Summary
Представлен метод количественной оценки временные особенности видели в летать суточный ритмы опорно. Количественная оценка достигается путем установки летать деятельность с несколькими параметрической модели сигнала. Параметры модели описывают форму и размер утром и вечером вершины повседневной деятельности.
Abstract
В большинстве животных и растений суточного часы оркестровать поведенческих и молекулярных процессов и синхронизировать их с суточным циклом свето тени. Основные механизмы, которые лежат в основе этой временной контроль широко изучаются с помощью плодовой мушки Drosophila melanogaster в качестве модельного организма. В мух часы обычно изучается, анализируя многодневное опорно-запись. Такая запись показывает комплекс Бимодальная модель с двумя пиками активности: пик утром, что происходит вокруг рассвета и пик вечером, что происходит вокруг закат. Эти две вершины вместе образуют сигнала, который очень отличается от синусоидальные колебания наблюдаются в часы генов, предполагая, что механизмы помимо часы имеют глубокое воздействие на производстве наблюдаемые закономерности в поведенческих данных. Здесь мы предоставляем инструкции по с помощью недавно разработанных вычислительный метод, который математически описываются временные шаблоны летать активности. Метод соответствует деятельности данных с моделью сигнала, который состоит из четырех экспоненциального терминов и девяти независимых параметров, которые полностью описывают форму и размер утром и вечером пиков активности. Извлечения параметров может помочь прояснить кинетические механизмы субстратов, которые лежат в основе часто наблюдаемых Бимодальная деятельности шаблоны в летать двигательного ритма.
Introduction
Суточный часы эндогенного биохимических осциллятор с в течение приблизительно 24 часов и почти повсеместно в животных и растений1,2. Часы помогает синхронизировать внутренние процессы организма и поведение для внешнего света темные цикла. С 1960 года широко изучена генетическая структура суточного часов с помощью плодовой мушки, D. melanogaster. В это насекомое, ядро суточного часов состоит из четырех белков: период, TIMELESS, будильник и цикла. Эти базовые компоненты вместе с другими молекулами формируют петлю обратной связи, которая производит почти синусоидальные колебания будильник генов3,4. Суточный часов в мух широко изучается записи многодневное опорно где летать деятельности обнаруживается с одной инфракрасный луч, пересекая середины отдельные трубки5. Типичная fly запись имеет сложный Бимодальная узор с двумя пиками хорошо различимы: пик утром (М), который начинается в конце ночи и имеет максимум, когда загорается; и вечером пик (E), который начинается в конце дня и имеет максимум, когда свет выключить6. Интересно, что форма таких поведенческих записи очень отличается от простой синусоидальных колебаний, наблюдается на молекулярном уровне, предложив действие дополнительных механизмов, способствующих наблюдаемых временных моделей. Чтобы лучше понять эти скрытые механизмы, мы разработали вычислительных инструмент, который обеспечивает количественное описание временной структуры.
В нашей работе опорно-двигательного ритма определяются в терминах сигнала, который имитирует летать деятельности шаблон. Поскольку простой синусоиды не может использоваться для моделирования наблюдаемые изменения художественной деятельности, мы испытывали различные формы сигнала выберите простой один, которая захватывает все характерные черты видели в записи. Плодовая муха суточного поведение управляется активности нейронов часы, которые часто имеют экспоненциальной модели активации и деактивации7. Экспоненциальная динамика и визуального анализа данных побудило нас создать модель с экспоненциальной термины, состоящий из четырех экспонентов с девяти независимых параметров и напоминающий узор летать деятельности8. Помимо данных, опорно-двигательного аппарата мы также анализируем его мощность спектра. Типичный летать деятельности спектр показывает несколько пиков в гармоник T0/2, T0/3, и т.д., помимо ожидаемых основных пика суточного периода T0. Согласно теореме Фурье только Чистая синусоида производит один пик мощности спектра, в то время как более сложные сигналы показывают нескольких спектральных пиков на гармоник начального периода (рис. 1). Таким образом учитывая несинусоидальных височной шаблон летать деятельности8, мульти пик мощности спектра данных математически ожидалось и не обязательно подразумевает наличие нескольких периодов колебаний. Важно отметить, что спектр мощности сигнала предлагаемой модели также показывает пики на всех гармоник начального периода, похож на лету опорно записи, таким образом подчеркнув высокой верности, с которой наша модель описывает летать данных во времени и частоты.
На время резолюций несколько минут или менее, летать деятельности данных появляется шумные, что делает его трудно извлечь параметры непосредственно из исходных данных. Биннинга данные в более длительные интервалы времени можно уменьшить уровень шума, но, может изменять данные в пути, которые могут повлиять на оценки параметров модели. Мы таким образом получить параметры из спектров питания записей, используя аналитическое выражение для ожидаемой мощности спектры, рассчитывается от Фурье функции модели8 (см. дополнительный файл 1 ссылка8). Этот подход получения параметров от спектров питания дает точные значения без каких-либо дополнительных манипуляций, например биннинга или фильтрации, необработанных данных о деятельности. Математического описания модели и приложений к данным одичал типа и мутантов, описаны в Справочник8. Протокол представил здесь сосредоточена на пошаговые инструкции для использования вычислительных инструмент.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. измерения летать передвижения с помощью дрозофилы активности монитора (Плотина)
Примечание: более подробная ссылка 5.
- Подготовить отдельные летать на одном конце трубы с пищей и хлопок с другой. Конец с пищевой должны быть запечатаны для предотвращения высыхания пищи.
- Положить 5-6 g летать пищи в 50 мл стакан. Порежьте на мелкие кусочки, так что это легче расплава it.
- Подключить 32 отдельных стеклянных трубок с резинкой.
- Расплава еда в стакан путем нагревать его в микроволновую печь на 10-15 с. остановка СВЧ каждые 5 s и тщательно встряхнуть стакан для обеспечения равных плавления пищи.
- , В то время как еда по-прежнему жидкость, положить подготовленные отдельные трубы в стакан с пищей. Переместите трубы вверх и вниз, чтобы они одинаково заполнены.
- Разрешить пищи, чтобы остыть и затвердеть для примерно 1 ч.
- После того, как еда является твердой, удалите трубки с пищей из стакан.
- Уплотнение конца, содержащие пищу с помощью воска. Во-первых тщательно очистить трубу с помощью бумажным полотенцем, затем нажмите трубки против воск. Визуально проверить качество печати и при необходимости повторите уплотнения снова.
- Закройте другой конец трубки с хлопком; хлопка позволит воздух, чтобы пройти через, в то время как сохраняя Муха заперты в трубе.
- Место один летать в каждой индивидуальной трубы и трубы в Плотина. Мониторы
- место в инкубаторе, поддерживающий постоянную температуру и влажность. На основании эксперимента, установите надлежащих условий свет/темно следующим образом.
- Для экспериментов свет/темно мух в свет/темно цикла для всего эксперимента. Не используйте в первый день измерений в анализе.
- Для постоянной темноты экспериментов, сначала мух на два дня в условиях свет/темно нейроволновой синхронизации и синхронизации часов и затем переключиться на постоянной темноты. Не используйте измерения от первого дня постоянной темноты в анализе.
- Собрать по меньшей мере четырех дней данных, которые могут быть использованы в анализе.
Примечание: Система Плотина будет выводить один файл с записью всех мух в мониторе локомоции.
2. Анализ данных
- разделить монитор выходной файл на несколько файлов одного летать деятельности; каждый файл должен быть один столбец ' .txt ' файл с измерением отдельных летать локомоции.
- Выполнения ' ModelFitPS3.m ' функция в окне команды Matlab с следующие входные параметры:
- для samplingrate, установите интервал времени выборки данных в секундах. Например, если каждую минуту измеряли активность, введите 60 как samplingrate.
- Для bin_interval задайте интервал времени в минутах, которые будут сегментирования данных для наглядности; интервал Рекомендуемые бин является 20-30 мин
- Тенденция, введите " 1 " если данные показывают тенденцию базовых и " 0 " иначе; данные с тенденцией будет detrended сначала установку второго порядка Полиномиальные и затем вычитанием из данных.
- В всплывающем окне выберите файл Лети мероприятием.
Примечание: Первый участок является спектра мощности данных и не знакомые активности сюжет. Из печати мощность спектра, определить первичный период T 0: либо нажмите с левой кнопкой мыши на суточный пик, или правой кнопкой мыши на второй гармоники пик (около T 0 / 2). - На участке открытых данных, проверьте, если утром и вечером пики хорошо визуализируются. Если нет, измените значение bin_interval, щелкнув правой кнопкой мыши в любом месте на графике и ввести новое значение bin_interval в диалоговом окне. Программа будет перерисовываться данных новое значение интервала. Чтобы принять значение bin_interval, слева щелкните в любом месте на графике.
- Программа будет снова перерисовать данные и показать первые пять дней деятельности. На этом участке, нажмите на первый пик М, который будет использоваться в анализе (иногда это нужно пропустить один или два дня).
Примечание: Программа будет перерисовываться граф, начиная от взял утром пик. Голубые и красные линии покажет приблизительное положение E пик и следующий день М пик, соответственно, основанный на период, определенный на шаге 2.4. - На одном графике, выбор данных для предварительной подгонки данных с моделью: нажмите на следующее (при этом порядок; Обратите внимание, что расположение нажмите кнопку будет указан с красной звездой на дне): (i) верхней М пик; (ii) конец М пик; (iii) начало E пик; (iv) верхней части E пик; (v) конец E пик; (vi) верхней части пика M следующего дня.
- Отметить, что программа теперь представляет мощность спектра.
Примечание: Ось x теперь приводится в частоте.- В открывшемся окне с мощность спектра, подобрать очки, которые будут использоваться для установки аналитические выражения для спектра мощности модели. Обнаружен в шаге 2.4 период отмечен красной линией. Чтобы выбрать установку точек, сначала примерно определите первичный период, подобный шаг 2.4. Затем с помощью ползунка, тонкой настройки начального периода значение так, чтобы установку точек (показано с красными кругами, появится после перемещения ползунка) будут закрыты до пиковых значений.
- После выбора визуального пик, нажмите " принимаю " и программа будет соответствовать выбранной точки с аналитическое выражение для вычисления параметров модели.
- Обратите внимание, что параметры и спектральные подходят ошибки сохраняются в файл " model_fit_parameters.txtŔ программа будет дополнительно сохранить 2 фигуры с подходит опорно данных и его мощность спектра.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представленные здесь метод позволяет количественного определения основных особенностей в лету локомоции шаблон. Количественная оценка достигается путем установки данных о деятельности с моделью, которая состоит из четырех экспоненциального терминов:
Модель имеет девять независимых параметров, которые описывают деятельность шаблон. Параметры bMD,bMR,bЭди bER определяют темпы утром распада (MD), утром подъем (MR), вечером распада (Эд) и вечером подъем (ER), соответственно. Параметр T0 определяет суточный период, TM и TE определяют ширину вершин M и E и HM и HE определения высот M и E пиков.
Значения параметров получаются из нефильтрованных данных за несколько шагов (рис. 2). Во-первых определяется суточный период деятельности мощность спектра (шаг 2.4 протокол). Затем предварительные параметры значения извлекаются из локомоции, запись, монтаж с F(t) (протокол шаги 2.5-2.6). Эти ценности служат первоначальный угадать для установки данных мощность спектра с аналитическим выражением, полученных8 (дополнительный файл 1 ссылка8), взяв Фурье F(t):
где Tn = T/n0, с n = 1,2,3... и T0 -суточный период (протокол шаги 2,7-2,8). С помощью спектрального fit, параметры модели извлекаются из летать передвижения без фильтрации или сегментирования. Установка мощности спектра производит конечные значения для параметров модели, которые затем используются для создания окончательной формы F(t), т.е., модель fly опорно-ритмов.
В модели параметры b может быть отрицательный или положительный, которые отражают кривизны соответствующего экспоненциального терминов. ПараметрыMD b и bER являются позитивные, когда экспонентов выпуклой и отрицательные когда экспонентов вогнутой, в то время как параметрыMR b и bЭд являются положительными, когда экспонентов вогнутые и отрицательные когда Экспоненты выпуклой. В общем для экспонентов, описывая М пик, увеличение параметра b указывает на медленный рост или распада, и для экспонентов, описывая E пик, увеличение b параметров указывает быстрее подъема или спада.
Рисунок 3 показывает примеры подходит, полученные этим алгоритмом. Оснащены спектральных пиков на T0 и гармоник от T0/2 T0/10 (рис. 3A). Другие гармоники обычно имеют высоту ниже, чем уровень значимости 0,05 и поэтому не используются в анализе. Параметры, полученные из спектральных fit используются для построения модели для fly локомоции (рис. 3Б, красный). Этот метод работает как для дикого типа мух (рис. 3, верхней панели), так и для суточного мутантов с измененной периода длины (рис. 3, средней и нижней панели). Дополнительные примеры и связи между моделью и базовой биологии обратитесь к Lazopulo и др. 8 результаты от процедуры установки сохраняются в файле в следующем порядке: bMD,bMR,bER,bЭд, T0, TM/t0, TE / T0, H,M, HE (Таблица 1). Программа сохраняет выходной файл установки ошибка спектральных fit, «Err», которая рассчитывается как сумма квадратов остатков (остаточная сумма квадратов), нормализуется на площади максимальная мощность спектра данных.
Рисунок 1 . Мощность спектра различных сигналов. Согласно теореме Фурье только синусоиды показывает один пик мощности спектра, в то время как более сложных сигналов, таких как квадратные или пилообразной волны, Показать дополнительные пики гармоник начального периода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Схематическое представление алгоритма параметр извлечения. Последний параметр значения получаются из установки мощность спектра. Поскольку процедура установки может быть чувствительным к начальных значений, алгоритм использует предварительные значения, рассчитанные по данным локомоции и обновляет их, используя мощность спектра. Последний параметр значения используются для создания F(t), наилучшим образом описывающую данные. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Представитель результаты метода, который дает количественную оценку летать двигательный аппарат, с помощью модели сигнала. (A) параметры модели извлекаются из арматура вершины первых десяти мощность спектра. (B) получаемую параметры используются для построения модели деятельности. Этот метод может применяться к дикого типа мух (верхней панели) или мутантов с короткой (средней панели) и долго (нижней панели) циркадные ритмы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| летать генотип | bMD (1/мин) | bг-н (1/мин) | bED (1/мин) | bER (1/мин) | T0 (мин) | TM/t0 | TE/t0 | HM | HE |
| дикого типа | 0.0094 | 0.2077 | -0.0383 | 0.0606 | 1438 | 0.1528 | 0.0833 | 5.2238 | 8.7185 |
| короткие суточного мутант | 0,015 |
Таблицы 1. Пример параметров, извлеченных из установки спектры мощности, показанный на рисунке 3. Программа выводит значения последнего параметра файл «model_parameters.txt», как показано в таблице.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта работа представляет инструкции по использованию вычислительных инструмента, который обеспечивает количественное описание структуры летать локомоции. Средство подходит локомоции данных с математической модели, состоящей из четырех экспоненциального терминов, которые вместе описывают форму и размер M и E пиков. Конечные значения для параметров модели получаются из установки мощности спектра данных, где использование необработанных данных можно избежать артефакта эффекты, которые биннинга или фильтрации данных можно наложить на значения параметров. Параметры модели может затем использоваться для дальнейшего изучения летать локомоции и механизмы, которые порождают пиков активности.
Качество фурнитуры может оцениваться двумя способами: путем визуального наблюдения спектра мощности подходят и, используя установку ошибка (остаточная сумма квадратов), которая рассчитывается вместе с параметрами. Одним из ключевых факторов, которые влияют на качество совпадения является определение суточного периода T0 (протокол шаг 2.8). Это значение T0 влияет на оценку пиков в параметрах мощности спектра и модель. Другой ключевой шаг, который влияет на качество совпадения является выбор отправной точкой для предварительной подгонки данных (протокол шаг 2.7), поскольку TM и TE значения определяются через этот выбор. Пользователь может изучить несколько подходят результаты, выбирая различные дни активности для определения TM и TE.
Наша модель ориентирована на пародирование хорошо описана будильник контролируемых двигательного поведения с двух известных пиков активности. Такое поведение наблюдается как в свет/темно, так и в условиях постоянной темноты, что делает этот подход для этих двух видов экспериментов. Однако модель не принимать во внимание инициативе всплеск активности наблюдается в некоторых экспериментах светлый/Темный свет. Другое ограничение возникает из извлечение параметров модели, требующие ввода пользователя (протокол шаги 2.7-2.9). Поскольку параметры T TE,Mи T0 полученный из пользовательского ввода, каждый летать деятельности должны быть проанализированы вручную. Кроме того рекомендуется использовать метод с отдельными мероприятиями, а не с населением в среднем записи, поскольку процедуры усреднения скрывает многие важные индивидуальные различия в лету локомоции. Хотя это может показаться обременительной для большое количество мух, анализируя летать деятельности индивидуально, пользователь получает ценную статистическую информацию о степени вариации параметров в группе животных. Игнорировать эти преимущества, можно создать населения в среднем летать локомоции и анализировать ее для получения среднего значения.
Модель, используемая в этой работе является улучшенной версией сигнала от наших предыдущих исследований8. В отличие от предыдущей модели она имеет отдельные параметры для M и E пик высот,М H и HE, соответственно. Новая модель предсказуемо показывает лучше соглашение с летать деятельности данных, так как утром и вечером пики, как правило, имеют разную высоту.
Этот анализ не ограничивается летать локомоции, измеренная с инфракрасной техники. Другие методы, такие как видео слежения, производят похожие шаблоны летать повседневной деятельности с M и E пиков, показаны экспоненциального динамика подъем и упадок9. Инструмент, обсуждаемые здесь легко может применяться для этих альтернативных наборов данных, а также.
Обсуждаемые здесь метод дает количественную оценку летать опорно записей с целью подключения поведенческих вывода основных механизмов, которые регулируют летать ежедневно поведение и контролировать Бимодальная активности шаблон. Несколько недавних исследования, направленные на выявление нейронов и субстраты что форма M и E деятельность пики10,11. Следователи манипулировать деятельностью некоторых нейронов групп и проанализированы их роль в формировании пик вечером, наблюдая изменения в высоте и фазы E пик. В нашей модели параметры HE определяет высоту E пик, ТЕ дает ширина пика, и параметры bER и bЭд описывают пик формы. Как указано в ссылка8, в биохимических контексте HE может указать меру уровней Нейропептиды НПФ и ITP, в то время как bER и bЭд может представлять показатели их освобождения и деградации. Вместе, эти параметры могут быть использованы в будущем исследования лучше подключить летать поведение с neuromodulatory, сигнализации, к Комплексное Описание бимодального моделей в летать двигательного ритма.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарны Станислав Lazopulo за помощь с видео контента.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Activity Monitor | TriKinetics | DAM2, DAM5 | Measures fly locootion using single infrared beam |
| MatLab | Mathworks | Computing environment and programming language, MatLab should include Optimization and Symbolic Math toolboxes | |
| Drosophila melanogaster | per[S], per[L], iso31(wild type) | Our analysis can be performed with fly mutants of any circadian period |
References
- Pittendrigh, C. S. Circadian systems: general perspective. Biological Rhythms. II, 57-80 (1981).
- Zhang, E. E., Kay, S. A. Clocks not winding down: unravelling circadian networks. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (11), 764-776 (2010).
- Tataroglu, O., Emery, P. The molecular ticks of the Drosophila circadian clock. Curr Opin Insect Sci. 7, 51-57 (2015).
- Plautz, J. D., et al. Quantitative analysis of Drosophila period gene transcription in living animals. J Biol Rhythms. 12 (3), 204-217 (1997).
- Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying locomotor activity to study circadian rhythms and sleep parameters in Drosophila. J Vis Exp. (43), e2157 (2010).
- Helfrich-Förster, C. Differential control of morning and evening components in the activity rhythm of Drosophila melanogaster--sex-specific differences suggest a different quality of activity. J Biol Rhythms. 15 (2), 135-154 (2000).
- Dautzenberg, F. M., Neysari, S. Irreversible binding kinetics of neuropeptide Y ligands to Y2 but not to Y1 and Y5 receptors. Pharmacology. 75 (1), 21-29 (2005).
- Lazopulo, A., Syed, S. A mathematical model provides mechanistic links to temporal patterns in Drosophila daily activity. BMC Neuroscience. 17 (1), 14 (2016).
- Donelson, N., Kim, E. Z., Slawson, J. B., Vecsey, C. G., Huber, R., Griffith, L. C. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. PloS ONE. 7 (5), e37250 (2012).
- Schlichting, M., et al. A Neural Network Underlying Circadian Entrainment and Photoperiodic Adjustment of Sleep and Activity in Drosophila. J Neurosci. 36 (35), 9084-9096 (2016).
- Guo, F., et al. Circadian neuron feedback controls the Drosophila sleep-activity profile. Nature. 536 (7616), 292-297 (2016).
