gemakkelijk worden aangepast om de mogelijkheid te bieden om alternatieve fenotypes te meten. De leeftijd van de worm kan worden gevarieerd om te kunnen meten op leeftijd gerelateerde hongersnood geïnduceerde aversieve veranderingen. Bovendien kunnen variaties in de voedingsstatus van de experimentele wormen ook een analyse van de wervelharmonisatie in het kader van voedsel en chemische afkeer mogelijk maken. Zolang protocollen consistent zijn met vergelijkbare datasets, kan bijna elke pre-conditionering van experimentele organismen worden beoordeeld via de chemotaxis-analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

We hebben niets om te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de Natuurwetenschappen en Technische Onderzoeksraad van Canada Discovery Grant RGPIN36481-08 aan William G. Bendena.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.] Produced in lab
Cupric Sulfate Sigma C-1297 Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314 (1165), 1-340 (1986).
  2. Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans (October 25, 2006). The C. elegans Research Community, WormBook. , wormbook.1.123.1, http://www.wormbook.org (2006).
  3. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
  4. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 70 (3), 817-821 (1973).
  5. Ramot, D., MacInnis, B. L., Goodman, M. B. Bidirectional temperature-sensing by a single thermosensory neuron in C. elegans. Nat. Neurosci. 11 (8), 908-915 (2008).
  6. Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (22), 8269-8274 (2014).
  7. van Campen, J. S., et al. Sensory modulation disorders in childhood epilepsy. J. Neurodev. Disord. 7 (34), (2015).
  8. Festa, E. K., et al. Neocortical disconnectivity disrupts sensory integration in Alzheimer's disease. Neuropsych. 19 (6), 728-738 (2005).
  9. Boecker, H., et al. Sensory processing in Parkinson's and Huntington's disease: investigations with 3D H(2)(15)O-PET. Brain. 122 (9), 1651-1665 (1999).
  10. Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human disease in Caenorhabditis elegans. Biotechnol. J. 5 (12), 1261-1276 (2010).
  11. O'Reilly, L. P., Luke, C. J., Perlmutter, D. H., Silverman, G. A., Pak, S. C. C. elegans in high-throughput drug discovery. Adv. Drug Deliv. Rev. 0, 247-253 (2014).
  12. Thompson, O. The million mutation project: a new approach to genetics in Caenorhabditis elegans. Genome Res. 23 (10), 1749-1762 (2013).
  13. Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (43), 15512-15517 (2004).
  14. Maricq, A. V., Peckol, E., Driscoll, M., Bargmann, C. I. Mechanosensory signaling in C. elegans mediated by the GLR-1 glutamate receptor. Nat. 378 (6552), 78-81 (1995).
  15. Chalasani, S. H., et al. Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans. Nat. 450 (7166), 63-70 (2007).
  16. Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail. Curr. Biol. 12 (9), 730-734 (2002).
  17. Hart, A. C., Kass, J., Shapiro, J. E., Kaplan, J. M. Distinct signaling pathways mediate touch and osmosensory responses in a polymodal sensory neuron. J. Neurosci. 19 (6), 1952-1958 (1999).
  18. Ishihara, T., et al. HEN-1, a secretory protein with an LDL receptor motif, regulates sensory integration and learning in Caenorhabditis elegans. Cell. 109 (5), 639-649 (2002).
  19. Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. J. Exp. Biol. 204 (10), 1757-1764 (2001).
  20. Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (43), 15512-15517 (2004).
  21. Campbell, J. C., Polan-Couillard, L. F., Chin-Sang, I. D., Bendena, W. G. NPR-9, a Galanin-Like G-Protein Coupled Receptor, and GLR-1 Regulate Interneuronal Circuitry Underlying Multisensory Integration of Environmental Cues in Caenorhabdities elegans. PLoS Genet. 12 (5), (2016).
  22. Harris, G. P., et al. Three distinct amine receptors operating at different levels within the locomotory circuit are each essential for the serotonergic modulation of chemosensation in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 29 (5), 1446-1456 (2009).
  23. Harris, G., et al. Dissecting the serotonergic food signal stimulating sensory-mediated aversive behavior in C. elegans. PLoS One. 6 (7), (2011).
  24. Mitchell, P., et al. A differential role for neuropeptides in acute and chronic adaptive responses to alcohol: behavioural and genetic analysis in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5 (5), (2010).
  25. Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learn Mem. 4 (2), 179-191 (1997).
  26. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genet. 77 (1), 71-71 (1974).
  27. Behavior (July 3, 2006). The C. elegans Research Community, WormBook. Hart, A. C. , wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org (2006).
  28. Sambongi, Y., et al. Sensing of cadmium and copper ions by externally exposed ADL, ASE, ASH neurons elicits avoidance response in Caenorhabditis elegans. NeuroReport. 10 (4), 753-757 (1999).
  29. Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102 (9), 3184-3191 (2004).
  30. Rechavi, O., et al. Starvation-Induced Transgenerational Inheritance of Small RNAs in C. elegans. Cell. 158 (2), 277-287 (2014).
  31. Gloria-Soria, A., Azevedo, R. B. R. npr-1 Regulates Foraging and Dispersal Strategies in Caenorhabditis elegans. Cell. 18 (21), 1694-1699 (2008).
  32. Beron, C., et al. The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: A new assay for the study of neuromuscular disorders. Genes Brain Behav. 14 (4), 357-368 (2015).
  33. Wang, S. J., Wang, Z. W. Track-A-Worm, An Open-Source System for Quantitative Assessment of C. elegans Locomotory and Bending Behavior. PLoS One. 8 (7), (2013).

Tags

Neurobiologie nummer 125, Chemosensatie koper hongersnood aversie chemotaxis voedsel
EEN<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Voedingsstatus gebaseerde Koper Aversion Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Campbell, J. C., Chin-Sang, I. D.,… More

Campbell, J. C., Chin-Sang, I. D., Bendena, W. G. A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay. J. Vis. Exp. (125), e55939, doi:10.3791/55939 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter