Summary
本文提出了一种量化飞行节律中主要时间特征的方法。通过拟合参数模型波形, 实现了飞行活动的量化。模型参数描述了每日活动的早晚峰值的形状和大小。
Abstract
在大多数动物和植物中, 昼夜节律时钟协调行为和分子过程, 并使它们与每日暗周期同步。这种时间控制基础的基本机制被广泛地研究使用果蝇, 作为一个模型生物体 .在苍蝇, 时钟通常是研究通过分析多日运动记录。这样的记录显示了一个复杂的双峰模式, 有两个活动的高峰: 黎明时分发生的峰值, 以及黄昏时分发生的傍晚高峰。这两个峰值一起形成一个波形, 它与时钟基因中的正弦振荡非常不同, 这表明除了时钟之外的机制对产生行为数据中的观察到的模式有深远的影响。在这里, 我们提供了使用最近开发的计算方法的说明, 数学描述了飞行活动中的时态模式。该方法符合活动数据的模型波形, 包括四指数术语和九独立的参数, 充分描述的形状和大小的上午和晚上的活动高峰。提取的参数可以帮助阐明基底的动力学机制的基础上普遍观察到的双峰活动模式的飞行节律。
Introduction
生物钟是一种内生的生化振荡器, 周期约24小时, 在动植物中几乎无处不在1,2。时钟有助于将生物体的内部过程和行为与外部光暗循环同步。自二十世纪六十年代使用果蝇、四腹果蝇以来, 昼夜节律时钟的遗传结构得到了广泛的研究。在这种昆虫中, 生物钟的核心包括四种蛋白质: 周期、永恒、时钟和周期。这些核心组分与其他分子一起形成一个反馈回路, 产生时钟基因的几乎正弦振荡3,4。在苍蝇的生物钟是广泛的研究使用多日运动记录, 飞行活动是检测到的一个单一的红外光束跨越中间的单个管5。一个典型的飞行记录有一个复杂的双峰模式与两个很好的可区分峰: 早晨峰值 (M), 开始在晚上的结束, 并有一个最大的灯打开;和傍晚峰值 (E), 它在一天结束时开始, 在指示灯关闭6时具有最大值。有趣的是, 这种行为记录的形状与在分子水平上观察到的简单的正弦振荡有很大的不同, 这暗示了额外的机制对观测到的时间模式的作用。为了更好地理解这些隐藏的机制, 我们开发了一个计算工具, 它提供了对时态模式的定量描述。
在我们的工作中, 运动节律的定义是一个波形, 模仿飞行活动模式。由于简单的正弦波不能用来对活动中观察到的节律变化进行建模, 我们测试了各种信号形状, 以选择最简单的方法来捕捉记录中所看到的所有显著特征。果蝇昼夜节律行为是由时钟神经元的活动控制的, 通常有指数模式的激活和失活7。数据的指数动力学和可视化分析促使我们建立一个指数条件的模型, 由四指数组成, 具有九独立参数, 与飞行活动模式8相似。除了运动数据外, 我们还分析了它的功率谱。典型的飞行活动谱显示多个峰值在谐波 t0/2, t0/3,等, 除了预期的基本峰值在生理周期 t0。根据傅立叶定理, 只有一个纯正弦波在功率谱中产生一个峰值, 而更复杂的波形在主周期的谐波中显示多个谱峰 (图 1)。因此, 考虑到飞行活动中的正弦时间模式8, 数据的峰功率谱在数学上是预期的, 并不一定意味着存在多个周期的振荡。重要的是, 所提出的模型波形的功率谱也显示了主周期所有谐波的峰值, 类似于飞行的运动记录, 从而强调了我们的模型描述的时间和频率上的飞行数据的高保真度。
在时间分辨率为几分钟或更少的情况下, 飞行活动数据出现噪音, 使得很难直接从原始数据中提取参数。分数据进入更长的时间间隔可以降低噪声水平, 但是, 可以改变数据的方式, 可能会影响模型参数的估计。因此, 我们从记录的功率谱中获取参数, 使用从模型函数的傅里叶变换中计算出的期望功率谱的解析表达式8 (参见附加文件1的引用8)。这种从功率谱获取参数的方法产生了精确的参数值, 而不需要对原始活动数据进行任何附加操作 (如分或过滤)。在参考8中描述了模型的数学细节以及对野生类型和突变数据的应用。这里介绍的协议集中于使用计算工具的 step-by 步骤指令。
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Protocol
1. 使用果蝇活动监测器 (大坝) 测量飞行运动
注意: 有关详细信息, 请参阅参考 5 。
- 在一端和棉花上准备单独的苍蝇管。食物的末端应密封, 以防食物干燥。
- 在50毫升的烧杯中放入5-6 克的飞行食物。把食物切成小块, 使它更容易融化.
- 连接32个单独的玻璃管和一个橡皮筋.
- 将烧杯中的食物加热到微波炉中10-15 秒. 每5秒停止微波炉, 并小心摇动烧杯, 以确保食物的均等融化.
- 当食物仍然是液体时, 把准备好的单独的管子放入烧杯中, 然后用食物。把管子上下移动, 这样它们就同样充满了.
- 允许食物冷却并固化约1小时.
- 食物固体后, 用烧杯中的食物取出管子.
- 用蜡封住含有食物的末端。首先, 用纸巾小心地清洗管子, 然后按下管子对蜡。目视检查密封件的质量, 如有必要, 再次重复密封.
- 用棉把管子的另一端关上; 棉花将允许空气通过, 同时保持一只苍蝇被锁在管子里.
- 在每个单独的管道中放置一只苍蝇, 并将管道放置在大坝中.
- 将监视器放置在恒温恒湿的恒温箱中。根据实验, 设置适当的光/暗条件如下。
- 用于进行光/暗实验以使苍蝇在光/暗循环中进行整个实验。不要在分析中使用测量的第一天.
- 对于恒定的黑暗实验, 首先保持苍蝇在光/黑暗的条件下, 夹带和同步时钟, 然后切换到恒定的黑暗。不要在分析中使用恒定黑暗的第一天的测量.
- 收集可在分析中使用的至少四天的数据.
注: 大坝系统将输出一个单一的文件与移动记录的所有苍蝇在显示器.
2。数据分析
- 将监视器输出文件拆分为多个单飞活动文件; 每个文件都应是单个列和 #39; .txt 和 #39; 文件与个人飞行运动测量.
- 运行和 #39; ModelFitPS3 #39; 在 Matlab 命令窗口中使用以下输入参数:
- For samplingrate , 设置数据采样时间间隔 (以秒为单位)。例如, 如果每分钟测量一次活动, 则输入60作为 samplingrate.
- for bin_interval , 设置搁置数据的时间间隔 (以分钟为单位), 以便更好地进行可视化; 建议的 bin 间隔为 20-30 min.
- For 趋势 , 输入 和 #34; 1 和 #34; 如果数据显示基线趋势和 #34; 0 和 #34; 否则; 趋势首先通过拟合第二阶多项式, 然后从数据中减去数据。
- 在弹出窗口中选择一个单飞活动文件.
注意: 第一个图形是数据功率谱, 而不是熟悉的活动图。从绘制的功率谱中, 确定主周期 T 0 : 在生理峰值上单击鼠标左键, 或者在第二个谐波峰值 (在 T 0 /2) 上用鼠标右键. - 在打开的数据图中, 检查上午和晚上的峰值是否可视化。如果没有, 则通过右键单击关系图上的任意位置来更改 bin_interval 值, 并在对话框中输入新的 bin_interval 值。该程序将使用间隔的新值重绘数据。若要接受 bin_interval 值, 请在关系图上的任意位置单击左键.
- 程序将重新绘制数据, 并显示前五天的活动。在此图中, 单击将在分析中使用的第一个 M 峰值 (有时需要跳过一或两天).
注意: 该程序将重新绘制的图形从采摘的早晨峰值开始。蓝色和红色线将根据步骤2.4 中确定的期间分别显示 E 峰值和第二天 M 峰值的大致位置. - 在同一图形上, 为数据的初步拟合选择数据与模型: 单击以下点 (按此顺序; 请注意, 单击的位置将在底部显示一个红星): (i) M 峰值的顶部;(ii) M 峰值的结束;(iii) 电子山顶的开始;(iv) 山顶;(v) 电子山顶的终点;(vi) 第二天最高的 M 峰值.
- 请注意, 该程序现在显示了功率谱.
注意: x 轴现在是以频率给定的。- 在打开的窗口中使用功率谱, 选取将用于拟合模型功率谱的解析表达式的点。在步骤2.4 中检测到的期间标记为红色线。要选取拟合点, 首先粗略确定主周期, 类似于步骤2.4。然后使用滑块, 微调主周期值, 以便在移动滑块后显示的管接头点 (以红色圆圈显示) 将关闭到峰值值.
- 在视觉峰值选择之后, 单击并 #34; 接受和 #34; 该程序将与分析表达式的选取点配合以计算模型参数.
- 请注意, 参数和频谱拟合错误保存到文件和 #34; model_fit_parameters. txt 和 #34;; 该程序将另外保存2数字与适合的运动数据和它的功率谱.
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Representative Results
这里提出的方法可以量化的主要特点, 在飞行的运动模式。量化是通过将活动数据与由四指数术语组成的模型拟合来实现的:
该模型具有描述活动模式的九独立参数。参数 bmd、bMR、bED、和 bER分别定义了晨衰 (md)、晨升 (mr)、夜间衰变 (ED) 和傍晚上升 (ER) 的速率。参数 t0定义了昼夜节律周期, tm和 te定义 m 和 e 峰值的宽度, hm和 he定义 m 和 e 峰值的高度。
参数的值是从几个步骤 (图 2) 中的未筛选数据获得的。首先, 确定了活动功率谱 (协议步骤 2.4) 的昼夜周期。然后, 通过拟合 F (t) (协议步骤 2.5-2.6), 从运动记录中提取初始参数值。这些值用作拟合数据功率谱的初始猜想, 其分析表达式为8 (引用8中的附加文件 1), 方法是采用 F (t) 的傅立叶变换:
其中 tn = t0/n, 与 n = 12, 3... 和 T0是昼夜周期 (协议步骤 2.7-2.8)。利用频谱拟合, 从无滤波或分的飞行运动中提取模型参数。功率谱的拟合为模型参数生成最终值, 然后用于构造 F (t) 的最终形式,即即, 即飞行运动节律的模型。
在模型中, b 参数可以是负或正, 这反映了相应的指数项的曲率。当指数为凹时, 参数 bMD和 bER是正数, 而参数 bMR和ED是正数, 当指数为凹和负时,指数是凸的。一般而言, 对于描述 M 峰值的指数, b 参数的增加表示慢升或衰减, 而对于描述 E 峰值的指数, b 参数的增加表示更快的上升或衰减。
图 3显示了此算法所获得的合适的示例。谱峰在 t0和谐波从 t0/2 到 t0/10 都装有 (图 3A)。其他谐波通常有高度低于意义级别的 0.05, 因此没有使用的分析。从频谱拟合得到的参数用于构造飞行运动的模型 (图 3B, 红色)。该方法既适用于野生类型苍蝇 (图 3、顶部面板), 又可用于具有更改周期长度 (图 3、中和下面板) 的昼夜突变体。有关模型和底层生物学的其他示例和连接, 请参阅 Lazopulo et al。按照以下顺序将管接头过程中的8结果保存到文件中: bMD、bMR、bER、bED、T0、tM/t0、tE/T0, hM, hE (表 1)。该程序还保存到输出文件的频谱拟合, ' Err ' 的适当误差, 这是计算为一个平方和的残值平方和 (剩余的平方和) 归一化的最大的数据功率谱正方形。
图 1.不同波形的功率谱.根据傅里叶定理, 只有正弦波在功率谱中显示单个峰值, 而更复杂的波形, 如方形或锯齿波, 则在主周期的谐波中显示额外的峰值。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.参数提取算法的示意图表示.最后的参数值是从拟合的功率谱。由于拟合过程可能对起始值很敏感, 因此该算法使用从移动数据计算的初始值, 并使用功率谱对其进行更新。最后的参数值用于构造最能描述数据的 F (t)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3.用模型波形量化飞行运动的方法的代表性结果.(A) 从对功率谱的前十峰值进行拟合, 提取该模型的参数。(B) 获得的参数用于构造活动模型。该方法可应用于野生型蝇 (顶部板) 或突变体与短 (中板) 和长 (底部面板) 昼夜节律。请单击此处查看此图的较大版本.
果蝇基因型 | bMD (1/分钟) | bMR (1/分) | bED (1/分钟) | bER (1/分钟) | T0 (min) | tM/t0 | tE/t0 | HM | HE |
野生型 | 0.0094 | 0.2077 | -0.0383 | 0.0606 | 1438 | 0.1528 | 0.0833 | 5.2238 | 8.7185 |
短暂的昼夜节律突变体 | 0.015 |
表1。从拟合图 3中所示的功率谱中提取的参数的示例。程序将最终参数值输出到 "model_parameters" 文件, 如表中所示。
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Discussion
这项工作给出了使用计算工具的说明, 它提供了对飞行运动模式的定量描述。该工具适用于运动数据与一个数学模型, 由四指数术语, 共同描述的形状和大小的 M 和 E 峰。模型参数的最终值是从拟合数据的功率谱得到的, 在这里, 原始数据的使用可以避免数据分或过滤对参数值施加的 artefactual 影响。模型参数可用于进一步研究飞行运动和引起活动峰的机制。
该管接头的质量可以通过两种方法进行评估: 通过对功率谱拟合的目视观察和使用与参数一起计算的拟合误差 (平方和残差)。影响健身质量的关键因素之一是昼夜周期 T0 (协议步骤 2.8) 的确定。T0的这个值影响了功率谱和模型参数中峰值的估计。影响 fit 质量的另一个关键步骤是选择数据的初步拟合的起始点 (协议步骤 2.7), 因为 tM和 tE值是通过此选择定义的。用户可以通过选择不同的活动天数来定义 tM和 tE来探索多个合适的结果。
我们的模型的重点是模仿良好描述的时钟控制的运动行为与两个突出的活动高峰。这种行为是在光/暗和恒定的黑暗条件下观察到的, 这使得这种方法适用于这两种类型的实验。然而, 该模型并没有考虑到在一些光/暗实验中观察到的光驱动的活动爆发。另一个限制是从提取需要用户输入的模型参数 (协议步骤 2.7-2.9) 中产生的。由于参数 tM、tE和 t0是从用户输入中获得的, 因此应手动分析每个飞行活动。此外, 建议使用该方法与个别活动, 而不是与人口平均记录, 因为平均程序隐藏了许多重要的个人差异, 在飞行运动。虽然它似乎是繁琐的大量苍蝇, 通过单独分析飞行活动, 用户获得有价值的统计信息的程度参数变化在一组动物。为了忽略这些好处, 可以生成一个总体平均值的飞行运动, 并对其进行分析以获得平均参数值。
此工作中使用的模型是我们以前的研究8中波形的改进版本。与前面的模型不同, 它分别为 M 和 E 峰值高度、hm和 hE提供了单独的参数。新的模型可以预见地显示出更好的协议与飞行活动数据, 因为早晨和傍晚高峰通常有不同的高度。
该分析不限于用红外光束技术测量飞行运动。其他方法, 如视频跟踪, 产生了类似的飞行日常活动的模式与 M 和 E 峰显示指数动态上升和衰减9。此处讨论的工具也可以很容易地应用于这些可选的数据集。
这里讨论的方法量化飞行运动记录的目标连接行为输出的基础机制, 调节苍蝇的日常行为和控制双峰活动模式。最近的几项研究旨在识别形成 M 和 E 活动的神经元和基底, 峰值10,11。研究人员操纵了某些神经元群的活动, 并通过观察 E 峰高度和相位的变化, 分析了它们在形成傍晚高峰中的作用。在我们的模型中, 参数 He确定 E 峰值的高度, Te给出峰值宽度, 而参数 bER和ED描述峰值形状。如参考8所述, 在生物化学环境中, HE可能表示神经肽基金和 ITP 水平的测量, 而 bER和 bED可能表示其释放和降解的速率。在未来的研究中, 这些参数可以用于更好地将飞行行为与促进信号联系起来, 从而对飞行节律中的双峰模式进行综合描述。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢斯坦尼斯拉夫·切尔 Lazopulo 对视频内容的帮助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Drosophila Activity Monitor | TriKinetics | DAM2, DAM5 | Measures fly locootion using single infrared beam |
MatLab | Mathworks | Computing environment and programming language, MatLab should include Optimization and Symbolic Math toolboxes | |
Drosophila melanogaster | per[S], per[L], iso31(wild type) | Our analysis can be performed with fly mutants of any circadian period |
References
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