In Situ Caracterização de Shewanella oneidensis MR1 biofilmes por SALVI e ToF-SIMS

Summary

Este artigo apresenta um método para o cultivo de um biofilme para em situ íon secundário de tempo-de-voo espectrometria de massa para mapeamento químico em seu estado hidratado, habilitado por um reator microfluídicos, sistema para análise na Interface líquido do vácuo. A Shewanella oneidensis MR-1 com proteína de fluorescência verde foi usado como um modelo.

Abstract

Biofilmes bacterianos são comunidades de superfície associadas que são vastamente estudadas para entender suas auto-produzido substâncias poliméricas extracelulares (EPS) e seus papéis em microbiologia ambiental. Este estudo descreve um método para cultivar apego de biofilme no sistema para análise na Interface líquido de vácuo (SALVI) e alcançar em situ mapeamento químico de um biofilme vivos por espectrometria de massa de iões secundário de tempo-de-voo (ToF-SIMS). Isto é feito através do cultivo de bactérias tanto fora como dentro do canal SALVI com nossa instalação especializada, bem como através de técnicas de imagem ópticas para detectar a presença de biofilme e espessura antes da análise de ToF-SIMS. Nossos resultados mostram os Picos característicos de biofilme a Shewanella em seu estado natural e hidratado, destacando em seu ambiente de cluster de água localizadas, bem como EPS fragmentos, que são drasticamente diferentes do biofilme a mesma desidratado Estado. Estes resultados demonstram a capacidade de descoberta de SALVI que permite em situ biofilme de imagem com um instrumento de imagem químico baseada em vácuo.

Introduction

Biofilmes bacterianos são comunidades associadas a superfície que evoluíram ao longo do tempo como uma defesa para que as bactérias sobrevivem variando adversos estímulos físicos e mecânicos, em que células são capazes de unir e sobreviver em muitos ambientes de possíveis. ^{1 , 2} biofilmes são vastamente investigados e têm aplicações em muitos campos tais como biomedicina, Engenharia Biomédica, agricultura e investigação industrial e desenvolvimento. ^{1 , 2} compreender o mapeamento químico dessas comunidades microbianas complexas, incluindo suas auto-produzido substâncias poliméricas extracelulares (EPS) e o seu ambiente de cluster de água local, é essencial para ganhar uma exata e detalhada Descrição de suas atividades biológicas. ²

Biofilmes existirem e crescem dentro de um estado altamente hidratado. Isto representa um grande desafio na utilização de técnicas de análise de superfície baseada em vácuo como espectrometria de massa de iões secundário de tempo-de-voo (ToF-SIMS) devido à dificuldade em estudar líquidos voláteis no vácuo. Como resultado, técnicas de análise de superfície baseada em vácuo tem sido limitadas quase exclusivamente ao estudo de amostras de biofilme em apenas seu estado seco. No entanto, estudar um biofilme no seu estado seco inibe a investigação exata de sua verdade biológica microambiente. Muitas vezes provoca mudanças drásticas para a morfologia de integridade e biofilme EPS, que demonstrou-se depois de comparar resultados massa espectral biofilme seco em situ estudos líquido. ^{3 , 4} este artigo apresenta uma solução para o estudo de biofilmes dentro de seu estado hidratado natural empregando o uso de nosso sistema para análise na Interface líquido de vácuo (SALVI),^5,6 um reator microfluidic que contém líquido sob sua membrana de nitreto (pecado) de silicone fina em um microchannel feita de polidimetilsiloxano (SPDM), proporcionando acesso directo ao feixe de íon secundário de sonda, mantendo a integridade estrutural da matriz líquido dentro de um vácuo Câmara. ^{7 , 8}

S. oneidensis MR-1 mutado para expressar a proteína fluorescência verde (GFP) foi escolhido como um organismo modelo para esta ilustração do procedimento de biofilme devido à sua versatilidade metabólica e uso comum em microbiologia ambiental e aplicada, que foi baseado fortemente na sua capacidade única para redução de metal e a transferência de elétrons extracelular. ^{9 , 10 , 11} além disso, a presença de GFP permitido para fácil espessura biofilme contínua monitoramento através de microscopia de fluorescência, utilizando um filtro (FITC) de isotiocianato de fluoresceína. Nossos estudos anteriores mostraram evidências desta bactéria, favorecendo o apego à janela pecado utilizando em operando imagens de fluorescência para o crescimento do biofilme para uma espessura de até 100 micrômetros. ^{4 , 12} enquanto este artigo discutirá apenas a confirmação da presença do biofilme através de microscopia de fluorescência, a SALVI é compatível com outros métodos de imagem ópticos como super-resolução fluorescência imagem latente (ou seja, estruturada iluminação microscopia (SIM),⁹) e laser confocal, microscopia (CLSM) imagem⁴). Imagem latente ótica pode servir para medir a espessura do biofilme e obter uma imagem 3D, da forma do biofilme como parece, confirmando a sua espessura e a sua fixação para a janela do pecado. ⁹ enquanto GFP foi usado na análise SIMS, s. oneidensis sem GFP foi utilizado para a curva de crescimento, como esta única medida necessária de densidade óptica e não exigem qualquer imagem fluorescente. Geralmente, a diferença entre o GFP marcados e espécies não marcados na curva de crescimento é insignificante. Além disso, enquanto este protocolo usa S. oneidensis MR-1 GFP como um organismo modelo para descrever o procedimento, este procedimento é projetado para qualquer estirpe bacteriana que pode ser necessário para o cultivo dentro SALVI. Embora, dado o conhecimento da estirpe bacteriana necessária, algumas condições de crescimento, tais como tempo, temperatura e oxigênio ambiente talvez precise ser modificado para acomodar a cepa de bactérias para ser usado. Por meio de crescimento, este procedimento usa "nanofios" médio, tryptic soy caldo de carne (TSB) sem glicose e tryptic soy agar (TSA) sem glicose para cultivo. A composição do meio de "nanofios", foi especialmente formulada para o crescimento e para o monitoramento de extensões da membrana e periplasm de S. oneidensis que parecem tomar a forma de pequenos fios e a composição média tem sido estabelecida na pesquisa anterior. ^{13 , 14}

Nosso protocolo anterior em in situ ToF-SIMS líquido ilustrou o benefício que SALVI tem para oferecer para imobilização de proteínas e acessório para o pecado, bem como um protocolo detalhado na redução de dados e análise de ToF-SIMS. ¹² em vez de reiterar as etapas de redução de dados, este documento servirá para em vez disso, focar a abordagem única de criação e cultivando biofilmes dentro nosso microchannel SALVI, bem como as etapas de imagem para detectar a presença de biofilme e espessura prévia a análise de ToF-SIMS. Enquanto biofilmes têm sido anteriormente limitados a apenas secas amostras dentro da câmara de técnicas analíticas de superfície baseada em vácuo, mapeamento detalhado EPS e biofilme químico de biofilmes ao vivo agora pode ser obtido em situ por causa deste novo recurso.

Protocol

1. preparação de materiais

1. Preparação do tubo médio
   1. garrafas de soro (um necessários por cultura de biofilme e três necessários por curva de crescimento)
      Nota: como mencionado na introdução, qualquer crescimento meio apropriado para fornecer os nutrientes necessários para a cepa de bactérias de interesse pode ser utilizado para este procedimento; Neste caso, " os nanofios " mídia e TSB sem médio de glicose foi usado para o crescimento da S. oneidensis MR-1 GFP. ¹³
      1. depósito 20 mL do meio de crescimento em um frasco de soro 70 mL, tampa do bujão e dobre a garrafa. Cubra a parte superior com um pedaço de papel alumínio limpo estéril.
      2. Autoclave a garrafa com um líquido ciclo durante 30 minutos a 121 ° C. depois, armazenar o frasco de soro esterilizado à temperatura ambiente.
   2. Tubos de cultura anaeróbia
      1. depositar 5 mL do meio de crescimento em um tubo de cultura anaeróbia com headspace de ar, colocar a rolha e dobre a garrafa. Cubra a parte superior com folha estéril.
2. Preparar tubos de armadilha de bolha
   1. cuidadosamente usando uma agulha de 22 calibre, faça um furo através de uma rolha de borracha do frasco de soro.
   2. 20 em corte de 1/32 " politetrafluoretileno (PTFE) tubulação com uma navalha tal que uma extremidade do segmento da tubulação é apontada.
   3. Usando a extremidade pontiaguda, passe o tubo de PTFE através do orifício na parte superior da rolha de borracha. Empurre o tubo através de até aproximadamente 2cm é através do bujão e cortar a ponta do tubo de PTFE com uma navalha para ter uma extremidade plana.
   4. Remover o êmbolo de uma seringa de 5 mL e a rolha de borracha da etapa 1.2.3 se encaixa a extremidade aberta da seringa. O final de 2 cm de tubo de PTFE é dentro do barril da seringa. Este é o borbulhador.
   5. Embrulhar o borbulhador (o PTFE tubo, rolha de borracha e seringa) feita na etapa 1.2.4 com folha de alumínio e fixe com a fita de autoclave. Autoclave a 121 ° C por 30 min. o pacote de folha para esterilizar a tubagem com uma gravidade do ciclo armazenar o pacote selado da folha à temperatura ambiente até que esteja pronto para o uso na etapa 2.4.
3. Curva de crescimento bacteriana
   Nota: Este protocolo usa S. oneidensis MR-1 GFP como um organismo modelo para o crescimento do biofilme em SALVI. No entanto, este procedimento pode ser adaptado para acomodar outras bactérias que crescem por via aeróbia ou anaeróbia. Dependendo de qual tensão é usado, tempo de crescimento e ambiente podem precisar ser ajustada em conformidade.
   Nota:-80 ° C estoques de congelador bacteriana consistiam em uma mistura 1:1 da TSB sem dextrose e glicerol. O exemplo de curva de crescimento mostrado na Figura 1 B foi preparado usando uma cultura de acionador de partida de TSB com sem dextrose, transferido em quantidades respectivas 0,2 mL três vezes para frascos de soro 70 mL com 20ml " nanofios " médio para remover vestígios de TSB. No entanto, este protocolo pressupõe que será usado apenas um meio, e que as transferências subsequentes serão não realizadas, como isso foi feita com estas soluções médias particulares para S. oneidensis. Embora não descrito neste protocolo, transferências extras como este são recomendadas como depositar inicialmente as bactérias para o TSB rica ajuda as células congeladas recuperar; e três transferências subsequentes para " nanofios " garante que todos os TSB se foi e que a dinâmica de crescimento típico está ocorrendo.
   1. Inocular a cultura Starter
      1. remover o estoque de glicerol bacteriana do congelador a-80 ° C e aquecer o estoque com uma mão enluvada para descongelar mais rapidamente possível. Mova este estoque do congelador para a câmara de segurança biológica (CSB).
      2. Dentro do BSC, use uma seringa de 1 mL com agulha 22g anexada para transferir 0,1 mL de caldo de congelador para um tubo de cultura anaeróbia tampado e frisado contendo 5 mL de meio de cultura com sem dextrose, preparado na etapa 1.1.2. Elimine o estoque restante de congelador no recipiente resíduos biológico apropriado, como congelar novamente poderia chocar as células.
      3. Incubar a cultura starter em uma agitador/incubadora a 30 ° C, a 150 rotações por minuto (rpm) e não se esqueça de levar uma densidade óptica em 600 nm (OD ₆₀₀) ler quando estiver pronto para uso. Registre o tempo de crescimento e OD ₆₀₀ tal que pode ser feito ao mesmo tempo para cada utilização posterior, tal que os resultados são reprodutíveis. Como exemplo, esta cultura foi permitida crescer para 15 h e usada em um OD de ₆₀₀ de aproximadamente 1.0.
   2. Meio de crescimento de inocular
      1. os frascos de três soro preparados na etapa 1.1.1.2 e a cultura starter preparado em 1.3.1.3 e trás tanto para o BSC.
      2. Dentro do BSC, usando uma seringa estéril 1 mL com agulha 22g anexada, 0,1 mL de solução de transferência da cultura do acionador de partida para cada uma das garrafas de soro, respectivamente.
      3. Esterilize o topo das garrafas de soro com 70% de etanol e cobrir com papel de alumínio esterilizado, rotular adequadamente e transferir para um agitador orbital dentro de uma incubadora. Definir o agitador orbital de 150 rpm e defina a incubadora para 30 ° C. Incubar até apontam os primeiros dados de ₆₀₀ OD é tomada, dentro passo 1.3.3.
   3. OD obtenção de ₆₀₀ pontos de dados
      1. Prepare um espaço em branco, depositando 100 µ l de filtro-esterilizados destilada deionizada (DI) água em uma cubeta estéril. Enrole filme plástico parafina ao redor do topo da cubeta para que a água não vai ser contaminada. Armazenar em temperatura ambiente. Uso esta em branco com o espectrofotômetro UV/Vis, antes de tomar quaisquer pontos de dados para a curva de crescimento inserir a cubeta e pressionando " em branco ".
         Nota: Cada 48 h um novo em branco deve ser preparado para evitar a leitura incorreta, como regularmente, substituir um espaço em branco é uma boa prática.
      2. Para cada ponto de dados de ₆₀₀ OD, remover as garrafas de soro preparadas na etapa 1.3.2.3 da incubadora e transferência para um BSC esterilizado. Retirar cada frasco de soro e depósito em três separadamente rotulado cubetas estéril 0,1 mL do meio de inoculados.
      3. Após anular, inserir a cubeta contendo a cultura no ultravioleta visível (UV/Vis) espectrofotómetro ler o OD ₆₀₀, um de cada vez e gravar todas as três leituras para esse ponto do tempo.
         Nota: Para S. oneidensis MR-1, os pontos de dados foram tirados 1, 14, 28, 32, 41, 57, 81 e 105 h após a inoculação. O crescimento está completo quando a bactéria foi concluída a fase de morte. Estes pontos devem ser ajustados em conformidade, se há falta de conhecimento sobre o tempo de crescimento específico e tendência de bactérias utilizadas neste protocolo. Se houver incerteza sobre a tendência de crescimento, dados pontos devem ser recolhidos mais frequentemente, por exemplo, todos os três h para o primeiro 12 h, todos os seis h para 36h subsequente, em intervalos de 12 h para o h 100 seguinte e em intervalos de 24 horas para o final h. 124
      4. Usando o OD ₆₀₀ pontos de dados como o eixo y e o tempo como o eixo x, gráfico de uma curva da média dos três pontos de tomadas com barras de erro de desvio padrão para cada ponto de tempo, usando um software gráfico. A curva de crescimento de S. oneidensis MR-1 é exibida na Figura 1 B, na seção resultados representativos.
      5. Usando o gráfico elaborado na etapa 1.3.3.4, identificar o prazo da seção log-fase da curva de crescimento. Para Shewanella, isto é entre 12 e 33 h de crescimento; Portanto, pode-se inferir que em 24 horas de crescimento, Shewanella será dentro de seu log-fase de crescimento, assumindo que as bactérias vão ser cultivadas usando a mesma mídia e tratamento antes do uso que foi usado para a curva de crescimento.

2. Cultivo da bactéria

1. dia: inocular a placa de ágar
   Nota: Esta seção do procedimento foi usada com um pla de agarosete levar uma unidade formadoras de Colônia (UFC) em fase de registro, em vez da cultura starter líquido usada para a curva de crescimento. Isto poderia ser assumido para reproduzir as mesmas condições de crescimento, devido ao fato de que TSA sem glicose foi usado e posteriormente transferido para " nanofios " médio no procedimento de curva de crescimento e TSA tem os mesmos ingredientes que compõem o TSB.
   1. Remover S. oneidensis MR-1 GFPbacteria estoque do congelador-80 ° C e coloque em um balde de gelo, coloque este balde dentro do BSC esterilizado.
   2. Dentro do BSC, use uma ansa de inoculação estéril 1 µ l para raspar a superfície da unidade populacional de bactérias congeladas e use o laço para a superfície de uma placa de agarose T-raia.
   3. Após a selagem dos lados da placa com película de plástico da parafina, inverter a placa e armazenar em uma incubadora de 30 ° C por 24 h, até colônias individuais aparecem.
2. Dia dois: inocular o frasco de soro
   1. retirar a placa da incubadora e abrir dentro do BSC.
   2. Dentro do BSC, limpe a superfície da rolha de borracha em um frasco de soro preparado da etapa 1.1.1 com 70% de etanol em água DI.
   3. Selecione um UFC individual da placa de ágar e, usando uma seringa estéril com um anexo 22 calibre agulha, depósito suficientes meios de crescimento para desalojar a colônia da placa sem tocar qualquer colônias vizinhas e misturar a colônia com o meio com a ponta da a agulha.
      Nota: A isoladamente colônia deve ser seleccionada que é longe o suficiente de outras bactérias na placa, tal que médio pode ser depositado nela sem tocar quaisquer outras colónias.
   4. Usando a mesma seringa, extrair o líquido da superfície da placa.
   5. Depois da batida para fora as bolhas dentro da seringa, injete o líquido do frasco de soro e coloque em um agitador orbital dentro de 30 ° C, situado a 150 rpm para 24 h.
      Nota: Bater as bolhas da seringa é importante a fim de evitar a introdução de mais oxigênio para o frasco de soro, como introdução de mais oxigênio para a garrafa pode alterar condições experimentais e reduzir a consistência entre os tempos de crescimento para as bactérias.
3. Dia dois: esterilização de microcanais o SALVI
   Nota: para promover a esterilidade do sistema de tubulação, etapas que exigem destacando a seringa da tubulação e substituição com uma seringa nova devem ser feitas dentro do BSC. Para fazer isso, simplesmente desconectar a seringa da bomba de seringa desapertando o titular seringa de metal e trazer a seringa com tubos ligados a um BSC estéril. Quando sistema de tubulação é mencionado nos procedimentos, isto refere-se a seringa que contém o reservatório de líquido, anexado com um injector de polyetheretherketon (PEEK) para o tubo de PTFE, ligado à câmara de gotejamento, que tem um injector PEEK montagem anexado para o Entrada de SALVI, tubulação, bem como o recipiente de saída que o tubo de saída SALVI é selado para.
   1. Usar um novo dispositivo SALVI e anexar um encaixe PEEK e injector para uma extremidade de um tubo de PTFE.
      Nota: Dispositivos SALVI preparados frescos para cada experimento seguinte a fabricação de dispositivo detalhada em pesquisas anteriores e patentes. ^{5 , 6 , 8 , 15}
   2. tomar 2 mL de etanol a 70% em uma seringa e conectar-se à instalação a PEEK a SALVI. Depois de conectar a seringa de uma bomba de seringa e anexar a saída da SALVI para uma garrafa de resíduos, deixe a solução etanol DI água correr através o SALVI em 20 µ l/min para 1,5 h.
   3. Tomar 4 mL de esterilizado DI água em uma seringa e conecta a entrada da mesma SALVI. Depois de conectar a seringa de uma bomba de seringa, deixe a água correr através o SALVI em 20 µ l/min pelo menos 3 h.
   4. Dentro de um BSC, abra o pacote de folha preparado na etapa 1.2.5 e conectar uma injeção PEEK estéril, encaixe a extremidade da seringa de 5 mL e encaixes de PEEK estéril para a extremidade do tubo de TFE. Leve ~ 3 mL de meio estéril em uma seringa e anexar ao tubo TFE. Inverta a câmara de gotejamento de 5ml e, usando uma seringa estéril, injetar o meio de crescimento para a câmara de gotejamento até atingir um volume total de 1 mL.
   5. Conecte a extremidade da câmara de gotejamento de seringa de 5 mL para a entrada da SALVI.
   6. Tomar 10 mL do meio de crescimento para uma seringa estéril e conectar-se para a entrada do tubo de gotejamento. Depois de conectar a seringa de uma bomba de seringa, permita a médio e a percorrer o SALVI em 20 µ l/min por 12 h (ou durante a noite). Use fita adesiva para proteger estas partes. Cobrir a garrafa de tomada com papel alumínio ou filme plástico parafina para minimizar a probabilidade de partículas de poeira e organismos nele contidas para não contaminar o meio. Uma descrição detalhada de como essa configuração deve ser pode ser encontrada na Figura 1 A.
      1. Permitem ao tubo de gotejamento para ser vertical, significando que a bomba de seringa deve ser colocada sobre uma superfície elevada com gotejamento tubulação fixada com fita adesiva e com o SALVI fixado sobre uma superfície plana abaixo.
      2. Executar médio através da SALVI para 12 h para assegurar que todos os vestígios de álcool etílico foram removidos da tubulação da SALVI antes de inocular com bactérias e microchannel.
      3. Para a proteção adicionada, mantenha microchannel câmara SALVI dentro de um prato de Petri esterilizada, com o lado cortado para caber os tubos de saída e de entrada. Além disso, manter a fita sempre na janela para proteger a membrana do pecado e o canal antes da análise de imagem.
4. Dia três: inoculação de microcanais o Santos de Souza
   1. remover o sistema de tubulação toda (seringa conectada para gotejar câmara ligada ao SALVI conectado ao frasco de resíduos) da bomba de seringa e trazê-lo para um BSC esterilizado. Além disso, remova o frasco de soro da etapa 2.2.5 da incubadora e trazê-lo para o BSC.
   2. Limpe a superfície da rolha de garrafa soro com etanol a 70% para evitar qualquer contaminação e então usar uma seringa estéril com uma agulha estéril de 22g anexado para extrair 4 mL de bactérias da garrafa.
   3. Desanexar o SALVI da câmara 5 mL do tubo de soro e conectar a seringa com meio inoculado diretamente para a entrada da SALVI. Deixar o tubo de soro em um pacote de folha de alumínio estéril ou dentro do BSC.
   4. Ligue a seringa com garrafa SALVI e saída para a bomba de seringa para correr em 20 µ l/min para 3h inocular o canal do SALVI, para permitir múltiplas variações de volume do líquido contido dentro SALVI.
   5. Após a inoculação, desconecte a seringa com SALVI a bomba de seringa e trazer para o BSC. Depois de anexar a entrada da Santos de Souza volta para a câmara de gotejamento de 5ml da etapa 2.4.3, tome 20 mL do meio de crescimento para uma seringa estéril e una para a entrada do tubo de gotejamento.
   6. Trazer os tubos ligados ao SALVI a partir do BSC para a bomba de seringa e permitir a médio e a passar a tubulação a uma taxa de 2 µ l/min por seis a dez dias, ou até imagens de fluorescência (discutida na etapa 3) mostram o crescimento do biofilme visível favorável para Análise de ToF-SIMS. Reencher meio fresco como se esgota dentro do BSC, enchendo uma nova seringa estéril de 10mL do meio de crescimento e anexando ao SALVI, depois o meio de crescimento anterior esgotou-se.
      Nota: Após o início da inoculação em 2 µ l/min, a taxa de fluxo nunca deve ser aumentada ou diminuída, como alterar a taxa de fluxo criaria tensão de cisalhamento dentro do canal e desanexar o biofilme. É fundamental que esta taxa de fluxo nunca deve ser alterada; para preparar este, ~ 24 h antes de SIMS, observar o tubo perto para certificar-se de que não há nenhuma bolha para que não há nenhuma necessidade de empurrar o meio mais em um ritmo mais rápido em toda a tubagem.
      1. Evite bolhas no microchannel, como eles podem empurrar o biofilme do canal. É importante ser cauteloso de bolhas na parte inferior do tubo 5 mL de gotejamento onde ele se conecta a tubulação SALVI. Meio fresco pode ser injetado com o fim do injector PEEK para assegurar que nenhum ar será forçado para o SALVI.

3. Optical Imaging do biofilme dentro o Microchannel SALVI

1. Imagem de microscopia de fluorescência
   Nota: O Shewanella usado como um organismo modelo no âmbito do presente protocolo é uma mutação para expressar as boas práticas agrícolas; como tal, não exige a coloração. Se as bactérias necessitam de coloração, isso sempre deve ser feito ao mesmo caudal (por exemplo, 2 µ l/min) para evitar o desprendimento de biofilme. Além disso, quando as células ir sem a disponibilidade de nutrientes, eles desanexar. Portanto, se qualquer coloração adicional for necessária, a mancha deve ser injetada para o meio de crescimento, ao invés de água antes de fornecer para manchar as células.
   1. Desanexar o SALVI do gotejamento tubulação dentro do BSC e fechar o SALVI aparafusando os encaixes de PEEK para dedo-apertar a União PEEK.
   2. Fita a tubagem da câmara SALVI microchannel firmemente sobre uma lâmina de vidro, tal que a janela é completamente plana e virada para cima. Remova a fita protetora da janela. Braçadeira do slide para o palco do microscópio, colocando a lâmina de vidro entre as pinças de estágio na plataforma.
   3. Menor fase do microscópio tal que o topo do SALVI é posicionado perto o suficiente para o fim do objectivo X 10, onde o ajuste do foco não causará a lente para toque na janela.
   4. Interruptor sobre a luz de fundo e encontrar o canal usando o 10 x objetivo de microscópio, ajustando o foco. Neste momento, certifique-se que a presença de fixação bacteriana para a janela de pecado o SALVI é aparente em comparação com a janela de um canal de controle com nenhuma bactéria inoculada. Para mais imagens de células, alterne para o objectivo de 20 x. Quando comparado a um canal vazio de SALVI, a presença de bactérias anexado à janela deve ter uma forte fluorescência verde.
   5. Desligar a luz de fundo e ligue a fonte de mercúrio do microscópio. Espere 2-3 min e alterne para o filtro FITC definido no microscópio para visualização e captura de imagens do biofilme anexado à janela. Como um exemplo do que o biofilme amadurecido será como quando estiver pronto, veja Figura 1 C.
   6. Vez fora a fonte de mercúrio e desanexar o SALVI de slide. Se necessário, anexar a 2 µ l/min de fluxo médio mais uma vez para permitir mais crescimento antes de imagem novamente, ou transferir o SALVI para uso de contenção secundária para análise de ToF-SIMS. Isto é necessário se a espessura do biofilme é concluiu não ser grossa o suficiente, e mais uma vez para o crescimento é necessário antes da análise de ToF-SIMS. Para anexar ao fluxo médio mais uma vez, consulte a etapa 2.3.6.
      Nota: Se colocar de volta sob fluxo médio, imagem de fluorescência deve ser feita novamente antes da análise de ToF-SIMS. Meio de crescimento
      1. dar o biofilme para alimentá-lo até a análise de ToF-SIMS pode ser conduzida. Enquanto não recomendado, se necessário, o SALVI fechado pode ser armazenada dentro de 4 ° C durante a noite, mas deve ser permitido para aquecer a temperatura ambiente antes de inserir para a câmara de vácuo de ToF-SIMS. No entanto, analisar o biofilme imediatamente após desanexado do fluxo médio para reduzir o desprendimento de biofilme.

4. Aquisição de dados de ToF-SIMS

Nota: Esta seção serve como uma visão geral e é discutida em maior detalhe dentro de nosso protocolo anterior, descrevendo a molécula adsorvida proteína líquida análise de SIMS. ¹²

1. SALVI instalar na câmara de Loadlock ToF-SIMS
   Nota: as luvas devem ser usadas em todos os momentos quando Manipulação o dispositivo SALVI e instalá-lo para o ToF-SIMS palco para evitar possíveis contaminações durante a superfície análise.
   1. Santos de Souza monte para o palco e corrigi-lo com vários parafusos. Certifique-se de que a janela de pecado é plana por aperto de parafuso ajuste e inserindo bolacha de silicone peças na parte inferior da câmara de microchannel PDMS. Remover a fita protetora da janela e, em seguida, carregar o estágio na câmara de loadlock ToF-SIMS.
   2. Abrir o de loadlock ToF-SIMS, segurar e definir o palco horizontalmente sobre a plataforma de carga e fechar a porta de loadlock. Iniciar a bomba de vácuo e esperar para garantir esse vácuo adequado é alcançado.
   3. Mover a SALVI na câmara principal, uma vez que o vácuo está estável a 1 x 10 ^-7 mbar.
2. Perfis de profundidade e pontos de coleta dados
   1. encontrar o canal microfluidic usando o microscópio óptico equipado no ToF-SIMS.
   2. Selecionar modo positivo ou negativo antes de aquisição de dados. Uso a 25 keV Bi ₃ ⁺ feixe como o feixe de íon primário em todas as medições e use o canhão de elétrons inundação para neutralizar a superfície de carregamento durante todas as medições.
   3. De varredura o feixe de ₃ ⁺ de Bi com pulso de ns 150 largura em uma área redonda com um diâmetro de ~ 2 µm com 64 pixels por 64 pixels de resolução. Após a perfuração através da janela de pecado 100 nm, continuar a procurar outros 150 s para coletar dados de alta intensidade para a imagem latente. Depois intercalado, as contagens aumentará significativamente dentro da profundidade, região de criação de perfil. Após estabilização, isto pode ser referido como a região de alta intensidade.
   4. Reduzir a largura de pulso de 50 ns para coleta de dados para adquirir espectros com melhor resolução em massa. Continuar esta aquisição para sobre outros 200 s.
   5. Repita essas etapas para a coleta de pelo menos três positivos e três pontos de dados negativos.
      Nota: Certifique-se de espaço as áreas intercalado, tal que a janela de pecado não quebrará e vazamento na câmara do vácuo de comprometeu a integridade da janela.

5. Análise de dados de ToF-SIMS

1. , calibração de massa usando Software de IonToF
   1. abrir o software de análise de ToF-SIMS (medição Explorer) e clique no " perfis ", " espectros " e " imagem " botões, respectivamente, para dados de imagem, espectro m/z e perfil de profundidade do processo.
   2. Abrir os arquivos de dados obtidos ao longo de aquisição de dados de ToF-SIMS.
   3. Selecione a profundidade perfil dados de interesse e reconstruir os espectros de acordo com as séries temporais de profundidade perfil.
   4. Imprensa " F3 " para abrir o " massa de calibração " janela. Escolher a picos de calibração com base em compostos químicos que deverão existir na amostra específica.
2. Picos de interesse seleção
   1. como seleção de pico é necessária para a análise da amostra, determinar Picos característicos da amostra de acordo com a literatura ou outros achados anteriores, se houver. Compare a intensidade dos picos de interesse em espectros de m/z. Se necessário, adicionar novos picos ou eliminar picos de interferência na lista pico.
   2. Clique em um pico, encontrar as linhas vermelhas na janela inferior esquerdo. Mover as linhas vermelhas para delimitar o pico todo.
   3. Selecione um pico correspondente a fórmula química na janela principal do espectro e em seguida, clique no " adicionar pico " botão acima da janela. < /Li >
3. Exportar dados de calibração de massa
   1. para exportar uma lista de pico, no " lista de pico " menu, selecione " salvar … " lista de pico no " itmil " formato.
   2. Para exportar um perfil de profundidade, no " perfil " janela, clique sobre o " arquivo " menu, selecione " exportar " e selecione " salvar como " um ". txt " arquivo.
   3. Para exportar um arquivo de m/z espectro, no " Spectra " janela, clique no " arquivo " menu, selecione " exportar " e em seguida, selecione " salvar como " um ". txt " arquivo.
   4. Para exportar um arquivo de imagem, no " imagem " janela, imprimir a tela e salvar como arquivo de imagem.

6. Plotagem de dados ToF-SIMS e apresentação

1. usar uma ferramenta gráfica para importar os dados.
2. Fazer um gráfico usando o m/z como o eixo x e pico a intensidade como o eixo y para mostrar o espectro reconstruído. Um exemplo é dado na Figura 2.
3. Combinar reconstruída bidimensionais (2D) imagens de diferente m/z e forma uma matriz para mostrar qualquer mapeamento de íon positivo ou negativo. Um exemplo é dado na Figura 2 B.

Representative Results

Estes resultados representativos servem para mostrar como o perfil químico do biofilme anexado pode ser identificado e interpretado, como obtidas por ToF-SIMS. Após a plotagem de espectros de massa de aquisição de dados de ToF-SIMS, destacada-se brevemente na seção procedimentos, identificação de pico deve ser conduzida para atribuir as identidades para cada valor de m/z respectivos. Isso pode ser feito através da revisão de literatura extensa na espectrometria de massa em bactérias e fragmentos de químicos específicos que deverão estar presentes dentro as bactérias estudadas, tais como vários clusters de água, ácidos graxos e fragmentos de proteína. ^{16 , 17 , 18 , 19 , 20} estes resultados representativos só mostram os espectros de massa negativos como obtidas pelo biofilme S. oneidensis MR-1 e uma amostra de água DI. Interpretação de espectros positivos seguir um procedimento semelhante.

Figura 1 A mostra o esquemático de configuração de acordo com este protocolo, quando cultivar um biofilme no microchannel SALVI. Na parte superior esquerda, a seringa é anexada a uma bomba de seringa, que mantém o fluxo médio a uma taxa constante ao longo do sistema de tubulação de PFTE e dentro o microchannel. A bomba de seringa é colocada acima da câmara de gotejamento, que impede a contaminação ao reservatório para evitar motile organismos de natação montante médio de trás para a frente. O médio flui do reservatório de câmara de gotejamento directamente para o tubo de PFTE do SALVI, que passa através do microchannel e o tubo de saída para uma garrafa selada da tomada. As linhas pontilhadas ponto da janela de pecado para uma imagem de um amadurecido oneidensis S. células GFP Sr-1, capturadas por microscopia de fluorescência, detalhada no passo 3.1. Figura 1 B mostra um exemplo de uma curva de crescimento estabelecido usando o organismo modelo para este protocolo, S. oneidensis MR-1. Desde as fases de crescimento neste gráfico, pode concluir-se que a fase de registo de crescimento ocorre entre 15-32 h nestas condições de cultivo específico. Informações adicionais deste gráfico mostram que h 0-15 é a fase de retardo de crescimento, e 33-105 h representa a fase estacionária de crescimento. Figura 1 C é uma imagem adquirida com microscopia de fluorescência, mostrando um exemplo de um biofilme amadurecido.

Figura 2 A mostra os espectros de massa negativos de uma hidratada S. oneidensis MR-1 biofilme dentro do canal microfluídicos, como obtidas por em situ líquido ToF-SIMS. Este gráfico mostra um exemplo da comparação entre o biofilme de água S.oneidensis Sr-1 e DI, intervalo selecionado em massa (m/z 100-350) o último obteve-se como um sistema de controle. Figura 2 B exibe uma comparação de imagens 2D dos picos de interesse no Sr-1 biofilme e DI água obtidos por ToF-SIMS. Interessante valores m/z pode ser identificado de estudar os espectros de massa, identificação potencial de pico de valores m/z corretamente são atribuídas a químicos fragmentos, como suportado pelo levantamento de literatura e biblioteca de software do IonToF SIMS. Picos de interesse na Figura 2 incluem clusters de água (ou seja, m/z 107 (H₂O)₅OH^–, 125 (H₂O)₆OH^–, 143 (H₂O)₇OH^-, 161 (H₂ O)₈OH^–, 179 (H₂O)₉OH^–, 197 (H₂O)₁₀OH^–, 215 (H₂O)₁₁OH^–, 233 (H₂O)₁₂OH^-, 251 (H₂O) ₁₃ OH^–, 269 (H₂O)₁₄OH^–, 287 (H₂O)₁₅OH^–, 323 (H₂O)₁₇OH^-, 341 (H₂O)₁₉OH^–))⁹, como indicado por linhas vermelhas acima respectivos picos, quorum sensing relacionados compostos biomarcadores (i.e., m/z 175 C₁₀H₉₂^–), subprodutos EPS (m/z 123 C₂H₄PO₄^-, 159 P ₂ O₈H^–, 216 Cr₂O₇^–, 285 octadecanoethiols, 325 compostos polares, compostos de Polar C₁₂ )^15,16,18e ácidos graxos de cadeia fragmentos (ou seja, m/z 127 [C₂H₃(CH₂)₃COO]^-, ácido graxo de C16:0 255, 279 ácido linoleico, C₁₈H₃₁O₂^–, 325 C₂₁H₄₀O₂ ^-, lipídios, 18-MEA vinculado por meio de uma ligação Tioéster, ácido esteárico C₁₈H₃₅O₂^–, íons de monoacylglyceryls de ácido palmítico C₁₉H₁₇O₆ de superfície 341 ^-). ^{16 , 19}

Uma vez que o biofilme é hidratado, não é surpreendente que alguns picos vistos no exemplo de biofilme são semelhantes aos encontrados na água DI. Estes picos de aglomerado de água são marcados com uma linha vermelha acima cada pico na Figura 2A, incluindo a m/z, 107, 125, 143, 161, 179, 197, 215, 233, 251, 269, 287, 323 e 341 e correspondente a (H₂O)₅OH^– (H₂O) ₆ Ah^– (H₂O)₇OH^– (H₂O)₈OH^– (H₂O)₉OH^– (H₂O)₁₀OH^– (H₂ O)₁₁OH^– (H₂O)₁₂OH^– (H₂O)₁₃OH^– (H₂O)₁₄OH^– (H₂O)₁₅OH^- (H₂O)₁₇OH^– (H₂O)₁₉OH^-, respectivamente. ⁹ como há prevalência de muitos clusters de água característico neste espectro de massa, este resultados fornece uma forte evidência de ambiente de cluster a química da água presente em um biofilme hidratado. Além disso, água não-cluster relacionados com picos observados em ambos os espectros comumente podem ser atribuídos como picos de interferência, normalmente a partir do PDMS, um componente do canal microfluidic. Por exemplo, um pico de interferência conhecido comum de PDMS é a m/z 137 no modo de íon negativo.

Quando comparando o biofilme SIMS massa espectros ao de água DI, conforme mostrado na Figura 2, alguns picos não estão presentes na água DI, ainda consta o biofilme. Por exemplo, o pico m/z 255 ([CH₃(CH₂)₁₄COO]^-, ácido palmítico) está presente em alta intensidade na amostra de biofilme, mas nada da amostra de água DI. Isto sugere que os sinais come do biofilme, provavelmente o biofilme e/ou seus EPS auto-gerada. Muitos picos interessantes foram identificados na Figura 2. Por exemplo, o EPS relacionados com picos incluem m/z 123^-, encontrado para ser C₂H₄PO₄^-, 159 (P₂O₈H^–), 216 (Cr₂O7^–), 285 (octadecanoethiols) e 325 (compostos polares, C ₁₂ compostos polares). ^{17 , 18 , 20} picos associados com ácidos graxos foram encontrados para ser 127 ([C₂H₃(CH₂)₃COO]^–), 255 ([CH₃(CH₂)₁₄COO]^-, ácido palmítico), 279 ([CH₃ (CH₂)₁₅COO]^-, ácido linoleico), 317 (C₂₁H₃₃O₂^–), 325 (C₂₁H₄₀O₂^–) e 341 (lipídios de superfície, 18-MEA vinculados por meio Tioéster enlace, ácido esteárico C₁₈H₃₅O₂^-, íons de monoacylglyceryls de ácido palmítico C₁₉H₁₇O₆^–). ^{16 , 19} por último, um quinolona sinal quórum sensoriamento relacionados com pico de C₁₀H₉₂^– foi observada em m/z 175.

Figura 2 B exibe imagens 2D da distribuição de quatro diferentes íons interessantes entre o biofilme s. oneidensis MR-1 (linha superior) e água (linha inferior). O valor de m/z 107 ((H₂O)₅OH^–) mostra um cluster de água de intensidade significativa dentro das amostras, o valor de m/z 175 (C₁₀H₉₂^–) retrata um quórum de sensoriamento sinal relacionado, m/z 255 é um ácido graxo ([CH₃(CH₂)₁₄COO]^-, ácido palmítico), e m/z 341 (C₂₁H₄₁O₂^–) podem representar os dois fragmentos de lipídios e aglomerados devido a precisão de 1 amu em massa de água. ⁹ regiões mais brilhantes das imagens 2D indicam uma contagem mais elevada do íon molecular presente na imagem. Como esperado, composto de sinais para os QS e lipídios eram muito maiores em quantidade dentro da amostra de biofilme. Enquanto o sinal para o cluster de água (m/z 107) foi mais forte em toda a amostra de biofilme, também esteve presente na amostra de água DI, conforme o esperado. Por último, o sinal em m/z 341 foi encontrado para ser homogênea dentro da amostra de biofilme, mas muito fracamente dentro da amostra de água DI. Enquanto m/z 341 foi um pico de aglomerado de água, também foi representativa de vários diferentes ácidos graxos e lipídeos de superfície. ¹⁶ sua presença mais forte dentro da amostra de biofilme após normalização dos dados sugere que a presença de fragmentos de lipídios supera de longe a presença de aglomerados de água.

Figura 1 : Esquema experimental. (A) exibe o esquema experimental da instalação do biofilme como ele aparece dentro do laboratório. Começando no canto superior esquerdo, médios fluxos da seringa (1), que é anexado à bomba de seringa (2), controlando a taxa na qual líquido move através de. As setas indicam a direção do fluxo em todo o sistema. A seringa (1) é conectada através de um injector PEEK montagem (3) para o tubo de TFE (4). Médio flui através de uma câmara de gotejamento (5) para evitar a contaminação e eventualmente se move através da SALVI (6) para o recipiente de descarga selada (7). A bomba de seringa está posicionada sobre uma superfície elevada (9) tal que a câmara de gotejamento (5) pode ser perpendicular à superfície plana (8) que o Santos de Souza (6) é colocado em cima. (B) crescimento curva para Shewanella oneidensis MR-1, no meio de "nanofios". Tempo 0-15 h representa a fase de retardo, tempo 15-33 h representa fase de registro, tempo 33-105 h representa a fase estacionária e a hora h 105 ou já representa fase de morte. Barras de erro representam o desvio padrão. (C) A imagem de um biofilme amadurecido adquirida com microscopia de fluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Comparações de ToF-SIMS negativo espectros do hidratado Shewanella oneidensis biofilme e meio Sr-1 na microchannel SALVI. Espectros de massa (A), a m/z SIMS do biofilme Shewanella oneidensis no meio Sr-1 e água DI. O último foi usado como um controle. Linhas vermelhas indicam locais dos picos de aglomerado característico da água. (B) comparação de imagens 2D dos picos de interesse entre o biofilme e DI água. Da esquerda para a direita, imagens exibir um cluster de água (m/z 107 (H₂O)₅OH^–), um sinal de detecção/hormônio Quórum (m/z 175, C₁₀H₉₂^–), um ácido graxo (m/z 255, [CH₃(CH ₂)₁₄COO]^-, ácido palmítico) e superfície fragmentos de lipídios/EPS (m/z 341, 18-MEA, C₂₁H₄₁O₂^–). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Após inocular em fase de registro, é importante testar o número de dias e a temperatura na qual o biofilme deve crescer antes que seja saudável e grossa o suficiente para a imagem latente, conforme descrito na etapa 3.1. Este procedimento abrange especificamente cultivo um S. oneidensis MR1 biofilme à temperatura ambiente; no entanto, diferentes temperaturas de quarto pode influenciar a taxa de crescimento. Portanto, é fundamental usar imagens ópticas para entender se o biofilme está pronto antes de proceder à análise de ToF-SIMS. Da mesma forma, diferentes cepas de bactérias requerem condições de crescimento diferente e comprimento para obter uma espessura desejável para análise. Enquanto a curva de crescimento na Figura 1b retrata a fase log 200 da bactéria ser 12-32 h, e esta foi usada em 24 horas durante todo o procedimento, é importante notar que este tempo não pode ser usado como log-fase para outras cepas de bactérias sem estabelecer a curva de crescimento de forma independente. Enquanto a fase de registro foi entre 12 e 33 h de crescimento para S. oneidensis, 24 h foi escolhido devido ao fato de que foi na parte de onde o oxigênio estava começando a limitar a taxa de crescimento do organismo, no final do log-fase de crescimento. Experimentos mostraram que se tratava de células o tempo começaram a produzir os nanofios, assim preparados para biofilmes de forma bem sucedida que poderiam sobreviver em ambientes de baixa de oxigênio. ^{3 , 13} -consequentemente, o momento escolhido para usar as bactérias durante a fase de registo deve ser influenciado pela pesquisa experiência e conhecimento adquiridos com literatura em estudo experimental da bactéria em estudo. Além disso, uma curva de crescimento separado deve ser estabelecida para entender a fase de registro para todas as diferentes cepas de bactérias que serão usadas para o crescimento do biofilme usando esta abordagem. A taxa de crescimento de 2 µ l/min foi calculado, assim como para não exceder a máxima taxa de crescimento de S. oneidensis MR-1 e o tempo total foi escolhido para obter um biofilme maduro que não foi abandonado e propenso a desanexação. Estas taxas podem ser ajustadas conformemente ao conhecimento de diferentes bactérias para ser usado com esta configuração.

Algumas limitações ao uso de SALVI para o crescimento do biofilme incluem Bioincrustação dentro do canal, bem como a probabilidade de bactérias para anexar as paredes planas do canal. Apesar do crescimento a um ritmo constante, recomendado para ser 2 µ l/min no âmbito do presente protocolo, Bioincrustação ainda pode ocorrer se o biofilme é permitido crescer por muito tempo. Nesse caso e sem aviso, o biofilme pode desanexar-se da janela e sair o SALVI para a contenção da tomada. Bioincrustação também pode ocorrer simplesmente pela adição de força mecânica (ou seja, movendo-se) o Santos de Souza, que não podem ser evitado. No entanto, isto pode ser mantido em xeque exibindo o acessório do biofilme para a janela de pecado antes da análise de ToF-SIMS sob um microscópio de luz. Uma outra limitação inclui a lisura do microchannel PDMS, que pode tornar difícil para algumas bactérias anexar. No entanto, isso pode ser alterado no projeto da SALVI para acomodar criando bordas com nervuras para o canal, se fixação das bactérias é um problema. Por último, a contagem de células pode ser feita em vez de leituras de₆₀₀ OD para determinação de curva de crescimento. Por exemplo, estudos têm mostrado uma correlação direta e consistente de contagem de células para leituras de₆₀₀ OD. ²¹ portanto, OD₆₀₀ é considerada suficiente na avaliação do crescimento do biofilme.

Limitações a esta técnica são poucos, como o SALVI essencialmente atua como um prato de cultura que tem muita versatilidade para uso em muitas aplicações, tais como anaerobicamente dentro de uma caixa de luva, ou dentro de qualquer câmara ambiental temperatura controlada. Algumas limitações menores incluem condições de sala incontrolável como umidade relativa, temperatura, colocação perto de luz solar, que são ainda possíveis de ser acomodados, para condições de crescimento ideal de cada específica das bactérias. Além disso, alguns destes desafios técnicos podem ser superados com uma incubadora com temperatura ou características de mediação RH na configuração do biofilme.

SALVI é uma interface compatível com vácuo microfluidic. Neste trabalho, utilizou-se um canal de microfluidic 200 x 300 µ l à cultura biofilmes seguidos com SIMS líquidos e óptico de imagem. Líquidos apresentam um desafio técnico para estudar técnicas de vácuo com base, porque eles são voláteis e difícil de manter-se na fase líquida no vácuo. Assim, vácuo técnicas tais como ToF-SIMS têm sido tradicionalmente restritas a amostras apenas secas e criogênicas. ²² além disso, SALVI pode ser usado para diversas imagens e espectroscopia usando uma variedade de técnicas de microscopia e espectroscopia. ^{4 , 9} o nosso grupo tem trabalhado para expandir continuamente várias aplicações de SALVI em situ análise de líquidos e interfaces sólido-líquido. ^{15 , 23 , 24} nosso mais recente esforço efetivamente demonstrou bactérias apego à membrana do pecado. ⁹ após fixação inicial, fluxo contínuo de mídia ao longo do tempo foi mostrado para cultivar com sucesso um biofilme diretamente na janela do pecado do SALVI. Durante ToF-SIMS, o feixe de íon primário é usado para bombardear os furos de 2 µm de diâmetro. Esta dimensão é semelhante ao comprimento da célula do biofilme anexado à janela de pecado, fornecendo assim um perfil químico do biofilme em seu microambiente naturalmente hidratado. Isto é altamente importante devido a diferença de identidade química de um biofilme, presença de EPS e ambiente de cluster de água quando se comparam os biofilmes em seu estado hidratado com amostras secas. ⁹ sem o uso de SALVI, ToF-SIMS podia só ser realizado em amostras secas e criogênicas, fornecendo mapeamento químico que não consegue capturar o perfil químico de uma amostra em seu estado natural e hidratado.

Como mostrado na Figura 1A, é importante manter a bomba de seringa sobre a tubagem de gotejamento para permitir ao tubo de gotejamento para ser perpendicular a microchannel SALVI. Além disso, bolhas será menos prováveis de se tornar presa dentro da tubulação do dispositivo, se o tubo de saída PFTE (dentro da garrafa de saída) é menor do que a tubulação de entrada (em anexo para a câmara de gotejamento). Outro passo crítico de cultivar bactérias de crescimento SALVI é primeiro obter uma curva de crescimento da cepa específica de bactérias que será usada, conforme descrito no passo 1.3. Isso pode ser feito através da obtenção de curvas de crescimento com medidas de densidade óptica. Uma curva de crescimento, como mostrado na Figura 1B, é importante para compreender o período de tempo no qual as bactérias vão ser a log-fase de crescimento, quando pode-se supor que as bactérias são mais saudáveis. Utilizando bactérias dentro dessa fase do crescimento facilita a criação de um microambiente biofilme saudável e garante que o biofilme crescerá na velocidade esperada. O microchannel SALVI é esterilizado em temperatura ambiente com 70% de etanol e água DI, como não podem ser esterilizados em autoclave para esterilização antes de utilizar com ToF-SIMS. Isto é devido ao fato de que autoclave pode danificar a janela do SALVI e introduzir o vapor de água para o canal. Após vários dias de crescimento, o microchannel deve ser verificado com microscopia de fluorescência para validar a fixação bacteriana. Um exemplo pode ser encontrado na Figura 1C, esta imagem foi tirada para mostrar um biofilme amadurecido. Devido o caminho do fluxo do meio, as bactérias mais favoravelmente anexa e cresce ao longo das bordas do microchannel, à medida que este local é onde o fluxo e forças de cisalhamento são lowest.

Em resumo, SALVI é um excelente método para o qual a cultura e estudo de biofilmes usando em situ mapeamento de química, pois permite fornecer o biofilme vivos em seu estado hidratado natural para o vácuo de imagem espectrômetro de massa. Esta abordagem única pode fornecer mais informações sobre água cluster microambiente de um biofilme, tão bem quanto uma compreensão mais profunda de seus derivados EPS. Esta informação pode ser usada para compreender as atividades biológicas de um biofilme e pode ser utilizada em diversas aplicações tais como em biomedicina, Engenharia Biomédica, agricultura e investigação industrial e desenvolvimento.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ToF-SIMS	IONTOF	TOF.SIMS 5	Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI)	Pacific Northwest National Laboratory	N/A	SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
-80°C Freezer	New Brunswick Scientific	N/A	U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer
4°C Refrigerator	BioCold Scientific	N/A	COLDBOX1
Orbital Shaker	New Brunswick Scientific	N/A	Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm.
Syringe Pump	Cole-Parmer	EW-74905-02	Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate.
Incubator	Barnstead International	LT1465X3	Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing.
Autoclave	Getinge	533LS	Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	4001-000	GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves.
Biological Safety Cabinet	Thermo Fisher Scientific	1385	1300 Series AZ Biological Safety Cabinet
Fluorescence Microscope	Nikon	N/A	Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply.
pH Meter	Mettler Toledo	51302803	Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving.
PEEK Union	Valco	ZU1TPK	For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system.
5 Axes Sample Stage	IONTOF	N/A	Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS.
Barnstead Nanopure Water Purification System	Thermo Fisher Scientific	D11921	ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Pipette	Thermo Fisher Scientific	21-377-821	Range: 100 to 1,000 µL.
Pipette Tip	Neptune	2112.96.BS	1,000 µL pipette tips
Razor Blade Handle	Stanley	N/A	Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing
Syringe	BD	309659	1 mL
Syringe	BD	309657	3 mL
Syringe	BD	309646	5 mL; Used for making the drip chamber
Syringe	BD	309604	10 mL
Syringe	BD	302830	20 mL
Disposable Pipette	Thermo Fisher Scientific	13-678-11	25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles.
Electric Pipette Filler	Pipet-aid	P-57260	Vacuum pressure electric serological pipette filler
Serum Bottle	Sigma	33109-U	Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle.
Anaerobic Culture Tube	VWR	89167-178	Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal.
Rubber Stopper	Sigma	27235-U	Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber.
Aluminum Crimp Seal (without septum)	Sigma	27227-U	Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper.
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper	Wheaton	224307	30 mm crimper with standard seal.
PTFE Tubing	Supelco	58697-U	1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system.
Disposable Cuvettes	GMBH	759085D	1.5 Ml for use with spectrophotometer.
Needle	BD	303015	22G; used for serum bottle injection.
Needle	BD	305120	23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system.
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP	N/A	N/A	Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94.
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	S25310A	95% Denatured
TSA	BD	212305	Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol
PIPES Buffer	Sigma	P-1851	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Hydroxide	Sigma	S-5881	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Ammonium Chloride	Sigma	A-5666	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Potassium Chloride	Sigma	P-4504	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S-9638	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Chloride	Thermo Fisher Scientific	S271-3	Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium lactate	Sigma	L-1375	60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Bicarbonate	Sigma	S-5761	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt	Sigma	N-0253	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron (III) Chloride	Sigma	451649	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Magnesium Sulfate	Sigma	208094	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Manganese (II) Sulfate Monohydrate	Sigma	M-7634	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron(II) Sulfate Heptahydrate	Sigma	215422	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma	223506	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Cobalt(II) Chloride	Sigma	60818	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Zinc Chloride	Sigma	229997	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Copper(II) Sulfate Pentahydrate	Sigma	C-8027	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate	Sigma	237086	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Boric Acid	Sigma	B-6768	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Molybdate Dihydrate	Sigma	331058	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nickel(II) Chloride	Sigma	339350	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Tungstate Dihydrate	Sigma	14304	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Biotin	Sigma	47868	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Folic Acid	Sigma	F-7876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Pyridoxine Hydrochloride	Sigma	P-9755	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Riboflavin (B2)	Sigma	47861	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thiamine Hydrochloride	Sigma	T-4625	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nicotinic Acid	Sigma	N4126	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt	Sigma	21210	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Vitamin B12	Sigma	V-2876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
4-Aminobenzoic Acid	Sigma	A-9878	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thioctic Acid	Sigma	T-1395	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}