In Situ Caratterizzazione di Shewanella oneidensis MR1 biofilm di SALVI e ToF-SIMS

Summary

Questo articolo presenta un metodo per la coltivazione di un biofilm per in situ spettrometria totale di ione secondaria tempo di volo per la mappatura chimica allo stato idratato, attivata da un reattore di microfluidica, sistema per analisi presso l'interfaccia liquida di vuoto. Shewanella oneidensis MR-1 con proteine di fluorescenza verde è stato usato come modello.

Abstract

Biofilm batterici sono comunità di superficie-collegati che sono ampiamente studiata per capire la loro auto-prodotti sostanze polimeriche extracellulari (EPS) e i loro ruoli in microbiologia ambientale. Questo studio descrive un metodo per coltivare biofilm allegato al sistema per l'analisi all'interfaccia liquido di vuoto (SALVI) e raggiungere in situ chemical mapping di un biofilm vivente mediante spettrometria di massa di ioni secondari di tempo di volo (ToF-SIMS). Questo viene fatto attraverso la coltura di batteri sia all'esterno che all'interno del canale SALVI con la nostra installazione specializzata, nonché attraverso tecniche di imaging ottici per rilevare la presenza di biofilm e spessore prima analisi ToF-SIMS. I nostri risultati mostrano picchi caratteristici del biofilm Shewanella nel suo stato naturale idrata, evidenziando al suo ambiente cluster d'acqua localizzate, come pure di EPS frammenti, che sono drasticamente diversi di biofilm stesso disidratato stato. Questi risultati dimostrano la capacità di innovazione di SALVI che permette per l'imaging di biofilm in situ con uno strumento di imaging chimico basati su vuoto.

Introduction

Biofilm batterici sono comunità di superficie-associati che si sono evolute nel tempo come una difesa per i batteri di sopravvivere variando negativi stimoli fisici e meccanici, in cui le cellule sono in grado di allegare e sopravvivere in molti ambienti possibili. ^{1 , 2} i biofilm sono ampiamente studiati e hanno applicazioni in molti campi quali la biomedicina, ingegneria biomedica, l'agricoltura e ricerca industriale e sviluppo. ^{1 , 2} comprendere la mappatura chimica di queste comunità microbiche complesse, tra cui loro autoprodotti sostanze polimeriche extracellulari (EPS) e il loro ambiente di cluster di acqua locale, è essenziale per ottenere un'accurata e dettagliata rappresentazione della loro attività biologica. ²

Biofilm esistano e crescono all'interno di uno stato altamente idratato. Questo presenta una grande sfida nell'utilizzo di tecniche di analisi delle superfici basate su vuoto come spettrometria di massa di ioni secondari di tempo di volo (ToF-SIMS) dovuto la difficoltà nello studio liquidi volatili nel vuoto. Di conseguenza, tecniche di analisi delle superfici basate su vuoto sono stati limitati quasi esclusivamente a studiare campioni di biofilm al solo allo stato secco. Tuttavia, studiando un biofilm nel suo stato essiccato inibisce l'indagine accurata del suo microambiente biologico vero. Causa spesso drastici cambiamenti alla morfologia EPS integrità e biofilm, che è stata dimostrata dopo aver confrontato i risultati spettrali di massa secca biofilm agli studi in situ di liquido. ^{3 , 4} questo articolo presenta una soluzione per lo studio di biofilm nel loro naturale stato idratato impiegando l'uso del nostro sistema per l'analisi a liquido vuoto interfaccia (SALVI),^5,6 un reattore microfluidici che contiene liquido sotto la sua membrana di nitruro (SiN) di silicio sottile in un microchannel di polidimetilsilossano (PMD), fornendo così accesso diretto per il fascio di ioni secondari sonda pur mantenendo l'integrità strutturale della matrice liquida all'interno di un vuoto camera. ^{7 , 8}

S. oneidensis MR-1 mutato per esprimere proteine di fluorescenza verde (GFP) è stato scelto come organismo modello per questa illustrazione di procedura di biofilm grazie alla sua versatilità metabolica e di uso comune in microbiologia applicata ed ambientale, che è stato basato pesantemente sulla sua capacità uniche per la riduzione del metallo e trasferimento di elettroni extracellulare. ^{9 , 10 , 11} inoltre, la presenza di GFP ammessi per facile biofilm-spessore continuo monitoraggio mediante microscopia a fluorescenza, utilizzando un filtro di fluoresceina isotiocianato (FITC). Nostri studi precedenti hanno indicato la prova di questo batterio favorendo allegato alla finestra peccato utilizzando l'imaging di fluorescenza in operando per la crescita di biofilm ad uno spessore di fino a 100 micrometri. ^{4 , 12} mentre questa carta discuterà solo la conferma della presenza di biofilm attraverso microscopia di fluorescenza, la SALVI è compatibile con altri metodi di imaging ottici come super-resolution imaging di fluorescenza (cioè, illuminazione strutturata microscopia (SIM)⁹) e laser confocale microscopia (CLSM)⁴di imaging). Imaging ottico può servire per misurare lo spessore del biofilm e ottenere un'immagine 3D di, la forma del biofilm come appare, confermando il suo spessore ed il suo attaccamento alla finestra di peccato. ⁹ mentre GFP è stato utilizzato nell'analisi SIMS, s. oneidensis senza GFP è stato usato per la curva di crescita, come questa unica misura necessaria della densità ottica e non richiede alcuna formazione immagine fluorescente. Generalmente, la differenza tra la GFP taggati e senza tag specie nella curva di crescita è insignificante. Inoltre, mentre questo protocollo utilizza S. oneidensis MR-1 GFP come organismo modello per descrivere la procedura, questa procedura è stata progettata per qualsiasi ceppo batterico che può essere necessaria per la coltivazione all'interno di SALVI. Anche se, data la conoscenza del ceppo batterico necessario, alcune condizioni di crescita come tempo, temperatura e ossigeno ambiente potrebbero essere necessario essere modificati per accogliere il ceppo di batteri per essere utilizzato. Per mezzo di crescita, questa procedura utilizza il brodo di soia medio, Trittico "nanofili" (TSB) senza destrosio e tryptic soy agar (TSA) senza destrosio per la coltura. La composizione del mezzo "nanofili" è stato appositamente formulata per la crescita e per il monitoraggio delle estensioni della membrana e Periplasma di S. oneidensis che sembrano prendere la forma di piccoli fili e la composizione media è stata stabilito nella precedente ricerca. ^{13 , 14}

Il nostro protocollo precedente su in situ liquido ToF-SIMS ha illustrato il beneficio che SALVI ha da offrire per immobilizzazione della proteina e l'attaccamento al peccato, come pure un protocollo dettagliato sulla riduzione dei dati e analisi ToF-SIMS. ¹² piuttosto che ripetere passaggi di riduzione dei dati, questa carta servirà invece focalizzare l'approccio unico di impostazione e coltivando i biofilm all'interno nostro microchannel SALVI, come pure i passaggi imaging per rilevare la presenza di biofilm e spessore preventivo per l'analisi ToF-SIMS. Mentre biofilm sono stati precedentemente limitati solo asciugato campioni all'interno della camera di vuoto-base superficie tecniche analitiche, EPS e biofilm chimica mappatura dettagliata di biofilm live possa ora essere ottenuto in situ a causa di questa nuova funzionalità.

Protocol

1. preparazione dei materiali

1. Preparazione di Medium tubi
   1. bottiglie di siero (uno per ogni cultura di biofilm e tre per ogni curva di crescita)
      Nota: come accennato nell'introduzione, qualsiasi crescita mezzo adatto a fornire i nutrienti necessari per il ceppo di batteri di interesse può essere utilizzato per questa procedura; in questo caso, " nanofili " media e TSB senza supporto di destrosio è stato utilizzato per la crescita di S. oneidensis MR-1 GFP. ¹³
      1. deposito 20 mL di terreno di coltura in una bottiglia di siero di 70 mL, tappo il tappo e la bottiglia a crimpare. Coprire la parte superiore con un pezzo di carta stagnola pulita sterile.
      2. Autoclave la bottiglia con un ciclo liquido per 30 min a 121 ° C. poi, conservare il flacone di siero sterile a temperatura ambiente.
   2. Provette di coltura anaerobica
      1. depositare 5 mL di terreno di coltura in una provetta di coltura anaerobica con spazio di testa aria, mettere sul tappo e bottiglia a crimpare. Coprire la parte superiore con un foglio sterile.
2. Preparando Bubble Trap tubi
   1. con attenzione usando un ago da 22 gauge, fare un buco attraverso un tappo di gomma del flacone di siero.
   2. Tagliare 20 a 1/32 " politetrafluoroetilene (PTFE) della tubazione con un rasoio tali che una delle estremità del segmento di tubazione è aguzza.
   3. Utilizzando l'estremità appuntita, infilare il tubo di PTFE attraverso il foro nella parte superiore del tappo di gomma. Spingere il tubo fino a circa 2 cm è attraverso il tappo e tagliare l'estremità appuntita di tubo flessibile in PTFE con un rasoio per avere un piatto fine.
   4. Togliere lo stantuffo di una siringa da 5 mL e montare il tappo di gomma dal punto 1.2.3 nell'estremità aperta della siringa. L'estremità di 2 cm del tubo di PTFE è all'interno della canna della siringa. Questo è il gorgogliatore.
   5. Avvolgere il gorgogliatore (il PTFE tubo, tappo di gomma e siringa) effettuata nel passaggio 1.2.4 con foglio di alluminio e fissare con nastro autoclave. Autoclave per sterilizzare il tubo con una gravità del pacchetto della stagnola del ciclo a 121 ° C per 30 min. memorizzare il pacchetto di alluminio sigillata a temperatura ambiente fino a che pronto per l'uso nel passaggio 2.4.
3. Curva di crescita batterica
   Nota: questo protocollo utilizza S. oneidensis MR-1 GFP come organismo modello per la crescita di biofilm in SALVI. Tuttavia, questa procedura può essere adattata per ospitare altri batteri che crescono aerobicamente o anaerobicamente. A seconda di quale ceppo viene utilizzato, tempo di crescita e ambiente potrebbe essere necessario essere regolata.
   Nota: scorte batteriche congelatore-80 ° C ha consistito di una miscela 1:1 di TSB senza destrosio e glicerolo. Nell'esempio di curva di crescita mostrata nella Figura 1 B è stato preparato utilizzando una coltura starter di TSB con nessun destrosio, trasferito in quantità rispettive 0,2 mL tre volte per bottiglie da 70 mL siero con 20 mL " nanofili " mezzo per rimuovere tracce di TSB. Tuttavia, questo protocollo presuppone che verrà utilizzato solo un terreno di coltura, e che i trasferimenti successivi non potranno essere condotto, come questo è stato fatto con queste particolari soluzioni medie per S. oneidensis. Anche se non descritto in questo protocollo, trasferimenti extra come questo sono raccomandati come inizialmente depositando i batteri per il ricco TSB aiuta le cellule congelate recuperare; e tre trasferimenti successivi a " nanofili " assicura che tutti i TSB è andato e che tasso di crescita tipici che si verifica.
   1. Inoculando la coltura Starter
      1. rimuovere lo stock di glicerolo batterica dal congelatore-80 ° C e scaldare il brodo con una mano guantata scongelare più rapidamente possibile. Spostare questo stock di freezer per la cappa di sicurezza biologica (BSC).
      2. All'interno il BSC, utilizzare una siringa da 1 mL con ago 22G collegato per trasferire 0,1 mL di Stock in freezer in una provetta di coltura anaerobica innevate e aggraffato contenente 5 mL di medium di crescita con nessun destrosio, preparata al punto 1.1.2. Smaltire il rimanente brodo di freezer nel contenitore dei rifiuti biologico appropriato, come congelamento nuovamente potrebbe scioccare le cellule.
      3. Incubare la coltura starter in un incubatore/agitatore a 30 ° C a 150 rotazioni al minuto (rpm) e assicuratevi di prendere la densità ottica a 600 nm (OD ₆₀₀) lettura quando si è pronti per l'uso. Registrare il tempo di crescita e OD ₆₀₀ tale che può essere fatto a quel tempo stesso per ogni uso successivo, tale che i risultati sono riproducibili. Ad esempio, questa coltura starter era permesso di crescere per 15 h e utilizzata un OD ₆₀₀ di circa 1.0.
   2. Inoculando crescita medio
      1. prendere le bottiglie di tre siero preparate al punto 1.1.1.2 e la coltura starter preparato in 1.3.1.3 e portare entrambi a BSC.
      2. All'interno il BSC, usando una siringa sterile da 1 mL con un ago 22G, 0,1 mL di soluzione di trasferimento dalla coltura starter a ciascuna delle bottiglie del siero, rispettivamente.
      3. Sterilizzare la parte superiore delle bottiglie del siero con 70% di etanolo e coprire con un foglio di alluminio sterilizzato, etichettare correttamente e trasferimento a Agitatore orbitale all'interno di un'incubatrice. Impostare l'agitatore orbitale a 150 rpm e impostare l'incubatrice a 30 ° C. Incubare fino a che punto i primi dati di ₆₀₀ OD è adottata, entro passo 1.3.3.
   3. OD ottenere ₆₀₀ punti dati
      1. preparare uno spazio vuoto che depositano 100 µ l di filtro-sterilizzato distillata deionizzata (DI) l'acqua in una provetta sterile. Avvolgere pellicola plastica paraffina intorno alla parte superiore della provetta in modo che l'acqua non vengano contaminato. Conservare a temperatura ambiente. Uso questo vuoto con lo spettrofotometro UV/Vis prima di prendere qualsiasi punti di dati per la curva di crescita inserendo la cuvetta e premendo " vuoto ".
         Nota: Ogni 48 h un nuovo vuoto dovrebbe essere preparato per evitare lettura errata, come regolarmente sostituendo uno spazio vuoto è buona pratica.
      2. Per ogni punto di dati OD ₆₀₀, rimuovere le bottiglie di siero preparate nel passaggio 1.3.2.3 dall'incubatore e trasferimento a un BSC sterilizzato. Prendere 0,1 mL di inoculato da ogni flacone di siero e deposito in tre etichettato separatamente le provette sterili.
      3. Dopo la tranciatura, inserire la provetta contenente la cultura in spettrofotometro ultravioletto visibile (UV/Vis) e leggere il OD ₆₀₀ uno alla volta e registrare tutte le tre letture per quel punto di tempo.
         Nota: Per S. oneidensis MR-1, i punti dati sono stati presi a 1, 14, 28, 32, 41, 57, 81 e 105 h dopo l'inoculazione. La crescita è completa quando i batteri è stata completata la fase di morte. Questi punti dovrebbero essere adeguati di conseguenza se c'è mancanza di conoscenza sulla crescita particolare tempo e tendenza dei batteri utilizzati nel presente protocollo. Se vi è incertezza circa la tendenza di crescita, dati punti dovrebbero essere raccolti più frequentemente, per esempio, ogni tre ore per le prime 12 h, ogni 6 h per successive 36 h, a intervalli di 12 h per il seguente h 100 e a intervalli di 24 h per il finale h. 124
      4. Usare il OD ₆₀₀ punti dati come l'asse y e il tempo come l'asse x, grafico di una curva della media dei tre punti presi con barre di errore quadratico medio per ogni punto di tempo utilizzando un software di grafico. La curva di crescita di S. oneidensis MR-1 viene visualizzata in Figura 1 nella sezione risultati rappresentativi, B.
      5. Utilizzando il grafico preparato nel passaggio 1.3.3.4, identificare l'intervallo di tempo della sezione Registro-fase della curva di crescita. Per Shewanella, questo è tra 12 e 33 h di crescita; Pertanto si può dedurre che alla 24 h di crescita, Shewanella sarà all'interno del suo registro-fase di crescita, assumendo che i batteri saranno coltivati utilizzando la stessa media e trattamento prima dell'uso che è stato utilizzato per la curva di crescita.

2. Coltura di batteri

1. primo giorno: inoculare la piastra di Agar
   Nota: questa sezione della procedura è stata utilizzata con un pla di agarosiote di prendere una sola unità formanti colonie (CFU) in fase di log, invece la cultura starter liquido utilizzata per la curva di crescita. Questo potrebbe essere presupposto per riprodurre le stesse condizioni di crescita, dovuto al fatto che TSA senza destrosio è stato utilizzato e successivamente trasferito a " nanofili " medium nella procedura della curva di crescita e TSA ha gli stessi ingredienti che la compongono TSB.
   1. Togliere Stock in S. oneidensis MR-1 GFPbacteria dal congelatore a-80 ° C e posto in un secchio di ghiaccio, mettere questo secchio dentro sterilizzato BSC.
   2. All'interno il BSC, utilizzare un ciclo di inoculazione sterile 1 µ l per raschiare la superficie dello stock congelati batteri e viene utilizzato il ciclo di T-striscia la superficie di una piastra di agarosio.
   3. Dopo la sigillatura ai lati della piastra con la pellicola di plastica paraffina, capovolgere la piastra e memorizzare in un'incubatrice di 30 ° C per 24 h, fino a quando appaiono diverse colonie.
2. Day Two: inoculare il flacone di siero
   1. rimuovere la piastra dall'incubatrice e aperti all'interno di BSC.
   2. All'interno il BSC, pulire la superficie del tappo di gomma su una bottiglia di siero preparato dal punto 1.1.1 con etanolo al 70% in acqua deionizzata.
   3. Selezionare un singolo CFU dalla piastra di agar e, utilizzando una siringa sterile con un allegato 22 ago del manometro, depositare abbastanza mezzi di crescita per sloggiare la Colonia dalla piastra senza toccare alcun colonie vicine e mescolare la Colonia con il mezzo con la punta del l'ago.
      Nota: Un singolarmente Colonia dovrebbe essere selezionata che è abbastanza lontano da altri batteri sulla piastra, tale che medie possono essere depositate su di esso senza toccare le altre colonie.
   4. Utilizzando la stessa siringa, estrarre il liquido dalla superficie della placca.
   5. Dopo aver toccato fuori le bolle all'interno della siringa, iniettare il liquido nella bottiglia del siero e posto su un agitatore orbitale all'interno di 30 ° C a 150 rpm per 24 h.
      Nota: Toccando le bolle fuori la siringa è importante al fine di evitare di introdurre più ossigeno alla bottiglia del siero, come introducendo più ossigeno alla bottiglia può modificare le condizioni sperimentali e ridurre la coerenza tra i tempi di crescita per i batteri.
3. Day Two: sterilizzazione del Microchannel SALVI
   Nota: per promuovere la sterilità del sistema di tubazione, passaggi che richiedono staccare la siringa dalla tubazione e la sostituzione con una nuova siringa dovrebbero essere fatto entro il BSC. Per effettuare questa operazione, semplicemente staccare la siringa dalla pompa siringa svitando il titolare metallo siringa e portare la siringa con tubo collegato a un BSC sterile. Quando il sistema della tubazione è menzionato nelle procedure, si riferisce alla siringa contenente il serbatoio, collegato con un iniettore di polyetheretherketon (PEEK) per il tubo di PTFE, collegato alla camera di gocciolamento, che ha un iniettore PEEK raccordo collegato il Ingresso SALVI tubazione, così come il contenitore di uscita che il tubo di uscita SALVI è sigillato per.
   1. Utilizza un nuovo dispositivo SALVI e allegare un raccordo PEEK e iniettore a un'estremità di un tubo di PTFE.
      Nota: I dispositivi SALVI sono preparati freschi per ogni esperimento segue la fabbricazione di dispositivi dettagliata in precedenti ricerche e brevetti. ^{5 , 6 , 8 , 15}
   2. prendere 2 mL di etanolo al 70% in una siringa e collegare al raccordo di PEEK sulla SALVI. Dopo la siringa come collegare una pompa a siringa e collegare la presa della SALVI per una bottiglia di scarico, lasciare che la soluzione di etanolo DI acqua a correre attraverso la SALVI a 20 µ l/min per 1,5 h.
   3. Prendere 4 mL di sterilizzato DI acqua in una siringa e collegare all'ingresso della SALVI stesso. Dopo aver collegato la siringa una pompa a siringa, permettere all'acqua di correre attraverso la SALVI a 20 μL/min per almeno 3 h.
   4. All'interno di un BSC, aprire il pacchetto di lamina preparato al punto 1.2.5 e collegare un raccordo all'estremità della siringa da 5 mL e sterile PEEK raccordi all'estremità della tubazione TFE sterile per iniezione PEEK. Prendere ~ 3 mL di terreno sterile in una siringa e collegare al tubo TFE. Invertire la camera di gocciolamento 5 mL e, utilizzando una siringa sterile, iniettare il mezzo di crescita nella camera di gocciolamento, fino a raggiungere un volume totale di 1 mL.
   5. Collegare l'estremità della camera di gocciolamento siringa 5ml all'ingresso della SALVI.
   6. Prendere 10 mL di terreno di coltura in una siringa sterile e collegare all'ingresso del tubo di gocciolamento. Dopo aver collegato la siringa una pompa a siringa, lasci che il media attraversano la SALVI a 20 µ l/min per 12 h (o notte). Utilizzare nastro adesivo per proteggere queste parti. Coprire la bottiglia presa con fogli o lamine di plastica paraffina per ridurre al minimo la probabilità di particelle di polvere e organismi ivi contenuti per contaminare il mezzo. Una raffigurazione dettagliata di come dovrebbe apparire il programma di installazione può essere trovata in Figura 1 A.
      1. Consentire il tubo di gocciolamento di essere verticale, che significa che la pompa a siringa deve essere inserita su una superficie sopraelevata con tubi a goccia protetta con nastro adesivo e con la SALVI fissato su una superficie piana sottostante.
      2. Eseguire medio attraverso la SALVI per 12 h per garantire che siano state rimosse tutte le tracce di etanolo dalla tubazione della SALVI prima dell'inoculo con batteri e microchannel.
      3. Per una maggiore protezione, tenere la camera di microchannel SALVI all'interno di una capsula Petri sterilizzati, con i lati tagliati per adattarsi l'ingresso e il tubo di uscita. Inoltre, tieni il nastro sempre sulla finestra per proteggere la membrana di peccato e canale prima dell'analisi di imaging.
4. Giorno tre: inoculazione del Microchannel SALVI
   1. rimuovere il sistema intero della tubazione (siringa collegata a gocciolare camera collegata a SALVI collegato alla bottiglia dei rifiuti) da pompa a siringa e portarlo a un BSC sterilizzato. Inoltre, rimuovere il flacone di siero dal punto 2.2.5 dall'incubatrice e portarlo al BSC.
   2. Pulire la superficie del tappo di bottiglia del siero con etanolo al 70% per evitare qualsiasi contaminazione e quindi utilizzare una siringa sterile con un ago 22G sterile per estrarre 4 mL di batteri dalla bottiglia.
   3. Scollegare la SALVI dal vano di 5ml della tubazione del gocciolamento e collegare la siringa con inoculato direttamente all'ingresso della SALVI. Lasciare il tubo di gocciolamento all'interno di un pacchetto di lamina di alluminio sterile o BSC.
   4. Collegare la siringa con la bottiglia di SALVI e presa per la pompa a siringa per eseguire a 20 µ l/min per 3 h inoculare il canale di SALVI, al fine di consentire più variazioni di volume del liquido contenuto all'interno di SALVI.
   5. Dopo l'inoculazione, scollegare la siringa con SALVI dalla pompa a siringa e portare al BSC. Dopo aver montato l'ingresso della SALVI torna alla camera di gocciolamento 5 mL dal punto 2.4.3, prendere 20 mL di terreno di coltura in una siringa sterile e collegare all'ingresso del tubo di gocciolamento.
   6. Portare il tubo collegato alla SALVI dal BSC per la pompa a siringa e lasci che il media di passare attraverso il tubo ad un tasso di 2 µ l/min per sei a dieci giorni, o fino a formazione immagine di fluorescenza (discussa nel passaggio 3) Mostra la crescita di biofilm visibile favorevole per Analisi ToF-SIMS. Riempire mezzo fresco come si esaurisce entro il BSC riempiendo una siringa sterile nuova con 10mL di terreno di coltura e collegando alla SALVI dopo che il mezzo di crescita precedente è esaurita.
      Nota: Dopo aver iniziato l'inoculazione a 2 µ l/min, la portata non dovrebbe mai essere aumentata o diminuito, come variare la velocità di flusso sarebbe creare sollecitazione di taglio all'interno del canale e staccare il biofilm. È fondamentale che questa portata non deve essere mai modificata; per preparare questo, ~ 24 h prima di SIMS, osservare il tubo molto attentamente per assicurarsi che non ci sono nessun bolle così che c'è bisogno di spingere il mezzo più ad un tasso più veloce in tutto il tubo.
      1. Evitare bolle in microchannel, come si può spingere il biofilm fuori del canale. È importante essere cauti di bolle all'interno del fondo del tubo di gocciolamento 5 mL dove si collega al tubo di SALVI. Medium fresco può essere iniettato nell'estremità dell'iniettore PEEK per garantire che nessun aria sarà costretti nella SALVI.

3. Optical Imaging del Biofilm all'interno il Microchannel SALVI

1. Imaging microscopia di fluorescenza
   Nota: Shewanella utilizzato come organismo modello all'interno di questo protocollo è mutato per esprimere GFP; come tale, non richiede la macchiatura. Se i batteri richiedono la macchiatura, questo dovrebbe essere fatto sempre alla stessa portata (ad es., 2 µ l/min) per evitare il distacco del biofilm. Inoltre, quando le cellule vanno senza disponibilità di nutrienti, essi si staccherà. Pertanto, se qualsiasi colorazione aggiuntiva è necessaria, la macchia deve essere iniettata il mezzo di crescita, piuttosto che acqua prima fornitura per macchiare le cellule.
   1. Staccare la SALVI dal gocciolamento della tubazione all'interno del BSC e chiudere la SALVI avvitando i raccordi di PEEK per serrare l'Unione PEEK.
   2. Nastro il tubo della camera microchannel SALVI in modo sicuro su una lastra di vetro, di modo che la finestra sia completamente piatto e rivolta verso l'alto. Rimuovere il nastro protettivo dalla finestra. Morsetto della diapositiva sul palco del microscopio ponendo il vetrino tra i morsetti di fase sulla piattaforma.
   3. Abbassare la fase del microscopio tale che la parte superiore della SALVI è posizionata abbastanza vicino alla fine dell'obiettivo 10x, dove la regolazione della messa a fuoco non causerà l'obiettivo di toccare la finestra.
   4. Interruttore sulla retroilluminazione e trovare il canale utilizzando l'obiettivo del microscopio 10X regolando la messa a fuoco. In questo momento, assicurarsi che la presenza di attacco batterico alla finestra peccato della SALVI è evidente rispetto alla finestra di un canale di controllo con nessun batteri inoculato. Più vicino imaging delle cellule, per passare all'obiettivo 20x. Rispetto ad un canale vuoto SALVI, la presenza di batteri collegato alla finestra dovrebbe avere una forte fluorescenza verde.
   5. Disattivare la retroilluminazione e accendere la fonte di mercurio di microscopio. Attendere 2-3 min e passare al filtro FITC impostata sul microscopio vista e catturare le immagini del biofilm collegato alla finestra. Come un esempio di come apparirà il biofilm maturato come quando si è pronti, fare riferimento alla Figura 1 C.
   6. Turn off la fonte di mercurio e staccare la SALVI dal vetrino. Se necessario, collegare a 2 µ l/min flusso medio ancora una volta per consentire una crescita più prima dell'imaging di nuovo, o trasferire la SALVI a uso di contenimento secondario per analisi ToF-SIMS. Ciò è necessario se lo spessore del biofilm è concluso di non essere abbastanza spessa, e prima analisi ToF-SIMS è necessario più tempo per la crescita. Per allegare al flusso medio, ancora una volta, fare riferimento al punto 2.3.6.
      Nota: Se rimesso sotto flusso medio, l'imaging di fluorescenza dovrebbe essere fatto prima analisi ToF-SIMS.
      1. Dare il biofilm crescita medio per la sua alimentazione fino a quando possono essere condotte analisi ToF-SIMS. Mentre non consigliato, se necessario, la SALVI chiuso possono essere memorizzati all'interno di 4 ° C durante la notte, ma dovrebbe essere lasciata scaldare a temperatura ambiente prima di inserire la camera del vuoto del ToF-SIMS. Tuttavia, analizzare il biofilm immediatamente dopo staccati dal flusso medio per ridurre il distacco di biofilm.

4. Acquisizione dati ToF-SIMS

Nota: questa sezione serve come una panoramica ed è discusso più dettagliatamente all'interno del nostro precedente protocollo che descrive le analisi di proteine adsorbite molecola liquida SIMS. ¹²

1. Installare SALVI nella camera di Loadlock ToF-SIMS
   Nota: guanti devono essere indossati tutti i tempi quando il manipolatore di SALVI e installarla sul ToF-SIMS tappa per evitare potenziali contaminazioni durante la superficie analisi.
   1. Monte SALVI sul palco e fissarla con le viti diverse. Assicurarsi che la finestra di peccato è flat di regolazione vite strettezza e inserimento di wafer di silicio pezzi nella parte inferiore della camera di microchannel PDMS. Rimuovere il nastro protettivo dalla finestra, quindi caricare la fase camerare ToF-SIMS loadlock.
   2. Aprire il loadlock ToF-SIMS, tenere e impostare la fase orizzontalmente sul pianale e chiudere la porta di loadlock. Avviare la pompa del vuoto e aspettare per assicurarsi raggiunto quel vuoto adatto.
   3. Spostare la SALVI nella camera principale, una volta che il vuoto si stabilizza a 1 x 10 ^-7 mbar.
2. Profondità di analisi e raccolta dati punti
   1. trovare il canale di microfluidica con il microscopio ottico attrezzato nella ToF-SIMS.
   2. Selezionare modalità positiva o negativa prima di acquisizione dati. Uso il 25 keV Bi ₃ ⁺ del fascio come il fascio di ioni primari in tutte le misure e utilizzare la pistola di elettrone inondazione per neutralizzare la carica durante tutte le misure di superficie.
   Larghezza di
   3. scansione il fascio di ₃ ⁺ Bi con impulso di ns 150 su una zona rotonda con un diametro di ~ 2 µm con 64 pixel per 64 pixel di risoluzione. Dopo la perforazione attraverso la finestra di peccato 100 nm, continuare a eseguire la scansione per altri 150 s per raccogliere i dati ad alta intensità per l'imaging. Dopo la foratura passante, i conteggi aumenterà in modo significativo all'interno della regione di profilatura di profondità. Dopo l'assestamento, questo può essere indicato come la regione ad alta intensità.
   4. Ridurre la larghezza di impulso a 50 ns per la raccolta di dati di acquisire spettri con migliore risoluzione di massa. Continuare questa acquisizione per circa un altro 200 s.
   5. Ripetere questi passaggi per la raccolta positiva almeno tre e tre punti di dati negativi.
      Nota: Assicurarsi di spazio le zone di foratura passante, tale che non si romperà la finestra di peccato e perdita nella camera del vuoto da compromessa l'integrità finestra.

5. Analisi dei dati ToF-SIMS

1. massa calibrazione utilizzando il IonToF Software
   1. aprire il software di analisi di ToF-SIMS (misurazione Explorer) e quindi fare clic sul " profili ", " spettri " e " immagine " pulsanti, rispettivamente al processo profondità profilo, spettro di m/z e dati di immagine.
   2. Apri i file di dati ottenuti nel corso di acquisizione dati ToF-SIMS.
   3. Selezionare la profondità di analisi dei dati di interesse e ricostruire gli spettri secondo la serie temporale di profondità profilo.
   4. Press " F3 " per aprire la " massa calibrazione " finestra. Scegliere picchi per calibrazione basato su composti chimici che dovrebbero esistere nell'esempio specifico.
2. Picchi di interesse selezione
   1. come picco selezione è necessaria per le analisi, determinare picchi caratteristici del campione secondo letteratura o altri risultati precedenti, se presente. Confrontare l'intensità dei picchi di interesse negli spettri m/z. Se necessario, aggiungere nuove vette o Elimina i picchi di interferenza nell'elenco picco.
   2. Clicca su un picco, trovare le linee rosse nella finestra in basso a sinistra. Spostare le linee rosse per racchiudere il picco tutto.
   3. Selezionare un picco in corrispondenza la formula chimica nella finestra principale dello spettro e poi cliccare il " aggiungere picco " pulsante sopra la finestra. < /li >
3. Esportare dati calibrato di massa
   1. per esportare un elenco di picco, nella " picco elenco " menu, selezionare " salvare … " l'elenco di picco nella " itmil " formato.
   2. Per esportare un profilo di profondità, nella " profilo " finestra, fare clic sul " File " dal menu, quindi selezionare " Export " e quindi selezionare " salvare come " un ". txt " file.
   3. Per esportare un file di spettro m/z, nella " Spectra " finestra, fare clic sul " File " dal menu, quindi selezionare " Export " e quindi selezionare " salvare come " un ". txt " file.
   4. Per esportare un file di immagine, nella " immagine " finestra, stampa schermo e salvare come file immagine.

6. ToF-SIMS dati stampa e presentazione

1. utilizzare uno strumento grafico per importare i dati.
2. Fare una trama usando il m/z come l'asse x e picco intensità come l'asse y per mostrare lo spettro ricostruito. Un esempio è dato in Figura 2 A.
3. Combine ricostruite immagini bidimensionali (2D) di differenti m/z e forma una matrice per visualizzare la mappatura un ione positivo o negativo. Un esempio è dato in Figura 2 B.

Representative Results

Questi risultati rappresentativi servono a mostrare come il profilo chimico del biofilm allegato può essere identificato e interpretato, come ottenuta attraverso ToF-SIMS. Dopo aver tracciato spettri di massa da acquisizione dati ToF-SIMS, brevemente evidenziato nella sezione procedure, identificazione del picco dovrebbe essere condotta al fine di assegnare le identità di ogni valore rispettivo m/z. Questo può essere fatto attraverso la revisione di una vasta letteratura sulla spettrometria di massa su batteri e frammenti chimici specifici che dovrebbero essere presenti all'interno i batteri studiati, come vari mazzi dell'acqua, acidi grassi e frammenti della proteina. ^{16 , 17 , 18 , 19 , 20} questi risultati rappresentativi di mostrare solo gli spettri di massa negativi come ottengono il biofilm di S. oneidensis MR-1 e un campione di acqua DI. Interpretazione degli spettri positivi seguire una procedura simile.

Figura 1 A Mostra la configurazione schematica secondo questo protocollo quando coltivando un biofilm nel microchannel SALVI. In alto a sinistra, la siringa è attaccata ad una pompa siringa, che mantiene medie che scorre a una velocità costante in tutto il sistema di tubi di PTFE e all'interno il microchannel. Pompa a siringa viene posizionata sopra la camera di gocciolamento, che impedisce all'indietro contaminazione al serbatoio medio per prevenire motili organismi da nuoto a Monte. Il mezzo fluisce dal serbatoio di camera di gocciolamento direttamente nel tubo PTFE di SALVI, che passa attraverso il microchannel e attraverso il tubo di uscita di una bottiglia sigillata presa. Le linee tratteggiate scegliere dalla finestra peccato un'immagine di una maturata S. oneidensis cellule GFP MR-1 catturate da microscopia di fluorescenza, dettagliata al punto 3.1. Figura 1 B viene illustrato un esempio di una curva di crescita fissato utilizzando l'organismo modello per questo protocollo, S. oneidensis MR-1. Dalle fasi di crescita in questo grafico, si può concludere che il log-in fase di crescita si verifica tra 15-32 h in queste condizioni colturali specifici. Ulteriori informazioni da questo grafico mostrano che 0-15 h è la fase di ritardo di crescita, e 33-105 h rappresenta la fase stazionaria di crescita. Figura 1 C è un'immagine acquisita con microscopia di fluorescenza che mostra un esempio di un biofilm stagionato.

Figura 2 A Mostra gli spettri di massa negativi di un idrato S. oneidensis MR-1 biofilm all'interno del canale di microfluidica, come ottenuti da in situ liquido ToF-SIMS. Questo grafico mostra un esempio di confronto intervallo selezionato di massa (m/z 100-350) tra il biofilm di S.oneidensis MR-1 e DI acqua, quest'ultima è stata ottenuta come un controllo di sistema. Figura 2 B Visualizza un confronto di immagini 2D dei picchi di interesse nel biofilm MR-1 e DI acqua ottenuta da ToF-SIMS. Una volta interessanti valori m/z può essere identificato da studiare gli spettri di massa, identificazione del picco potenziale di valori m/z sono attribuite correttamente ai frammenti chimici, come sostenuto dall'indagine IonToF SIMS software biblioteca e letteratura. Picchi di interesse in Figura 2A includono mazzi dell'acqua (cioè, m/z 107 (H₂O)₅OH^–, 125 (H₂O)₆OH^–, 143 (H₂O)₇OH^-, 161 (H₂ O) OH₈^–, 179 (H₂O)₉OH^–, 197 (H₂O)₁₀OH^–, 215 (H₂O)₁₁OH^–, 233 (H₂O)₁₂OH^-, 251 (H₂O) ₁₃ OH^–, 269 (H₂O)₁₄OH^–, 287 (H₂O)₁₅OH^–, 323 (H₂O)₁₇OH^-, 341 (H₂O)₁₉OH^–))⁹, come indicati da linee rosse sopra rispettivi picchi, quorum sensing hanno collegato i biomarcatori di composti (cioè, m/z 175 C₁₀H₉n.₂^–), sottoprodotti EPS (m/z 123 C₂H₄PO₄^-, 159 P ₂ O₈H^–, 216 Cr₂O₇^–, 285 octadecanoethiols, 325 composti polari, C₁₂ polare composti)^15,16,18e la catena dell'acido grasso frammenti (cioè m/z 127 [C₂H₃(CH₂)₃COO]^-, C16: 0 255 degli acidi grassi, acido linoleico 279, C₁₈H₃₁O₂^–, 325 C₂₁H₄₀O₂ ^-, lipidi, 18-MEA associato tramite sollevatore tioesteri, acido stearico C₁₈H₃₅O₂^–, ioni di monoacylglyceryls di acido palmitico C₁₉H₁₇Oh₆ di superficie di 341 ^-). ^{16 , 19}

Poiché i biofilm è idratato, non è sorprendente che alcune vette visualizzati nell'esempio biofilm sono simili a quelli trovati in acqua deionizzata. Questi picchi di cluster di acqua sono contrassegnati con una linea rossa sopra ogni picco nella Figura 2A, inclusi i m/z 107, 125, 143, 161, 179, 197, 215, 233, 251, 269, 287, 323 e 341 e corrispondente a (H₂O)₅OH^– (H₂O) ₆ OH^– (H₂O)₇OH^– (H₂O)₈OH^– (H₂O)₉OH^– (H₂O)₁₀OH^– (H₂ O)₁₁OH^– (H₂O)₁₂OH^– (H₂O)₁₃OH^– (H₂O)₁₄OH^– (H₂O)₁₅OH^- (H₂O)₁₇OH^– (H₂O)₁₉OH^-, rispettivamente. ⁹ come c'è prevalenza di molti mazzi di caratteristica dell'acqua in questo spettro di massa, questo risultati fornisce una forte evidenza dell'ambiente cluster chimico dell'acqua presente in un biofilm idratato. Inoltre, acqua non cluster relativi picchi osservati in due spettri possono essere attribuiti comunemente come picchi di interferenza, in genere da PDMS, un componente del canale microfluidico. Ad esempio, un picco di interferenza noti comuni da PDMS è il m/z 137 in modalità ioni negativi.

Quando confrontando il biofilm SIMS di massa spettri a quella dell'acqua DI, come mostrato in Figura 2A, non sono presenti nell'acqua DI alcuni picchi, eppure appaiono nel biofilm. Ad esempio, il picco a m/z 255 ([CH₃(CH₂)₁₄COO]^-, acido palmitico) è presente ad alta intensità nel biofilm campione, ma non è affatto nel campione DI acqua. Ciò suggerirebbe che la c di segnaliome da biofilm, molto probabilmente il biofilm e/o suoi EPS auto-generata. Molte vette interessanti sono stati identificati nella Figura 2A. Ad esempio, EPS relativi picchi includono m/z 123^-, risultata C₂H₄PO₄^-, 159 (P₂O₈H^–), 216 (Cr₂O7^–), 285 (octadecanoethiols) e 325 (composti polari, C ₁₂ composti polari). ^{17 , 18 , 20} picchi associati con gli acidi grassi sono stati trovati per essere 127 ([C₂H₃(CH₂)₃COO]^–), 255 ([CH₃(CH₂)₁₄COO]^-, acido palmitico), 279 ([CH₃ (CH₂)₁₅COO]^-, acido linoleico), 317 (C₂₁H₃₃O₂^–), 325 (C₂₁H₄₀O₂^–) e 341 (lipidi di superficie, 18-MEA associati tramite tioesteri sollevatore, acido stearico C₁₈H₃₅O₂^-, ioni di monoacylglyceryls di acido palmitico C₁₉H₁₇Oh₆^–). ^{16 , 19} infine, un chinolonico rilevamento segnale quorum relativo picco di C₁₀H₉n.₂^– è stata osservata a m/z 175.

Figura 2 B consente di visualizzare immagini 2D della distribuzione di quattro diversi ioni interessanti tra il biofilm di s. oneidensis MR-1 (riga superiore) e DI acqua (riga inferiore). Il valore di m/z 107 ((H₂O)₅OH^–) Mostra un ammasso di acqua di significativa intensità all'interno i campioni, il valore di m/z 175 (C₁₀H₉n.₂^–) raffigura un quorum sensing relative al segnale, m/z 255 è un acido grasso ([CH₃(CH₂)₁₄COO]^-, acido palmitico), e m/z 341 (C₂₁H₄₁O₂^–) possono rappresentare entrambi i frammenti del lipido e mazzi a causa l'accuratezza di massa 1 amu dell'acqua. ⁹ regioni più luminose delle immagini 2D indicano un conteggio superiore dello ione molecolare presente nell'immagine. Come previsto, i segnali per il QS composto e lipidi erano molto maggiori in quantità all'interno del campione di biofilm. Mentre il segnale per il cluster di acqua (m/z 107) era più forte in tutto il campione di biofilm, era anche presente nel campione DI acqua, come previsto. Infine, il segnale a 341 m/z è stato trovato per essere omogenea all'interno del campione di biofilm, ma molto debolmente all'interno del campione di acqua DI. Mentre m/z 341 era un picco di cluster dell'acqua, era anche rappresentanza di parecchi diversi acidi grassi e lipidi di superficie. ¹⁶ cluster di presenza più forte all'interno del campione di biofilm dopo normalizzazione dei dati suggerisce che la presenza di frammenti di lipidi supera di gran lunga la presenza di acqua.

Figura 1 : Schema sperimentale. (A) consente di visualizzare lo schema sperimentale del biofilm setup come esso appare all'interno del laboratorio. A partire da in alto a sinistra, medie portate dalla siringa (1), che è collegato alla pompa a siringa (2), controllando il tasso al quale liquidi si muove attraverso. Le frecce indicano la direzione del flusso in tutto il sistema. La siringa (1) è collegata tramite un iniettore PEEK raccordo (3) alla tubazione di TFE (4). Medio scorre attraverso una camera di gocciolamento (5) per evitare la contaminazione e alla fine si muove attraverso la SALVI (6) al contenitore sigillato outlet (7). Pompa a siringa è posizionata su una superficie sopraelevata (9) tale che la camera di gocciolamento (5) può essere perpendicolare alla superficie del piatta (8) che la SALVI (6) è posto su. (B) crescita curva per Shewanella oneidensis MR-1 in mezzo "nanofili". Tempo 0-15 h rappresenta la fase di ritardo, tempo 15-33 h rappresenta la fase di log, tempo 33-105 h rappresenta la fase stazionaria e ora 105 h o rappresenta più fase di morte. Barre di errore rappresentano la deviazione standard. (C), A immagine di un biofilm stagionato acquisito con microscopia di fluorescenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : I confronti di ToF-SIMS negativo spettri dell'idrata Shewanella oneidensis biofilm e MR-1 medie il microchannel SALVI. Spettri di massa (A), il m/z SIMS del biofilm Shewanella oneidensis MR-1 medio e DI acqua. Quest'ultimo è stato utilizzato come controllo. Linee rosse indicano le posizioni dei picchi di cluster acqua caratteristica. (B) confronto delle immagini 2D dei picchi di interesse tra il biofilm e DI acqua. Da sinistra a destra, immagini visualizzare un cluster di acqua (m/z 107 (H₂O)₅OH^–), un segnale di quorum sensing/ormone (m/z 175, C₁₀H₉n.₂^–), un acido grasso (m/z 255, [CH₃(CH ₂)₁₄COO]^-, acido palmitico) e frammenti di lipidi/EPS (m/z 341, 18-MEA, C₂₁H₄₁O₂^–) di superficie. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Dopo inoculando in ritardo-fase, è importante verificare il numero di giorni e la temperatura alla quale il biofilm dovrebbe crescere prima che sia sano e abbastanza spessa per imaging, come descritto al punto 3.1. Questa procedura riguarda in particolare la coltura di un S. oneidensis MR1 biofilm a temperatura ambiente; Tuttavia diverse temperature ambiente possono influenzare il tasso di crescita. Pertanto, è fondamentale utilizzare imaging ottico per capire se il biofilm è pronto prima di procedere all'analisi ToF-SIMS. Allo stesso modo, diversi ceppi di batteri richiedono diverse condizioni di crescita e lunghezza per ottenere uno spessore desiderabile per l'analisi. Mentre la curva di crescita in figura 1b raffigura fase log 200 dei batteri per essere h 12-32, e questo è stato usato a 24 h durante tutta la procedura, è importante notare che questa volta non può essere utilizzata come registro-fase per altri ceppi di batteri senza stabilire la curva di crescita in modo indipendente. Mentre la fase di log era tra 12 e 33 h di crescita per S. oneidensis, 24 h è stato scelto in quanto era nella parte di crescita dove ossigeno stava iniziando a limitare il tasso di crescita dell'organismo, verso la fine della fase di log. Esperimenti hanno mostrati che questo era le cellule di tempo ha cominciato a produrre nanowires, così innescato a forma di biofilm successo che potrebbe sopravvivere in ambienti a basso tenore di ossigeno. ^{3 , 13} di conseguenza, il tempo scelto di utilizzare i batteri durante la fase di log dovrebbe essere influenzato dalla ricerca esperienza e conoscenza acquisita dalla letteratura su studio sperimentale dei batteri in fase di studio. Inoltre, è necessario stabilire una curva di crescita separata per comprendere la fase di log per tutti i diversi ceppi di batteri che verranno utilizzati per la crescita di biofilm utilizzando questo approccio. Il tasso di crescita di 2 µ l/min è stato calcolato così come per non superare il massimo tasso di crescita di S. oneidensis MR-1 e il tempo totale è stato scelto per ottenere un biofilm maturo che non era invaso e incline allo scollegamento. Questi tassi possono essere regolati di conseguenza alla conoscenza di batteri diversi da utilizzare con il programma di installazione.

Alcune limitazioni all'utilizzo di SALVI per la crescita di biofilm includono biofouling all'interno del canale, nonché la probabilità di batteri per attaccare alle pareti del piatte del canale. Nonostante la crescita ad un tasso costante, raccomandato per essere 2 µ l/min all'interno di questo protocollo, biofouling ancora può verificarsi se il biofilm è permesso di crescere troppo a lungo. In tal caso e senza preavviso, il biofilm può staccare dalla finestra e uscire la SALVI per il contenimento di presa. Biofouling può verificarsi anche semplicemente aggiungendo forza meccanica (vale a dire, in movimento) la SALVI, che non possono essere evitati. Tuttavia, questo può essere tenuto sotto controllo da visualizzare l'allegato del biofilm alla finestra peccato prima analisi ToF-SIMS sotto un microscopio chiaro. Un'altra limitazione comprende la scorrevolezza del PDMS microchannel che può rendere difficile per alcuni batteri attaccare. Tuttavia, questo può essere cambiato nella progettazione della SALVI per ospitare creando bordi a costine per il canale, se allegato dei batteri è un problema. Infine, i conteggi delle cellule possono essere fatto al posto di letture di₆₀₀ OD per determinazione di curva di crescita. Ad esempio, studi hanno dimostrato una correlazione diretta e coerenza della conta delle cellule a letture di₆₀₀ OD. ²¹ perciò, OD₆₀₀ si ritiene sufficiente a valutare la crescita di biofilm.

Limitazioni di questa tecnica sono pochi, come la SALVI funge essenzialmente da una piastra di coltura che ha tanta versatilità per l'utilizzo in molte applicazioni, come ad esempio condizioni aerobiche all'interno di un vano portaoggetti o qualsiasi camera ambientale temperatura controllata. Alcune piccole limitazioni includono incontrollabile camera condizioni quali umidità, temperatura, posizionamento vicino alla luce solare, che sono ancora possibile essere ospitati per, per condizioni di crescita ottimali di ogni batteri specifici. Inoltre, alcune di queste sfide tecniche possono essere superati con un incubatore con temperatura o caratteristiche di mediazione RH nel setup del biofilm.

SALVI è un'interfaccia di microfluidica vuoto-compatibile. In questo lavoro, un canale di microfluidica 200 x 300 µ l è stato utilizzato alla cultura biofilm seguito con SIMS ottica e liquido di imaging. Liquidi presentano una sfida tecnica per studiare utilizzando tecniche di base vuoto, perché sono volatili e difficili da mantenere in fase liquida nel vuoto. Così vuoto tecniche quali ToF-SIMS sono stati tradizionalmente limitati ai campioni solo asciutti e criogenici. ²² inoltre, SALVI può essere utilizzato per diversi imaging e spettroscopia utilizzando una varietà di tecniche di microscopia e spettroscopia. ^{4 , 9} il nostro gruppo ha lavorato per espandere continuamente varie applicazioni di SALVI in analisi in situ di liquidi e interfacce solido-liquido. ^{15 , 23 , 24} il nostro sforzo più recente ha efficacemente mostrato batteri allegato alla membrana del peccato. ⁹ dopo il pignoramento iniziale, continuo flusso di medie nel corso del tempo ha dimostrato di coltivare con successo un biofilm direttamente sulla finestra SIN della SALVI. Durante ToF-SIMS, il fascio di ioni primario viene utilizzato per bombardare fori di 2 µm di diametro. Questa dimensione è simile alla lunghezza delle cellule del biofilm collegato alla finestra di peccato, fornendo così un profilo chimico del biofilm nel suo microambiente naturalmente idratata. Questo è molto importante a causa della differenza di identità chimica di un biofilm, la presenza di EPS e ambiente di cluster di acqua quando si confrontano i biofilm nel suo stato idratato con campioni secchi. ⁹ senza l'uso di SALVI, ToF-SIMS potevano essere condotte solo su campioni asciutti e criogenici, fornendo mapping chimica che non riesce a catturare il profilo chimico di un campione nel suo stato naturale idrata.

Come illustrato nella Figura 1A, è importante mantenere la pompa a siringa sopra il tubo di gocciolamento per far sì che il tubo di gocciolamento devono essere perpendicolari al microchannel SALVI. Inoltre, le bolle saranno meno probabile di diventare intrappolati all'interno il tubo del dispositivo, se il tubo di uscita al PTFE (all'interno della bottiglia di presa) è inferiore rispetto al tubo di aspirazione (collegato alla camera di gocciolamento). Un altro passo fondamentale di coltivare batteri per la crescita di SALVI è prima ottenere una curva di crescita del ceppo particolari batteri che verrà utilizzato, come descritto nel punto 1.3. Questo può essere fatto da ottenere curve di crescita con misure di densità ottica. Una curva di crescita, come mostrato in Figura 1B, è importante per comprendere il lasso di tempo in cui i batteri sarà entro la log-in fase di crescita, quando si può presumere che i batteri sono più sani. Utilizzando batteri all'interno di questa fase della crescita facilita la creazione di un microambiente di biofilm sano e assicura che il biofilm crescerà al ritmo previsto. Il microchannel SALVI è sterilizzato a temperatura ambiente con etanolo al 70% e DI acqua, come non può essere sterilizzato nell'autoclave per la sterilizzazione prima dell'uso con ToF-SIMS. Questo è dovuto al fatto che in autoclave può danneggiare la finestra della SALVI e introdurre vapore acqueo al canale. Dopo diversi giorni di crescita, il microchannel dovrebbe essere controllato con microscopia di fluorescenza per convalidare batterica allegato. Un esempio può essere trovato nella Figura 1C, questa immagine è stata presa per mostrare un biofilm stagionato. Dovuto il percorso di flusso del mezzo, i batteri più favorevole si attacca e si sviluppa lungo i bordi del microchannel, come questa posizione è dove il flusso e le forze di taglio sono lowest.

In sintesi, SALVI è un metodo eccellente per cui a biofilm cultura e studio, utilizzando in situ chemical mapping, quanto consente di fornire il biofilm di vivere nel suo stato naturale idrata per lo spettrometro di massa imaging basati su vuoto. Questo approccio unico può fornire ulteriori informazioni su acqua cluster microambiente di un biofilm, anche per ottenere una comprensione più profonda dei suoi sottoprodotti EPS. Queste informazioni potrebbero essere utilizzate per comprendere attività biologiche di un biofilm e possono essere utilizzate in varie applicazioni come nella biomedicina, ingegneria biomedica, l'agricoltura e ricerca industriale e sviluppo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ToF-SIMS	IONTOF	TOF.SIMS 5	Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI)	Pacific Northwest National Laboratory	N/A	SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
-80°C Freezer	New Brunswick Scientific	N/A	U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer
4°C Refrigerator	BioCold Scientific	N/A	COLDBOX1
Orbital Shaker	New Brunswick Scientific	N/A	Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm.
Syringe Pump	Cole-Parmer	EW-74905-02	Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate.
Incubator	Barnstead International	LT1465X3	Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing.
Autoclave	Getinge	533LS	Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	4001-000	GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves.
Biological Safety Cabinet	Thermo Fisher Scientific	1385	1300 Series AZ Biological Safety Cabinet
Fluorescence Microscope	Nikon	N/A	Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply.
pH Meter	Mettler Toledo	51302803	Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving.
PEEK Union	Valco	ZU1TPK	For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system.
5 Axes Sample Stage	IONTOF	N/A	Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS.
Barnstead Nanopure Water Purification System	Thermo Fisher Scientific	D11921	ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Pipette	Thermo Fisher Scientific	21-377-821	Range: 100 to 1,000 µL.
Pipette Tip	Neptune	2112.96.BS	1,000 µL pipette tips
Razor Blade Handle	Stanley	N/A	Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing
Syringe	BD	309659	1 mL
Syringe	BD	309657	3 mL
Syringe	BD	309646	5 mL; Used for making the drip chamber
Syringe	BD	309604	10 mL
Syringe	BD	302830	20 mL
Disposable Pipette	Thermo Fisher Scientific	13-678-11	25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles.
Electric Pipette Filler	Pipet-aid	P-57260	Vacuum pressure electric serological pipette filler
Serum Bottle	Sigma	33109-U	Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle.
Anaerobic Culture Tube	VWR	89167-178	Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal.
Rubber Stopper	Sigma	27235-U	Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber.
Aluminum Crimp Seal (without septum)	Sigma	27227-U	Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper.
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper	Wheaton	224307	30 mm crimper with standard seal.
PTFE Tubing	Supelco	58697-U	1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system.
Disposable Cuvettes	GMBH	759085D	1.5 Ml for use with spectrophotometer.
Needle	BD	303015	22G; used for serum bottle injection.
Needle	BD	305120	23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system.
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP	N/A	N/A	Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94.
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	S25310A	95% Denatured
TSA	BD	212305	Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol
PIPES Buffer	Sigma	P-1851	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Hydroxide	Sigma	S-5881	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Ammonium Chloride	Sigma	A-5666	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Potassium Chloride	Sigma	P-4504	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S-9638	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Chloride	Thermo Fisher Scientific	S271-3	Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium lactate	Sigma	L-1375	60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Bicarbonate	Sigma	S-5761	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt	Sigma	N-0253	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron (III) Chloride	Sigma	451649	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Magnesium Sulfate	Sigma	208094	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Manganese (II) Sulfate Monohydrate	Sigma	M-7634	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron(II) Sulfate Heptahydrate	Sigma	215422	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma	223506	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Cobalt(II) Chloride	Sigma	60818	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Zinc Chloride	Sigma	229997	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Copper(II) Sulfate Pentahydrate	Sigma	C-8027	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate	Sigma	237086	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Boric Acid	Sigma	B-6768	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Molybdate Dihydrate	Sigma	331058	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nickel(II) Chloride	Sigma	339350	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Tungstate Dihydrate	Sigma	14304	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Biotin	Sigma	47868	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Folic Acid	Sigma	F-7876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Pyridoxine Hydrochloride	Sigma	P-9755	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Riboflavin (B2)	Sigma	47861	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thiamine Hydrochloride	Sigma	T-4625	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nicotinic Acid	Sigma	N4126	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt	Sigma	21210	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Vitamin B12	Sigma	V-2876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
4-Aminobenzoic Acid	Sigma	A-9878	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thioctic Acid	Sigma	T-1395	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}