في الموقع وصف أونيدينسيس شيوانيلا MR1 الأغشية الحيوية سالفي و ToF-سيمز

Summary

تقدم هذه المقالة طريقة لزراعة بيوفيلم في الموقع وقت الطيران الثانوية أيون الطيف الكتلي لتمكين بمفاعل موائع جزيئية، نظام للتحليل في "الواجهة فراغ" السائل تعيين الكيميائية في حالته رطب،. السيد أونيدينسيس شيوانيلا -1 مع البروتينات الفلورية الخضراء كنموذج.

Abstract

الأغشية الحيوية البكتيرية هي المجتمعات المحلية المرتبطة بالسطحية التي تجري دراستها إلى حد كبير على فهم تلك المواد البوليمرية خارج الخلية المنتجة ذاتيا (EPS) وأدوارها في الميكروبيولوجيا البيئية. تحدد هذه الدراسة أسلوباً لزراعة بيوفيلم المرفق إلى النظام للتحليل في واجهة فراغ السائل (سالفي) وتحقيق في الموقع الكيميائية تعيين بيوفيلم الحية بوقت الطيران الثانوية أيون الطيف الكتلي (ToF-سيمز). ويتم هذا عن طريق استزراع البكتيريا خارج وداخل القناة سالفي مع الإعداد المتخصصة لدينا على حد سواء، فضلا عن تقنيات التصوير الضوئي للكشف عن وجود بيوفيلم وسمك قبل تحليل ToF-سيمز. إظهار النتائج قمم بيوفيلم شيوانيلا المميزة في حالته المائية الطبيعية، تسليط الضوء على بناء بيئة الكتل المائية المترجمة، فضلا عن EPS الشظايا، التي تختلف اختلافاً جذريا عن بيوفيلم نفسه المجففة الدولة. وتبين هذه النتائج قدرة اختراق سالفي الذي يسمح للتصوير في الموقع بيوفيلم مع أداة تصوير كيميائية المستندة إلى فراغ.

Introduction

الأغشية الحيوية البكتيرية هي المجتمعات المحلية المرتبطة بالسطحية التي تطورت على مر الزمن كدفاع للبكتيريا البقاء على قيد الحياة متفاوتة المحفزات المادية والميكانيكية الضارة، حيث خلايا قادرة على إرفاق والبقاء على قيد الحياة في العديد من البيئات الممكنة. ^{1 , 2} الأغشية الحيوية يجري التحقيق فيها إلى حد كبير، وأن تكون لها تطبيقات في العديد من المجالات مثل الطب الحيوي والهندسة الطبية الحيوية، والزراعة، والبحوث الصناعية والتنمية. ^{1 , 2} فهم التعيين الكيميائية هذه المجتمعات الميكروبية المعقدة، بما في ذلك تلك المواد البوليمرية خارج الخلية المنتجة ذاتيا (EPS) وبيئتها الكتلة المائية المحلية، أمر ضروري للحصول على نحو دقيق ومفصل تصوير أنشطتهم البيولوجية. ²

الأغشية الحيوية موجودة وتنمو داخل دولة رطب جداً. هذا يمثل تحديا كبيرا في استخدام تقنيات التحليل السطحي القائم على فراغ مثل وقت الطيران الثانوية أيون الطيف الكتلي (ToF-سيمز) بسبب الصعوبة في دراسة السوائل المتطايرة في فراغ. نتيجة لذلك كانت تقنيات التحليل السطحي القائم على فراغ محدودة تقريبا حصرا لدراسة عينات بيوفيلم فقط حالتها المجففة. ومع ذلك، دراسة بيوفيلم في حالته المجففة يحول دون التحقيق المكروية البيولوجية الحقيقية دقة. غالباً ما يسبب تغييرات جذرية مورفولوجية النزاهة وبيوفيلم EPS، الذي أثبت بعد مقارنة النتائج الجماعية الطيفية بيوفيلم الجافة للدراسات السائلة في الموقع . ^{3 , 4} تقدم هذه المقالة حلاً لدراسة الأغشية الحيوية داخل دولتهم المائية الطبيعية باستخدام استخدام نظامنا للتحليل في السائل الفراغ واجهة (سالفي)،^5،6 مفاعل موائع جزيئية أن تحتوي على سائل تحت لها غشاء نتريد (سين) رقيقة السليكون في microchannel مصنوعة من بولي دايمثيل سيلوكسان (تطويره)، مما يوفر إمكانية الوصول المباشر إلى شعاع مسبار أيون الثانوية مع الحفاظ على سلامة هيكل المصفوفة السائل داخل فراغ الدائرة. ^{7 , 8}

أونيدينسيس س. اختير السيد-1 تحور للتعبير عن البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) ككائن نموذج لهذا التوضيح بيوفيلم الداخلي نظراً لتعدد التمثيل الغذائي والاستخدام الشائع في الميكروبيولوجيا البيئية والتطبيقية، الذي يستند إلى بشدة على قدرتها فريدة من نوعها للحد من المعادن ونقل الإلكترون خارج الخلية. ^{9 , 10 , 11} بالإضافة إلى ذلك، يسمح وجود بروتينات فلورية خضراء لسمك بيوفيلم المستمر سهل الرصد عن طريق الفحص المجهري الأسفار، باستخدام عامل تصفية fluorescein isothiocyanate (فيتك). وقد أظهرت دراساتنا السابقة أدلة على هذه البكتيريا التي تحابي مرفق للإطار الخطيئة باستخدام في أوبيراندو تصوير الأسفار لنمو بيوفيلم بسماكة تصل إلى 100 ميكرومتر. ^{4 , 12} بينما فقط ستناقش هذه الورقة تأكيد الوجود بيوفيلم من خلال الفحص المجهري الأسفار، سالفي متوافق مع غيرها من أساليب التصوير الضوئية مثل القرار فائقة تصوير الأسفار (أي منظم الإضاءة الفحص المجهري (SIM)⁹) والليزر [كنفوكل] الفحص المجهري (كلسم) التصوير⁴). التصوير البصري يمكن أن تستخدم لقياس سمك بيوفيلم، والحصول على صورة ثلاثية الأبعاد لشكل بيوفيلم كما يبدو، يؤكد سمك وتمسكها بالإطار الخطيئة. ⁹ "بروتينات فلورية خضراء بينما" كان يستخدم في تحليل سيمز، س. أونيدينسيس دون بروتينات فلورية خضراء كهذا القياس المطلوب فقط من الكثافة الضوئية لمنحنى النمو، ولا تحتاج إلى أي تصوير فلوري. عموما، معلم الفرق بين التجارة والنقل، والأنواع غير المميزة في منحنى النمو غير ذي بال. بالإضافة إلى ذلك، بينما يستخدم هذا البروتوكول "بروتينات فلورية خضراء" 1 السيد س. أونيدينسيس ككائن نموذج لوصف الإجراء، يهدف هذا الإجراء لأي السلالة البكتيرية التي قد تكون هناك حاجة لزراعة داخل سالفي. على الرغم من ذلك، نظراً للمعرفة للسلالة البكتيرية اللازمة، قد تحتاج بعض شروط النمو مثل الوقت ودرجة الحرارة والبيئة الأوكسجين إلى تعديل لاستيعاب سلالة البكتيريا لاستخدامها. للمتوسطة النمو، يستخدم هذا الإجراء مرق الصويا متوسطة، تريبتيك "أسلاك" (TSB) دون سكر العنب، وفول الصويا تريبتيك أجار (TSA) دون سكر العنب لاستزراع. تكوين "أسلاك" متوسطة وقد وضع خصيصا للنمو والرصد لامتدادات للغشاء وكان بيريبلاسم س. أونيدينسيس التي يبدو أنها تأخذ شكل الأسلاك الصغيرة، وتكوين المتوسطة إنشاء نطاق البحث السابقة. ^{13 , 14}

لدينا بروتوكول السابقة في الموقع سيمز ToF السائل بتوضيح الفائدة التي تقدمها لتجميد البروتين والتمسك الخطيئة، فضلا عن بروتوكول مفصلة بشأن ToF-سيمز التحليل والبيانات الحد سالفي. ¹² بدلاً من أن نكرر خطوات الحد من البيانات، سوف تخدم هذه الورقة بدلاً من ذلك التركيز على نهج فريد لإعداد وزراعة الأغشية الحيوية داخل microchannel سالفي لدينا، فضلا عن خطوات التصوير للكشف عن وجود بيوفيلم وسمك السابقة لتحليل ToF-سيمز. وبينما كانت سابقا محدودة الأغشية الحيوية تجفف العينات داخل الدائرة بتقنيات التحليل السطحي القائم على فراغ فقط، يمكن الآن الحصول EPS وبيوفيلم الكيميائية رسم خرائط تفصيلية للأغشية الحيوية الحية في الموقع بسبب هذه القدرة الجديدة.

Protocol

1-"إعداد مواد"

1. 1. "زجاجات المصل" (واحد في حاجة لثقافة بيوفيلم وثلاثة بحاجة كل منحنى النمو) من إعداد أنابيب المتوسطة
      ملاحظة: كما ذكر في المقدمة، أي النمو يمكن الاستفادة من مناسبة لتوفير العناصر الغذائية اللازمة لسلالة البكتيريا ذات الأهمية المتوسطة لهذا الإجراء؛ وفي هذه الحالة، " أسلاك " وسائل الإعلام ولجان دون سكر العنب المتوسطة كانت تستخدم لنمو "التجارة والنقل" 1-السيد س. أونيدينسيس. ¹³
      1. إيداع 20 مل من متوسط النمو إلى 70 مل مصل زجاجة، كاب السدادة وتجعيد الزجاجة. تغطية الجزء العلوي مع قطعة من رقائق الألومنيوم نظيفة معقمة.
      2. اﻷوتوكﻻف الزجاجة مع دورة سائل لمدة 30 دقيقة في 121 ° أفتيروارد جيم، تخزين زجاجة المصل المعقم في درجة حرارة الغرفة-
   2. "اللاهوائية الثقافة أنابيب"
      1. إيداع 5 مل متوسط النمو في أنبوب ثقافة اللاهوائية مع headspace الجوية ووضع على السدادة تجعيد الزجاجة. تغطية الجزء العلوي مع إحباط العقيمة.
2. إعداد أنابيب فخ فقاعة
   1. بعناية باستخدام إبرة قياس 22، لكمه ثقب سداده مطاطية زجاجة مصل.
   2. قص 20 في 1/32 " تترافلوروايثيلين (PTFE) الأنابيب مع حلاقة هذه أن واحدة من نهاية جزء الأنابيب أشار.
   3. نهاية مدببة، باستخدام مؤشر ترابط أنابيب PTFE من خلال الثقب في الجزء العلوي من سداده مطاطية. دفع الأنبوب من خلال حتى تقريبا 2 سم عن طريق السدادة وقطع أشار نهاية الأنبوب PTFE مع الشفرة إلى حد شقة-
   إزالة المكبس لحقنه 5 مل
   4. وتناسب سداده المطاط من الخطوة 1.2.3 في النهاية المفتوحة للمحاقن. نهاية 2 سم PTFE أنابيب داخل ماسورة المحاقن. هذا هو فخ فقاعة.
   5. التفاف في فخ فقاعة (PTFE أنابيب، وسداده المطاط، والمحاقن) في الخطوة 1.2.4 مع رقائق الألومنيوم وآمنة مع شريط اﻷوتوكﻻف. اﻷوتوكﻻف دورة الحزمة إحباط لتعقيم الأنابيب مع جاذبية في 121 درجة مئوية للحد الأدنى 30 تخزين الحزمة إحباط مختومة في درجة حرارة الغرفة حتى جاهزة للاستخدام في الخطوة 2، 4-
3. منحنى النمو البكتيري
   ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول "بروتينات فلورية خضراء" 1 السيد س. أونيدينسيس ككائن نموذج لزراعة بيوفيلم في سالفي. ومع ذلك، هذا الإجراء يمكن تكييفها لاستيعاب البكتيريا الأخرى تزايد هوائيا أو لاهوائيا. اعتماداً على سلالة الذي يستخدم، قد تحتاج إلى تعديلها تبعاً لذلك وقت النمو والبيئة-
   ملاحظة: الأرصدة المجمد البكتيرية-80 درجة مئوية يتكون من خليط من 1:1 من TSB دون سكر العنب والجلسرين. المثال منحنى النمو هو مبين في الشكل 1 ب أعد استخدام ثقافة كاتب TSB مع لا سكر العنب، نقل كميات كل منها 0.2 مل ثلاث مرات إلى 70 مل مصل زجاجات مع 20 مل " أسلاك " المتوسطة لإزالة آثار TSB. ومع ذلك، يفترض هذا البروتوكول أنه سيتم استخدام متوسط نمو واحد فقط، وأن التحويلات اللاحقة لا تجري، كهذا حدث مع هذه الحلول المتوسطة خاصة بالنسبة أونيدينسيس س.. على الرغم من عدم المبينة في هذا البروتوكول، تحويلات إضافية مثل هذا ينصح في البداية إيداع البكتيريا إلى TSB الغنية تساعد الخلايا المجمدة استرداد؛ ونقل الثلاثة اللاحقة إلى " أسلاك " يضمن أن جميع لجان ذهب وأن ديناميات النمو النموذجية التي تحدث.
   1. تطعيم "ثقافة كاتب"
      1. إزالة الأسهم والغليسيرول البكتيرية من الثلاجة-80 درجة مئوية والحارة الأسهم مع جهة القفاز لذوبان الجليد، في أسرع وقت ممكن. نقل هذا المخزون المجمد للسلامة البيولوجية مجلس الوزراء (BSC).
      2. داخل BSC، استخدم حقنه 1 مل بإبرة ز 22 المرفقة لنقل 0.1 مل مخزون المجمد إلى أنبوب توج ومجعد ثقافة اللاهوائية التي تحتوي على 5 مل متوسط النمو مع لا سكر العنب، أعد الخطوة 1.1.2. تخلص المخزون المجمد المتبقي في حاوية النفايات البيولوجية المناسبة، كتجميد مرة أخرى يمكن أن صدمة الخلايا.
      3. احتضان ثقافة كاتب في شاكر/حاضنة في 30 درجة مئوية في تناوب 150 في الدقيقة (لفة في الدقيقة) ويجب التأكد من أن تتخذ بكثافة بصرية في 600 نانومتر (OD ₆₀₀) القراءة عندما تكون جاهزاً للاستخدام. تسجيل الوقت للنمو والتطوير التنظيمي ₆₀₀ حيث يمكن أن يتم في نفس الوقت لكل استخدام اللاحقة، مثل أن تكون النتائج استنساخه. على سبيل مثال، يسمح لتنمو على ح 15 ثقافة كاتب هذا وتستخدم OD ₆₀₀ من ما يقرب من 1.0.
   2. "تطعيم المتوسطة النمو"
      1. اتخاذ زجاجات المصل ثلاثة إعداد في الخطوة 1.1.1.2، وثقافة كاتب أعد في 1.3.1.3، وجلب على حد سواء لدرجة البكالوريوس.
      2. داخل BSC، استخدام المحاقن معقمة 1 مل بإبرة ز 22 المرفقة، نقل 0.1 مل من محلول من ثقافة كاتب لكل من زجاجات المصل، على التوالي.
      الإيثانول
      3. تعقيم الجزء العلوي من زجاجات المصل مع 70% وتغطي برقائق الألومنيوم معقمة، التسمية على نحو مناسب، ونقل إلى شاكر مداري داخل حاضنة. تعيين شاكر المدارية إلى 150 في الدقيقة وتعيين الحاضنة إلى 30 ° إينكوباتي جيم حتى نقطة البيانات الأولى ₆₀₀ OD مأخوذ، ضمن خطوة 1.3.3.
   3. OD الحصول على ₆₀₀ نقطة بيانات
      1. إعداد فارغ بإيداع ميليلتر 100 من تصفية تعقيم مقطر منزوع (DI) المياه في ومبومو عقيمة. لف الفيلم البارافين البلاستيك حول الجزء العلوي من ومبومو حيث أنه سوف لا تكون ملوثة المياه. تخزين في درجة حرارة الغرفة. استخدام هذا فارغة مع الأشعة فوق البنفسجية/تجاه "جهاز المطياف الضوئي" قبل اتخاذ أي من نقاط البيانات لمنحنى النمو بإدراج ومبومو الضغط على " فارغة ".
         ملاحظة: ينبغي أن تكون كل ح 48 جديدة فارغة معدّة لتجنب قراءة غير صحيحة، كاستبدال فارغة بانتظام هو الممارسة الجيدة-
      2. لكل نقطة بيانات ₆₀₀ OD، إزالة زجاجات المصل إعدادها في الخطوة 1.3.2.3 من الحاضنة ونقل إلى BSC معقمة. تأخذ 0.1 مل الوسط الملقحين من كل زجاجة المصل والودائع إلى ثلاثة بشكل منفصل يسمى الترعة العقيمة.
      3. بعد تقطيع، إدراج ومبومو يحتوي على الثقافة في الأشعة فوق البنفسجية (UV/Vis) تظهر جهاز المطياف الضوئي وقراءة OD ₆₀₀ واحد في وقت واحد، وتسجيل جميع ثلاث قراءات لهذه النقطة الزمنية.
         ملاحظة: للسيد س. أونيدينسيس-1، أخذ نقاط البيانات في 1 و 14، 28، 32، 41، 57، 81 وح 105 بعد التطعيم. اكتمال النمو عند اكتمال هذه البكتيريا في مرحلة الموت. وينبغي تعديل هذه النقاط تبعاً لذلك إذا كان هناك نقص في المعرفة على النمو خاصة الوقت والميل للبكتيريا المستخدمة في هذا البروتوكول. إذا كان هناك عدم يقين حول اتجاه النمو، جمع البيانات ينبغي أن تكون النقاط على سبيل المثال، أكثر تواترا، كل ح ثلاثة ح 12 الأولى، كل ح الست للاحقة ح 36، في فترات ح 12 عن ح 100 التالية، وفترات ح 24 ل h. 124 النهائي
      4. استخدام OD ₆₀₀ نقاط البيانات كمحور y والوقت كالمحور س، رسم منحنى متوسط النقاط الثلاث التي اتخذت مع أشرطة الخطأ المعياري لكل مرة استخدام برامج الرسوم البيانية. يتم عرض منحنى النمو السيد س. أونيدينسيس-1 في الشكل 1 ب في قسم النتائج التمثيلية.
      5. باستخدام الرسم البياني إعدادها في الخطوة 1.3.3.4، تحديد الإطار الزمني للقسم سجل-المرحلة من منحنى النمو. بالنسبة شيوانيلا، هذا بين 12 و 33 ح النمو؛ ولذلك يمكن استنتاج أن في 24 ساعة للنمو، شيوانيلا سيكون داخل السجل المرحلة النمو، على افتراض أن مثقف البكتيريا باستخدام نفس الوسائط والعلاج قبل الاستخدام التي تم استخدامها لمنحنى النمو.

2. استزراع البكتيريا

1. يوم واحد: تطعيم "لوحة أجار"
   ملاحظة: تم استخدام هذا الجزء من الإجراء مع جيش التحرير الشعبي الصيني [اغروس]الشركة المصرية للاتصالات أن وحدة تكوين مستعمرة واحدة (زيمبابوي) في السجل-المرحلة، بدلاً من ثقافة كاتب السائلة المستخدمة لمنحنى النمو. وهذا يمكن أن يفترض إعادة إنتاج نفس شروط النمو، يرجع ذلك إلى حقيقة أن يستخدم حساب السياحة الفرعي دون سكر العنب ونقل فيما بعد إلى " أسلاك " المتوسط في النمو الداخلي المنحنى، وحساب السياحة الفرعي له نفس المكونات التي تتألف منها TSB.
   1. إزالة الأسهم "جفبباكتيريا" 1-السيد س. أونيدينسيس من الثلاجة-80 درجة مئوية ومكان إلى دلو الجليد، ومكان هذا الدلو داخل BSC معقمة.
   2. داخل بكالوريوس العلوم، استخدم حلقة تلقيح ميليلتر 1 عقيمة كشط سطح الأوراق المالية المجمدة البكتيريا واستخدم في الحلقة إلى T-الانتصارات سطح صفيحة [اغروس]-
   3. بعد ختم على جانبي اللوحة مع الفيلم البارافين البلاستيك، عكس اللوحة وتخزينها في حاضنة 30 درجة مئوية ح 24، حتى تظهر مستعمرات فردية.
2. "يوم اثنين": تطعيم "زجاجة المصل"
   1. إزالة اللوحة من الحاضنة وفتح داخل البكالوريوس-
   2. داخل بكالوريوس العلوم، تنظيف سطح سداده المطاط على زجاجة مصل استعدادا من الخطوة 1.1.1 مع الإيثانول 70% في المياه دي-
   حدد
   3. زيمبابوي فردية من لوحة أجار، واستخدام المحاقن معقمة مع 22 مرفقة قياس الإبرة، وإيداع ما يكفي من وسائط النمو لإزاحة المستعمرة من اللوحة دون لمس أي المستعمرات المجاورة ويخلط المستعمرة المتوسطة بطرف الإبرة-
      ملاحظة: A منفردة مستعمرة يجب أن يكون محدداً بما فيه الكفاية بعيداً عن بكتيريا أخرى على اللوحة، مثل أن يمكن أن تودع المتوسطة على ذلك دون لمس أي مستعمرات أخرى.
   4. باستخدام نفس المحاقن، استخراج السائل من سطح اللوحة.
   5. بعد التنصت على فقاعات داخل المحاقن، حقن السائل في زجاجة المصل، ووضع على شاكر مداري ضمن 30 درجة مئوية في 150 دورة في الدقيقة ل 24 h.
      ملاحظة: التنصت على فقاعات الخروج من المحاقن مهم تفاديا لإدخال المزيد من الأوكسجين إلى زجاجة المصل، إدخال المزيد من الأوكسجين إلى الزجاجة يمكن أن تغير الظروف التجريبية والحد من الاتساق بين أوقات نمو للبكتيريا.
3. "يوم اثنين": تعقيم Microchannel سالفي
   ملاحظة: ينبغي أن يتم تعزيز العقم نظام الأنابيب، الخطوات التي تتطلب فصل المحاقن من الأنابيب والاستعاضة بحقنه جديدة داخل بكالوريوس العلوم. للقيام بهذا، ببساطة فصل المحاقن من مضخة الحقن بفك حامل المحاقن المعدنية، وجلب المحاقن مع أنابيب يعلق على بكالوريوس عقيمة. عندما ذكر نظام الأنابيب في الإجراءات، وهذا يشير إلى حقنه تحتوي على خزان السائل، المرفقة مع حاقن بولييثيريثيركيتون (نظرة خاطفة) لأنابيب PTFE، تعلق على الدائرة بالتنقيط، التي قد حاقن نظرة خاطفة تركيب يعلق على الأنابيب، فضلا عن الحاوية منفذ أن يتم إغلاق الأنبوب منفذ سالفي لمدخل سالفي.
   1. استخدام جهاز سالفي جديد وإرفاق تركيب نظرة خاطفة وحاقن إلى واحدة من نهاية الأنابيب PTFE.
      ملاحظة: تعد أجهزة سالفي الطازجة لكل تجربة تصنيع الجهاز بالتفصيل في البحوث السابقة وبراءات الاختراع. ^{5 ، 6 ، 8 ، 15}
   2. أخذ 2 مل إيثانول 70% في محقن والاتصال المناسب نظرة خاطفة على سالفي. بعد الاتصال حقنه بمضخة الحقن وإرفاق مخرج سالفي زجاجة نفايات، يسمح الحل الإيثانول دي المياه لتشغيل من خلال سالفي في الدقيقة 20 ميليلتر ل 1.5 h.
   3. مل تأخذ 4 دي تعقيم المياه في محقن والاتصال إلى المدخل سالفي نفس. بعد الاتصال حقنه بمضخة الحقن، السماح للمياه لتشغيل من خلال سالفي في 20 ميكروليتر/دقيقة على الأقل 3 h.
   فتح الحزمة إحباط إعدادها في الخطوة 1.2.5
   4. "داخل البحرين"، والاتصال حقن معقمة خاطفة المناسب إلى نهاية حقنه 5 مل وتجهيزات خاطفة العقيمة إلى نهاية الأنبوب TFE. تأخذ ~ 3 مل متوسطة العقيمة في محقن ونعلق على أنبوب TFE. عكس الدائرة 5 مل بالتنقيط، واستخدام المحاقن معقمة، حقن المتوسطة النمو في الدائرة بالتنقيط حتى يصل إجمالي حجم 1 مل.
   5. توصيل نهاية الدائرة بالتنقيط حقنه 5 مللي إلى مدخل سالفي.
   6. تأخذ 10 مل متوسط النمو في المحاقن معقمة والاتصال إلى المدخل أنابيب التنقيط. بعد الاتصال حقنه بمضخة الحقن، تسمح على المديين المتوسط والبعيد من خلال سالفي في الدقيقة 20 ميليلتر ح 12 (أو بين ليلة وضحاها). استخدم شريط لاصق لتأمين هذه الأجزاء. تغطي زجاجة منفذاً بإحباط أو البارافين البلاستيك فيلم للتقليل من احتمال ذرات الغبار والكائنات الحية الواردة فيها تلوث المتوسط. يمكن الاطلاع على تصوير مفصلة لكيفية ظهور هذه الإعداد في الرقم 1 أ.
      1. السماح لأنابيب التنقيط لتكون عمودية، بمعنى أن مضخة الحقن ينبغي أن توضع على سطح مرتفع مع أنابيب التنقيط المضمون مع الشريط، ومع سالفي المضمونة على سطح مستو أدناه.
      2. تشغيل المتوسطة عن طريق سالفي ح 12 التأكد من أنه تمت إزالة جميع آثار الإيثانول من microchannel والأنابيب سالفي قبل تطعيم مع البكتيريا.
      3. المضافة للحماية تبقى الدائرة microchannel سالفي داخل طبق بتري معقمة، مع الجانبين قطع لتناسب بمدخل ومخرج الأنابيب. بالإضافة إلى ذلك، تبقى الشريط دائماً على نافذة لحماية غشاء الخطيئة والقناة قبل التصوير التحليل.
4. "يوم الثلاث": تلقيح Microchannel سالفي
   1. إزالة نظام أنابيب كله (حقنه متصلة بالتنقيط دائرة متصلة سالفي متصلاً بزجاجة النفايات) من مضخة الحقن واحضاره إلى بكالوريوس معقمة. بالإضافة إلى ذلك، إزالة القنينة المصل من الخطوة 2.2.5 من الحاضنة وجعله على بكالوريوس العلوم-
   2. تنظيف سطح سداده زجاجة المصل مع الإيثانول 70% لمنع أي تلوث ومن ثم استخدام المحاقن معقمة مع إبرة ز 22 عقيمة مرفقة استخراج 4 مل بكتيريا من الزجاجة.
   3. فصل سالفي من الدائرة 5 مل من أنابيب التنقيط، وربط المحاقن مع المتوسطة الملقحين مباشرة إلى المدخل سالفي. ترك أنابيب التنقيط ضمن حزمة رقائق ألومنيوم عقيمة أو داخل البكالوريوس-
   4. نعلق المحاقن مع زجاجة سالفي ومنفذ لضخ حقنه لتشغيل في 20 ميليلتر/دقيقة ح 3 لتطعيم قناة سالفي، بغية السماح لعدة تغييرات حجم السائل الواردة ضمن سالفي.
   5. بعد التطعيم، قطع المحاقن مع سالفي مضخة الحقن وتجلب على بكالوريوس في العلوم. بعد إرفاق المدخل سالفي العودة إلى قاعة بالتنقيط 5 مل من الخطوة 2.4.3، تأخذ 20 مل متوسط النمو في المحاقن معقمة وإرفاق إلى المدخل أنابيب التنقيط.
   6. إحضار أنابيب المرفقة سالفي BSC إلى مضخة الحقن والسماح على المديين المتوسط ويمر عبر الأنابيب بمعدل 2 ميليلتر/دقيقة لستة إلى عشرة أيام، أو حتى تصوير الفلورية (نوقشت في الخطوة 3) يظهر النمو مواتية بيوفيلم مرئية تحليل ToF-سيمز. عبوة متوسطة جديدة أثناء تشغيله داخل بكالوريوس العلوم بملء المحاقن معقمة جديدة مع 10 مل متوسط النمو وإرفاق سالفي بعد المتوسطة النمو السابقة قد نفد.
      ملاحظة: بعد بداية التطعيم في 2 ميليلتر/دقيقة، معدل تدفق ينبغي ابدأ زيادة أو انخفضت، كتغيير معدل التدفق سيكون إنشاء القص-الضغط داخل القناة وفصل في بيوفيلم. من الأهمية بمكان أنه ينبغي تغيير هذا معدل التدفق ابدأ؛ للتحضير لهذا، ح ~ 24 قبل سيمز، مراقبة الأنبوب عن كثب للتأكد من أن هناك لا فقاعات حيث أنه ليست هناك حاجة لدفع أكثر المتوسطة بمعدل أسرع في جميع أنحاء الأنبوب.
      1. تجنب الفقاعات في microchannel، كما أنها يمكن أن تدفع بيوفيلم خارج القناة. من المهم أن تكون حذرة من فقاعات داخل الجزء السفلي من الأنبوب بالتنقيط 5 مل فيها وهو يربط الأنبوب سالفي. يمكن حقن متوسطة جديدة في نهاية حاقن نظرة خاطفة التأكد من أنه سيتم فرض لا الهواء سالفي.

3. البصرية التصوير من بيوفيلم داخل Microchannel سالفي

1. Fluorescence التصوير المجهري
   ملاحظة: شيوانيلا المستخدمة ككائن نموذج ضمن هذا البروتوكول هو تحور للتعبير عن التجارة والنقل؛ وعلى هذا النحو، فإنه لا يتطلب تلوين. إذا تتطلب البكتيريا تلطيخ، وهذا ينبغي دائماً أن يتم في فلووراتي نفسه (مثلاً، 2 ميليلتر/دقيقة) لتجنب مفرزة بيوفيلم. بالإضافة إلى ذلك، عندما تذهب الخلايا دون توافر المغذيات، سيتم فصل. ولذلك، إذا كان مطلوباً أي تلطيخ إضافية، وصمة عار ينبغي حقن المتوسطة النمو بدلاً من الماء قبل توريد لوصمة عار الخلايا.
   1. فصل سالفي من بالتنقيط الأنابيب داخل بكالوريوس العلوم وأغلق سالفي بالشد التركيبات نظرة خاطفة للاصبع-تشديد الاتحاد نظرة خاطفة-
   2. الشريط الأنابيب الدائرة microchannel سالفي بشكل أمن إلى شريحة زجاج، مثل أن يكون الإطار مسطحة تماما والتي تواجه التصاعدي. إزالة شريط الحماية من النافذة. المشبك الشريحة إلى مرحلة المجهر بوضع الشريحة الزجاجية بين المشابك المرحلة على المنصة-
   3. أقل مرحلة المجهر مثل أن يتم وضع الجزء العلوي من سالفي إغلاق ما يكفي لنهاية الهدف العاشر 10، حيث لن يسبب التكيف للتركيز العدسة للمس النافذة.
   4. التبديل على الخلفية والعثور القناة باستخدام 10 × الهدف المجهر بضبط التركيز. وفي هذا الوقت، تأكد من وجود مرفق البكتيرية إلى الإطار الخطيئة من سالفي يتضح بالمقارنة مع نافذة قناة التحكم مع لا البكتيريا الملقحين. لتوثيق تصوير الخلايا، قم بالتبديل إلى هدف 20 x. بالمقارنة مع قناة سالفي فارغة، وجود البكتيريا التي تعلق على الإطار ينبغي أن يكون فلورية خضراء قوية.
   5. إيقاف تشغيل الإضاءة الخلفية وتشغيل المصدر الزئبق المجهر. الانتظار 2-3 دقيقة وقم بالتبديل إلى عامل التصفية فيتك تعيين على المجهر لعرض والتقاط صور بيوفيلم يعلق على النافذة. كمثال لما بيوفيلم نضجت سوف تبدو وكأنها عندما تكون جاهزاً، الرجوع إلى الشكل 1 ج.
   6. بدوره قبالة مصدر الزئبق وفصل سالفي من الشريحة. إذا لزم الأمر، إرفاق 2 ميليلتر/دقيقة تدفق المتوسط مرة أخرى للسماح لمزيد من النمو قبل التصوير مرة أخرى، أو نقل سالفي إلى استخدام الاحتواء الثانوي لتحليل ToF-سيمز. وهذا مطلوب إذا كان سمك بيوفيلم هو خلص إلى أن لا تكون سميكة ما يكفي، والمطلوب المزيد من الوقت للنمو قبل تحليل ToF-سيمز. لإرفاق إلى تدفق المتوسط مرة أخرى، أرجع إلى الخطوة 2.3.6.
      ملاحظة: إذا وضع مرة أخرى تحت التدفق المتوسط، تصوير الأسفار وينبغي أن يتم مرة أخرى قبل تحليل ToF-سيمز.
      1. تعطي بيوفيلم المتوسطة النمو إطعام عليه حتى يمكن إجراء تحليل ToF-سيمز. وبينما لا يوصي، إذا لزم الأمر، سالفي مغلقة يمكن تخزينها داخل 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها، ولكن ينبغي أن يسمح للحارة إلى درجة حرارة الغرفة قبل إدراج إلى الدائرة فراغ ToF-سيمز. غير أن تحليل بيوفيلم فورا بعد فصل من تدفق المتوسط للحد من مفرزة بيوفيلم-

4. الحصول على البيانات ToF-سيمز

ملاحظة: هذا القسم بمثابة نظرة عامة، ويناقش بمزيد من التفصيل داخل لدينا بروتوكول سابق يصف جزيء البروتين الممتزة السائل سيمز التحليل. ¹²

1. سالفي تثبيت في قاعة لوادلوك سيمز ToF
   ملاحظة: يجب أن تلبس القفازات في جميع الأوقات عند التعامل مع الجهاز سالفي وتثبيته على ToF-سيمز المرحلة لتجنب التلوث المحتملة خلال السطح تحليل.
   1. سالفي جبل على خشبة المسرح وإصلاحه مع عدة مسامير. تأكد من أن الإطار الخطيئة شقة بضبط المسمار ضيق وإدراج السيليكون رقاقة القطع في الجزء السفلي من الدائرة microchannel PDMS. إزالة شريط الحماية من النافذة، ثم تحميل المرحلة في قاعة لوادلوك سيمز ToF.
   2. فتح لوادلوك ToF-سيمز، عقد ومهدت أفقياً على منصة التحميل، وتغلق الباب في وجه لوادلوك. بدء مضخة الفراغ والانتظار لضمان التوصل إلى ذلك الفراغ مناسبة.
   3. نقل سالفي إلى الدائرة الرئيسية بمجرد الفراغ واستقرت على 1 × 10 ^-7 [مبر]-
2. عمق التنميط وجمع بيانات النقاط
   1. العثور على القناة موائع جزيئية باستخدام المجهر الضوئي مجهزة في سيمز ToF.
   2. تحديد وضع إيجابي أو سلبي قبل الحصول على البيانات. استخدام 25 كيلو بي ₃ ⁺ شعاع كشعاع أيون الأولية في كل القياسات، واستخدام البندقية الفيضانات الإلكترون لتحييد السطح الشحن خلال كافة القياسات.
   عرض
   3. مسح شعاع ₃ ⁺ ثنائية مع 150 نانوثانية نبض في منطقة جولة مع قطر ~ 2 ميكرومتر مع 64 بكسل بكسل 64. بعد اللكم من خلال نافذة الخطيئة 100 نانومتر، مواصلة لمسح لآخر 150 s لجمع بيانات الكثافة العالية للتصوير. بعد لكمه من خلال، ستزيد التهم إلى حد كبير داخل عمق التنميط المنطقة. بعد تحقيق الاستقرار، وهذا يمكن أن يشار إليها باسم منطقة عالية الكثافة.
   4. تقليل عرض النبضة إلى 50 ns لجمع البيانات للحصول على الأطياف بقرار جماعي أفضل. يستمر هذا الاستحواذ لحوالي 200 آخر س.
   5. كرر هذه الخطوات لجمع ثلاث نقاط بيانات سلبية وإيجابية على الأقل ثلاثة-
      ملاحظة: تأكد من الفضاء لكمه من خلال مجالات مثل أنه لن كسر الإطار الخطيئة وتسرب في الدائرة بالفراغ من المساس بسلامة الإطار.

5. تحليل البيانات ToF-سيمز

1. "معايرة الكتلة" باستخدام البرمجيات إيونتوف
   1. فتح برنامج تحليل ToF-سيمز (قياس Explorer)، وثم انقر فوق " الملامح "، " الأطياف " و " الصورة " الأزرار، على التوالي، إلى عملية عمق الشخصية والطيف m/z، وبيانات الصورة-
   2. فتح ملفات البيانات التي تم الحصول عليها في جميع أنحاء اقتناء البيانات ToF-سيمز.
   3. تحديد عمق تنميط البيانات ذات الاهتمام وإعادة إعمار الأطياف وفقا للسلسلة الزمنية الشخصية عمق.
   4. الصحافة " F3 " لفتح " الشامل المعايرة " النافذة. اختر قمم للمعايرة استناداً إلى المركبات الكيميائية التي من المتوقع أن توجد في عينة محددة.
2. قمم التحديد الاهتمام
   1. كذروة التحديد الضروري لتحليل العينات، تحديد القمم المميزة للعينة وفقا للأدب أو غيرها من النتائج السابقة، إذا كان هناك أي. مقارنة كثافة قمم مصلحة في الأطياف m/z. إذا لزم الأمر، إضافة قمم جديدة أو حذف قمم تدخل في قائمة الذروة.
   2. فوق في ذروتها، العثور على الخطوط الحمراء في الإطار السفلي الأيسر. نقل الخطوط الحمراء أن أرفق ذروة كله.
   3. تحديد ذروة مطابقة الصيغة الكيميائية في إطار النطاق الرئيسي، ثم انقر فوق " إضافة ذروة " الزر أعلى النافذة.
3. تصدير بيانات معايرة الكتلة
   1. لتصدير قائمة ذروة، في " "قائمة ذروة" " القائمة، حدد " حفظ … " قائمة الذروة في " إيتميل " تنسيق.
   2. لتصدير ملف تعريف عمق، في " الشخصية " إطار، انقر على " ملف " القائمة، ثم حدد " تصدير "، ثم حدد " حفظ ك " ".txt " ملف.
   3. لتصدير ملف طيف m/z، في " الأطياف " النافذة، انقر فوق " ملف " القائمة، ثم حدد " تصدير "، ثم حدد " حفظ ك " ".txt " الملف.
   4. لتصدير ملف صورة، في " الصورة " النافذة، طباعة الشاشة وحفظها كملف الصورة.

6. ToF-سيمز رسم البيانات وعرض

1. استخدام أداة رسم لاستيراد البيانات.
2. جعل أرض استخدام m/z ككثافة المحور السيني والذروة كمحور لإظهار الطيف أعيد بناؤها. يرد مثال في الشكل 2 أ.
3. بناؤها الجمع بين الصور ثنائية الأبعاد (2D) m/z مختلفة وشكل مصفوفة لإظهار أما تعيين أيون إيجابية أو سلبية. ويرد مثال في الشكل 2 ب.

Representative Results

تخدم هذه النتائج ممثلة لإظهار كيف يمكن تحديد ملامح الكيميائية بيوفيلم المرفقة وتفسيرها، كما تم الحصول عليها من خلال ToF-سيمز. أن يجري تحديد الذروة بعد التآمر الأطياف الشامل من الحصول على البيانات ToF-سيمز، يبرز بإيجاز في المقطع "إجراءات"، بغية تعيين هويات لكل قيمة كل منهما m/z. يمكن أن يتم ذلك من خلال استعراض الأدبيات الواسعة في الطيف الكتلي على البكتيريا وشظايا الكيميائية المحددة التي من المتوقع أن تكون موجودة داخل البكتيريا درس، مثل مختلف الكتل المائية، والأحماض الدهنية، وشظايا البروتين. ^{16 , 17 , 18 , 19 , 20} إظهار هذه النتائج ممثلة فقط الأطياف السلبية الجماعية كما حصل بيوفيلم السيد س. أونيدينسيس -1 وعينه مياه دي. تفسير أطياف إيجابية اتباع إجراء مماثل.

الشكل 1 أ يظهر الإعداد التخطيطي وفقا لهذا البروتوكول عندما يزرعون بيوفيلم في microchannel سالفي. في أعلى اليسار، أرفقت حقنه مضخة الحقن، التي تحافظ على تدفق متوسط معدل ثابت في جميع أنحاء النظام أنابيب بفتي وداخل microchannel. يتم وضع مضخة الحقن فوق الدائرة بالتنقيط، مما يمنع التلوث إلى الخزان المتوسطة لمنع الكائنات متحركة من السباحة تيار يصل إلى الوراء. المتوسط تدفقات من الخزان الدائرة بالتنقيط مباشرة في الأنبوب بفتي من سالفي، الذي يمر من خلال microchannel والأنابيب منفذ باستخدام زجاجة منفذ مختومة. خطوط منقطة أشر من نافذة الخطيئة إلى صورة نضجت . س. أونيدينسيس الخلايا "بروتينات فلورية خضراء" MR-1 ألقت مجهرية الأسفار، مفصلة في الخطوة 3، 1. الشكل 1 ب يبين مثالاً لمنحنى نمو المنشأة باستخدام نموذج الكائن لهذا البروتوكول، السيد س. أونيدينسيس -1. من مراحل النمو في هذا الرسم البياني، يمكن استنتاج أن السجل--مرحلة النمو يحدث بين 15-32 ح في هذه الظروف زراعة محددة. معلومات إضافية من هذا الرسم البياني يظهر أن ح 0-15 مرحلة تأخر النمو، وح 33-105 يمثل المرحلة ثابتة للنمو. الشكل 1 ج صورة المكتسبة مع مجهرية fluorescence عرض مثال بيوفيلم نضجت.

الشكل 2 أ يظهر الأطياف السلبية الجماعية من رطب . س. أونيدينسيس بيوفيلم MR-1 داخل القناة موائع جزيئية، كالتي حصلت عليها في الموقع السائل ToF-سيمز. يوضح هذا الرسم البياني مثال على النطاق الجماعي المحدد (m/z 100-350) المقارنة بين بيوفيلم المياه السيد S.oneidensis -1 ودي، هذا الأخير تم الحصول عليها كعنصر تحكم نظام. الشكل 2 ب يعرض مقارنة لصور ثنائية الأبعاد من قمم اهتمامها بيوفيلم MR-1 والمياه دي التي حصل عليها ToF-سيمز. تحديد ذروة المحتملة لقيم m/z مرة واحدة مثيرة للاهتمام قيم m/z يمكن التعرف من دراسة الأطياف الشامل، بشكل صحيح يعزى إلى شظايا الكيميائية، كما تدعمها "سيمز إيونتوف" برامج المكتبة والأدب الدراسة الاستقصائية. قمم اهتمام في الشكل 2ألف تشمل تجمعات المياه (أي، ض م/107 (ح₂س)₅يا^–، 125 (ح₂س)₆يا^–، 143 (ح₂س)₇يا^-، 161 (ح₂ س) 215 (ح₂س)₁₁يا^–، 197 (ح₂س)₁₀يا^–، 233 (ح₂س)₁₂يا^-، 251،₈يا^–، 179 (ح₂س)₉يا^– (ح₂س) ₁₃ أوه^–، 269 (ح₂س)₁₄يا^–، 287 (ح₂س)₁₅يا^–، 323 (ح₂س)₁₇يا^-، (ح₂س) 341₁₉يا^–))⁹، كما إلى بواسطة خطوط حمراء فوق قمم كل منهما، الاستشعار عن النصاب القانوني المتعلقة بالمؤشرات الحيوية مركبات (أي، m/z 175 ج₁₀ح₉رقم₂^–)، تركات EPS (m/z ج 123₂ح₄ص₄^-، ع 159 ₂ O₈ح^–، Cr 216₂س₇^–، أوكتاديكانويثيولس 285، المركبات القطبية 325، المركبات القطبية₁₂ ج)^15،،من¹⁶¹⁸، وسلسلة الأحماض الدهنية شظايا (أي m/z 127] ج₂ح₃(الفصل₂)₃سجع [^-، 255 C16:0 الأحماض الدهنية، حمض اللينوليك 279،₃₁س ج₁₈ح₂^–، 325 ج₂₁ح₄₀س₂ ^-، 341 السطحية الدهون، 18-اتفاق بيئي متعدد الأطراف ملزمة من خلال الربط ثيويستير، وحمض دهني ج₁₈ح₃₅س₂^–، وأيونات مونواسيلجليسيريلس بلميتيك ج₁₉ح₁₇س₆ ^-). ^{16 , 19}

منذ بيوفيلم هو رطب، فإنه ليس من المستغرب أن بعض قمم ينظر في العينة بيوفيلم مماثلة لتلك الموجودة في المياه دي. وتتميز هذه القمم الكتلة المائية مع خط أحمر فوق كل ذروة في الشكل 2أ، بما في ذلك m/z 107، 125، 143، 161، 179، 197، 215، 233، 251، 269، 287، 323، و 341 والمقابلة إلى يا^– (ح₂س)₅ (ح₂س) ₆ أوه^– (ح₂س)₇يا^– (ح₂س)₈يا^– (ح₂س)₉يا^– (ح₂س)₁₀يا^– (ح₂ O)₁₁يا^– (ح₂س)₁₂يا^– (ح₂س)₁₃يا^– (ح₂س)₁₄يا^– (ح₂س)₁₅يا^- يا^– يا^-، (ح₂س)₁₉(ح₂س)₁₇على التوالي. ⁹ كما أن هناك انتشار العديد من الكتل المائية المميزة في هذا النطاق الشامل، هذه النتائج تقدم دليلاً قويا للبيئة المجموعة الكيميائية للمياه الموجودة في بيوفيلم رطب. بالإضافة إلى ذلك، الكتلة المائية غير المتصلة بقمم لوحظت في كل الأطياف ويمكن أن يعزى عادة كقمم التدخل، عادة من PDMS، مكون من القناة موائع جزيئية. على سبيل المثال، هو ذروة التدخل المعروفة الشائعة واحدة من PDMS m/z 137 في وضع أيونات سالبة.

عند مقارنة بيوفيلم سيمز الجماعي الأطياف لأن دي المياه، كما هو مبين في الشكل 2أ، بعض قمم ليست موجودة في المياه دي، بعد ظهورها في بيوفيلم. على سبيل المثال، في الذروة في m/z 255 ([₃(الفصل₂) CH₁₄سجع]^-، بلميتيك) موجودة بكثافة عالية في العينة بيوفيلم، ولكن ليس على الإطلاق في عينة المياه دي. وهذا يوحي أن ج إشاراتome من بيوفيلم، الأكثر احتمالاً بيوفيلم و/أو EPS المولدة ذاتيا،. تم تحديد العديد من قمم مثيرة للاهتمام في الشكل 2ألف. على سبيل المثال، تشمل قمم m/z 123^-، وجد أن ج₂ح₄ص₄^-، 159 (ف₂س₈ح^–)، 216 المتعلقة EPS (Cr₂O7^–)، 285 (أوكتاديكانويثيولس)، و 325 (المركبات القطبية، ج المركبات القطبية ₁₂ ). ^{17 , 18 , 20} تم العثور على قمم المرتبطة بالأحماض الدهنية إلى 127 ([ج₂ح₃(الفصل₂)₃سجع]^–)، 255 ([₃(الفصل₂) CH₁₄سجع]^-، بلميتيك)، 279 ([ش₃ (الفصل₂)₁₅سجع]^-، حمض اللينوليك)، 317 (ج₂₁ح₃₃س₂^–) و 325 (ج₂₁ح₄₀س₂^–) 341 (الدهون السطحية، ملزمة من خلال 18-طيران الشرق الأوسط ثيويستير الربط، حمض دهني ج₁₈ح₃₅س₂^-، أيونات مونواسيلجليسيريلس من حمض النخليك ج₁₉ح₁₇س₆^–). ^{16 , 19} أخيرا، إشارة الاستشعار عن نصاب إشارة quinolone المتصلة بذروة ج₁₀ح₉رقم₂^– لوحظ في m/z 175.

الشكل 2 ب عرض صور ثنائية الأبعاد لتوزيع أربعة أيونات مثيرة للاهتمام مختلفة بين بيوفيلم 1 السيد س. أونيدينسيس (الصف العلوي) والمياه دي (الصف السفلي). القيمة m/z 107 ((ح₂س)₅يا^–) يظهر كتلة الماء من كثافة كبيرة داخل العينات، القيمة m/z 175 (ج₁₀ح₉رقم₂^–) يصور نصاب الاستشعار من الإشارات ذات الصلة، m/z 255 هي الأحماض الدهنية ([₃(الفصل₂) CH₁₄سجع]^-، بلميتيك)، وقد تمثل كل أجزاء المادة الدهنية m/z 341 (ج₂₁ح₄₁س₂^–) والمياه الكتل نظراً لدقة 1 اتحاد المغرب العربي الشامل. ⁹ مناطق أكثر إشراقا في 2D الصور تشير إلى عدد أكبر من أيون الجزيئية الموجودة في الصورة. كما هو متوقع، إشارات QS المركبة، والدهون كانت أكبر بكثير في الكمية داخل العينة بيوفيلم. كان أقوى في جميع أنحاء العينة بيوفيلم الإشارة للكتلة المائية (m/z 107)، فإنه كان حاضرا أيضا في عينات المياه دي، كما هو متوقع. أخيرا، تم العثور على الإشارة في m/z 341 لتكون متجانسة داخل العينة بيوفيلم، ولكنها ضعيفة جداً داخل العينة المياه دي. إذا كان m/z 341 ذروة كتلة المائية، كان أيضا الممثل عدة مختلفة من الأحماض الدهنية والدهون السطحية. ¹⁶ وجودها أقوى داخل بيوفيلم العينة بعد تطبيع البيانات تشير إلى أن وجود شظايا الدهون تفوق بوجود تجمعات المياه.

الشكل 1 : التخطيطي التجريبية. (أ) يعرض التخطيطي تجريبية من إعداد بيوفيلم كما يظهر داخل المختبر. بدءاً من أعلى اليسار، تدفقات متوسطة من المحاقن (1)، التي أرفقت بمضخة الحقن (2)، السيطرة على المعدل الذي يتحرك السائل من خلال. تشير الأسهم إلى اتجاه التدفق في جميع أنحاء النظام. المحاقن (1) متصل عن طريق حاقن نظرة خاطفة تركيب (3) إلى أنابيب TFE (4). المتوسطة التدفقات من خلال دائرة بالتنقيط (5) لتجنب التلوث، ويتحرك في نهاية المطاف من خلال سالفي (6) للحاوية منفذ مختومة (7). يتم وضع مضخة الحقن على سطح مرتفع (9) أن الدائرة بالتنقيط (5) يمكن أن يكون عمودياً على سطح مستو (8) سالفي (6) يوضع عليها. (ب) النمو منحنى بالنسبة أونيدينسيس شيوانيلا السيد-1 في المتوسط "أسلاك". ح 0-15 الوقت يمثل مرحلة انتقالية، يمثل الوقت ح 15-33 سجل المرحلة، الوقت ح 33-105 يمثل مرحلة ثابتة، والوقت ح 105، أو لم يعد يمثل مرحلة الموت. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. (ج) صورة بيوفيلم نضجت المكتسبة مع الفحص المجهري الأسفار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 : مقارنات ToF-سيمز السلبية أطياف ترطيب بيوفيلم أونيدينسيس شيوانيلا والسيد-1 المتوسطة في microchannel سالفي. (أ) m/z سيمز الشامل أطياف بيوفيلم أونيدينسيس شيوانيلا في MR-1 المتوسطة والمياه دي. واستخدمت هذه الأخيرة كعنصر تحكم. الخطوط الحمراء تبين مواقع قمم الكتلة المائية المميزة. (ب) صورة 2D مقارنة قمم اهتمام بين بيوفيلم والمياه دي. عرض الصور من اليسار إلى اليمين، كتلة الماء (m/z 107 (ح₂س)₅يا^–)، إشارة استشعار هرمون النصاب القانوني (m/z 175، ج₁₀ح₉رقم₂^–)، الأحماض الدهنية (m/z 255،] الفصل₃(CH ₂)₁₄سجع]^-، بلميتيك)، والسطح شظايا الدهون/EPS (m/z 341، 18-الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف،₄₁س ج₂₁ح₂^–). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

بعد تطعيم المرحلة سجل، من المهم لاختبار العدد من الأيام ودرجة الحرارة التي ينبغي أن ينمو بيوفيلم قبل أن تكون سليمة وسميكة ما يكفي للتصوير، كما هو موضح في الخطوة 3، 1. ويشمل هذا الإجراء على وجه التحديد استزراع. س. أونيدينسيس بيوفيلم MR1 في درجة حرارة الغرفة؛ ومع ذلك يمكن أن تؤثر درجة حرارة الغرفة مختلفة معدل النمو. ولذلك، من المهم استخدام التصوير الضوئي لفهم سواء بيوفيلم جاهز قبل الشروع في تحليل ToF-سيمز. وبالمثل، تتطلب سلالات مختلفة من البكتريا شروط مختلفة للنمو والطول لتحقيق سمك مرغوب فيه للتحليل. بينما منحنى النمو في الشكل 1b يصور المرحلة سجل 200 من البكتيريا لتكون ح 12-32، وكان يستخدم هذا في 24 ساعة طوال فترة الإجراءات، من المهم أن نلاحظ أن هذا الوقت لا يمكن استخدامه كسجل-المرحلة لسلالات أخرى من البكتيريا دون إنشاء منحنى النمو بشكل مستقل. بينما كانت المرحلة سجل بين ح 12 و 33 لنمو س. أونيدينسيس، اختير 24 ح يرجع ذلك إلى حقيقة أن كان في جزء النمو حيث بدأ الأكسجين للحد من معدل النمو للكائن الحي، ونهاية المرحلة سجل. تجارب أظهرت أن هذه الخلايا وقت بدأ إنتاج أسلاك، وهكذا تستعد للنموذج الأغشية الحيوية الناجحة التي يمكن البقاء على قيد الحياة في بيئات منخفضة الأكسجين. ^{3 , 13} ونتيجة لذلك، الوقت المختار لاستخدام البكتيريا خلال مرحلة تسجيل ينبغي أن تتأثر بالبحوث الخبرة والمعرفة المكتسبة من الأدب في دراسة تجريبية للبكتيريا قيد الدراسة. بالإضافة إلى ذلك، يجب إنشاء منحنى نمو منفصلة لفهم المرحلة السجل لجميع سلالات مختلفة من البكتيريا التي سوف تستخدم لنمو بيوفيلم استخدام هذا النهج. وكان معدل النمو 2 ميليلتر/دقيقة حتى المحسوبة كما لا أن تتجاوز الحد الأقصى-معدل النمو أونيدينسيس س. اختير السيد-1، وإجمالي الوقت للحصول بيوفيلم ناضجة التي كانت متضخمة لا وعرضه لفصل. ويمكن تعديل هذه المعدلات تبعاً لذلك إلى معرفة بكتيريا المختلفة ليتم استخدامها مع هذا الإعداد.

وتشمل بعض القيود على استخدام سالفي للنمو بيوفيلم التسمم داخل القناة، فضلا عن احتمال البكتيريا تعلق على الجدران المسطحة من القناة. على الرغم من النمو بمعدل ثابت، يوصي بأن تكون 2 ميليلتر/دقيقة في هذا البروتوكول، لا يزال يمكن أن يحدث التسمم إذا سمح بيوفيلم أن تنمو لفترة طويلة جداً. في هذه حالة، ودون سابق إنذار، بيوفيلم فصل من النافذة والخروج سالفي لاحتواء منفذ. كما يمكن أن يحدث التسمم ببساطة بإضافة قوة ميكانيكية (أي، نقل) سالفي، التي لا يمكن تجنبها. ومع ذلك، هذا يمكن أن يوضع في الاختيار عن طريق عرض إرفاق بيوفيلم للنافذة الخطيئة قبل تحليل ToF-سيمز تحت مجهر خفيفة. يتضمن واحدة أخرى القيد نعومة microchannel PDMS التي يمكن أن تجعل من الصعب بالنسبة لبعض أنواع البكتيريا لإرفاق. ومع ذلك، يمكن تغيير هذا في تصميم سالفي لاستيعاب عن طريق إنشاء حواف مضلع للقناة، إذا كان مرفق البكتيريا قضية. أخيرا، يمكن أن يتم حساب الخلية بدلاً من القراءات₆₀₀ التطوير التنظيمي لتحديد منحنى النمو. على سبيل المثال، أظهرت الدراسات علاقة مباشرة ومتسقة لعدد خلايا للقراءات₆₀₀ OD. ²¹ ولذلك, OD₆₀₀ تعتبر كافية في تقييم النمو بيوفيلم.

القيود على هذا الأسلوب قليلة، كما سالفي أساسا بمثابة طبق ثقافة التي لديها الكثير من التنوع لاستخدامها في العديد من التطبيقات، مثل لاهوائيا داخل صندوق القفازات، أو داخل أي دائرة البيئة التحكم في درجة الحرارة. وتشمل بعض القيود البسيطة ظروف غرفة لا يمكن السيطرة عليها مثل الرطوبة النسبية ودرجة الحرارة وموضع القرب من أشعة الشمس، والتي لا يزال من الممكن استيعابها، لظروف النمو المثلى كل بكتيريا محددة. وبالإضافة إلى ذلك، بعض من هذه التحديات التقنية يمكن التغلب عليها مع حاضنة مع ميزات الوساطة الصحة الإنجابية في الإعداد بيوفيلم أو درجة الحرارة.

سالفي واجهة متوافقة مع فراغ موائع جزيئية. في هذا العمل، استخدمت 200 × 300 ميليلتر موائع جزيئية قناة للثقافة الأغشية الحيوية التي اتبعت مع سيمز الضوئية والسائل التصوير. السوائل تحديا تقنيا لدراسة استخدام تقنيات استناداً إلى الفراغ، لأنها متقلبة ويصعب الاحتفاظ في الطور السائل في الفراغ. وهكذا كانت تقنيات الفراغ مثل سيمز ToF تقليديا يقتصر على العينات المبردة والجافة فقط. ²² بالإضافة إلى ذلك، سالفي يمكن استخدامها لتصوير متنوعة، والتحليل الطيفي باستخدام مجموعة متنوعة من تقنيات الفحص المجهري والتحليل الطيفي. ^{4 , 9} عملت مجموعتنا باستمرار توسيع نطاق التطبيقات سالفي المختلفة في التحليل في الموقع للسائلة والصلبة والسائلة واجهات. ^{15 , 23 , 24} جهودنا الأخيرة فعالية أثبتت البكتيريا مرفق للغشاء الخطيئة. ⁹ بعد الإلحاق الأولية، ثبت التدفق المستمر للمتوسطة على مر الزمن بنجاح زراعة بيوفيلم مباشرة في نافذة الخطيئة سالفي. خلال ToF-سيمز، يستخدم شعاع أيون الأولية لقصف ثقوب 2 ميكرومتر في القطر. هذا البعد يشبه طول خلية بيوفيلم يعلق على النافذة الخطيئة، وبالتالي توفير لمحة كيميائية عن بيوفيلم في به المكروية رطب بطبيعة الحال. وهذا بالغ الأهمية بسبب اختلاف الهوية الكيميائية بيوفيلم، وجود EPS، وبيئة الكتل المائية عند مقارنة الأغشية الحيوية في حالته المائية مع العينات المجففة. ⁹ دون استخدام سالفي، سيمز ToF يمكن فقط أن تجري على عينات الجافة والمبردة، توفير الخرائط الكيميائية التي تعجز عن التقاط صورة عينة في حالته المائية الطبيعية الكيميائية.

كما هو مبين في الشكل 1ألف، من المهم إبقاء المضخة حقنه أعلاه أنابيب التنقيط بغية السماح لأنابيب التنقيط لتكون عمودية microchannel سالفي. بالإضافة إلى ذلك، ستكون فقاعات أقل من المحتمل أن تصبح المحاصرين داخل الأنبوب للجهاز، إذا كان الأنبوب بفتي منفذ (داخل الزجاجة منفذ) أقل من أنابيب مدخل (المرفقة إلى الدائرة بالتنقيط). هو آخر خطوة حاسمة لزراعة البكتيريا للنمو سالفي أولاً الحصول على منحنى نمو لسلالة معينة من البكتيريا التي سيتم استخدامها، كما هو موضح في الخطوة 1، 3. يمكن أن يتم ذلك عن طريق الحصول على منحنيات النمو مع قياسات الكثافة البصرية. منحنى نمو، كما هو مبين في الشكل 1ب، مهم لفهم الإطار الزمني الذي سيتم البكتيريا داخل السجل-مرحلة النمو، عند فإنه يمكن الافتراض بأن البكتيريا أصح. استخدام البكتيريا في هذه المرحلة من النمو يسهل إنشاء المكروية بيوفيلم صحي ويضمن أن بيوفيلم سوف تنمو المعدل المتوقع. يتم تعقيم microchannel سالفي في درجة حرارة الغرفة مع الإيثانول 70% والمياه دي، كما أنه لا يمكن أن يعقم للتعقيم قبل استخدامها مع سيمز ToF. وهذا يرجع إلى أن التعقيم يمكن كل الأضرار نافذة سالفي وإدخال بخار الماء إلى القناة. بعد عدة أيام من النمو، يجب التحقق من microchannel مع الأسفار الفحص المجهري للتحقق من صحة ملحق البكتيرية. يمكن العثور على مثال في الشكل 1ج، واتخذت هذه الصورة لإظهار بيوفيلم نضجت. بسبب مسار التدفق المتوسط، البكتيريا أكثر تفضيلاً تعلق وينمو على طول حواف microchannel، كما أن هذا الموقع تدفق وقوى القص فيها أدنىt.

وخلاصة القول، سالفي وسيلة ممتازة للذي للأغشية الحيوية الثقافة ودراسة استخدام في الموقع تعيين الكيميائية، كما أنها تسمح بتوفير بيوفيلم الحية في حالته المائية الطبيعية إلى مطياف كتلة التصوير القائم على فراغ. هذا النهج الفريد يمكن أن تقدم معلومات أكثر عن المياه الكتلة المكروية بيوفيلم، كذلك فيما يتعلق باكتساب فهم أعمق لتركات EPS،. هذه المعلومات يمكن استخدامها لفهم الأنشطة البيولوجية بيوفيلم، ويمكن أن تستخدم في تطبيقات مختلفة كما هو الحال في الطب الحيوي والهندسة الطبية الحيوية، والزراعة، والبحوث الصناعية والتنمية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ToF-SIMS	IONTOF	TOF.SIMS 5	Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI)	Pacific Northwest National Laboratory	N/A	SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
-80°C Freezer	New Brunswick Scientific	N/A	U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer
4°C Refrigerator	BioCold Scientific	N/A	COLDBOX1
Orbital Shaker	New Brunswick Scientific	N/A	Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm.
Syringe Pump	Cole-Parmer	EW-74905-02	Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate.
Incubator	Barnstead International	LT1465X3	Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing.
Autoclave	Getinge	533LS	Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	4001-000	GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves.
Biological Safety Cabinet	Thermo Fisher Scientific	1385	1300 Series AZ Biological Safety Cabinet
Fluorescence Microscope	Nikon	N/A	Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply.
pH Meter	Mettler Toledo	51302803	Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving.
PEEK Union	Valco	ZU1TPK	For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system.
5 Axes Sample Stage	IONTOF	N/A	Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS.
Barnstead Nanopure Water Purification System	Thermo Fisher Scientific	D11921	ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Pipette	Thermo Fisher Scientific	21-377-821	Range: 100 to 1,000 µL.
Pipette Tip	Neptune	2112.96.BS	1,000 µL pipette tips
Razor Blade Handle	Stanley	N/A	Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing
Syringe	BD	309659	1 mL
Syringe	BD	309657	3 mL
Syringe	BD	309646	5 mL; Used for making the drip chamber
Syringe	BD	309604	10 mL
Syringe	BD	302830	20 mL
Disposable Pipette	Thermo Fisher Scientific	13-678-11	25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles.
Electric Pipette Filler	Pipet-aid	P-57260	Vacuum pressure electric serological pipette filler
Serum Bottle	Sigma	33109-U	Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle.
Anaerobic Culture Tube	VWR	89167-178	Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal.
Rubber Stopper	Sigma	27235-U	Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber.
Aluminum Crimp Seal (without septum)	Sigma	27227-U	Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper.
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper	Wheaton	224307	30 mm crimper with standard seal.
PTFE Tubing	Supelco	58697-U	1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system.
Disposable Cuvettes	GMBH	759085D	1.5 Ml for use with spectrophotometer.
Needle	BD	303015	22G; used for serum bottle injection.
Needle	BD	305120	23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system.
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP	N/A	N/A	Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94.
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	S25310A	95% Denatured
TSA	BD	212305	Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol
PIPES Buffer	Sigma	P-1851	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Hydroxide	Sigma	S-5881	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Ammonium Chloride	Sigma	A-5666	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Potassium Chloride	Sigma	P-4504	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S-9638	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Chloride	Thermo Fisher Scientific	S271-3	Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium lactate	Sigma	L-1375	60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Bicarbonate	Sigma	S-5761	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt	Sigma	N-0253	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron (III) Chloride	Sigma	451649	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Magnesium Sulfate	Sigma	208094	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Manganese (II) Sulfate Monohydrate	Sigma	M-7634	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron(II) Sulfate Heptahydrate	Sigma	215422	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma	223506	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Cobalt(II) Chloride	Sigma	60818	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Zinc Chloride	Sigma	229997	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Copper(II) Sulfate Pentahydrate	Sigma	C-8027	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate	Sigma	237086	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Boric Acid	Sigma	B-6768	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Molybdate Dihydrate	Sigma	331058	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nickel(II) Chloride	Sigma	339350	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Tungstate Dihydrate	Sigma	14304	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Biotin	Sigma	47868	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Folic Acid	Sigma	F-7876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Pyridoxine Hydrochloride	Sigma	P-9755	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Riboflavin (B2)	Sigma	47861	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thiamine Hydrochloride	Sigma	T-4625	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nicotinic Acid	Sigma	N4126	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt	Sigma	21210	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Vitamin B12	Sigma	V-2876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
4-Aminobenzoic Acid	Sigma	A-9878	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thioctic Acid	Sigma	T-1395	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}