Summary
sequencing के लिए ट्विटर प्रौद्योगिकी जीवन विज्ञान में व्यापक अनुप्रयोगों है, रोगजनकों की पहचान सहित, खाद्य सुरक्षा निगरानी, जीनोमिक विश्लेषण, metagenomic पर्यावरणीय निगरानी, और बैक्टीरियल के लक्षण वर्णन एंटीबायोटिक प्रतिरोध । इस अनुच्छेद में, ट्विटर अनुक्रमण प्रौद्योगिकी का उपयोग प्रजातियों की पहचान के लिए metagenomic मिट्टी डीएनए अनुक्रमण के लिए प्रक्रिया का प्रदर्शन किया है ।
Abstract
यह लेख मिट्टी से एक डीएनए पुस्तकालय के निर्माण के लिए कदम का वर्णन, तैयारी और ट्विटर प्रवाह सेल के उपयोग, और डीएनए का विश्लेषण अनुक्रम कंप्यूटर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर पहचान की । ट्विटर डीएनए अनुक्रमण एक लचीला तकनीक है कि बैक्टीरिया और वायरल प्रजातियों की पहचान करने के लिए तेजी से माइक्रोबियल जीनोम अनुक्रमण के लिए अनुमति देता है, जीवाणु उपभेदों को चिह्नित करने के लिए, और आनुवंशिक परिवर्तन है कि एंटीबायोटिक दवाओं के लिए प्रतिरोध प्रदान का पता लगाने के लिए । जीवन विज्ञान के लिए ट्विटर अनुक्रमण (एनएस) के लाभों को अपनी कम जटिलता, कम लागत, और शुद्ध जीनोमिक डीएनए, पीसीआर amplicons, सीडीएनए नमूनों, या आरएनए के तेजी से वास्तविक समय अनुक्रमण शामिल हैं । एनएस एक सिंथेटिक बहुलक झिल्ली में डाला जाता है कि एक ट्विटर के माध्यम से एक एकल असहाय डीएनए अणु मार्गदर्शक द्वारा अनुक्रमण डीएनए शामिल है जो "किनारा अनुक्रमण" का एक उदाहरण है । झिल्ली एक विद्युत वर्तमान इसे भर में लागू किया गया है, तो के रूप में व्यक्तिगत ठिकानों ट्विटर के माध्यम से गुजरती विद्युत वर्तमान चार न्यूक्लियोटाइड अड्डों द्वारा डिग्री अलग करने के लिए बाधित है । प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड की पहचान विभिन्न ठिकानों द्वारा विद्युत वर्तमान के लक्षण मॉडुलन का पता लगाने के रूप में वे ट्विटर के माध्यम से पारित होता है । एन एस प्रणाली के एक handheld, USB संचालित पोर्टेबल डिवाइस और एक डिस्पोजेबल प्रवाह कक्ष है कि एक ट्विटर सरणी शामिल हैं । पोर्टेबल डिवाइस एक मानक लैपटॉप कंप्यूटर है कि पढ़ता है और कंप्यूटर सॉफ्टवेयर का उपयोग डीएनए अनुक्रम रिकॉर्ड में प्लग ।
Introduction
इस प्रक्रिया का लक्ष्य sequencing, एक ट्विटर फ्लो सेल अनुक्रमण डिवाइस के उपयोग के लिए एक पर्यावरणीय डीएनए पुस्तकालय की तैयारी के लिए आवश्यक कदम का प्रदर्शन करने के लिए है, और प्रणाली सॉफ्टवेयर का उपयोग कर उत्पन्न डीएनए दृश्यों का विश्लेषण करने के लिए और जैव प्रौद्योगिकी सूचना के लिए राष्ट्रीय केंद्र (NCBI) bioinformatics उपकरण मिट्टी में माइक्रोबियल प्रजातियों की पहचान करने के लिए । वर्तमान में, सबसे डीएनए sequencing प्लेटफार्मों संसाधन गरीब वातावरण में या क्षेत्र अनुप्रयोगों में व्यवहार्य नहीं है जो तकनीकी प्रशिक्षण और जटिल उपकरण, में एक प्रमुख निवेश की आवश्यकता है । ट्विटर अनुक्रमण (एन एस) मंच एक लागत प्रभावी, पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए आसान है, और अनुक्रम और न्यूक्लिक एसिड1,3के विभिन्न प्रकार की एक किस्म का विश्लेषण करने के लिए एक पोर्टेबल डिवाइस के साथ इन मुद्दों को समाप्त । हम मास्टर की डिग्री छात्रों के लिए कई प्रयोगशाला कक्षाओं में एन एस मंच शामिल किया है ।
sequencing के लिए ट्विटर प्रौद्योगिकी जीवन विज्ञान में व्यापक अनुप्रयोगों का प्रदर्शन किया है, बैक्टीरियल और वायरल रोगजनकों की पहचान सहित1,2,6, पर्यावरण जैव विविधता अध्ययन, खाद्य सुरक्षा निगरानी, जीनोमिक विश्लेषण3,5, और बैक्टीरियल एंटीबायोटिक प्रतिरोध4के लक्षण वर्णन । NS एक तेजी से और सही विधि न्यूक्लिक एसिड है कि अलग न्यूक्लियोटाइड कुर्सियां जब एकल असहाय डीएनए एक ट्विटर में डाला के माध्यम से गुजरता द्वारा विद्युत व्यवधान का पता लगाने के द्वारा "किनारा अनुक्रमण" के सिद्धांत पर आधारित है के लिए एक विद्युतीकृत सिंथेटिक बहुलक झिल्ली । एन एस के लिए डीएनए तैयार करने में शामिल कदम जीनोम विखंडन, अंत मरंमत और 3 ' दा-जीनोमिक टुकड़े, अनुकूलक और तार एनीलिंग के डीएनए, डीएनए पुस्तकालय शुद्धि के लिए पूंछ, और ट्विटर प्रवाह सेल डिवाइस में पुस्तकालय लोड शामिल है । में जीनोम के विखंडन ~ 8 केबी आकार एक जी के माध्यम से जीनोमिक डीएनए के 1-2 µ जी ट्यूब विखंडन ट्यूब द्वारा पूरा किया है । खंडित जीनोमिक समाप्त होता है तो मरंमत और पाली डीए के साथ पूंछ एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर रहे हैं । एकल असहाय अनुकूलक अनुक्रम, जो ट्विटर मोटर प्रोटीन के साथ संगत कर रहे हैं डीएनए समाप्त होता है जो ट्विटर (चित्रा 1) के माध्यम से डीएनए अनुक्रम मार्गदर्शन करने के लिए उपयोग किया जाता है के लिए जोड़ रहे हैं । तार अनुक्रम डीएनए शोधन के लिए आवश्यक है और ताकना झिल्ली को डीएनए अणुओं स्थानीयकरण के लिए । कांटा दा पुच्छ लायब्रेरी के एक छोर करने के लिए एक कांटा एडेप्टर ligating द्वारा उत्पन्न होता है । डीएनए समाप्त होता है पर कांटा संरचनाओं नब्ज के पढ़ने की अनुमति देता है और डीएनए के रूप में antisense किस्में ट्विटर (चित्रा 2) के माध्यम से गुजरता है । तैयार जीनोमिक पुस्तकालय तो streptavidin मोतियों का उपयोग कर एक चुंबकीय क्षेत्र का उपयोग करके प्रतिक्रिया से शुद्ध है, विश्लेषण के लिए ट्विटर फ्लो सेल में नमूना लोड करने के बाद.
अनुक्रम डीएनए गुणवत्ता और अनुक्रमण है कि विश्लेषण के लिए स्वीकार्य है तो कई bioinformatics उपकरणों के अधीन है रोगाणुओं की पहचान के लिए मूल्यांकन किया जाता है । अनुक्रम एक FAST5 प्रारूप से एक FASTQ में "अनुवाद" कर रहे हैं । FASTQ स्वरूप में, अनुक्रम फिर विस्फोट विश्लेषण में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Protocol
नोट: Metagenomic डीएनए मिट्टी से शुद्ध (बाल्टीमोर काउंटी, मैरीलैंड) एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मिट्टी जीनोमिक आइसोलेशन किट ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग कर रहा है । एक यूवी spectrophotometer का उपयोग करना ( सामग्री की तालिकादेखें), शुद्ध जीनोमिक डीएनए एक 260/280 (एनएम) अनुपात & #62; १.८ और २.०-२.२ के बीच एक 260/230 अनुपात के लिए आश्वासन दिया है कि नमूना संदूषण के मुक्त है होना चाहिए । एनएस पर्वतमाला के लिए आवश्यक जीनोमिक डीएनए की मात्रा २०० एनजी से 2 µ छ.
1. रैपिड लाइब्रेरी तैयारी विधि (लघु प्रोटोकॉल)
नोट: यह एक छोटा प्रोटोकॉल है । रैपिड sequencing किट के लिए सामग्री की तालिका देखें ।
- एक ०.२ मिलीलीटर पतली घिरी ट्यूब में (देखें सामग्री की तालिका) २०० आसुत पानी की ७.५ µ एल की मात्रा के एक अंतिम में उच्च आणविक वजन डीएनए के एनजी जोड़ें ।
- तेजी से पुस्तकालय तैयारी किट से विखंडन मिश्रण (एफएम) के २.५ µ एल जोड़ें और धीरे से उलटा करके मिश्रण । नाड़ी केंद्रापसारक नीचे स्पिन करने के लिए (5 एस के लिए १,००० x g) ।
- नमूने को एक thermocycler में रखें ( सामग्री की तालिकादेखें) 1 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर एक दौर के लिए ७५ ° c के बाद 1 मिनट के लिए. ट्यूब और पल्स को हटाने के लिए नीचे नमूने स्पिन केंद्रापसारक ।
- तेजी से अनुकूलक के 1 µ एल जोड़ें और कुंद/टा ligase मास्टर मिश्रण के ०.२ µ एल, और फिर बर्फ पर अनुकूलित और सीमित पुस्तकालय की दुकान ।
नोट: यदि लघु प्रोटोकॉल का उपयोग कर चरण 8 पर आगे बढ़ें
2. बंधाव अनुक्रमण प्रोटोकॉल (लांग प्रोटोकॉल): Metagenomic डीएनए विखंडन
नोट: सामग्री की तालिका बंधाव sequencing किट के लिए देखें ।
- ४६ µ एल के एक अंतिम मात्रा के लिए शुद्ध जीनोमिक डीएनए के 1 µ जी पानी में पतला ।
- एक डीएनए विखंडन ट्यूब के लिए नमूना हस्तांतरण ( सामग्री की तालिकादेखें) और ८,००० x जी में कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए केंद्रापसारक एक microcentrifuge का उपयोग कर (देखें सामग्री की तालिका) के उत्पादन के लिए ~ 8 केबी जीनोमिक टुकड़े । सुनिश्चित करें कि सभी तरल संग्रह ट्यूब में पारित कर दिया है ।
- विखंडन ट्यूब पलटना, केंद्रापसारक करने के लिए वापस, और निचले कक्ष में खंडित जीनोमिक डीएनए इकट्ठा करने के लिए 1 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
- एक बाँझ कम डीएनए बाइंडिंग १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए खंडित जीनोमिक डीएनए स्थानांतरण, और एक कम प्रतिशत agarose जेल (०.६%) पर एक भाग का विश्लेषण करने के लिए विखंडन की पुष्टि करने के लिए & #62; 30 kb.
3. खंडित जीनोमिक डीएनए अंत-तैयारी
- ४५ µ में खंडित जीनोमिक डीएनए के ८०० एनजी का उपयोग कर पानी की, 7 µ एल अंत-तैयारी प्रतिक्रिया बफर जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें), 3 µ एल एंजाइम मिश्रण ( सामग्री की तालिकादेखें), और µ मुक्त पानी की 5 nuclease एल ।
- उलटा और नाड़ी केंद्रापसारक द्वारा मिश्रण (5 एस के लिए १,००० x g) ।
- एक ०.२ मिलीलीटर पतली घिरी ट्यूब के लिए स्थानांतरण नमूना, और 5 मिनट के लिए 20 ° c, 5 मिनट के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर मशीन के बाद में मशीन नमूना ।
- पल्स ट्यूब के नीचे करने के लिए सामग्री लाने के लिए केंद्रापसारक ।
- एक १.५ मिलीलीटर कम डीएनए बाध्यकारी microcentrifuge ट्यूब के लिए स्थानांतरण नमूना ।
- चुंबकीय मोती तैयार ( सामग्री की तालिकादेखें) । pipetting द्वारा चरण ३.५ और मिश्रण से अंत तैयारी प्रतिक्रिया करने के लिए reसस्पैंड मोतियों की ६० µ एल जोड़ें ।
- १०० rpm पर एक रोटेटर मिक्सर पर मशीन ( सामग्री की तालिकादेखें) कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ।
- नाड़ी नमूने को मोतियों की गोली, तो चुंबक के बगल में नमूना जगह है ।
- एक बार मोती चुंबक का पालन कर रहे हैं, बंद पिपेट supernatant और त्यागें ।
- चुंबक से ट्यूब निकालें और हौसले से तैयार ७०% इथेनॉल के २०० µ एल के साथ धोने के लिए धीरे से नमूना pipetting अप और नीचे ।
- पल्स करने के लिए मोतियों की गोली और चुंबक के लिए वापस करने के लिए केंद्रापसारक ।
- supernatant निकालें और छोड़ें । दोहराएं धुलाई कदम फिर से ७०% इथेनॉल के २०० µ एल का उपयोग कर ।
- नाड़ी ट्यूब, चुंबक पर लौटने और सभी ७०% इथेनॉल धोने को दूर ।
- खुले microcentrifuge ट्यूब ढक्कन के साथ, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सूखी हवा के लिए मोती की अनुमति दें ।
- चुंबक से ट्यूब निकालें और 31 बाँझ के µ l में गोली निलंबित, nuclease मुक्त पानी. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए मशीन ।
- चुंबक के लिए ट्यूब वापस जब तक सभी मोतियों को गोली लगी है और eluate स्पष्ट है ।
- eluate को १.५ एमएल microcentrifuge ट्यूब पर ट्रांसफर करें । नमूना के 1 µ एल का उपयोग कर, अंत prepped २६० एनएम पर एक यूवी spectrophotometer का उपयोग डीएनए यों तो ( सामग्री की तालिकादेखें).
नोट: प्रतिशत वसूली जीनोमिक डीएनए के 1 µ जी के एक शुरू एकाग्रता से ~ ७०% (७०० एनजी) होना चाहिए ।
4. एडाप्टर और तार अंत करने के लिए इसके अलावा-prepped जीनोमिक डीएनए टुकड़े
- मिश्रण सभी कुंद/टा ligase मास्टर मिश्रण ट्यूबों उलटा द्वारा, और फिर नाड़ी के नीचे करने के लिए सामग्री लाने के लिए केंद्रापसारक ।
- अंत prepped डीएनए के 30 µ एल का उपयोग करना, अनुकूलक मिश्रण के 20 µ एल जोड़ें, और कुंद/टा बंधाव मास्टर मिक्स के ५० µ एल ।
- उलटा, नाड़ी केंद्रापसारक द्वारा मिक्स, और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए गर्मी ।
5. चुंबकीय बीढ़ा तैयारी
- भंवर मोती और फिर निलंबित मोतियों की ५० µ एल स्थानांतरण एक १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूब ।
- eluate साफ करता है जब तक मोतियों की गोली के लिए चुंबक पर ट्यूब प्लेस ।
- supernatant निकालें और छोड़ें ।
- मनका बाध्यकारी बफर के १०० µ एल जोड़ें (मनका किट के लिए सामग्री की तालिका देखें) मोतियों को फिर से स्थगित करने के लिए, मोती, चुंबक पर मोतियों की गोली, supernatant हटाने और त्यागने के लिए भंवर । दोहराएं बाइंडिंग बफर के १०० µ एल के साथ धोने ।
- जोड़ें १०० µ मनका बाध्यकारी बफर के एल धोया मोती के लिए । भंवर ने मोतियों को फिर से सस्पेंड कर.
6. पुस्तकालय शुद्धिकरण
- एक P200 micropipette का प्रयोग, के लिए पिछले कदम से ४० µ एल जोड़ने के लिए अनुकूलित/ pipetting द्वारा नमूना सावधानी से मिलाएं ।
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए १०० rpm पर एक रोटेटर मिक्सर पर नमूना मशीन ।
- चुंबक पर नमूना प्लेस और मोतियों को व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं । पिपेट बंद supernatant और त्यागें.
- pipetting द्वारा मनका बाध्यकारी बफर के १४० µ एल में मोतियों को पुनर्निलंबित । चुंबक के खिलाफ नमूना प्लेस, supernatant त्यागें, और मनका बाध्यकारी बफर के एक और १४० µ एल के साथ फिर से धो लें ।
- पल्स ट्यूब केंद्रापसारक, 2 मिनट के लिए चुंबक पर ट्यूब जगह. गोली से बचे हुए मनका बाध्यकारी बफर निकालें ।
7. चुंबक मोतियों से पुस्तकालय का रेफरेंस
- pipetting द्वारा 15 µ एल ऑफ रेफरेंस बफर में चुंबकीय मोतियों को पुनर्निलंबित कर । कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए नमूना मशीन ।
- चुंबक के खिलाफ ट्यूब प्लेस मोतियों की गोली ।
नोट: प्रतिशत वसूली जीनोमिक डीएनए के 1 µ जी के एक शुरू एकाग्रता से ~ 25% (२५० एनजी) होना चाहिए ।
8. एक रन/
- पैकेजिंग से फ्लो सेल निकालें और पोर्टेबल, रीयल-टाइम sequencer ( सामग्री की तालिकादेखें) करने के लिए प्रवाह सेल देते हैं ।
- यूएसबी केबल के माध्यम से एक कंप्यूटर के लिए sequencer संलग्न और अनुक्रमण सॉफ्टवेयर शुरू ( सामग्री की तालिकादेखें).
- अनुक्रमण सॉफ्टवेयर के माध्यम से "कनेक्ट" डिवाइस पर क्लिक करें, "NC_Platform_QC. py" का चयन करें और "Start" पर क्लिक करे ।
- गुणवत्ता नियंत्रण (QC) को पूरा करने के लिए लगभग 6-7 मिनट लगते हैं; ' हरे रंग की एक समुद्र के लिए देखो ' (उत्पादन के बड़े क्षेत्रों) QC readout पर पुष्टि करने के लिए कि पर्याप्त सक्रिय है pores (& #62; ८००) डीएनए अनुक्रमण के लिए ।
9. एक sequencing रन प्रारंभ कर रहा है
- sequencing प्रोग्राम खोलें; एक संवाद बॉक्स दिखाई देगा । नमूना ID बॉक्स में, नमूना नाम है ।
- "फ्लो सेल आईडी" बॉक्स पर क्लिक करें और फ्लो सेल के शीर्ष पर स्टीकर पर पाया कोड दर्ज.
- प्रवाह कक्ष लिड खोलें, और तब नमूना पोर्ट दृश्यमान है ताकि सही (दक्षिणावर्त) के लिए नमूना पोर्ट कवर स्लाइड । एक बार बंदरगाह खुला है, एक छोटे बुलबुले के लिए जांच करें । बबल सहित बफ़र के कुछ microliters निकालें ।
- यह सुनिश्चित करने के लिए जांचें कि सेंसर सरणी में बफ़र है । ईंधन मिश्रण के साथ बफर चलाने के ४८० µ एल मिश्रण से भड़काने बफर बनाओ (RBF-1, सामग्री की मेजदेखें) (अच्छी तरह से पहले मिश्रण करने के लिए सुनिश्चित हो) ५२० µ l nuclease-मुक्त पानी के साथ.
- भड़काना बफर के ८०० µ एल कण्ठ बंदरगाह जोड़ें । ध्यान से इसे सुलभ बनाने के लिए "SpotOn" कवर उठा ।
- 5 मिनट के बाद, भड़काना के एक अतिरिक्त २०० µ l को भड़काने वाले पोर्ट के लिए बफ़र जोड़ें ।
10. पुस्तकालय लोड हो रहा है
- पुस्तकालय की तैयारी करने से पहले बर्फ पर निम्नलिखित एजेंट जगह: RBF-1 (अनुक्रमण किट से), अनुकूलित और सीमित पुस्तकालय, और पुस्तकालय लोड हो रहा है मोतियों (एलएलबी; sequencing किट से) ।
- एक ०.२ एमएल केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए, RBF के २५.५ µ एल और nuclease के 12 µ एल जोड़ें-मुक्त पानी कमरे के तापमान पर रखा ।
- एलएलबी को pipetting अप-डाउन करके मिक्स करें । एलएलबी के ०.२ µ एल ट्यूब के २६.५ µ l को जोड़ें । ऊपर-नीचे pipetting करके रिएजेंट्स को मिक्स करें ।
नोट: एलएलबी मिश्रण से बाहर बसने के लिए जाता है । - ०.२ µ एल ट्यूब के लिए अनुकूलित और सीमित पुस्तकालय के 11 µ एल जोड़ें । उलटा करके मिश्रण और नाड़ी केंद्रापसारक द्वारा नीचे स्पिन ।
- "SpotOn" पोर्ट dropwise करने के लिए चरण ९.४ से नमूना के ७५ µ l जोड़ें । सुनिश्चित करें कि प्रत्येक ड्रॉप अगले जोड़ने से पहले पोर्ट में बहती है ।
- ध्यान से बदलें नमूना पोर्ट कवर ताकि डाट पोर्ट में प्रवेश करती है, और डिवाइस ढक्कन बदलें ।
11. एक sequencing सॉफ़्टवेयर प्रोटोकॉल स्क्रिप्ट प्रारंभ कर रहा है
- ' का चयन करें प्रोग्राम ' के अंतर्गत ड्रॉपडाउन मेनू खोलें और "४८ घंटा अनुक्रमण" का चयन करें ।
- स्क्रिप्ट शुरू करने के लिए "निष्पादित" बटन पर क्लिक करें ।
- Mux स्कैन के परिणाम Mux स्कैनमें सक्रिय pores की संख्या के लिए सूचना स्ट्रीम में रिपोर्ट की जांच करें ।
नोट: यह संख्या QC रन में pores की संख्या से अलग हो सकता है और एक बड़ा अंतर एक समस्या का संकेत हो सकता है ।- यदि वहां एक महत्वपूर्ण कमी के सक्रिय QC से pores चलाने के लिए, सॉफ्टवेयर को पुनः आरंभ, और अगर वहां अभी भी एक महत्वपूर्ण अंतर है, कंप्यूटर रिबूट ।
- सिंक तापमान ३४ ° c sequencing सॉफ्टवेयर स्क्रिप्ट द्वारा रिपोर्ट के रूप में है कि जाँच करें ।
नोट: यदि तापमान ३४ डिग्री सेल्सियस पर नहीं है तो पर्याप्त सक्रिय नहीं होगा चलाने के लिए pores । - अनुक्रम लंबाई अपेक्षित और प्रायोगिक डिज़ाइन के लिए उपयुक्त हैं, तो यह निर्धारित करने के लिए पढ़ें लंबाई के हिस्टोग्राम की जाँच करें ।
- ' बंद x. ' का उपयोग करते हुए डेस्कटॉप एजेंट बंद करें वेब GUI बंद करके sequencing सॉफ़्टवेयर से बाहर निकलें । डिवाइस को कंप्यूटर से डिस्कनेक्ट कर ।
12. भागो और परिणामों का विश्लेषण
नोट: sequencing चलाने के दौरान, डेटा डेस्कटॉप एजेंट का उपयोग करते हुए "रिपोर्ट देखें" प्रोग्राम का उपयोग कर मॉनिटर किया जा सकता है । के दौरान या चलाने के पूरा होने के बाद, फ़ाइलें एक FAST5 फ़ाइल स्वरूप में डेटा → पुस्तकें → पास फ़ोल्डर (डिफ़ॉल्ट) में उपलब्ध हैं । sequencing सक्रिय है, जबकि इस फ़ोल्डर खुला है, तो कंप्यूटर फ़्रीज कर सकता है ।
- दृश्यों को देखने और बदलने के लिए, एक "HDFViewer" डाउनलोड करें ।
- sequencing फ़ाइलों को देखने के लिए, सीधे HDF व्यूअर → खोलें डेटा फ़ोल्डर खोलें → सभी फ़ाइल प्रकारों का चयन करें → चुनें C: ड्राइव (डिफ़ॉल्ट) → डेटा का चयन करें → चुनें पुस्तकें → चुनें दर्रा ।
- ढूँढें और बाएँ ड्रॉपडाउन मेनू में FASTQ फ़ाइल का चयन करें; फ़ाइलें खुल जाएंगी और FASTQ स्वरूप में सहेजी जा सकती हैं ।
नोट: छात्र प्रयोग के प्रयोजन के लिए, ३५० न्यूक्लियोटाइड के दृश्यों या अब आगे विश्लेषण के लिए चुना गया । बेस कॉलिंग से आउटपुट उपयोगकर्ता अनुक्रम पढ़ता आकार के आधार पर सॉर्ट करने के लिए अनुमति देता है । FASTQ फ़ाइलें विस्फोट (NCBI) या अंय bioinformatics कार्यक्रमों के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है ।
Representative Results
प्रायोगिक डिजाइन और ट्विटर प्रौद्योगिकी ने छात्रों के लिए मृदा डीएनए का अनुक्रम करने के लिए एक तेज और सस्ती विधि प्रदान की । प्रतिनिधि चलाने के साथ अधिक से अधिक ८०० pores अनुक्रमण के लिए उपलब्ध गुणवत्ता नियंत्रण मापदंडों पारित कर दिया । चलाने के परिणामस्वरूप १२५,००० से अधिक पुस्तकें ५.३८ kb की एक औसत अनुक्रम लंबाई के साथ अध्ययन के लिए उपलब्ध है । अनुक्रम एक गुणवत्ता स्कोर दिया जाता है और केवल स्वीकार्य स्कोर के साथ उन दृश्यों का विश्लेषण किया गया । अनुक्रमण प्रतिक्रिया के उत्पादन के रूप में FAST5 प्रारूप में है, जो इस तरह के विस्फोट (NCBI) के रूप में कार्यक्रमों द्वारा स्वीकार नहीं किया है, अनुक्रम HDF दर्शक जो FASTQ स्वरूप है, जो विस्फोट विश्लेषण के लिए संगत है क्रम में धर्मांतरित में देखा गया । सॉफ्टवेयर की भविष्य पुनरावृत्ति में, डेटा एक FASTQ प्रारूप के रूप में उपलब्ध हो जाएगा, HDF दर्शक की जरूरत को नष्ट करने । अनुपूरक आंकड़े देखें 1, 2 और 3.
लंबाई में ३५० से अधिक न्यूक्लियोटाइड के ५० दृश्यों BLASTN (न्यूक्लियोटाइड के खिलाफ न्यूक्लियोटाइड डेटाबेस) या BLASTX (एमिनो एसिड अनुक्रम में अनुवादित न्यूक्लियोटाइड) द्वारा विश्लेषण के अधीन थे (NCBI) मिट्टी के नमूने में जीवों की पहचान करने के लिए. वर्ग की समय की कमी को देखते हुए और है कि पाठ्यक्रम का ध्यान प्रयोगशाला तरीकों पर है और bioinformatics नहीं है, हम छात्रों को इन मापदंडों के भीतर दृश्यों का विश्लेषण किया है । हमारे bioinformatics वर्गों पाइपलाइन विश्लेषण उपकरण के विकास के लिए डेटा का उपयोग कर सकते हैं । bioinformatics विश्लेषण के इस स्तर को प्रयोगशाला आधारित वर्ग में शामिल नहीं है । तालिका 1 उन जीवों की सूची है जो 4 ई-04 से कम के ई-मूल्यों के साथ पहचाने गए थे । सामांयत:, 4 e-04 से कम ई-मान इनपुट अनुक्रम (क्वेरी) और मिलान अनुक्रम के बीच प्रबल समानता का संकेत देते हैं । BLASTN द्वारा पहचाने गए जीवों (गैर के खिलाफ निरर्थक (nr) डाटाबेस) प्रजातियों की एक विस्तृत विविधता से कर रहे हैं और आगे जीनोमिक और प्रोटीन विश्लेषण के लिए उपलब्ध हैं. मिट्टी का यह नमूना है, जो बाल्टीमोर काउंटी में एक बगीचे से आया था, एमडी परीक्षण कभी नहीं किया गया था, तो वहां से कोई पिछले डेटा जो निर्धारित करने के लिए क्या जीवों मिट्टी में हो सकता था । BLASTN विश्लेषण (nr डाटाबेस के खिलाफ) विश्लेषण भी संकेत दिया वहां nr डाटाबेस में कोई समानता के साथ अनुक्रम थे । यह निर्धारित करने के लिए कि ये वास्तव में उपंयास अनुक्रम हैं, आगे के अध्ययन की जरूरत है । BLASTX द्वारा कई दृश्यों का विश्लेषण BLASTN विश्लेषण में प्रतिनिधित्व नहीं जीवों से कई प्रोटीन का पता चला. तालिका 2 endopeptidases सहित कई संभव प्रोटीन की सूची, और ATPases-प्रोटीन की तरह । दृश्यों के इस पुस्तकालय का उपयोग करना, छात्रों को और अधिक परिष्कृत bioinformatics उपकरण का उपयोग करने के लिए और अधिक विश्लेषण करने का अवसर है, अगर अनुदेशकों द्वारा निर्देशित ।
चित्र 1 : जीनोमिक ग्रंथालय तयारी. ट्विटर प्रौद्योगिकी का उपयोग कर अनुक्रमण के लिए जीनोमिक डीएनए लाइब्रेरी की तैयारी के लिए कदम । यह आंकड़ा आवश्यक अनुमतियों के साथ संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 . एक ट्विटर का उपयोग डीएनए अनुक्रमण के योजनाबद्ध. डीएनए विद्युत संकेत पीढ़ी और आधार पहचान के साथ एक ट्विटर झिल्ली के माध्यम से गुजर रहा है । यह आंकड़ा आवश्यक अनुमतियों के साथ संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| जीव | e मान |
| Streptomyces एसपीके. | 3.00 ई-06 |
| Nocardoides एसपीके. | 5.00 ई-04 |
| Gordonia एसपीके. | 5.00 ई-04 |
| Hyphomicrobium nitrativorens | 1.00 ई-१३९ |
| Starkeya नोवेल्ला | 1.00 ई-31 |
| Hyphomicrobium denitrificans | 1.00 ई-30 |
| Fibomicrobium एसपीके. | 5.00 ई-17 |
| Pseudomonas एसपीके. | 2.00 ई-15 |
| Rhodothemus marinus | 1.00 ई-17 |
| Turneiella पर्व | 2.00 ई-24 |
| ई. कोलाई | 0.00 e + 00 |
| Bradyrhizobium एसपीके. | 3.00 ई-30 |
| Gemmatirosa kalamazoonesis | 1.00 ई-20 |
| Burkholderia एसपीके. | 8.00 ई-10 |
| Sphingomonas एसपीके. | 8.00 ई-10 |
| Cellumonas एसपी के. | 6.00 ई-11 |
तालिका 1: BLASTN विश्लेषण के चयनित परिणाम. मृदा metagenomics डीएनए अनुक्रम NCBI गैर निरर्थक न्यूक्लियोटाइड डेटाबेस के खिलाफ BLASTN समानता खोज के अधीन । डेटा में बताया गया है कि ई-वैल्यूज़ 4 x e-4 या उससे कम है ।
| प्रोटीन | जीव |
| काल्पनिक प्रोटीन | Acidobacter जीवाणु |
| सैम आश्रित methyltransferase | H. denitrificans |
| ATPase | Jannaschia एसपी के. |
| Endopeptidase | शिगेला sonnei |
| Lysis प्रोटीन | ई. कोलाई |
तालिका 2: BLASTX विश्लेषण के चयनित परिणाम. मृदा metagenomics डीएनए NCBI गैर निरर्थक प्रोटीन डाटाबेस के खिलाफ BLASTX समानता खोज के अधीन अनुक्रम ।
पूरक चित्रा 1: प्लेटफ़ॉर्म QC परिणाम. मंच QC के परिणाम प्रस्तुत कर रहे हैं । ऊपरी दाएं कोने में सक्रिय pores के लिए QC के परिणाम हैं । प्रवाह कोशिका के प्रत्येक वृत्त का चक्र सक्रिय pores के लिए परीक्षण किया है । मुख्य पृष्ठ गतिशील और परिवर्तन के रूप में प्रत्येक वृत्त का परीक्षण किया है । इस चलाने में, १,४१४ एकल pores का पता लगाया गया ।कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
पूरक चित्रा 2: FAST5 फ़ाइलों को FASTQ फ़ाइलों में परिवर्तित करना. यहाँ दाईं ओर, sequencing चलाने से डेटा का आउटपुट है । प्रत्येक पंक्ति एक व्यक्तिगत अनुक्रम का प्रतिनिधित्व करता है । चित्रा के बाईं ओर दाईं ओर से प्रकाश डाला अनुक्रम से पता चलता है, HDF दर्शक है कि एक FASTQ फ़ाइल है जो आगे विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अनुक्रम धर्मांतरित में । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
पूरक चित्रा 3: HDF viewer में FASTQ अनुक्रम का उदाहरण. इस अनुक्रम (८०३ पढ़ें) एक FASTQ फ़ाइल है जो न्यूक्लियोटाइड में FAST5 डेटा धर्मांतरित में है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Discussion
कई अगली पीढ़ी अनुक्रमण विधियों उत्पन्न किया गया है और प्रत्येक संश्लेषण द्वारा अनुक्रमण पर निर्भर करता है, लेकिन न्यूक्लियोटाइड की पहचान करने के लिए पता लगाने प्लेटफार्मों अलग. एन एस, बाजार के लिए सबसे हाल ही में इसके अलावा, एक अनुक्रमण प्रतिक्रिया या लेबल न्यूक्लियोटाइड की आवश्यकता नहीं है, जो पूरी तरह से एक अलग विधि का उपयोग करता है. यह विधि पहले से ही शामिल न्यूक्लियोटाइड के प्रभारी विभेदक का लाभ लेता है के रूप में वे एक विद्युतीकृत ताकना के माध्यम से गुजरती हैं । प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड की पहचान विभिन्न ठिकानों द्वारा विद्युत वर्तमान के मॉडुलन के रूप में वे ट्विटर के माध्यम से पारित द्वारा होता है. यह मल्टीप्लेक्स सिस्टम उपयोगकर्ता को एक समय में कई टुकड़ों को अनुक्रम करने की अनुमति देता है । डीएनए के दोनों किस्में अनुक्रमण करके, अनुक्रम की सटीकता काफी बढ़ जाती है और अनुक्रमण सॉफ्टवेयर है, जो एक लैपटॉप कंप्यूटर पर लोड किया जा सकता है, संकेतों प्रक्रियाओं और विश्लेषण किया जा सकता है कि अनुक्रम जानकारी प्रदान करता है.
pyrosequencing में, एक sequencing द्वारा संश्लेषण (SBS) विधि, टेंपलेट में शामिल विशिष्ट आधार का पता लगाना luciferase पर निर्भर करता है और chemiluminescent संकेतों की जनरेशन8। आयन अर्धचालक अनुक्रमण में, जारी हाइड्रोजन आयन, जो पीएच कम हो जाती है एक आयन सेंसर द्वारा पता लगाया है9. एकल अणु वास्तविक समय अनुक्रमण शूंय मोड वेव गाइड (ZMW)10, जो एक फ्लोरोसेंट अणु शामिल न्यूक्लियोटाइड को टैग का पता लगाने के लिए रोशन पर निर्भर करता है । SBS लक्ष्य डीएनए को बढ़ाना के लिए एक अनूठी विधि का उपयोग करता है, जैसे कि अद्वितीय अनुक्रम के क्लस्टर13जेनरेट किए जाते हैं । टैग की गई न्यूक्लियोटाइड की प्रतिदीप्ति दर्ज की गई है जब जोड़ा न्यूक्लियोटाइड की खोज हासिल की है । दूसरे हाथ पर एनएस है कि यह सीमित तकनीकी संसाधनों की आवश्यकता है, पोर्टेबल है, लंबे अनुक्रमण पढ़ता उत्पादन, कोई पूर्व डीएनए प्रवर्धन की आवश्यकता है, और अंय तरीकों की तुलना में एक कम लागत पर संचालित किया जा सकता है में अंय तरीकों पर अद्वितीय लाभ है । हमारे छात्रों को नए, रैपिड लाइब्रेरी तैयारी प्रोटोकॉल पाया सीधा और एक तीन घंटे प्रयोगशाला वर्ग के लिए उत्तरदाई है । हम का सामना करना पड़ा मुद्दों में से कुछ को दूर करने के लिए मुश्किल थे जो प्रवाह सेल में बुलबुले थे, यह महत्वपूर्ण कंप्यूटर शक्ति (भंडारण के एक टेराबाइट) की आवश्यकता, डेटा के वर्तमान उत्पादन एक FAST5 फ़ाइल में है, और अनुक्रमण प्रवाह सेल एक सीमित शैल्फ जीवन है इससे पहले कि यह खराब. इसके अलावा, एन एस बंधाव अनुक्रमण प्रोटोकॉल (लांग प्रोटोकॉल) के अन्य नुकसान है कि यह कई पुस्तकालय तैयारी कदम की आवश्यकता है, आणविक जीव विज्ञान की तकनीक में विशेषज्ञता की आवश्यकता है, और कुछ की तुलना में जब कम sequencing निष्ठा उत्पन्न करता है अनुक्रमण के तरीके3। हालांकि, नई रैपिड लाइब्रेरी तैयारी किट के साथ हाल ही की अग्रिमों के लिए केवल 10 मिनट की आवश्यकता है पुस्तकालय तैयारी और एक कम अनुक्रमण त्रुटि दर का प्रदर्शन किया है । नई पुस्तकालय की तैयारी विधि बहुत एक प्रयोगशाला वर्ग में उपयोग के लिए उत्तरदायी था ।
प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं, विशेष रूप से प्रवाह सेल के QC में । यह प्रवाह सेल की प्राप्ति के पांच दिनों के भीतर एक प्रारंभिक QC प्रदर्शन शामिल है और उंहें 8 सप्ताह के भीतर का उपयोग कर । हालांकि हम प्रवाह कोशिकाओं है कि 8 सप्ताह से परे थे का उपयोग किया है, खुले/सक्रिय pores की संख्या बहुत कम है । यह महत्वपूर्ण है कि प्रयोगों के लिए एक समय रेखा है जहां प्रवाह कोशिकाओं का अधिकतम उपयोग हासिल की है फिट की योजना बनाई है । हम सफाई प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है और सफलता के साथ प्रवाह कोशिकाओं का इस्तेमाल किया ।
मिट्टी के metagenomics की जांच माइक्रोबियल विविधता के एक अप्रयुक्त आनुवंशिक जलाशय का प्रतिनिधित्व करते हैं । उदाहरण के लिए, मिट्टी का एक ग्राम 107 -109 prokaryotic कोशिकाओं14के बीच में शामिल होने का अनुमान है । इसके अलावा, मिट्टी जीवों उपंयास प्राकृतिक उत्पादों, एंजाइमों, और एंटीबायोटिक दवाओं का एक मुख्य स्रोत हैं । इस प्रकार, मृदा metagenomics डीएनए अनुक्रम विश्लेषण शिक्षा के हर स्तर पर छात्रों के लिए एक मूल्यवान अनुदेशात्मक उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है । एन एस प्रौद्योगिकी का उपयोग करें और कम लागत की आसानी इस प्रणाली एक बहुत ही प्रभावी शिक्षण उपकरण बनाते हैं । छात्रों को पर्यावरण के नमूनों अनुक्रम कर सकते हैं, और अनुक्रम के पूरा होने पर उपलब्ध bioinformatics उपकरण का उपयोग करने की पहचान और परीक्षण नमूनों में रोगाणुओं और metagenomics अनुक्रम की विशेषता. एन एस प्रौद्योगिकी का उपयोग करना, छात्रों को सच हाथ अनुभव है, जो अब तक पहुंच से बाहर किया गया है क्योंकि उंनत तकनीकी विशेषज्ञता और उच्च पुनर्अभिकर्ता, उपकरण, और अंय अनुक्रमण प्लेटफार्मों में रखरखाव की लागत के प्रयोगशाला पाठ्यक्रमों में उपयोग के लिए । हाल ही में, हमारे छात्रों में से एक (जे हैरिसन, व्यक्तिगत संचार) कृषि मिट्टी की एक पर्यावरणीय निगरानी परियोजना में इस तकनीक के उपयोग की सूचना दी । हम उम्मीद करते हैं कि शिक्षा के अंतरिक्ष में इस तकनीक के लिए कई और आवेदन आएंगे ।
Disclosures
लेखकों ने कोई खुलासे नहीं किए हैं ।
Acknowledgments
इस परियोजना के भाग में जॉंस हॉपकिंस विश्वविद्यालय, प्रोवोस्ट के कार्यालय द्वारा गेटवे विज्ञान पहल के माध्यम से समर्थन था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermal Cycler | LifeECO | BTC42096 | |
| Covaris g-TUBE | Covaris | 520079 | |
| NEBNext End Repair Module | New England BioLab | E7546 | |
| Eppendorf LoBind Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | |
| NEB Blunt/TA Ligase Master Mix | New England BioLab | MO367 | |
| MyOne C1 Strepavidin Beads | Thermo Fisher | 65001 | |
| Eppendorf microcentrifuge | Eppendorf | Model 5420 | |
| Nanodrop UV spectrophotometer | Thermo Fisher | ND-2000 | Model 2000 |
| Belly Dancer Orbital Shaker | Sigma-Aldrich | Z768499 | |
| Power Soil DNA Isolation Kit | MO BIO | 12888-50 | |
| Ligation Sequencing Kit 2D | Oxford Nanopore | SQK-LSK208 | |
| Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA | Oxford Nanopore | SQK-RAD002 | |
| End-Prep Reaction Buffer and enzyme mix (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix) | New England BioLab | MO367 | |
| AmPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Basic Starter Pack | Oxford Nanopore | Includes MinION Sequencing Device and Flow Cell | |
| MinKNOW software | Oxford Nanopore | ||
| Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA | Oxford Nanopore | SQK-RAD002 | Includes Running Buffer with Fuel (RBF), Fragmentation Mix (FRM) Rapid Adapter (RAD) Library Lodaing Beads (LLB) |
References
- Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).
- Greninger, A. L., et al. Rapid metagenomics identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis. Genome Med. 7, 99 (2015).
- Quick, J., et al. Rapid draft sequencing and real-time nanopore sequencing in a hospital outbreak of Salmonella. Genome Biology. 16, 114 (2015).
- Ashton, P. M., et al. MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of a bacterial antibiotic resistance island. Nat Biotechnol. 33, 296-300 (2015).
- Loman, N. J., Quick, J., Simpson, J. T. A complete bacterial genome assembled de novo. using only nanopore sequencing data. Nat Method. 12, 733-735 (2015).
- Hoenen, T., et al. Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Outbreak Tool. Emerg Infect Dis. 22 (2), 331-334 (2016).
- Petrosino, J. F., Highlander, S., Luna, R. A., Gibbs, R. A., Versalovic, J. Metagenomic pyrosequencing and microbial identification. Clin Chem. 55 (5), 856-866 (2009).
- Cummings, P. J., Ahmed, R., Durocher, J. A., Jessen, A., Vardi, T., Obom, K. M. Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization. J. Vis. Exp. (78), e50405 (2013).
- Rothberg, J. W., et al. An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing. Nature. 475, 348-352 (2011).
- Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations. Science. 299, 682-686 (2003).
- Eid, J., et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323, 133-138 (2009).
- Stoddart, D., Heron, A. J., Mikhailova, E., Maglia, G., Bayley, H. Single-nucleotide discrimination in immobilized DNA oligonucleotides with a biological nanopore. PNAS. 106, 7702-7707 (2009).
- Shendure, J., Hanlee, J. Next generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
- Daniel, R.
