Summary
On présente une méthode pour quantifier les principales caractéristiques temporelles vus voler rythmes locomotrice circadienne. La quantification est réalisée par montage mouche activité avec une forme d’onde modèle multi paramétrique. Les paramètres du modèle décrivent la forme et la taille du matin et les sommets de la soirée de l’activité quotidienne.
Abstract
Dans la plupart des animaux et des plantes, horloges circadiennes orchestrent les processus comportements et moléculaires et les synchronisent au quotidien cycle lumière-obscurité. Les mécanismes fondamentaux qui sous-tendent ce contrôle temporel sont largement étudiés à l’aide de la drosophile Drosophila melanogaster comme un organisme modèle. Chez les mouches, l’horloge est généralement étudié en analysant plusieurs jours enregistrement locomotrice. Une telle inscription montre un schéma complexe bimodal avec deux pics d’activité : une pointe du matin qui se passe autour de l’aube et un pic de la soirée qui se passe autour de crépuscule. Ces deux pics forment une forme d’onde qui est très différent des oscillations sinusoïdales observée dans les gènes de l’horloge, ce qui suggère que les mécanismes en plus de l’horloge ont des effets profonds en produisant les tendances observées dans les données comportementales. Ici nous fournissent des instructions sur l’utilisation d’une méthode de calcul développée récemment que mathématiquement décrit les tendances temporelles dans l’activité de mouche. La méthode s’adapte à des données d’activité avec une forme d’onde du modèle qui se compose de quatre termes exponentiels et neuf paramètres indépendants qui décrivent parfaitement la forme et la taille du matin et les soirée pics d’activité. Les paramètres extraits peuvent aider à élucider les mécanismes cinétiques des substrats qui sous-tendent les patrons d’activité bimodal fréquemment observés dans les rythmes locomotrices mouches.
Introduction
L’horloge circadienne est un oscillateur endogène biochimique avec une période d’environ 24 heures et est presque omniprésent chez les animaux et plantes1,2. L’horloge permet de synchroniser les processus internes de l’organisme et le comportement au cycle noir lumière externe. La structure génétique de l’horloge circadienne a été largement étudiée depuis les années 1960 à l’aide de la mouche à fruit, d. melanogaster. Chez cet insecte, le noyau de l’horloge circadienne est constitué de quatre protéines : période, TIMELESS, horloge et CYCLE. Ces éléments de base ainsi que d’autres molécules forment une boucle de rétroaction qui produit des oscillations sinusoïdales près horloge gènes3,4. L’horloge circadienne chez les mouches est largement étudié en utilisant des enregistrements de locomotrices plusieurs jours où l’activité mouche est détectée avec un seul faisceau infrarouge traverse au milieu de chaque tube5. Une mouche typique d’enregistrement a un patron bimodal complexe avec deux pics bien distinctes : de pointe du matin (M) qui commence à la fin de la nuit et a un maximum lorsque les lumières s’allument ; et le pic de soir (E) qui commence à la fin de la journée et a un maximum lorsque lumières coupe6. Fait intéressant, la forme de cet enregistrement comportemental est très différente des oscillations sinusoïdales simples observées à l’échelle moléculaire, ce qui suggère l’action d’autres mécanismes qui contribuent aux tendances temporelles observées. Pour mieux comprendre ces mécanismes cachés, nous avons développé un outil de calcul qui fournit une description quantitative des tendances temporelles.
Dans notre travail, rythmes locomoteurs sont définis par une forme d’onde qui imite le modèle d’activité mouche. Étant donné que les ondes sinusoïdales simples ne peuvent servir à modéliser les changements rythmiques observés en activité, nous avons testé différentes formes de signaux pour sélectionner le plus simple qui capture toutes les caractéristiques saillantes dans les enregistrements. Mouche des fruits circadienne comportement est contrôlé par l’activité des neurones d’horloge qui ont souvent des modèles exponentiels de l’activation et la désactivation7. La dynamique exponentielle et l’analyse visuelle des données nous motivés pour construire un modèle avec des termes exponentiels consistant en quatre exposants avec neuf paramètres indépendants et ressemblant étroitement à l’activité fly modèle8. En plus des données locomotrices, nous analysons également son spectre de puissance. Spectre d’activité mouche typique montre plusieurs pics harmoniques T02, T03, etc., en plus du pic fondamentaux attendu à la période circadienne T0. Selon le théorème de Fourier, seulement une onde sinusoïdale pure produit un seul pic dans les spectres de puissance, alors que les signaux plus complexes présentent plusieurs pics spectraux aux harmoniques de la période primaire (Figure 1). Par conséquent, étant donné le modèle temporel non sinusoïdale en activité mouche8, un spectre de puissance multi-pointe des données devrait mathématiquement et n’implique pas nécessairement la présence de multiples périodes d’oscillation. Ce qui est important, le spectre de puissance de l’onde du modèle proposé montre également pics à toutes les harmoniques de la période primaire, semblable aux mouches enregistrements locomotrices, soulignant ainsi la haute fidélité avec laquelle notre modèle décrit les données mouches en temps et en fréquence.
Avec des résolutions de temps de quelques minutes ou moins, l’activité mouche données semble bruyantes, rendant difficile d’extraire les paramètres directement à partir de données brutes. Binning données dans des intervalles de temps plus longs peuvent réduire le niveau de bruit, mais, peuvent modifier les données d’une manière qui peut influer sur l’estimation des paramètres du modèle. Nous obtenons donc les paramètres des spectres de puissance des relevés, à l’aide d’une expression analytique pour les spectres de puissance prévue, calculées à partir de la transformée de Fourier de la fonction modèle8 (voir fiche supplémentaire 1 de référence8). Cette approche d’obtenir paramètres à partir des spectres de puissance donne des valeurs de paramètre précise sans aucune manipulations supplémentaires, tels que binning ou de filtrage, des données brutes de l’activité. Des détails mathématiques du modèle et des applications aux données de type sauvage et les mutantes sont décrites dans référence8. Le protocole présenté ici se concentre sur les étapes à suivre pour utiliser l’outil informatique.
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Protocol
1. mesurant Fly Locomotion utilisant drosophile activité moniteur (DAM)
Remarque : pour plus de détails, voir référence 5.
- Prepare individuel voler des tubes avec de la nourriture à une extrémité et de coton sur l’autre. La fin avec les aliments doit être étanches pour éviter que les aliments ne se dessèchent pas.
- Mettre 5-6 g d’aliment mouche dans un bécher de 50 mL. Coupez les aliments en petits morceaux pour qu’il soit plus facile à fondre it.
- 32 raccorder des tubes de verre individuels avec une bande élastique.
- Fondre les aliments dans le bol en le chauffant dans un four à micro-ondes pour 10-15 s. Stop au micro-ondes tous les 5 s et agiter prudemment le bécher pour assurer la fusion égal de nourriture.
- Alors que la nourriture est encore liquide, mettre les tubes individuels disposés dans le bécher avec de la nourriture. Les tubes de monter et descendre donc ils sont tout aussi remplis.
- Autoriser la nourriture de refroidir et se solidifier pour environ 1 h.
- Une fois les aliments solides, retirer les tubes avec la nourriture du bécher.
- Sceller la fin contenant de la nourriture à l’aide de cire. Tout d’abord, nettoyer soigneusement un tube à l’aide d’une serviette en papier, puis appuyez sur le tube contre la cire. Visuellement vérifier la qualité du joint et le cas échéant, répétez l’étanchéité nouveau.
- Fermer l’autre extrémité du tube avec du coton, coton permettra de traverser tout en gardant une mouche enfermée dans le tube de l’air.
- Placer une mouche unique dans chaque tube individuel et placer les tubes dans le barrage de. Moniteurs de
- Place dans un incubateur qui maintient l’humidité et température constante. Basé sur l’expérience, définir les bonnes conditions de lumière/obscurité comme suit.
- Pour des expériences de lumière/obscurité Gardez les mouches dans cycle lumière/obscurité pour l’expérience entière. N’utilisez pas le premier jour des mesures dans l’analyse.
- Pour des expériences de l’obscurité totale, tout d’abord garder les mouches pendant deux jours dans des conditions de lumière/obscurité pour l’entraînement et la synchronisation des horloges et passera ensuite à l’obscurité totale. Ne pas utiliser les mesures dès le premier jour de l’obscurité totale dans l’analyse.
- Recueillir au moins quatre jours de données qui peuvent être utilisées dans l’analyse.
Remarque : Le système de barrage va afficher un seul fichier avec un enregistrement de locomotion de toutes les mouches dans le moniteur de.
2. Analyse des données
- Split fichier de sortie de l’écran en plusieurs fichiers de la seule activité de mouche, chaque fichier doit être une colonne unique ' .txt ' fichier avec une mesure individuelle de locomotion mouche.
- Run ' ModelFitPS3.m ' fonction dans une fenêtre de commande de Matlab avec les paramètres d’entrée suivants :
- pour samplingrate, définissez l’intervalle d’échantillonnage des données en quelques secondes. Par exemple, si l’activité a été mesurée à chaque minute, entrez 60 comme le samplingrate.
- Pour bin_interval, définissez l’intervalle de temps en minutes auquel les données vont être mis en cellule pour meilleure visualisation ; l’intervalle bin recommandée est de 20-30 min.
- Pour la tendance, entrez " 1 " si les données montrent l’évolution de base et " 0 " autrement ; données avec tendance vont être redressées tout d’abord par montage un polynôme de second ordre et il en soustrayant ensuite les données.
- Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez un fichier de seule activité mouche.
Remarque : La première parcelle est spectre de puissance de données et pas le tracé de l’activité familière. Dans le spectre de puissance tracés, déterminer la période primaire T 0 : cliquez avec le bouton gauche de la souris sur le pic du rythme circadien, ou avec le bouton droit de la souris sur le second pic harmonique (autour de T 0 / 2). - Sur le tracé de données ouvert, vérifiez si le matin et les sommets de la soirée sont bien visualisées. Si ce n’est pas le cas, modifiez la valeur de bin_interval par un clic droit n’importe où sur le graphique et l’entrée de la nouvelle valeur de bin_interval dans la boîte de dialogue. Le programme va redessiner les données avec la nouvelle valeur de l’intervalle. Pour accepter la valeur de bin_interval, à gauche cliquez n’importe où sur le graphe.
- Le programme va redessiner les données à nouveau et montrer les cinq premiers jours d’activité. Sur ce terrain, cliquez sur le premier pic de M qui est utilisé dans l’analyse (parfois il est nécessaire de sauter une ou deux journées).
NOTE : Le programme va redessiner le graphique à partir de la pointe du matin cueillies. Les lignes bleues et rouges indique la position approximative de la E PIC et de la prochaine journée M pic, respectivement, selon la période déterminée à l’étape 2.4. - Sur le même graphique, choisir les données pour un ajustement préliminaire des données avec le modèle : cliquez sur les points suivants (dans cet ordre ; Notez que l’emplacement du clic sera indiquée avec une étoile rouge sur le fond) : le sommet de (i) haut de M ; (ii) la fin du sommet de la M ; (iii) début du pic E ; (iv) haut de la crête E ; (v) la fin du sommet de la E ; (vi) Sommet du pic du lendemain M.
- Notez que le programme présente maintenant le spectre de puissance.
Remarque : L’axe des x est maintenant donné en fréquence.- Dans la fenêtre ouverte avec le spectre de puissance, choisir les points qui seront utilisés pour le montage de l’expression analytique pour le spectre de puissance de modèle. La période détectée à l’étape 2.4 est marquée par une ligne rouge. Pour sélectionner des points de fixation, tout d’abord déterminer approximativement la période primaire, semblable à l’étape 2.4. Puis en utilisant le glisseur, peaufiner la période primaire de valeur pour que le raccord pointe (montré avec les cercles rouges, apparaîtra après avoir déplacé le curseur) sont fermés à des valeurs crête.
- Après la sélection visuelle maximale, cliquez sur " Accept " et le programme s’adaptera à des points choisis avec l’expression analytique pour calculer les paramètres du modèle.
- Notez que les paramètres et l’erreur de forme spectrale sont enregistrés dans le fichier " model_fit_parameters.txtŔ le programme permettra en outre d’économiser 2 chiffres avec des ajustements des données locomotrices et son spectre de puissance.
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Representative Results
La méthode présentée ici permet la quantification des principales caractéristiques en jacquard de locomotion mouche. La quantification est réalisée en ajustant les données d’activité avec un modèle qui se compose de quatre termes exponentiels :
Le modèle a neuf paramètres indépendants qui décrivent le modèle d’activité. Les paramètres bMD,b,M.,bEDet bER définir les taux de décroissance de matin (MD), lieu de matin (M.), soirée de désintégration (ED) et soirée montée (ER), respectivement. Paramètre T0 définit la période circadienne, TM et TE définissent les largeurs des pics M et E et H,M et HE définissent des hauteurs de pics M et E.
Valeurs des paramètres sont obtenus à partir des données non filtrées en quelques étapes (Figure 2). Tout d’abord, une période circadienne du spectre de puissance de l’activité (étape 2.4 de protocole) est déterminée. Ensuite, les valeurs de paramètres préliminaires sont extraites de la locomotion enregistrement de montage avec le f (t) (pas de protocole 2.5-2.6). Ces valeurs servent d’estimation pour le montage le spectre de puissance de données avec une expression analytique dérivée en8 (fichiers supplémentaires 1 référence8) en prenant la transformée de Fourier de f (t) :
où Tn = T0/n, avec n = 1,2,3... et T0 correspond à la période circadienne (protocole étapes 2,7-2,8). En utilisant la forme spectrale, les paramètres du modèle sont extraites de locomotion mouche sans filtrage ni binning. Montage de la gamme de puissance produit finales valeurs pour les paramètres de modèle, qui sont ensuite utilisés pour construire la forme finale de f (t), c'est-à-dire, le modèle de mouches rythmes locomotrices.
Dans le modèle, b paramètres peuvent être soit négative ou positive, qui reflètent la courbure des termes exponentielles correspondantes. Les paramètres bMD et bER sont positifs lorsque les exposants sont convexes et négatifs lorsque les exposants sont concaves, alors que les paramètres bM. et bED sont positifs lorsque les exposants sont concaves et négative quand le les exposants sont convexes. En général, pour les exposants décrivant le PIC M, l’augmentation dans les paramètres b indique plus lente montée ou à la décomposition, et pour les exposants qui décrit le sommet E, l’augmentation des paramètres b indique plus rapide montée ou à la décomposition.
La figure 3 montre des exemples d’ajustements obtenus par cet algorithme. Les pics spectraux à T0 et harmoniques de T02 T010 sont équipés (Figure 3 a). Autres harmoniques en général ont des hauteurs plus bas que le niveau de signification de 0,05 et ne sont donc pas utilisées dans l’analyse. Paramètres obtenus à partir de la forme spectrale servent à construire un modèle de mouche locomotion (Figure 3 b, rouge). La méthode fonctionne pour les mouches de type sauvage (Figure 3, panneaux supérieure) et circadiennes mutants avec des longueurs de période altérées (Figure 3, les panneaux de milieu et du bas). Pour obtenir des exemples supplémentaires et les connexions entre le modèle et la biologie sous-jacente, consulter Lazopulo et al. 8 les résultats de la procédure d’ajustement sont enregistrées dans un fichier dans l’ordre suivant : bMD,b,M.,bER,bED, T0, TM/t0, TE / T0, H,M, HE (tableau 1). Le programme enregistre également dans le fichier de sortie l’erreur de raccord de l’ajustement spectrale, « Err », qui est calculé comme une somme des carrés des résidus (somme résiduelle des carrés) normalisés par le carré d’au maximum le spectre de puissance de données.
Figure 1 . Les spectres de différentes formes d’onde de puissance. Selon le théorème de Fourier, seulement une onde sinusoidale montre un pic unique dans un spectre de puissance, tandis que des signaux plus complexes, comme la vague carrée ou en dents de scie, montrent des pointes supplémentaires aux harmoniques de la première période. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Représentation schématique de l’algorithme d’extraction de paramètre. Les valeurs de paramètre final sont obtenus à partir de raccord le spectre de puissance. Étant donné que la procédure d’ajustement peut être sensible à des valeurs de départ, l’algorithme utilise des valeurs calculées à partir des données de locomotion et les met à jour en utilisant le spectre de puissance. Les valeurs de paramètre final sont utilisées pour construire f (t) qui décrit le mieux les données. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Des résultats représentatifs de la méthode qui quantifie volent locomotion en utilisant une forme d’onde modèle. (A) des paramètres du modèle sont extraites de montage les dix premiers pics du spectre de la puissance. (B) les paramètres obtenus sont utilisés pour construire un modèle d’activité. La méthode peut être appliquée pour les mouches de type sauvage (panneaux supérieure) ou de mutants à court (panneaux de moyenne) et longtemps les rythmes circadiens (panneaux inférieurs). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| voler le génotype | bMD (1/min) | bMonsieur (1/min) | bED (1/min) | bER (1/min) | T0 (min) | TM/t0 | TE/t0 | HM | HE |
| type sauvage | 0,0094 | 0.2077 | -0.0383 | 0.0606 | 1438 | 0.1528 | 0,0833 | 5.2238 | 8.7185 |
| mutant circadienne court | 0,015 |
Tableau 1. Exemple de paramètres extraits de montage les spectres de puissance, illustrés à la Figure 3. Le programme renvoie les valeurs de paramètre final au fichier « model_parameters.txt » comme indiqué dans le tableau.
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Discussion
Cet ouvrage présente des instructions pour l’utilisation d’un outil de calcul qui fournit une description quantitative du motif de locomotion mouche. L’outil adapté locomotion données avec un modèle mathématique consistant en quatre termes exponentiels qui ensemble décrivent la forme et la taille des sommets M et E. Les valeurs finales pour les paramètres du modèle sont obtenus à partir de montage les spectres de puissance des données, où l’utilisation des données brutes peut éviter des effets artéfactuelles données binning ou filtrage peuvent imposer des valeurs de paramètres. Les paramètres du modèle peuvent ensuite servir à encore étude de locomotion mouche et les mécanismes qui donnent lieu à des pics d’activité.
La qualité de l’ajustement peut être évaluée de deux façons : par l’observation visuelle du spectre pouvoir s’adapter et à l’aide de l’erreur de raccord (somme résiduelle des carrés) qui est calculée avec les paramètres. Un des facteurs clés qui influencent la qualité fit est la détermination de la période circadienne T0 (pas de protocole 2.8). Cette valeur de T0 sur l’estimation des pics dans les paramètres de modèle et spectre de puissance. Une autre étape clé qui influe sur la qualité d’ajustement est la sélection de point de départ pour un ajustement préliminaire des données (étape de protocole 2,7), depuis TM et TE valeurs sont définies par le biais de cette sélection. L’utilisateur peut explorer plusieurs bon résultats en choisissant différents jours d’activité pour définir TM et TE.
Notre modèle vise à imiter le comportement locomoteur bien décrite clock contrôlé avec deux pics importants de l’activité. Ce comportement est observé dans des conditions d’obscurité totale, tant en lumière/obscurité qui rend l’approche applicable à ces deux types d’expériences. Toutefois, le modèle ne prend pas en compte la lumière conduit sursaut d’activité observé dans certaines expériences de lumière/obscurité. Une autre limitation provient de l’extraction des paramètres du modèle nécessitant l’entrée d’utilisateur (pas de protocole 2,7 à 2,9). Étant donné les paramètres TMTEet T0 sont obtenus à partir de l’entrée d’utilisateur, chaque activité mouche il faudrait analyser manuellement. En outre, il est recommandé d’utiliser la méthode avec les activités individuelles plutôt qu’avec un enregistrement était en moyenne de la population, car la procédure de calcul de la moyenne cache de nombreuses différences individuelles importantes dans la locomotion mouche. Bien que cela puisse paraître lourd pour grand nombre de mouches, en analysant les activités mouches individuellement, l’utilisateur obtient des informations statistiques utiles sur le degré de variation du paramètre au sein d’un groupe d’animaux. Pour ignorer ces avantages, il est possible de générer une locomotion mouche était en moyenne de la population et de l’analyser pour obtenir les valeurs de paramètre moyen.
Le modèle utilisé dans ce travail est une version améliorée de notre précédente recherche8formes d’ondes. Contrairement à son prédécesseur, il a des paramètres distincts pour les hauteurs de pics M et E, H,M et HE, respectivement. Le nouveau modèle de montre prévisible meilleur accord avec les données d’activité mouche, puisque le matin et les sommets de la soirée en général ont des hauteurs différentes.
Cette analyse n’est pas limitée à voler locomotion mesurée avec la technique du faisceau infrarouge. Autres méthodes, comme la vidéo-tracking, produisent des phénomènes semblables d’activité quotidienne mouche avec des pics M et E affichage dynamique exponentielle de montée et la décomposition9. L’outil discuté ici peut être facilement appliqué à ces ensembles de données alternatives aussi bien.
La méthode décrite ici quantifie mouches enregistrements locomotrices dans le but de brancher la sortie comportementale à des mécanismes sous-jacents qui régulent voler le comportement quotidien et contrôler le modèle d’activité bimodal. Plusieurs études récentes visant à identifier les neurones et les substrats cette forme M et activité E pics10,11. Les enquêteurs manipulé l’activité de certains groupes neurones et analyser leur rôle dans la formation de la crête de la soirée en détectant les variations dans la hauteur et la phase du pic E. Dans notre modèle, les paramètres HE détermine la hauteur du pic E, TE donne la largeur du PIC et paramètres bER et bED décrivent la forme de pic. Comme indiqué dans la référence8, dans un contexte biochimique HE peut indiquer la mesure des niveaux de neuropeptides FNP et ITP, tandis que bER et bED peuvent représenter les tarifs de leur libération et leur dégradation. Ensemble, que ces paramètres peuvent être utilisés à l’avenir des études pour mieux relier comportement mouche avec neuromodulatrices signalisation, vers une description intégrée des modèles bimodales mouche rythmes locomotrice.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à Stanislav Lazopulo pour obtenir de l’aide du contenu vidéo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Activity Monitor | TriKinetics | DAM2, DAM5 | Measures fly locootion using single infrared beam |
| MatLab | Mathworks | Computing environment and programming language, MatLab should include Optimization and Symbolic Math toolboxes | |
| Drosophila melanogaster | per[S], per[L], iso31(wild type) | Our analysis can be performed with fly mutants of any circadian period |
References
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