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Biochemistry

एक परमाणु बल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एकल प्रोटीन अणुओं के बल स्पेक्ट्रोस्कोपी

Published: February 28, 2019 doi: 10.3791/55989
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Mechanical Engineering and Materials Science, Duke University

Summary

हम एक परमाणु बल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके यांत्रिक संपत्तियों और एकल प्रोटीन अणुओं के यांत्रिक खुलासा मार्ग को मापने के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं और रणनीतियों का वर्णन करते हैं । हम भी एक अच्छा एकल प्रोटीन अणु रिकॉर्डिंग के चयन और औचित्य के लिए एक संदर्भ के रूप में प्रतिनिधि परिणाम दिखाते हैं ।

Abstract

उनके एमिनो एसिड अनुक्रम से उनके मूल 3d संरचना करने के लिए प्रोटीन की तह प्रक्रिया का निर्धारण जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण समस्या है. परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (afm) खींच और एक प्रोटीन अणुओं की छूट को सक्षम करने के द्वारा इस समस्या का समाधान कर सकते हैं, जो विशिष्ट खुलासा और refolding विशेषताओं का प्रत्यक्ष सबूत देता है । afm आधारित एकल अणु बल-स्पेक्ट्रोस्कोपी (afm-smfs) लगातार पारंपरिक थोक (जैव रासायनिक) माप में संभव नहीं हैं कि प्रोटीन में उच्च ऊर्जा conformations को मापने के लिए एक साधन प्रदान करता है. हालांकि कई कागजात afm-smfs के सिद्धांतों को दिखाने के लिए प्रकाशित किया गया था, यह आसान नहीं है एक विस्तृत पूर्ण प्रोटोकॉल की कमी के कारण smfs प्रयोगों आचरण. इस अध्ययन में, हम संक्षेप में afm के सिद्धांतों का वर्णन और बड़े पैमाने पर विस्तार प्रोटोकॉल, प्रक्रियाओं, और एक दिशानिर्देश के रूप में डेटा विश्लेषण smfs प्रयोगों से अच्छे परिणाम प्राप्त करने के लिए. हम प्रतिनिधि smfs एकल प्रोटीन यांत्रिक खुलासा माप के परिणामों का प्रदर्शन और हम कुछ आमतौर पर समस्याओं का सामना करना पड़ा के लिए समस्या निवारण रणनीतियों प्रदान करते हैं ।

Introduction

एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी (smfs) में afm द्वारा अग्रिम यांत्रिक हेरफेर और एकल प्रोटीन अणुओं के सटीक लक्षण वर्णन सक्षम है । इस लक्षण वर्णन प्रोटीन यांत्रिकी के बारे में उपन्यास अंतर्दृष्टि का उत्पादन किया है1,2, प्रोटीन तह3, प्रोटीन-ligand बातचीत4, प्रोटीन प्रोटीन बातचीत5, और प्रोटीन आधारित इंजीनियर सामग्री6,7,8. smfs प्रोटीन खुलासा का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, के रूप में afm द्वारा खींच प्रोटीन अणु के भीतर रासायनिक और शारीरिक बांड की अनुमति देता है धीरे से उनके कठोरता के अनुसार विस्तार, जो एक लगातार बढ़ती समोच्च लंबाई को जंम देता है । एक प्रोटीन अणु की यह overstretching बल-विस्तार एक टूटना घटना (या बल चोटी) में जिसके परिणामस्वरूप वक्र में एक अचानक संक्रमण का उत्पादन कर सकते हैं । फोर्स पीक यांत्रिक खुलासा प्रक्रिया के दौरान खुलासा बल और प्रोटीन के संरचनात्मक परिवर्तन पर सीधी जानकारी देता है । पहले अध्ययन में से एक afm मापा titin1 और पाया प्रोटीन के उपंयास पहलुओं को खुलासा और केंद्रित रसायनों या चरम तापमान की तरह अप्राकृतिक denaturants के उपयोग के बिना शारीरिक स्थितियों के तहत refolding ।

smfs प्रयोगों उपकरणों की एक किस्म पर आयोजित कर रहे हैं, हालांकि यहाँ हम केवल afm पर विचार. afm चार मुख्य तत्वों से बना है: जांच, डिटेक्टर, नमूना धारक, और piezoelectric स्कैनर । जांच एक cantilever के मुक्त झूल अंत पर एक तेज टिप है । अंशांकन के बाद, एक संलग्न अणु की खींच के दौरान ब्रैकट के झुकने एक लेजर बीम कि बंद करने के लिए ब्रैकट के पीछे परिलक्षित होता है का उपयोग कर मापा जाता है ठीक है hooke कानून का उपयोग बलों का निर्धारण । परिलक्षित लेजर बीम परियोजनाओं में एक क्वाड्रेंट photodiode डिटेक्टर जो डायोड केंद्र से लेजर बीम के विस्थापन के अनुपात में एक वोल्टेज पैदा करता है. तरल पदार्थ में प्रोटीन नमूना के साथ सब्सट्रेट एक 3 डी piezoelectric मंच है कि उप नैनोमीटर परिशुद्धता के साथ नियंत्रित किया जा सकता है पर मुहिम शुरू की है । एक कंप्यूटर photodiode डिटेक्टरों से वोल्टेज पढ़ता है और एक कंप्यूटर नियंत्रित वोल्टेज की आपूर्ति के माध्यम से 3 डी चरण को नियंत्रित करता है. इन पीजो actuator चरणों आमतौर पर कपैसिटिव या तनाव गेज स्थिति सेंसर के साथ सुसज्जित कर रहे हैं ठीक पीजो विस्थापन को मापने के लिए और फ़ीड-वापस नियंत्रण प्रणाली के माध्यम से हिस्टेरीसिस सही करने के लिए. पीजो नियंत्रक से सेंसर संकेत उत्पादन कि कारखाना-calibrated है पीजो की वोल्टेज स्थिरांक का उपयोग कर दूरी में कनवर्ट किया जाता है. एक पुलिंग प्रयोग से एक उदाहरण बल-विस्तार वक्र चित्रा 2में दिखाया गया है ।

लगातार वेग और लगातार बल खींच माप: afm-smfs प्रयोगों के दो प्रकार के होते हैं । लगातार बल smfs मापन oberhauser एट अल में वर्णित हैं । 9, जबकि यहां हम लगातार वेग मापन पर ध्यान केंद्रित । एक ठेठ afm लगातार वेग खींच प्रयोग एक पीजो को वोल्टेज प्रदान करने के लिए धीरे से एक ब्रैकट टिप के सापेक्ष एक सब्सट्रेट चाल द्वारा किया जाता है । एक ठेठ प्रयोग टिप शुरू में सतह के खिलाफ दबाव है । खींच माप संपर्क से बाहर लाने के लिए टिप से सब्सट्रेट दूर ले जाकर शुरू हो गया है. अगर कोई प्रोटीन शुरू में टिप के संपर्क में आता है, तो उसे खींचा जाएगा और विस्थापन के खिलाफ बल का खुलासा किया जाएगा । सब्सट्रेट फिर टिप के साथ संपर्क में वापस लाया जाता है और एक आराम ट्रेस मापा जाता है जहां प्रोटीन तह बल विस्थापन से निर्धारित किया जा सकता है ।

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Protocol

1. प्रोटीन की तैयारी

  1. डीएनए क्लोनिंग.
    1. ब्याज की एक डीएनए अनुक्रम synthesize, उदाहरण के लिए, एनआई10सी10के डीएनए अनुक्रम, या मेजबान जीव से पीसीआर के माध्यम से अलग मानक आणविक जीव विज्ञान तकनीकों का उपयोग कर11। flank संश्लेषण के दौरान प्रतिबंध साइटों के साथ ब्याज की जीन या 5 ' में साइटों को रखकर-पीसीआर प्राइमरों के अंत प्लाज्मिड pEMI91 (addgene #74888)12में एक मॉड्यूल के अनुरूप है ।
    2. अलग से दोनों प्लाज्मिड pEMI9112 और ब्याज की एक जोड़ी के साथ प्रतिबंध साइटों की डीएनए अनुक्रम पचाने के लिए इतना है कि ब्याज की अनुक्रम मिलकर I91 दोहराता द्वारा flanked जाएगा ( चित्रा 1देखें) । प्रतिबंध साइट्स के लिए मानक प्रोटोकॉल का पालन करें ।
    3. जैल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करके पचा हुआ उत्पाद को शुद्ध करें और फिर एक मानक प्रोटोकॉल का पालन करते हुए टी 4 डीएनए लीगज़ का उपयोग करके उत्पादों को लिकेट करें । ligation के बाद, प्लाज्मिड शुद्धि के लिए ई. कोलाई कोशिकाओं में प्लाज्मिड रूपांतरण और मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्लाज्मिड शुद्ध । अनुक्रम सफलतापूर्वक रूपांतरित किया गया था, यह सत्यापित करने के लिए T7 प्राइमरों या आंतरिक pEMI91 प्राइमरों का उपयोग करते हुए क्रम ।
  2. परिवर्तन.
    1. प्रोटीन एक्सप्रेशन सेल निकालें, जैसे C41 (DE3) प्लाइस सेल, एक-८० डिग्री फ्रीजर से और बर्फ पर पूरी तरह से गल जाते हैं ।
    2. कोशिकाओं को प्लाज्मिड डीएनए के 1 μl जोड़ें और संक्षेप में हलचल; के रूप में यह हवा बुलबुले और गर्म कोशिकाओं को लागू करेगा ऊपर और नीचे pipetting उचित नहीं है ।
    3. कोशिकाओं और 30 मिनट के लिए बर्फ पर प्लाज्मिड युक्त संस्कृति ट्यूब सेते ।
    4. हीट ४५ एस के लिए ४२ डिग्री सेल्सियस पर एक पानी स्नान में कोशिकाओं को झटका ।
    5. 2 मिनट के लिए बर्फ के लिए ट्यूब लौटें ।
    6. कोशिकाओं में पौंड शोरबा के ९५० μl प्लेस और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए २५० rpm पर हिला ।
    7. १०० μg/एमएल एम्पीसिलीन युक्त पौंड प्लेटों पर परिवर्तन की २०० μl के बारे में रखें । यदि pEMI91 के अलावा एक प्लाज्मिड का उपयोग कर रहा है, तो उस प्लाज्मिड के लिए उपयुक्त एंटीबायोटिक का उपयोग करें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक इनकोबेटर में रात भर थाली रखें । अगले दिन, इनकोबेटर से प्लेट हटा दें, पैराफेilm के साथ लपेटें, और 1 महीने तक फ्रिज में स्टोर करें ।
  3. प्रोटीन अभिव्यक्ति ।
    1. १०० μg/ml एम्पीसिलिन में एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में ३७ डिग्री सेल्सियस के साथ एक पिपेट टिप को छूने से रात के विकास के लिए और पौंड में ऊपर और नीचे पिटिंग के लिए 15 मिलीलीटर पौंड ब्रोथ मीडियम के साथ
    2. 15 मिलीलीटर संस्कृति को पौंड शोरबा माध्यम के 1 एल में १०० μg/एमएल एम्पीसिलिन के साथ स्थानांतरित करें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 4-12 एच के लिए शेक (जब तक ओडी६०० > ०.८) ।
    3. प्लाज्मिड तैयारी के लिए संस्कृति की 10 मिलीलीटर लीजिए ।
    4. 0.2-1 मिमी isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (iptg) जोड़ें और रात भर अभिव्यक्ति के लिए तापमान कमरे के तापमान को कम ।
    5. फसल अगले दिन चार ट्यूबों में विभक्त करके और ४० मिनट के लिए ४,००० × g पर centrifuging, और फिर कई घंटे के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर गोली फ्रीज ।
    6. प्रोटीन12 के डाला कैसेट के लिए इसी प्राइमरों के साथ अनुक्रमण के लिए कोशिकाओं से निकाले plasmids भेजें और डाला डीएनए की निष्ठा का सत्यापन ।
  4. प्रोटीन शुद्धि ।
    1. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए जमे हुए कोशिकाओं की एक ट्यूब गल ।
    2. lysis बफर में गल कोशिकाओं को निलंबित (पानी की ३८ मिलीलीटर, ग्लिसरीन की 2 मिलीलीटर, ५० मिमी Tris-एचसीएल पीएच ७.६, १५० मिमी nacl, 1 मिमी cacl2, 10 μg/एमएल dnase, 1 मिमी pmsf, 1 मिमी tcep, ५०० μg/एमएल lysozyme) और 1 एच के लिए बर्फ पर हिला ।
    3. कई घंटे के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर लीजड ड कोशिकाओं फ्रीज और फिर कमरे के तापमान पर फिर से गल ।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए १३,१०० × g पर नीचे lysate स्पिन ।
    5. विशिष्ट टैग के लिए एक गुरुत्वाकर्षण प्रवाह कॉलम के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला भागो (जैसे, strep-टैग या अपने टैग) ।
    6. एक बफर एक्सचेंज का उपयोग कर एक केंद्रापसारक फिल्टर strep के लिए उपयुक्त बफर का उपयोग कर-टैग या अपने टैग और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर का उपयोग करने से पहले करते हैं ।

2. नमूना तैयारी के लिए स्लाइड तैयारी

  1. पिरान्हा समाधान का उपयोग कर कांच स्लाइड तैयार करें ।
    1. एक ४० मिलीलीटर गिलास बीकर में गोल गिलास कवर स्लिप (७.५ मिमी की त्रिज्या) के 10-30 टुकड़े रखें ।
      नोट: यह चरण और एक हुड में निम्न चरणों का पालन करें । इस चरण के दौरान खतरनाक रसायनों से निपटने के लिए मानक प्रक्रियाओं का पालन करें ।
    2. 30 मिलीलीटर सांद्रित (१८.४ मी) सल्फ्यूरिक अम्ल जोड़ें ।
    3. 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
    4. मिश्रण को 10-30 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म करें ।
    5. ध्यान से एक अलग अपशिष्ट कंटेनर में पिरांहा समाधान छानना (पुन: उपयोग या खारिज किया जा करने के लिए).
    6. पिरांहा समाधान को दूर करने के लिए विआयनीकृत पानी के साथ स्लाइड कुल्ला ।
    7. एसीटोन के ४० एमएल में स्लाइडों को सस्पेंड कर दीजिये ।
    8. decant एसीटोन एक अपशिष्ट कंटेनर में और फिर से निलंबन इथेनॉल की ४० मिलीलीटर में स्लाइड ।
    9. ध्यान से एक समय में एक स्लाइड निकालने के लिए और आर्गन या शुद्ध हवा के साथ सूखी साफ संदंश का प्रयोग करें ।
    10. स्वच्छ और सूखी स्लाइड वैक्यूम के तहत सोने के वाष्पीकरण तक, या लंबी अवधि के भंडारण के लिए आर्गन के तहत जगह है ।
  2. सोने लेपित स्लाइड (वैकल्पिक) तैयार करें ।
    नोट: इस चरण में एक वैक्यूम (ई-बीम) वाष्पकर्ता के उपयोग की आवश्यकता है, जो प्रमुख विश्वविद्यालयों में कई स्वच्छ कमरे सुविधाओं में उपलब्ध है ।
    1. एक glasscutter का उपयोग कर आधे में पांच माइक्रोस्कोप स्लाइड (25 मिमी x ७५ मिमी आयताकार आकार) में कटौती ।
    2. 10 आधे माइक्रोस्कोप स्लाइड में से प्रत्येक के बीच में डबल पक्षीय चिपकने वाला टेप लागू करें ।
    3. चिपचिपा नोट के चिपचिपा पक्ष को काटें और डबल-पक्षीय टेप पर लागू करें ताकि नोट का चिपचिपा पक्ष आमने-सामने हो । चिपचिपा नोट आम तौर पर कम चिपकने वाला है, लेकिन अभी भी दृढ़ता से स्लाइड को संलग्न करने के लिए भविष्य तोड़ने को रोकने के । फिर उन आधे माइक्रोस्कोप की स्लाइडें अब कांच की स्लाइड् स होल्डर के रूप में काम कर सकती हैं ।
    4. सावधानी से धारक के चिपचिपा पक्ष के प्रत्येक कोने में चार साफ कांच स्लाइड (अनुभाग 2.1.10 से) दबाएँ ।
    5. एक ई-बीम वाष्पक के लिए कांच स्लाइड ले जाएँ । वाष्पक के विनिर्देशों का पालन करने के लिए सतह पर ७० क्रोमियम और ३०० एनएम सोने के एनएम लागू होते हैं ।
    6. argon के तहत सोने की लेपित स्लाइड स्टोर ।

3. नमूना तैयारी

  1. स्लाइड तैयार करें ।
    1. एक साफ आयरन डिस्क (15 मिमी व्यास) का चयन करें और इसे करने के लिए एक चिपकने वाला टैब देते हैं ।
    2. चिपकने वाला टैब के आवरण का टुकड़ा न अनुलग्न करें ।
    3. साफ गिलास के एक टुकड़े का चयन करें (अनुभाग 2.1.10 से) या सोने (2.2.7 धारा से) और दृढ़ता से यह लौह डिस्क के चिपचिपा पक्ष पर जगह है, यह नमूना स्लाइड हो जाएगा ।
  2. स्लाइड पर जमा प्रोटीन ।
    1. पॉलीप्रोटीन को बफर में प्रयोग के लिए (25 मिमी Tris-HCl, pH ७.६ के साथ १५० एमएम nacl) को एक बफर एक्सचेंज कॉलम जैसे ०.५-एमएल केन्द्रापसारक फ़िल्टर का उपयोग करके डायल करें । १३,००० आरपीएम पर 10 मिनट के लिए कॉलम में प्रोटीन को स्पिन करें और फिर कॉलम को रिवर्स करें और 2 मिनट के लिए १,००० आरपीएम पर कताई करके प्रोटीन को एक नए बफर में बदलना ।
    2. २८० एनएम पर absorbance को मापने के द्वारा अनुमानित प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण, एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर.
    3. १०० μl की एक अंतिम मात्रा में 10-100 μg/एमएल के लिए प्रोटीन को पतला ।
    4. स्लाइड के केंद्र पर प्रोटीन समाधान के ६० μl लागू करें । इस चरण में सावधान रहें कि किसी भी तरल को कांच और लोहे की स्लाइड के बीच के अंतर में प्रवेश न करने दें, क्योंकि यह प्रयोग और अनियंत्रित नमूना आंदोलनों के दौरान चिपकने वाली सूजन का कारण बन सकता है ।
      नोट: सोने की स्लाइड hydrophobic हैं, और एक गोलाकार छोटी बूंद के रूप में होगा, जबकि कांच स्लाइड और अधिक hydrophobic है और प्रोटीन समाधान फैल सकता है ।
    5. चलो नमूना 10-60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठते हैं । इस समय के दौरान, परमाणु बल माइक्रोस्कोप की स्थापना शुरू करने के लिए अगले कदम के लिए आगे बढ़ें ।

4. परमाणु बल माइक्रोस्कोप (afm) सेटअप

नोट: afm को सेट करने के लिए एक सामान्य वर्णन निम्न है, और कुछ विशिष्ट विवरण उपयोग किए गए विशिष्ट इंस्ट्रूमेंटेशन के आधार पर अलग हो सकता है । इस्तेमाल किया इंस्ट्रूमेंटेशन आंशिक रूप से घर बनाया है और13scholl में विस्तार से वर्णित है ।

  1. एक afm सेल पर ब्रैकट माउंट ।
    1. अनुप्रयोग के लिए उपयुक्त गुणों के साथ ब्रैकट चुनें । स्प्रिंग स्थिरांक के साथ cantilevers का उपयोग करें 4-10 pn/कम खुलासा बलों के लिए एनएम (~ 10-50 pN), जबकि वसंत स्थिरांक के साथ उपयोग cantilevers 15-100 pN/एनएम उच्च खुलासा बलों के लिए ।
    2. ध्यान से अंत से ब्रैकट उठाओ और यह जांच होल्डिंग सेल में जगह है ।
    3. सुनिश्चित करें कि होल्डिंग सेल दृढ़ता से जारी रखने से पहले जगह में ब्रैकट रखती है ।
    4. लेजर के संरेखण के लिए afm सिर में होल्डिंग सेल रखें ।
  2. afm सिर में लेजर संरेखित करें ।
    1. एक औंधा खुर्दबीन पर सिर प्लेस और सिर में लेजर powering के लिए afm सिर करने के लिए एक बैटरी पैक कनेक्ट ।
    2. ताकि लेजर प्रकाश एक टीवी या मॉनिटर पर कल्पना जा सकता है खुर्दबीन डिटेक्टर के लिए एक कैमरा संलग्न ।
    3. लेजर की स्थिति इतना है कि यह ब्रैकट की नोक पर स्थित है
  3. नमूना के साथ माउंट सिर ।
    1. जांच होल्डिंग सेल के बंदरगाहों में से प्रत्येक में बफर के 10 μl फ्लश ।
    2. नमूना स्लाइड है जो इनकोबेटेड समाधान से तरल पदार्थ के ४० μl incubating और छानना किया गया है ले लो । स्लाइड पर बफ़र की ४० μl जोड़ें । नमूना स्लाइड piezo ऊपर चुंबक पर रखें ।
    3. सुनिश्चित करें कि afm चरण ऊंचा स्थिति में है । फिर मंच पर afm सिर जगह है कि afm ब्रैकट नमूना छोटी बूंद के ऊपर है ।
  4. प्रकाश डायोड पर परिलक्षित लेजर बीम केंद्र ।
    1. कागज का एक छोटा सा टुकड़ा काट और afm photodiode के सामने जगह है ।
    2. knobs के उपयोग afm लेजर की स्थिति इतनी है कि कागज पर लेजर स्पॉट ध्यान केंद्रित और उज्ज्वल हो जाता है ।
    3. afm सिर दर्पण समायोजित करें ताकि लेजर photodiode हिट सभी quadrants में कुल संकेत को अधिकतम करने के लिए (a + b + c + d) और ऊपर दो और नीचे दो quadrants के बीच अंतर संकेत का कारण बनता है शूंय (a + b-c-d) ।

5. परमाणु बल माइक्रोस्कोप अंशांकन

  1. पावर स्पेक्ट्रम को मापने ।
    1. फ़िल्टर afm करने के लिए कनेक्ट किया गया पर, afm सिर संकेत के लिए फ़िल्टर सेटिंग पूर्ण बैंडविड्थ के लिए चालू करें ।
    2. afm पर ही, यह संकेत करने के लिए शोर जोड़ देगा के रूप में पीजो बंद है कि सुनिश्चित करें.
    3. प्रति परिकलन १,०२४ डेटा बिंदुओं से पावर स्पेक्ट्रम की ५१२ परिकलन का औसत मापने के लिए afm सॉफ़्टवेयर14 का उपयोग करें ।
    4. afm सॉफ्टवेयर15 का उपयोग करने के लिए पहली चोटी है, जो cantilever के लिए कंपन के मुख्य मोड से मेल खाती है भर में शक्ति स्पेक्ट्रल घनत्व को एकीकृत ।
  2. फोटोडायोड संवेदनशीलता की गणना करें ।
    1. afm ही पर, पीजो नियंत्रक पर बारी और ५०० हर्ट्ज (कम पास फिल्टर) के लिए फिल्टर सेटिंग बदल जाते हैं.
    2. afm सॉफ्टवेयर में शून्य के आसपास अस्थिर होना चाहिए जो अंतर संकेत मॉनिटर. तेजी से कुछ सौ माइक्रोपोजिशनरों का उपयोग कर microeters नीचे afm सिर ले जाएं । सिर नीचे चलती दोहराने और लगातार छलांग के लिए अंतर संकेत की निगरानी । सतह बहुत पास है जब संकेत छलांग ऊंचाई में वृद्धि शुरू करते हैं ।
    3. जैसे ही विक्षेप संकेत सतह के साथ संपर्क पर संतृप्त होता है, सिर को सतह से थोड़ा दूर ले जाते हैं ।
    4. afm सॉफ्टवेयर में, सतह को खोजने के लिए पीजो वोल्टेज को विनियमित करने के लिए इनपुट नियंत्रण का उपयोग करें, ऊपर या नीचे जाने से 100-5000 एनएम. यदि सतह अभी भी पहुंच में नहीं है, तो सिर और नमूने के बीच की दूरी को मैंयुअली कम करना जारी रखें ।
    5. afm सॉफ्टवेयर में, के बारे में ५०० एनएम की एक स्कैन आकार के साथ एक खींच प्रयोग आचरण इतना है कि टिप के बारे में १०० पीजो यात्रा के समुद्री मील के लिए संपर्क में आता है ।
    6. पीजो विस्थापन वक्र जहां afm टिप सब्सट्रेट सतह के साथ संपर्क में रहता है बनाम photodiode संकेत के रैखिक क्षेत्र की ढलान को मापने ।
    7. ढलान और एकीकृत शक्ति स्पेक्ट्रम (Equation 1) का उपयोग वसंत निरंतर और संवेदनशीलता की गणना.

6. डाटा अधिग्रहण

  1. तैयारी.
    1. afm करने के लिए जुड़े फिल्टर पर, ताकि नमूना आवृत्ति कम से कम दो बार बैंडविड्थ (nyquist कसौटी) है, जो एक ऊपरी सीमा के निचले पास cutoff के लिए दे देंगे फिल्टर सेटिंग सेट.
  2. माप.
    1. सेट के कुल सैद्धांतिक आकार के लिए स्कैन आकार पॉलीप्रोटीन (एमिनो एसिड की संख्या × ०.३६५) प्लस के बारे में ४०% सब्सट्रेट के खिलाफ दबाने के लिए अनुमति देने के लिए. उदाहरण के लिए, एक 9x I91 के निर्माण के बारे में ३०० एनएम की एक सैद्धांतिक सामने आया लंबाई होगा खींच, तो स्कैन आकार के बारे में ४२० एनएम होना चाहिए ।
    2. afm सॉफ्टवेयर में, ब्रैकट की स्थिति इतनी है कि यह स्कैन की सतह से दूर आकार के ८०% है (इस मामले में, के बारे में ३४० समुद्री मील दूर सतह से) ।
    3. afm सॉफ्टवेयर में, ३०० एनएम/एस के लिए स्कैन गति निर्धारित शुरू में ।
      नोट: इस गति को धीमी, या तेजी से, आवेदन के आधार पर संशोधित किया जा सकता है ।
    4. एक खींच प्रयोग प्रदर्शन और पीजो और photodiode संकेत के परिणामस्वरूप स्थिति को मापने. स्कैन आरंभ करने के लिए afm सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें ।
    5. afm सॉफ्टवेयर में, के बारे में १०,००० रिकॉर्डिंग जब तक माप प्रदर्शन करने के लिए जारी है ।
      नोट: आम तौर पर, एक सकारात्मक-नियंत्रित अणु की पिकअप दर ०.५%16के आसपास होती है, इसलिए १०,००० का विश्लेषण करने के लिए पर्याप्त डेटा एकत्र करने में सक्षम होना आवश्यक है ।

7. डेटा विश्लेषण

  1. डेटा सामांयीज़ करना ।
    1. प्रत्येक रिकॉर्डिंग के लिए, एक्सटेंशन का उपयोग करके एक्सटेंशन की गणना करें = विस्थापन-F/kc (kc 5.2.7 से है) ।
    2. या तो बल-विस्तार ट्रेस की शुरुआत या अंत के औसत को लेकर आधारभूत बल स्तर निर्धारित करें, जहां कोई बल चोटियों मौजूद नहीं है और जहां ब्रैकट सतह के खिलाफ दबाव नहीं है । संपूर्ण बल-विस्तार वक्र को फिर इस माध्य मान से स्थानांतरित किया जा सकता है ।
    3. डेटा का अनुवाद करें ताकि एक्सटेंशन शूंय y-अक्ष के साथ संरेखित हो । इसका कारण यह है कि किसी ट्रेस के आरंभ में अणु को शून्य विस्तार पर सेट किया जाना चाहिए.
  2. ब्याज की प्रोटीन की पहचान करना.
    1. किसी एकल-अणु फ़िंगरप्रिंट प्रदान करने वाले कम से चार I91 ईवेंट्स वाली रिकॉर्डिंग्स पहचानें । ये रिकॉर्डिंग सच "एकल अणु माप" पर कब्जा ।
    2. आगे के विश्लेषण के लिए एकल-अणु घटनाओं को दर्शाने वाले ईवेंट सहेजें.
  3. समोच्च-लंबाई वृद्धि निर्धारित करें ।
    1. प्रत्येक रिकॉर्डिंग के लिए, एक कीड़ा की तरह श्रृंखला मॉडल घटना खुलासा करने के लिए Equation 2 फिट Equation 3 , जहां कमरे के तापमान पर, पी हठ लंबाई है (आमतौर पर ०.४ करने के लिए 1 एनएम), एक्स nanometers में विस्तार है, और एल में समोच्च लंबाई है नैनोमीटर.
      नोट: कीड़ा की तरह श्रृंखला के रूप सटीक करने के लिए एक दुओं समाधान है, एक और अधिक सटीक संख्यात्मक समाधान bouchiat एट अल में पाया जाता है । 17. वैकल्पिक फिटिंग मॉडल Su एट अल में पाया जा सकता है । 18.
    2. दो लगातार खुलासा घटनाओं के लिए निर्धारित एल के लिए मूल्यों के बीच अंतर की गणना, और इस अंतर गढ़ा है "समोच्च लंबाई वृद्धि".
  4. टूटना बल निर्धारित करते हैं ।
    1. खुलासा वक्र में सबसे बड़ी गिरावट से पहले उच्चतम बिंदु लेने के द्वारा एक दिया खुलासा घटना के लिए टूटना बल की गणना ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल से प्रतिनिधि परिणाम चित्र 2में दर्शाए गए हैं । दोनों पैनलों प्रोटीन से प्रतिनिधि बल-विस्तार घटता दिखाते हैं । शीर्ष एक I91 पॉलीप्रोटीन से परिणाम से पता चलता है, जबकि नीचे I91 प्रोटीन का एक प्रोटीन-ब्याज, एनआई10सी अणु अगल बगल से पता चलता है । इन रिकॉर्डिंग I91 (२०० pN) और समोच्च लंबाई वेतन वृद्धि (28 एनएम) जो इंगित करता है कि संरेखण और afm के अंशांकन सफल था की विशेषता बल दिखा । ये बल-विस्तार घटता है तो कृमि की तरह जंजीरों का विश्लेषण किया जा सकता है (डैश्ड लाइन) जो अणु के बल स्वतंत्र लंबाई निर्धारित करने में मदद और सामने आया अवशेषों की संख्या निर्धारित करते हैं । एक बार विश्लेषण, समोच्च लंबाई वेतन वृद्धि (बाद समोच्च लंबाई के बीच अंतर) और खुलासा बल के लिए प्रोटीन स्थिरता, खुलासा दर का निर्धारण किया जा सकता है, और खुलासा मार्ग19।

Figure 1
चित्र 1: पॉलीप्रोटीन का प्लाज्मिड मानचित्र । यह पॉलीप्रोटीन प्लाज्मिड मानचित्र अनुक्रम और शारीरिक डीएनए addgene रिपॉजिटरी (www.addgene.org/74888) के माध्यम से उपलब्ध है । यह afm, जहां एक polyprotein I91 प्रोटीन (ग्रे बक्से) के 8 समान दोहराता है जो ब्याज की एक प्रोटीन (लाल) के पार्श्व से बना है के लिए prototypical पॉलीप्रोटीन डिजाइन से पता चलता है । प्रत्येक मॉड्यूल अनुकूलन की अनुमति देता है जो एक अद्वितीय प्रतिबंध साइट शामिल हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि smfs परिणाम. A. पाली I91 प्रोटीन के लिए प्रतिनिधि बल-विस्तार वक्र । मतलब समोच्च लंबाई वृद्धि चोटियों के बीच ~ 28 एनएम है, और खुलासा बलों 100-200 pN के बीच हैं । B. प्रतिनिधि बल-विस्तार वक्र के लिए (I91)3-NI10C-(I91)3 प्रोटीन. अंयरिन दोहराने के लिए समोच्च लंबाई वृद्धि मतलब ~ १०.५ एनएम है, और खुलासा बलों 8-25 pN के बीच हैं । एंकायरिन दोहराता के लिए नियमित रूप से देखा-टूथ पैटर्न I91 खुलासा चोटियों के बाद किया जाता है । दोनों के लिए खींच गति (एक) और (ख) ०.०२ एनएम/ इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें कृपया कर रहे हैं ।

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Discussion

प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम एक पॉलीप्रोटीन का उपयोग है, चरण 1.1.2 में वर्णित है, जो "फिंगरप्रिंट" एकल अणु की घटनाओं के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है । आम तौर पर, पॉलीप्रोटीन प्रोटीन की घटनाओं का खुलासा होना चाहिए (I91 के लिए, इस के बारे में एक खुलासा बल का मतलब है २०० pN और समोच्च लंबाई के बारे में वेतन वृद्धि के बारे में 28 एनएम) स्पष्ट रूप से निष्कर्ष है कि ब्याज के प्रोटीन का खुलासा किया गया है. उदाहरण के लिए, जब ब्याज की प्रोटीन दोनों तरफ से तीन I91 डोमेन से flanked है, तो वहां कम से चार I91 घटनाओं को समाप्त होना चाहिए कि यह सकारात्मक एक एकल अणु घटना है । यदि कोई पॉलीप्रोटीन, या अन्य साधनों के माध्यम से सकारात्मक नियंत्रण नहीं है, तो कोई भी डेटा अशुद्ध अर्थ के लिए उत्तरदायी है ।

प्लाज्मिड के लिए क्लोनिंग रणनीति ब्याज की जीन और प्लाज्मिड पर निर्भर करती है । हम उपलब्ध कराया है एक पॉलीप्रोटीन प्लाज्मिड जो इस प्रोटोकॉल के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता12. इस कदम के लिए उपलब्ध plasmids है कि सरल20,21क्लोनिंग के लिए अद्वितीय प्रतिबंध साइटों को शामिल कर रहे हैं । इन plasmids केवल प्रतिबंध साइटों की एक अनूठी सेट के लिए आसानी से प्लाज्मिड में ब्याज के प्रोटीन में क्लोन की आवश्यकता है । वहां भी तरीके से इस प्लाज्मिड बनाने के लिए खरोंच से गिब्सन22 विधानसभा का उपयोग कर रहे है जो आसानी से flaking प्रोटीन को संशोधित करने का लाभ है जबकि ब्याज की प्रोटीन डालने उपलब्ध हैं । वहां भी कर रहे है साथ मॉड्यूलर polyproteins के साथ plasmids कोडोन साधा डोमेन है कि एक सरल तरीका कुशलतापूर्वक ब्याज की पूरी प्रोटीन अनुक्रम प्रदान करने के लिए, निष्ठा21सुनिश्चित करने में सहायता ।

सोने या कांच के विकल्प पर निर्भर करता है कि क्या प्रोटीन विशिष्ट लगाव उपलब्ध है । गोल्ड सबस्ट्रेट्स पॉलीप्रोटीन और सतह के बीच Au-cys बांड बनाने के लिए अनुमति देते हैं । यदि एक cys पॉलीप्रोटीन के अंत में संलग्न है, तो यह एक तरह से विशेष रूप से सतह के लिए प्रोटीन संलग्न के रूप में सेवा कर सकते हैं । कांच substrates स्वयं द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है, जो कुछ प्रोटीन के लिए उपयोगी होते हैं जो सोने के लिए अच्छी तरह से अधिशोषण नहीं है और भी उत्पन्न करने के लिए सरल कर रहे हैं. कांच स्लाइड भी विशेष रूप से बनाया polyproteins23के साथ विशिष्ट लगाव का उपयोग करने के लिए एक अग्रदूत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । मीका substrates भी इस्तेमाल किया जा सकता है, जो कुछ प्रोटीन जो विशिष्ट चार्ज साइटों है कि नकारात्मक आवेशित सतह के लिए बाध्य कर सकते है के लिए उपयोगी हो सकता है ।

प्रोटीन पर afm स्पेक्ट्रोस्कोपी कई महत्वपूर्ण सीमाएं हैं । नमूना तैयारी विफल हो सकता है अगर प्रोटीन एक पॉलीप्रोटीन में होनोलुलू नहीं किया जा सकता. प्रोटीन कि औसत दर्जे का समोच्च लंबाई वेतन वृद्धि या भी बल का विरोध करने के लिए कमजोर उत्पादन करने के लिए बहुत छोटे हैं भी afm द्वारा हल किया जा करने में सक्षम नहीं होगा. afm प्रयोगों में ठेठ संकल्प केवल 10-15 pN afm cantilevers में ठेठ RMS शोर के कारण के रूप में कम के रूप में बलों को हल करने की अनुमति देता है, हालांकि हाल के अग्रिमों उंनत इंस्ट्रूमेंटेशन24के साथ बेहतर समाधान उपलब्ध कराया है । लगातार वेग प्रयोगों के लिए गति भी के बारे में करने के लिए सीमित है 4 एनएम/एस25, और सबसे अच्छा प्रस्ताव हासिल आमतौर पर 10 μs से कम राज्यों का पता लगा सकते हैं24. यदि प्रोटीन कम यंत्रवत् स्थिर हैं, वे बेहतर ऑप्टिकल चिमटी जो एक कम बल रेंज और आम तौर पर एक उच्च लौकिक संकल्प किया है का उपयोग कर विशेषता है । वहां अभी भी भविष्य में सुधार कर रहे है afm के लिए उपलब्ध है, fret26के साथ संयोजन की तरह, afm इमेजिंग का उपयोग करने के लिए प्रोटीन27 पदों का निर्धारण और विशेष रूप से डिजाइन के साथ संकल्प बढ़ रही है28cantilevers ।

afm तकनीक मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्वपूर्ण है क्योंकि यह काइनेटिक मापदंडों निकालने की अनुमति देता है, एक ही अणु स्तर29पर दर और संक्रमण राज्य दूरी का खुलासा की तरह । जबकि अन्य पारंपरिक जैव रासायनिक तरीकों (एनएमआर, रासायनिक विकृतन, बंद कर दिया-प्रवाह प्रतिदीप्ति) भी काइनेटिक मापदंडों के बारे में जानकारी प्राप्त कर सकते हैं, इन तरीकों के परिणाम एक प्रोटीन एनसेंबल के कार्य कर रहे हैं और एक भी अणु नहीं. यह मामलों में एक महत्वपूर्ण अंतर है जहां एक ही प्रोटीन के विभिंन और अलग ensembles हैं । afm को subपॉपुलेशन भेद कर दिखाया गया है, उंहें औसत के बजाय एक साथ30।

ऊपर प्रोटीन अणुओं पर smfs प्रयोग के विस्तृत विवरण अभी भी संभव समस्याओं है कि अनुभव के साथ हल किया जा सकता है आशा नहीं है । निम्नलिखित में हम सामान्य समस्याओं और निरंतर वेग प्रयोगों के लिए एक afm ऑपरेटिंग के साथ जुड़े समस्या निवारण पर चर्चा.

sinusoidal के आकार का बल आधार रेखा । यह आधारभूत की गणना करने के लिए मुश्किल है के बाद से sinusoidal आकार सही बल पीक मान निर्धारित करने के लिए हानिकारक है. समस्या cantilever से परिलक्षित लेजर के हस्तक्षेप के कारण होता है । इस समस्या को दूर करने के लिए, ब्रैकट पर लेजर स्पॉट की स्थिति थोड़ा के रूप में लंबे समय के रूप में स्थानांतरित कर सकते है नई स्थिति अभी भी photodiode से एक अच्छा राशि संकेत बरकरार रखती है । यदि समस्या अभी भी बनी रहती है, तो जांच होल्डिंग सेल में कैंटीलीवर को पुन: पोजिशनिंग पर विचार करें ।

फोटोडायोड संकेत एक चरण में संतृप्त नहीं होता है जब पहली बार सतह को छूते हैं । जब सतह को छूने, photodiode संकेत कई चरणों में कूदता है जब तक यह संतृप्त मूल्य तक पहुँचता है. इसका मतलब यह है कि टिप afm सिर में सबसे कम बिंदु नहीं है और जांच चिप पर कुछ अंय जगह cantilever की नोक से पहले नमूना सतह को छू सकता है । यह समस्या smfs माप जारी रखने के लिए और सही बल-एक्सटेंशन वक्र प्राप्त करने के लिए तय किया जा करने के लिए है । समस्या को ठीक करने के लिए, जांच होल्डिंग सेल में कैंटीलीवर की स्थिति को आगे और पीछे ले जाने और हुक की जकड़न को समायोजित करने का प्रयास करें जो जगह में कैंटीलीवर को समझ रहा है । यदि यह मदद नहीं करता है, एक ही चिप पर एक अलग ब्रैकट स्विचन या यहां तक कि एक नया ब्रैकट चिप को बदलने की कोशिश करो ।

retraction पर कई घटनाओं, या कोई घटना बिल्कुल । यह प्रयोग के लिए सही प्रोटीन एकाग्रता खोजने से संबंधित है । अगर वहां हमेशा एक ही बड़ी शक्ति चोटी (> ५०० pN) खींच ट्रेस पर प्रदर्शित होने और कोई अंय चोटियों जबकि सोने लेपित सतह पर प्रयोगों का आयोजन प्रदर्शित कर रहे हैं, ब्रैकट वास्तव में सोने के नमूने अणुओं के बाद से सोने की बातचीत को मापने है सतह भी विरल हैं । इस मामले में, सोने की सतह पर जमा प्रोटीन नमूना की एकाग्रता में वृद्धि की जानी चाहिए । हालांकि, अगर वहां कई अनियमित आकार के प्रत्येक खींच चक्र के हर खींच ट्रेस पर दिखाई चोटियों हैं, यह इंगित करता है कि वहां भी कई सतह है कि एक परत या सतह पर एक जटिल नेटवर्क का गठन करने के लिए अवशोषित अणुओं हैं । इस मामले में, नमूना अतिरिक्त प्रोटीन अणुओं को हटाने के लिए इस्तेमाल किया बफर द्वारा धोया जा करने के लिए की जरूरत है । कई बार प्रोटीन की कम एकाग्रता के साथ एक नया नमूना तैयार करने के लिए इस समस्या से छुटकारा पाने के लिए आवश्यक है. यदि नए नमूने भी समस्या का समाधान नहीं कर सकते हैं, afm होल्डिंग सेल पर पाले सेओढ़ लिया वलयाकार नाली की जांच करने के लिए देखने के लिए कि यह किसी भी तरल में प्रवेश किया । नाली प्रयोग के दौरान सूखी रहना चाहिए क्योंकि नाली में किसी भी तरल पकड़ सेल में नमूना के कंपन जोड़ा जाएगा और photodiode संकेत असामान्य रूप से बदलने के लिए जब ब्रैकट और सतह के संपर्क में हैं कारण.

प्रकाश डायोड संकेत का नकली मॉडुलन, रैंप के बीच. यह प्रवाह का संकेत है कि ब्रैकट आगे और पीछे धक्का कर सकते हैं, जो आमतौर पर एक छोटा सा बुलबुला है कि द्रव चैनलों के माध्यम से गुजरेगा है के कारण होता है । समस्या के इस प्रकार के विशाल संकेत बढ़ जाती है या कम हो जाती है के साथ माप को बाधित करेगा । इस समस्या को हल करने के लिए, सब्सट्रेट से सिर उठाएँ, ताकि ब्रैकट के आसपास द्रव अब सब्सट्रेट के आसपास तरल पदार्थ को छूता है. फिर उन्हें एक साथ वापस लाने, और सिर वापस सतह के लिए नीचे ले जाएँ. afm सेल में द्रव कॉलम के सुधार आमतौर पर तरल चैनल से बुलबुला बाधित करने के लिए पर्याप्त है, लेकिन अगर नहीं, दोहरा आवश्यक है ।

फोटोडायोड संकेत में व्यवस्थित वृद्धि या कमी । बहती एक घटना है कि प्रत्येक प्रयोग, जहां cantilevers और टिप हमेशा बहुत तेजी से नमूना सतह पर तरल बूंद को छूने पर बहाव होगा भर में मौजूद है । बहाव तापमान समानता के कारण हो सकता है, जिसमें तापमान-प्रेरित विस्तार या ब्रैकट के संकुचन संकेत में कंपन का कारण बनता है । पहले प्रयोग के संचालन से अधिक 10 मिनट के लिए प्रतीक्षा में काफी बहती गति कम हो जाएगी । जब खींच प्रयोगों का आयोजन, खींच और आराम ट्रेस एक दूसरे के साथ मेल नहीं करते हैं, तो खींच चक्र है, जो एक तेजी से बहती दर से मेल खाती है और तक पहुँचने के लिए अतिरिक्त समय की आवश्यकता के दो हिस्सों के बीच एक शैथिल्य theres संतुलन. यदि बल आधारभूत एक छोटे कोण के साथ ऊपर की ओर झुका देता है, तो बहती गति खींचने की गति से तेज है और टिप के कम कंपन के लिए प्रतीक्षा करने के लिए प्रयोग को निलंबित करना बेहतर है ।

बल-विस्तार वक्र आरंभिक क्षेत्र ऊर्ध्वाधर नहीं है । यह एक नए calibrated सेटअप से प्राप्त किया गया है के बाद रिकॉर्डिंग के बल-एक्सटेंशन प्लॉट को देखने के लिए उपयोगी है । यदि ये रिकॉर्डिंग किसी अनुलंब क्षेत्र नहीं दिखाएँ जब ब्रैकट सतह के विरुद्ध दबाता है, तब अंशांकन एक समस्या हो सकती है और इसे चरण 5से दोहराया जाना चाहिए ।

प्रकाश डायोड संकेत कुछ समय के बाद गायब हो जाता है । यह द्रव कोशिका में बफर के वाष्पीकरण के कारण हो सकता है. यह अधिक बफर हर घंटे लागू करने से सेल rehydrate करने के लिए महत्वपूर्ण है या तो, आदेश में बाहर सुखाने से नमूना रखने के लिए और यह आगे प्रयोगों के लिए अनुपयोगी बना.

आंतरिक शोर उच्च है (> 30 pN). शोर की एक बड़ी राशि (calibrated photodiode fluctuations के RMS के रूप में मापा) बाहरी शोर का संकेत है. afm प्रयोगों के निर्माण के लिए युग्मन की राशि को कम करने के लिए एक हवा की मेज पर किया जाना चाहिए, लेकिन बाहरी शोर भी असुरक्षित मंच के कारण हो सकता है, श्रवण शोर पास, या हवा तालिका के युग्मन पास स्थिर वस्तुओं के लिए (जैसे, एक कुर्सी). शोर भी afm के इलेक्ट्रॉनिक नियंत्रण प्रणाली से आ सकता है (जैसे, इलेक्ट्रॉनिक प्रणाली में अस्थिर कनेक्शन) ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के लिए राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान mcb-१२४४२९७ और mcb-१५१७२४५ pem द्वारा समर्थित था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM Specimen Discs, 15mm diameter Ted Pella, Inc. 16218 Serve as base for glass substrate
Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick Ted Pella, Inc. 26024 serve as glass substrate and base for gold coating
Adhesive Tabs Ted Pella, Inc. 16079 Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips
STD Multimode head assembly Bruker Nano Inc. 1B75C AFM head
Glass probe holder Bruker Nano Inc. MTFML-V2 Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM.  
Microlever AFM probes Bruker Nano Inc. MLCT Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes
AFM probes with Au coated tips Bruker Nano Inc. OBL-10 Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force
Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs National Instruments PCI-6259 Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators
LISA Linear Piezo Stage Actuators Physik Instrumente LP P-753.11C Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements
XY Piezo Stage Physik Instrumente LP P-541.2CD Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface

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References

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Scholl, Z. N., Li, Q., Josephs, E., Apostolidou, D., Marszalek, P. E. Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope. J. Vis. Exp. (144), e55989, doi:10.3791/55989 (2019).

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