Summary
シーケンスの生体分子のナノ細孔技術、幅広い病原体、食品安全監視、ゲノム解析、metagenomic 環境の監視、および細菌の特性の識別を含む生命科学で抗生物質耐性。この記事でメタゲノム土壌 DNA 塩基配列ナノ細孔シーケンシング技術を使用して種の同定をする手順について説明します。
Abstract
土壌、調製とナノ細孔のフロー ・ セルの使用およびコンピュータ ・ ソフトウェアを使用して特定の DNA 配列の解析から DNA ライブラリの構築のための手順について説明します。ナノ細孔中の DNA の配列は、細菌やウイルスの種を識別するために急速な微生物ゲノム細菌の緊張の特徴に、抗生物質への耐性を付与する遺伝子の突然変異を検出することができます柔軟な手法です。ナノポア ライフ サイエンス (NS) を配列の利点には、低複雑さ、コストの削減、およびゲノム DNA の精製、PCR 産物、cDNA サンプル、または RNA の迅速なリアルタイム ・ シーケンシング機能があります。NS は、合成高分子系膜に挿入されているナノ細孔を通して単一鎖 DNA の分子を導くことによって DNA シーケンスを含む「鎖シーケンス"の例です。膜を有する個々 の拠点、ナノポアを通過する電流は 4 つのヌクレオチドの塩基によって程度に破壊されるので、それを渡って適用される電流。各ヌクレオチドの同定は、ナノポアを通過するとき、異なる拠点で電流の特徴的な変調を検出することにより発生します。USB 電源ポータブル デバイス、ナノ細孔アレイを含む使い捨てフローセル、NS システムは、ハンドヘルド機の成っています。ポータブル デバイスは読み込み、コンピューターのソフトウェアを使用して DNA のシーケンスを記録する標準的なラップトップ コンピューターに差し込みます。
Introduction
この手順の目的は、シーケンス、ナノポア フロー セル シーケンス デバイスの使用率の環境 DNA ライブラリの準備のために必要な手順を示すとシステム ソフトウェアを使用して生成された DNA シーケンスの解析を実行して土壌中の微生物の種を識別するために国立センター生物工学情報 (NCBI) のバイオインフォマティクス ツール。現在、ほとんどの DNA シーケンスのプラットフォーム技術トレーニングとリソース劣悪環境やフィールド アプリケーションで実現されていない複雑な計測に多大な投資が必要です。ナノ細孔シーケンシング (NS) プラットフォームのコスト、これらの問題を排除簡単にライブラリの準備のプロトコル、およびポータブル デバイスを使用してシーケンスおよび様々 な核酸1,3のさまざまな種類を分析します。修士課程の学生のいくつかの実験室のクラスに NS プラットフォームを組み込みました。
シーケンス生体分子のナノ細孔技術は、細菌やウイルスの病原体1,2,6, 環境生物多様性の識別を含む生命科学の広いアプリケーションを示しています。研究、食品の安全性の監視、ゲノム解析3,5、および細菌の抗生物質耐性4の評価。NS が基づいている主義「シーケンスの繊維」は電気の中断を検出することにより個々 のヌクレオチド塩基の配列によって、電化に挿入されたナノポアを通過する単一鎖 DNA シーケンス核酸を高速かつ正確な方法合成高分子膜。NS、ゲノム断片化、最後修理およびゲノム断片、アダプターとテザー アニーリング dna の 3' dA-テーリングのため DNA の準備手順 DNA ライブラリ精製とナノポア流れ携帯デバイスにライブラリを読み込みます。〜 8 kb のサイズにゲノムの断片化を実現するには、g 管断片化管を通してゲノム DNA の 1-2 μ g を遠心分離します。断片化したゲノムの端は修復し、市販のキットを使用してポリ dA と尾を持ちます。ナノポア モータータンパク質と互換性のある、単一の孤立したアダプターのシーケンスが追加されます (図 1) ナノ細孔を介して DNA シーケンスをガイドに使用される DNA の両端に。テザーのシーケンスは、DNA の浄化および細孔膜への DNA の分子をローカライズするために必要。ヘアピンは、dA 尾ライブラリの 1 つの端にヘアピン アダプターを縛ることによって生成されます。DNA の両端にヘアピン構造 (図 2) ナノポアを通過する DNA センスとアンチセンス鎖の読むことができます。準備のゲノム ライブラリーは、ナノポア フローセル分析のためにサンプルをロードすることによってその後磁場を用いたストレプトアビジン ビーズを用いた反応から浄化されます。
シーケンスの DNA が品質評価し、分析に適した配列読み取り微生物を識別するためにいくつかのバイオインフォマティクスのツールを受けます。シーケンスは、FAST5 形式から FASTQ に「翻訳」。FASTQ 形式でシーケンスを高炉解析で使用できます。
Protocol
注: メタゲノム DNA 市販土壌ゲノム分離を用いた土壌 (ボルティモア郡、メリーランド州) 精製キット (材料の表を参照してください)。紫外線分光光度計を使用して (材料の表を参照)、精製した DNA は 260/280 (nm) の比率を持つ必要があります > 1.8 と 2.0 から 2.2 サンプル確実に比 260/230 汚染物質の無料です。200 NS の範囲に必要な DNA 量 2 μ g に ng。
1. 急な図書館調製法 (短いプロトコル)
注: これは短いプロトコルです。急速なシーケンス キットの材料表を参照してください。
- 薄肉円管 (材料表参照) 200 を追加 0.2 mL の蒸留水の 7.5 μ L のボリュームの決勝での高分子量 DNA の ng。
- 急な図書館準備キットとミックスから優しくインバージョンによる断片化ミックス (FM) の 2.5 μ L を追加します。スピンダウンするパルス遠心分離機 (1,000 x g 5 s)。
- たちにサンプルを配置 (材料の表を参照してください) 30 ° c 1 分後 75 ° C で 1 分間に 1 回の試料のスピンダウンにチューブとパルスの遠心分離機を削除します。
- 急速なアダプターの 1 μ L と鈍/TA リガーゼ マスター ミックスの 0.2 μ L を追加し、氷の上適応と連結ライブラリを格納します。
注: 場合は、手順 8 に進みます短いプロトコルを使用して
2. 結紮シーケンス プロトコル (長い): メタゲノム DNA 断片化
注: は、結紮シーケンス キットの材料表を参照してください。
- 46 μ L の脱イオン水での最終巻に浄化された DNA の 1 μ g を希釈します。
- 転送 DNA 断片化するサンプル (材料の表を参照) を管、室温遠心機を使用して 8,000 × g で 1 分間遠心 (材料の表を参照) ~ 8 kb のゲノム断片を生成します。すべての液体のコレクションの管に渡されていることを確認します。
- 断片化管、遠心分離機、下院に断片化したゲノム DNA を収集するために 1 分間遠心して戻り値を反転します。
- 無菌低 DNA 結合 1.5 mL チューブに断片化したゲノム DNA を転送および分析して断片化を確認する割合が低い agarose のゲル (0.6%) の部分 > 30 kb です。
3. 断片化 DNA 終わり準備
- 800 を使用して 45 μ L の脱イオン水で断片化したゲノム DNA の ng 追加 7 μ L 終わり準備反応バッファー (材料の表を参照)、3 μ L の酵素ミックス (材料の表を参照)、およびヌクレアーゼ フリー水 5 μ。
- 反転とパルスの遠心分離機によるミックス (1,000 x g 5 s)。
- 0.2 mL 薄肉の管にサンプルを転送し、5 分の 65 ° c で 20 の ° C で 5 分間のサンプルをインキュベートします。
- パルス遠心管の底に内容をもたらす。
- 1.5 mL 低 DNA 結合遠心チューブにサンプルを転送します。
- 磁気ビーズ (材料の表を参照) を準備します。ピペッティングで終わり準備反応にステップ 3.5 ミックスからの再懸濁のビーズの 60 μ L を追加します。
- 室温で 5 分間 100 rpm (材料の表を参照) で回転ミキサーに孵化させなさい。
- パルスは、磁石の横にサンプルを配置し、ビーズ、ペレットにサンプルを遠心分離機します。
- ビーズは磁石に付着した、かつての上澄みと破棄をピペットします。
- 作りたての 70% エタノール 200 μ L で磁石と洗浄のビーズからチューブを削除するには、サンプルの上下を軽くピペッティングします。
- パルス遠心するビーズをペレットし、磁石に戻ります。
- 上澄みを除去し、破棄します。200 μ L の 70% のエタノールを使用して洗浄手順を繰り返します。
- パルスは磁石にリターン チューブを遠心し、すべての 70% エタノール洗浄を削除します。
- 遠心チューブのふたが開いたら、室温で 5 分間乾燥空気にビーズを許可します。
- 磁石からチューブを外し、滅菌、ヌクレアーゼ フリー水の 31 μ L でペレットを中断します。常温で 2 分間インキュベートします。
- すべてのビーズ、ペレット、溶出液がクリアまでチューブを磁石に戻ります。
- 溶出液を 1.5 mL 遠心チューブに転送します。260 紫外線分光光度計を使用して端準備中の DNA の定量化 1 μ L のサンプルを使用して nm (材料の表を参照してください)。
注: パーセント回復 〜 70% をする必要があります (700 ng) 1 μ g の DNA の開始の集中から。
4. アダプターとテザーに加えて、終了準備のゲノム DNA のフラグメント
- 反転してすべての鈍/TA リガーゼ マスター ミックス チューブをミックスし、下部に内容をもたらすに遠心分離機をパルスします。
- DNA の端準備中の 30 μ L を使用すると、アダプターのミックスの 20 μ L と鈍/TA 結紮マスター ミックスの 50 μ L を追加します。
- パルスの遠心分離機、反転してミックスし、室温で 10 分間インキュベートします。
5. 磁気Bead の準備
- 渦ビーズと 1.5 mL および microfuge に中断されたビーズの転送 50 μ 管します。
- 溶出液をクリアするまでビーズをペレットに磁石にチューブを置きます。
- 上澄みを除去し、破棄します。
- ビーズ結合バッファーを 100 μ l 添加ビーズ、ビーズ、再懸濁しますに渦に磁石のビーズをペレット、上澄みを除去し、破棄 (ビーズ キットの材料表を参照してください)。100 μ L の結合バッファーで洗浄を繰り返します。
- 洗浄のビーズにビーズ結合バッファーの 100 μ L を追加します。渦にビードを再停止しなさい。
6. ライブラリの浄化
- P200 ピペットを使用して、適応テザーのゲノム DNA を前の手順からビーズの 40 μ L を追加します。ピペッティングで慎重にこのサンプルをミックスします。
- 室温で 5 分間で 100 rpm 回転ミキサーでサンプルをインキュベートします。
- 磁石にサンプルを置き、解決するビーズを許可します。上澄みをピペットおよび破棄します。
- ピペッティングでビーズ結合バッファーの 140 μ L でビーズを再懸濁します。磁石に対してサンプルを置き、上澄みを廃棄ビーズ結合バッファーの 140 μ L 別でもう一度洗います。
- パルスは、チューブを遠心分離機、2 分ペレットから残りのビーズ結合バッファーを削除するため、磁石にチューブを配置します。
7. マグネット ビーズからライブラリの溶出
- 磁気ビーズは、ピペッティングにより 15 μ L の溶出バッファーで再懸濁します。室温で 10 分間のサンプルをインキュベートします。
- ビーズをペレットに磁石に対してチューブを配置します。
注: パーセント回復必要があります 〜 25% (250 ng) 1 μ g の DNA の開始の集中から。
8. 実行/品質管理を開始
- 包装からフローセルを取り外し、ポータブル、リアルタイムのシーケンサーにフローセルを取り付けます (材料の表を参照してください)。
- USB ケーブル経由でコンピューターにシーケンサーを接続し、起動シーケンス ソフトウェア (材料の表を参照してください)。
- シーケンス ソフトウェアを介してデバイスを「接続」をクリックして、"NC_Platform_QC.py"を選択し、「スタート」をクリックします。
- 品質管理 (QC) は完了する約 6-7 分緑の海の見える (出力の領域が大きい) QC 読み出し十分なアクティブな毛穴があることを確認するために (> 800) DNA シークエンシングのため。
9. シーケンス実行の開始
- シーケンス プログラムを開くダイアログ ボックスが表示されます。[サンプル ID] ボックスで、名前のサンプルを実行します。
- "フロー セル ID"ボックスをクリックし、フロー ・ セルの上にステッカーに記載のコードを入力します。
- フロー電池蓋を開くし、サンプル ポート カバーを右にスライドさせて (時計回りに) してサンプル ポートが表示されます。一度のポートが開いて、小さなバブルをチェックしてください。バブルを含むバッファーの数マイクロリットルを削除します。
- センサー アレイ全体のバッファーがあることを確認します。バッファーを搭載した燃料ミックスの 480 μ L を混合することによってプライミング バッファーを作る (RBF-1、材料の表を参照してください) (ミックス必ず徹底的に最初) 520 μ L ヌクレアーゼ フリー水で。
- プライミング ポートにプライミング バッファーの 800 μ L を追加します。慎重にアクセスできるように「生き残る」カバーを持ち上げます。
- 5 分後プライミング ポートにプライミング バッファーの追加 200 μ L を追加します。
10. ライブラリの読み込み
- ライブラリの場所に氷の上次の試薬を準備する前に: RBF-1 シーケンス キット) (から適応し、ライブラリ、およびライブラリのロードのビーズをつないだ (LLB; シーケンス キットから)。
- 0.2 mL の遠心管に RBF の 25.5 μ L と部屋の温度で保たれるヌクレアーゼ フリー水の 12 μ L を追加します。
- 上下ピペッティングで LLB をミックスします。0.2 μ L チューブに LLB の 26.5 μ L を追加します。上下ピペッティングによる試薬を混ぜます。
注: LLB は、混合物の解決する傾向があります。 - 0.2 μ L 管に適応し、つなぎ縄でつながれた図書館の 11 μ L を追加します。パルス遠心分離によって反転してスピン ミックスします。
- 9.4 のステップからの 75 μ L のサンプルを「生き残る」ポートに滴下し追加します。各ドロップは、次を追加する前にポートに流れていることを確認します。
- 慎重に、栓が入港できるようにサンプル ポート カバーを取り付けて、デバイスふた。
11. シーケンス ソフトウェア プロトコル スクリプトを開始
- 「プログラムの選択」下のドロップ ダウン メニューを開き、「48 時間シーケンス」を選択
- スクリプトを起動する「実行」ボタンをクリックします。
- MUX をスキャンでアクティブな毛穴の数の通知ストリームで報告Mux のスキャンの結果を確認します。
注: この数は実行 QC で毛穴の数から異なる場合があり、大きな違いは、問題を示すことがあります。- ある場合 QC 実行からアクティブな毛穴の大幅な削減はソフトウェアを再起動し、有意な差がある場合は、コンピューターを再起動します。
- シーケンス ソフトウェア スクリプトによって報告されるよう、ヒートシンク温度が 34 ° C であることを確認します。
注: 温度は 34 ° C でない場合、あるされません実行十分なアクティブな毛穴です。 - シーケンスの長さが予想されると実験的なデザインの適切なかどうかを判断する読み取りの長さのヒストグラムを確認してください。
- '近くに ' 終了シーケンス ソフトウェア web GUI を閉鎖を使用してデスクトップのエージェントを閉じます。コンピューターからデバイスを取り外します。
12. 実行と結果の解析
注: シーケンスの実行中にデータを監視できますデスクトップ エージェントを使用して、「レポートの表示」プログラムを使用しています。中に実行が完了すると、ファイル、ファイル形式でデータ → 読み取り → フォルダー (既定値) を渡す FAST5 で使用できますか。シーケンスがアクティブな間、このフォルダーが開いている場合、コンピューターがフリーズします。
- 表示し、シーケンスを操作するには、"HDFViewer"をダウンロードします。
- シーケンス ファイルを表示するには、直接開いて HDF ビューアー → オープン データ フォルダー → 選択すべてのファイルの種類 → 選択 c: ドライブ (デフォルト) → 選択 → 選択読み取り → 選択渡す。
- 検索して左のドロップ ダウン メニューに FASTQ ファイルを選択ファイルが開き、FASTQ 形式で保存することができます。
注: 学生実験の目的のため、以上 350 ヌクレオチドのシーケンスは、さらに分析に選ばれました。基本の呼び出しからの出力では、サイズに基づいてシーケンス リードを並べ替えできます。ブラスト (NCBI) やその他の生物情報学プログラムを介して FASTQ ファイルを分析できます。
Representative Results
実験の設計とナノ細孔技術土壌 DNA シーケンス処理する学生のため高速かつ安価な方法を提供します。代表的な実行は、800 以上孔シーケンスに使用可能な品質管理パラメーターを渡されます。5.38 kb の中央値のシーケンスの長さと研究利用可能以上 125,000 の読み取り実行となりました。シーケンスは、品質スコアを与えられているし、許容可能なスコアを持つシーケンスのみを行ったし。シーケンスの出力として反応は FAST5 形式、シーケンスはシーケンスを高炉解析互換性のある FASTQ 形式に変換する HDF ビューアーで表示されたブラスト (NCBI) などのプログラムで受け入れられていないです。将来的にソフトウェアのイテレーション データは HDF ビューアーの必要性を排除 FASTQ 形式として使用できます。参照してください補足数字 1、2、および 3 です。
50 長さ 350 以上のヌクレオチド シーケンスは BLASTN (ヌクレオチド塩基配列データベースに対して) または BLASTX (アミノ酸配列に翻訳のヌクレオチド) による解析の対象となった (NCBI) 土壌試料中の有機体を識別するために。時間を与えられたクラスの制約および実験方法とないバイオインフォマティクスにコースの焦点である、私達はこれらのパラメーター内のシーケンス分析学生があります。私たちの生物情報学のクラスは、パイプライン分析ツールの開発のため、データを使用できます。バイオインフォマティクス解析のこのレベルは、実験室ベースのクラスでは説明しません。表 1より小さい 4 e-04 の e 値と識別された有機体のリストです。通常、4 e-04 未満の e 値は、入力シーケンス (クエリ) と一致したシーケンスの間の強い類似性を示します。(非冗長 (nr) データベース) に対して BLASTN によって識別される生物からさまざまな種があり、さらにゲノム ・ タンパク解析。土壌は、ボルティモア郡、メリーランドの庭から来たのこのサンプルは決して、土壌中に有機体がかもしれないものを決定するための以前のデータがないのでテストされていた。BLASTN (nr データベース) に対して分析分析では、nr データベースでない類似性を持つシーケンスがあったまた示されました。これらは本当に新規シーケンスをあるかどうか、さらなる研究が必要です。BLASTX でいくつかのシーケンス解析は BLASTN 解析で表されていない生物からいくつかのタンパク質を明らかにしました。表 2は、いくつかの可能なタンパク質性エンドペプチグーゼ、Atpase のようなタンパク質などを示します。シーケンスのこのライブラリを使用すると、学生講師が指示された場合は、さらに分析を実行するより高度なバイオインフォマティクスのツールを使用する機会があります。
図 1: ゲノム ライブラリー作製。ナノ細孔を用いたシーケンスの genomic DNA ライブラリの準備のための手順を実行します。この図は、必要なアクセス許可が変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.ナノポアを使用して DNA の配列の模式。DNA は電気信号の生成とベースの識別を持つナノ細孔膜を通過します。この図は、必要なアクセス許可が変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 生物 | e 値 |
| 放線菌由来。 | 3.00 E-06 |
| Nocardoides sp。 | 5.00E-04 |
| Gordonia sp。 | 5.00E-04 |
| 併せ持つ nitrativorens | 1.00E-139 |
| Starkeya ノヴェッラ | 1.00E-31 |
| 併せ持つ系 | 1.00E-30 |
| Fibomicrobium sp。 | 5.00E-17 |
| 緑膿菌 sp。 | 2.00E-15 |
| Rhodothemus marinus | 1.00E-17 |
| Turneiella パルヴァ | 2.00E-24 |
| エシェリヒア属大腸菌 | 0.00 E + 00 |
| 根粒菌 sp。 | 3.00 E-30 |
| Gemmatirosa kalamazoonesis | 1.00E-20 |
| 病菌 sp。 | 8.00E-10 |
| スフィンゴモナス sp。 | 8.00E-10 |
| Cellumonas sp。 | 6.00 E-11 |
表 1: BLASTN 分析の結果を選択します。土壌メタゲノム DNA シーケンス NCBI 非冗長塩基配列データベースに対して BLASTN 類似検索を受けます。報告されたデータは、4 x e-4 以下の e 値を持ちます。
| タンパク質 | 生物 |
| タンパク質 | Acidobacter 菌 |
| サム依存メチルトランスフェラーゼ | H. 系 |
| Atp アーゼ | Jannaschia sp。 |
| エンドペプチダーゼ | 赤痢菌体 |
| 溶解タンパク質 | エシェリヒア属大腸菌 |
表 2: BLASTX 分析の結果を選択します。NCBI の重複を除いた蛋白質データベースに対して BLASTX 類似検索を受ける土壌メタゲノムの DNA 配列。
補足図 1: プラットフォーム QC 結果します。QC のプラットフォームの結果が掲載されています。右上隅で、アクティブな毛穴の QC の結果です。フロー ・ セルの各象限は、アクティブな毛穴のためテストされます。メインのページは動的であり、各象限のテストを変更します。この実行で 1,414 単一毛穴が検出されました。この図の拡大版を表示するのには、ここをクリックしてください。
補足図 2: FASTQ ファイルに変換する FAST5 ファイル。ここで、右側にある、シーケンス実行からデータの出力です。それぞれの行は、個々 のシーケンスを表します。図の左側は、シーケンスを詳しく分析するために使える FASTQ ファイルに変換する HDF ビューアーで右サイドから強調表示されているシーケンスを示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 3: HDF ビューアーで例の FASTQ シーケンス。このシーケンス (読み取り 803) は、ヌクレオチドに FAST5 データを変換する FASTQ ファイル。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
多くの次世代シーケンシング メソッドが生成されている、合成によるシーケンスに依存する各ヌクレオチドを識別する検出プラットフォームごとに異なります。NS、市場に最近加わったまたは標識ヌクレオチド シーケンス反応を必要としない完全に別の方法を使用します。このメソッドは、電化の細孔を通過するときに既に組み込まれたヌクレオチドの料金差の利点を受け取ります。各ヌクレオチドの同定、ナノポアを通過するとき、異なる拠点で電流の変調と発生します。この多重化システムでは、一度に多くの断片をシーケンス処理することができます。DNA の両方の鎖を配列することによってシーケンスの精度は大幅に向上し、シーケンス ソフトウェアは、ラップトップ コンピューターに読み込むことができます、信号を処理し、分析することができますシーケンス情報を提供します。
パイロシークエンス、合成 (SBS) 法によるシーケンス テンプレートに組み込まれて特定の塩基の検出はルシフェラーゼ アッセイと化学発光シグナル8世代に依存します。イオン半導体シーケンスで pH が減少リリースの水素イオンはイオン センサー9によって検出されます。1 分子リアルタイム ・ シーケンシング機能はゼロ モード波ガイド (ZMW)10、法人のヌクレオチドにタグ付きの蛍光分子を検出の照らすに依存します。SBS では、ユニークなメソッドを使用して、一意のシーケンスのクラスターが生成された13ターゲット DNA を増幅します。タグのヌクレオチドの蛍光が記録されたとき、追加されたヌクレオチドの検知が可能します。NS その一方では、他の方法に比べてユニークな利点それ限られた技術的な資源を必要とするポータブル、長いシーケンスの読み取りを生成、事前の DNA 増幅を必要としない、他の方法と比較して低コストで運営することができます。生徒たちは、新しい、急速なライブラリ準備プロトコルが単純で、3 時間授業を受けやすいを発見しました。私たちの問題のいくつかがのフロー ・ セルで泡を削除することは困難であった、重要なコンピューターの電源 (1 テラバイトのストレージ) が必要なデータの現在の出力は、FAST5 ファイル、シーケンス フロー ・ セルがそれの前に限られた棚の生活低下します。さらに、NS の Ligation のシーケンス プロトコル (長いプロトコル) の他の不利な点はそれいくつかのライブラリの準備手順が必要です、分子生物学の技術の専門知識を必要とする、いくつかと比較してときに減らされたシーケンス再現性を生成します配列方法論3。ただし、新しい急速なライブラリの準備キットの最近の進歩はライブラリの準備のため 10 分のみを必要とし、減らされたシーケンス エラー率を示しています。新しいライブラリの製法だった演習クラスでの使用に非常に従う義務があります。
フロー ・ セルの QC で特にプロトコルでは、いくつかの重要な手順があります。これは初期の QC を実行するフロー ・ セルの受領後 5 日以内、8 週間以内にそれらを使用して含まれています。8 週を超えていたフローセルを使用しているが、オープン/アクティブ毛穴の数は大幅に削減されます。流れ細胞を最大限に活用を実現して、タイムラインに合わせて実験を計画することが重要です。洗浄のプロトコルを使用し、成功を収めてフローセルを再利用しました。
土壌微生物の多様性の未開発の遺伝的貯留層を表すメタゲノムを調査しています。たとえば、土壌 1 グラムが 10 間で含んでいると推定される7 - 109原核細胞14。また、土の有機体、新規天然、酵素や抗生物質の主な情報源です。したがって、土壌メタゲノム DNA シーケンス解析は、教育のすべてのレベルで学生のための貴重な教育ツールを表します。NS の技術の使いやすさと低コストをこのシステムの非常に効果的な教育ツールです。学生が環境試料のシーケンスし、シーケンスの完了時に利用可能なバイオインフォマティクスのツールを使用して識別し、検体中の微生物とメタゲノム シーケンスを特徴付けます。NS テクノロジーを使用して、学生があるまで今のうちに到達している実験室のコースで使用する高度な技術的専門知識と他のシーケンスのプラットフォームで試薬、機器、およびメンテナンスはコスト高のため真の実践的な経験。最近、(j. ハリソン、パーソナル通信) 私達の生徒の一人は農耕地土壌の環境モニタリング プロジェクトでこの技術の使用を報告しました。教育空間のこの技術の多くのアプリケーションがあることを見込んでいます。
Disclosures
著者の開示があります。
Acknowledgments
このプロジェクトはサポート部分でジョンズ ・ ホプキンス大学で憲兵のオフィスによって、ゲートウェイ科学イニシアティブ。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermal Cycler | LifeECO | BTC42096 | |
| Covaris g-TUBE | Covaris | 520079 | |
| NEBNext End Repair Module | New England BioLab | E7546 | |
| Eppendorf LoBind Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | |
| NEB Blunt/TA Ligase Master Mix | New England BioLab | MO367 | |
| MyOne C1 Strepavidin Beads | Thermo Fisher | 65001 | |
| Eppendorf microcentrifuge | Eppendorf | Model 5420 | |
| Nanodrop UV spectrophotometer | Thermo Fisher | ND-2000 | Model 2000 |
| Belly Dancer Orbital Shaker | Sigma-Aldrich | Z768499 | |
| Power Soil DNA Isolation Kit | MO BIO | 12888-50 | |
| Ligation Sequencing Kit 2D | Oxford Nanopore | SQK-LSK208 | |
| Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA | Oxford Nanopore | SQK-RAD002 | |
| End-Prep Reaction Buffer and enzyme mix (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix) | New England BioLab | MO367 | |
| AmPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Basic Starter Pack | Oxford Nanopore | Includes MinION Sequencing Device and Flow Cell | |
| MinKNOW software | Oxford Nanopore | ||
| Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA | Oxford Nanopore | SQK-RAD002 | Includes Running Buffer with Fuel (RBF), Fragmentation Mix (FRM) Rapid Adapter (RAD) Library Lodaing Beads (LLB) |
References
- Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).
- Greninger, A. L., et al. Rapid metagenomics identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis. Genome Med. 7, 99 (2015).
- Quick, J., et al. Rapid draft sequencing and real-time nanopore sequencing in a hospital outbreak of Salmonella. Genome Biology. 16, 114 (2015).
- Ashton, P. M., et al. MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of a bacterial antibiotic resistance island. Nat Biotechnol. 33, 296-300 (2015).
- Loman, N. J., Quick, J., Simpson, J. T. A complete bacterial genome assembled de novo. using only nanopore sequencing data. Nat Method. 12, 733-735 (2015).
- Hoenen, T., et al. Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Outbreak Tool. Emerg Infect Dis. 22 (2), 331-334 (2016).
- Petrosino, J. F., Highlander, S., Luna, R. A., Gibbs, R. A., Versalovic, J. Metagenomic pyrosequencing and microbial identification. Clin Chem. 55 (5), 856-866 (2009).
- Cummings, P. J., Ahmed, R., Durocher, J. A., Jessen, A., Vardi, T., Obom, K. M. Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization. J. Vis. Exp. (78), e50405 (2013).
- Rothberg, J. W., et al. An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing. Nature. 475, 348-352 (2011).
- Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations. Science. 299, 682-686 (2003).
- Eid, J., et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323, 133-138 (2009).
- Stoddart, D., Heron, A. J., Mikhailova, E., Maglia, G., Bayley, H. Single-nucleotide discrimination in immobilized DNA oligonucleotides with a biological nanopore. PNAS. 106, 7702-7707 (2009).
- Shendure, J., Hanlee, J. Next generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
- Daniel, R. The Metagenomics of Soil. Nat Rev Microbiol. 3, 470-478 (2005).
