Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Tvinge spektroskopi enkelt Protein molekyler med en Atomic Force mikroskopet

Published: February 28, 2019 doi: 10.3791/55989
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Mechanical Engineering and Materials Science, Duke University

Summary

Vi beskriver detaljerte fremgangsmåter og strategier for å måle mekaniske egenskaper og mekanisk unfolding veier av enkelt protein molekyler med en atomic force mikroskop. Vi har også vise representant resultater som referanse for valg og justering av god enkelt protein molekyl innspillinger.

Abstract

Fastsettelse av folding proteiner fra deres aminosyresekvens til deres opprinnelige 3D struktur er viktig problem i biologi. Atomic force mikroskopi (AFM) kan løse dette problemet ved å aktivere strekking og avslapning av enkelt protein molekyler som gir direkte bevis av bestemte Utfolding og refolding egenskaper. AFM-baserte single-molekylet kraft-spektroskopi (AFM-SMFS) gir et middel til å måle konsekvent strømkrevende konformasjonen i proteiner som ikke er mulig i tradisjonell bulk (biokjemiske) mål. Selv om mange avhandlinger ble publisert for å vise prinsipper AFM-SMFS, er det ikke lett å utføre SMFS eksperimenter på grunn av en grundig komplett protokoll. I denne studien vi kort illustrere prinsippene i AFM og detalj mye protokoller, prosedyrer og dataanalyse som en retningslinje å oppnå gode resultater fra SMFS eksperimenter. Vi viser representant SMFS resultatene av enkelt protein mekanisk unfolding målinger og tilbyr feilsøking strategier for noen ofte støtt på problemer.

Introduction

Fremskritt innen ett molekyl force spektroskopi (SMFS) av AFM har aktivert mekanisk manipulasjon og presis karakterisering av enkelt protein molekyler. Denne karakteristikken har produsert romanen innsikt om protein mekanikk1,2, protein folding3, protein-ligand interaksjoner4, protein-protein interaksjoner5, og protein-basert utvikling materialer6,7,8. SMFS er spesielt nyttig for å studere protein utspiller seg, som strekker seg av AFM lar kjemiske og fysiske obligasjoner i protein molekylet gradvis utvide ifølge deres stivhet, som gir opphav til en stadig økende omkrets. Denne overstrekking av et protein molekyl kan produsere en brå overgang i kraft-utvidelse kurven som resulterer i en ruptur hendelse (eller tvinge topp). Force toppen gir direkte informasjon om unfolding styrke og strukturelle endringen av proteinet under mekanisk unfolding prosessen. En av de første studiene ved hjelp av AFM målt titin1 og fant romanen aspekter av protein Utfolding og refolding under fysiologiske forhold uten bruk av unaturlig denaturants som konsentrert kjemikalier eller ekstreme temperaturer.

SMFS eksperimenter er gjennomført på en rekke instrumenter, men her vi vurdere bare AFM. AFM består av fire hovedelementer: sonden, detektoren, prøve holderen og piezoelektrisk skanneren. Sonden er en skarp tips på den free-swinging enden av en cantilever. Etter kalibrering måles bøying hengende under strekking av en tilknyttet molekyl ved hjelp av en laserstråle som gjenspeiles av baksiden av hengende presist å avgjøre styrker med Hookes lov. Gjenspeiles laser strålen prosjektene i en kvadrant photodiode detektor som produserer en spenning til forskyvning av laserstrålen fra diode center. Underlaget med protein prøven i væske er montert på en 3D piezoelectric som kan kontrolleres med sub nanometer presisjon. En datamaskin leser spenningen fra de photodiode detektorer og styrer 3D scenen gjennom en datastyrt nettspenningen. Disse piezo aktuator faser er vanligvis utstyrt med kapasitive eller stamme-gauge posisjon sensorer å presist måle piezo forskyvning og riktig hysteresis gjennom tilbakemelding kontrollsystem. Sensor-utsignal fra piezo kontrolleren omdannes til avstand med konstant spenning av piezo som er kalibrert til fabrikken. En eksempel kraft-utvidelse kurve fra en trekke eksperiment er vist i figur 2.

Det finnes to typer AFM-SMFS eksperimenter: konstant hastighet og konstant kraft trekke målinger. Konstant kraft SMFS mål er beskrevet i Oberhauser et al. 9, mens her vi fokuserer på konstant hastighet målinger. En typisk AFM konstant hastighet trekke eksperiment gjøres ved å gi spenning til en piezo forsiktig flytte et substrat i forhold til en cantilever tips. En typisk eksperimentet har tipset først trykker mot overflaten. Trekke målingen er begynt ved å flytte underlaget fra spissen for å få ut av kontakten. Hvis et protein kommer i kontakt med spissen først, vil det bli trukket og unfolding spor av makt mot forskyvning vil bli målt. Underlaget er så brakt tilbake i kontakt med spissen og avslappende spor måles der proteinfolding kan bestemmes fra kraft forskyvning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. protein forberedelse

  1. DNA kloning.
    1. Syntetisere en DNA sekvens av interesse, for eksempel DNA sekvensen av NI10C10, eller isolere via PCR fra verten organisme ved hjelp av standard molekylærbiologi teknikker11. Flanke genet av interesse med begrensning nettsteder under syntese eller ved å plassere områder i 5'-slutten av PCR primere for tilsvarer en modul i plasmider pEMI91 (Addgene #74888)12.
    2. Separat fordøye både plasmider pEMI9112 og DNA sekvensen rundt med et par begrensning nettsteder slik at sekvensen rundt blir flankert av tandem I91 gjentar (se figur 1). Følg standardprotokollen for webområdene begrensning.
    3. Rens fordøyd produktet bruker gel geleelektroforese og deretter ligate produkter med T4 DNA ligase, etter en standardprotokoll. Etter hemorroider, forvandle plasmider E. coli celler for plasmider rensing og rense plasmider ved hjelp av standardprotokoller. Sekvens med T7 primere eller interne pEMI91 primer kontrollere at sekvensen ble vellykket forvandlet.
  2. Transformasjon.
    1. Fjerne protein uttrykk celler, for eksempel C41 (DE3) pLysS celler, fra en-80 ° C fryser og tine helt på is.
    2. Legg 1 µL av plasmider DNA til cellene og rør kort; pipettering opp og ned er ikke tilrådelig som det vil introdusere luftbobler og varme cellene.
    3. Inkuber kultur røret som inneholder cellene og plasmider på is 30 min.
    4. Varme sjokk cellene i et vannbad på 42 ° C i 45 s.
    5. Returnere røret til is i 2 minutter.
    6. Plasser 950 µL av LB kjøttkraft i cellene og riste på 250 rpm 1t på 37 ° C.
    7. Sett ca 200 µL av transformasjonen på LB plater som inneholder 100 µg/mL Ampicillin. Hvis bruker en plasmider enn pEMI91, bruk det passende antibiotikumet for at plasmider. Plasser platen over natten i en inkubator på 37 ° C. Neste dag, Fjern plate inkubator, Pakk med parafilm, og lager kjøling opptil 1 måned.
  3. Protein uttrykk.
    1. Vaksinere 15 mL LB kjøttkraft medium med 100 µg/mL ampicillin i en 50 mL tube på 37 ° C for overnatting vekst ved å berøre et sterilt pipette tips til en enkelt bakterie kolonien på tallerkenen og pipettering opp og ned i LB.
    2. Overføre 15 mL kulturen til 1 L LB kjøttkraft medium med 100 µg/mL ampicillin og riste for 4-12 h på 37 ° C (til OD600 > 0,8).
    3. Samle 10 mL av kultur for plasmider forberedelse.
    4. Legg 0,2-1 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) og senke temperaturen til romtemperatur over natten uttrykk.
    5. Høste celler dagen av deler i fire rør og sentrifugering på 4000 × g i 40 minutter, og deretter fryse pellet ved-80 ° C i flere timer.
    6. Send plasmider utdraget fra cellene for sekvensering med primerne tilsvarer innsatte kassetten av protein12 og kontrollere gjengivelsen av innsatte DNA.
  4. Protein rensing.
    1. Tine en tube av frosne celler i 30 min ved romtemperatur.
    2. Suspendere tinte celler i lyseringsbuffer (38 mL vann, 2 mL glyserol, 50 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl210 µg/mL DNase, 1 mM PMSF, 1 mM TCEP, 500 µg/mL lysozyme) og riste på is 1t.
    3. Fryse lysed cellene ved-80 ° C i flere timer og deretter igjen tine ved romtemperatur.
    4. Spinn lysate ned 13,100 × g i 30 min på 4 ° C.
    5. Kjør nedbryting gjennom en gravitasjon flow kolonne for den bestemte koden (f.eks, Strep-tag eller hans-tag).
    6. Utføre en buffer utveksling bruker en sentrifugal filter bruker den riktige bufferen for Strep-ID eller hans-tag og butikk på 4 ° C før bruk.

2. lysbilder forberedelse for eksempel forberedelse

  1. Forberede glass lysbilder med Piranha løsning.
    1. Sted 10-30 stykker av runde glass cover slips (radius 7,5 mm) i et 40 mL glass beger.
      Merk: Utføre dette trinnet og følgende i hette. Følg standard prosedyrer for håndtering av farlige kjemikalier i dette trinnet.
    2. Legge til 30 mL av konsentrert svovelsyre for (18,4 M).
    3. Legge til 10 mL av 30% hydrogenperoksid.
    4. Varm blandingen i 10-30 min til 95 ° C.
    5. Nøye Dekanter Piranha løsningen i en separat avfallsbeholderen (til gjenbrukes eller forkastet).
    6. Skyll lysbildene med deionisert vann fjerne Piranha løsningen.
    7. Avbryte lysbildene 40 mL aceton.
    8. Dekanter aceton i en avfall beholder og å suspendere lysbilder i 40 mL av etanol.
    9. Bruk ren tang nøye ett lysbilde om gangen og tørk med argon eller renset luften.
    10. Sted rent og tørket lysbilder under vakuum til gull fordampning, eller argon for langtidslagring.
  2. Klargjøre gull belagt lysbildene (valgfritt).
    Merk: Dette trinnet krever bruk av en vakuum (e-beam) fordamperen, som er tilgjengelig i mange rom. fasilitetene på store universiteter.
    1. Halvert fem objektglass (25 x 75 mm rektangel) med en glasscutter.
    2. Bruke dobbeltsidig teip over midten av hver av 10 halv objektglass.
    3. Klipp den selvklebende siden av en klistrelapp og gjelder dobbeltsidig tape slik at det klissete siden notatet er synlige. Klebrige notatet er generelt mindre selvklebende, men festes fortsatt til lysbilder å hindre fremtidige bryte. Deretter kan de halve objektglass nå fungere som glass lysbilder holderen.
    4. Trykk fire rent glass lysbilder (fra delen 2.1.10) til hvert hjørne av det klissete siden av holderen.
    5. Flytte glass lysbilder til en e-beam fordamperen. Følg spesifikasjonene til fordamperen gjelder 70 nm i krom og 300 nm gull til overflaten.
    6. Lagre gull-belagt lysbildene under argon.

3. eksempel forberedelse

  1. Forberede lysbildet.
    1. Velg en ren jern disk (15 mm diameter) og fest en lim kategorien til den.
    2. Unattach dekselet stykke selvklebende kategorien.
    3. Velg ren glass (fra delen 2.1.10) eller gull (fra delen 2.2.7) og plasserer fast den på den selvklebende siden av jern disken, vil dette være eksempel lysbildet.
  2. Innskudd protein på lysbildet.
    1. Dialyze polyprotein i bufferen for eksperimentet (25 mM Tris-HCl, pH 7.6 med 150 mM NaCl) bruker en buffer exchange kolonne som filtere 0,5 mL sentrifugalpumper. Spinn proteinet i kolonnen for 10 min 13.000 RPM og deretter reversere kolonnen og elute protein inn i en ny buffer av snurrende 1000 RPM i 2 minutter.
    2. Bestemme omtrentlig protein konsentrasjonen av måler absorbansen på 280 nm, bruker et spektrofotometer.
    3. Fortynne protein til 10-100 µg/mL i et siste volum på 100 µL.
    4. Bruke den 60 µL av protein løsning på midten av lysbildet. Pass på ikke å la væske inn under inn i gapet mellom glasset og jern lysbildet, da dette kan føre til hevelse av limet under eksperimentet og ukontrollert eksempel bevegelser.
      Merk: Gull lysbilder er hydrofobe en sfærisk dråpe vil danne, mens glass lysbilder er mer hydrofile og protein løsningen kan spres.
    5. La prøven sitte ved romtemperatur for 10-60 minutter. Samtidig Fortsett til neste trinn å begynne å sette opp atomic force mikroskopet.

4. atomic Force mikroskopet (AFM) oppsett

Merk: Følgende er en generell beskrivelse for å sette opp AFM, og noen spesifikke detaljer kan variere avhengig av den bestemte instrumenteringen brukes. Instrumentering brukes er delvis hjemme-bygget og beskrevet i detalj i Scholl13.

  1. Montere hengende på en AFM celle.
    1. Velg hengende med passende egenskaper for applikasjonen. Bruk cantilevers med våren konstanter 4-10 pN/nm for lav unfolding styrker (~ 10-50 pN), mens bruk cantilevers med våren konstanter 15-100 pN/nm for høy unfolding styrker.
    2. Forsiktig plukke opp hengende fra slutten og plasser den i sonden holder cellen.
    3. Kontroller at friplassen fast holder hengende på plass før du fortsetter.
    4. Plass holdingselskap celle i AFM hodet for justering av laser.
  2. Justere laseren i AFM hodet.
    1. Plasser hodet på en invertert mikroskop og koble en batteripakke til AFM hodet for strøm laser i hodet.
    2. Koble et kamera til mikroskopet detektoren slik at laserlys kan visualiseres på en TV eller skjerm.
    3. Plasser laser slik at den ligger på spissen av hengende
  3. Montere hodet med eksempler.
    1. Tømme 10 µL bufferen i hver av portene på sonden holder cellen.
    2. Ta prøven lysbildet som har vært rugende og Dekanter 40 µL av væske fra inkubert løsning. Legge til 40 µL av bufferen på lysbildet. Plass prøven lysbildet på magneten over piezo.
    3. Kontroller at AFM scenen i plassering. Plass AFM hodet på scenen slik at AFM hengende over eksempel slippverktøyet.
  4. Center reflektert laserstrålen på photodiode.
    1. Klippe et lite stykke papir og plasser det foran AFM photodiode.
    2. Omplasser AFM laser bruke knotter slik at laser stedet på papiret blir fokusert og lyse.
    3. Juster AFM hodet speilet slik at laseren treff photodiode for å maksimere totale signalet i alle kvadranter (A + B + C + D) og signalet forskjellen mellom to øverste og nederste to kvadranter å være null (A + B-C-D).

5. atomic Force mikroskop kalibrering

  1. Måle makt spekteret.
    1. På filteret koblet til AFM, slå til filterinnstillingene for AFM hodet signalet til full båndbredde.
    2. I AFM selv, kontrollerer du at piezo er av som dette vil legge støy til signalet.
    3. Bruk den AFM programvare14 å måle gjennomsnittet av 512 beregninger av makt spekteret fra 1024 datapunktene per beregning.
    4. Bruk AFM programvare15 for å integrere spectral tetthet over første toppen, som tilsvarer det viktigste modusen for vibrasjon for hengende.
  2. Beregne photodiode følsomhet.
    1. På AFM seg selv, aktivere piezo kontrolleren og endre filterinnstillingen for til 500 Hz (low pass-filteret).
    2. Overvåke forskjellen signalet som bør være varierende rundt null i AFM programvaren. Raskt flytte AFM hodet ned noen få hundre mikrometer bruker micropositioners. Gjenta flytte hodet ned og overvåke forskjellen signalet for konsekvent hopp. Overflaten er svært i nærheten når signalet hopper begynne å øke i høyden.
    3. Så snart nedbøyning signalet saturates ved kontakt med overflaten, bevege hodet fra overflaten litt.
    4. I AFM programvaren, bruker du kildekontrollene for å regulere piezo spenningen du finner overflaten, ved å flytte opp eller ned 100-5000 nm. Hvis overflaten ikke er fortsatt i rekkevidde, fortsette å redusere avstanden mellom hodet og prøven manuelt.
    5. I AFM programvaren, gjennomføre en trekke eksperimentere med en skanning størrelse på ca 500 nm slik at tipset kommer i kontakt i rundt 100 nm piezo reise.
    6. Måle stigningstallet for den lineære regionen av photodiode signal versus piezo forskyvning kurven hvor AFM spissen er fortsatt i kontakt med substrat overflate.
    7. Beregne våren konstant og følsomhet ved hjelp av skråningen og integrert strøm spekteret (Equation 1).

6. datainnsamling

  1. Forberedelse.
    1. På filtre koblet til AFM, angi filteret innstillingen slik at samplingsfrekvens er minst to ganger båndbredden (Nyquist kriteriet), som vil gi en øvre grense for low pass cut-off.
  2. Målinger.
    1. Angi skanning til teoretisk totalstørrelsen unfolding polyprotein (antall aminosyrer × 0.365) pluss ca 40% å tillate trykke mot underlaget. For eksempel trekke en 9 x I91 konstruksjon vil ha en teoretisk brettet lengde på ca 300 nm, så skanning størrelsen skal være ca 420 nm.
    2. Plasser hengende i AFM programvaren, slik at det er 80% av skanning-størrelse fra overflaten (i dette tilfellet om 340 nm fra overflaten).
    3. I AFM angi programvare, skannehastighet 300 nm/s først.
      Merk: Denne hastigheten kan endres til langsommere eller raskere, avhengig av programmet.
    4. Utføre en trekke eksperiment og måle den resulterende plasseringen av piezo og photodiode signalet. Bruk AFM programvaren for å starte søket.
    5. I AFM programvaren, fortsette å utføre målinger før det er 10.000 innspillinger.
      Merk: Vanligvis er pickup en positiv-kontrollerte molekylet rundt 0,5%16, så 10.000 er nødvendig for å kunne samle inn nok data til å analysere.

7. dataanalyse

  1. Normalisere data.
    1. For hver innspilling, beregne forlengelsen benytter forlengelsen = forskyvning - F/kc (kc er fra 5.2.7).
    2. Finn grunnlinjen force nivå ved å ta gjennomsnittet av enten på begynnelsen eller slutten av force-utvidelse spor, der ingen kraft topper er tilstede og hvor hengende ikke er trykke mot overflaten. Hele styrke-utvidelse kurven kan deretter bli forskjøvet denne middelverdien.
    3. Oversette data slik at filtypen er justert langs den null y-aksen. Dette er fordi molekylet bør settes til null utvidelse i begynnelsen av et spor.
  2. Identifisere protein av interesse.
    1. Identifisere innspillinger med minst fire I91 hendelser som gir et enkelt-molekylet fingeravtrykk. Disse innspillingene fange sant "single-molekylet mål".
    2. Lagre hendelser som er betegnet single-molekylet hendelser for videre analyse.
  3. Bestemme kontur lengde økning.
    1. For hver innspilling, passer en ormen som forsyningskjeden modellen til etterfølgende hendelse, Equation 2 der Equation 3 i romtemperatur, p er utholdenhet lengden (vanligvis 0,4 til 1 nm) x er utvidelsen i nanometer og L er omkrets i nanometer.
      Merk: Av ormen som kjeden er en interpolert løsning på nøyaktig, en mer nøyaktig numerisk løsning er funnet i Bouchiat et al. 17. alternativ passende modeller finnes i Su et al. 18.
    2. Beregner forskjellen mellom verdiene for L bestemt for to påfølgende unfolding begivenheter, og denne forskjellen er skapt "kontur lengde tilvekst".
  4. Bestemme ruptur kraft.
    1. Beregne ruptur for en gitt unfolding hendelse ved å ta det høyeste punktet før største unfolding kurven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representant resultater fra denne protokollen er vist i figur 2. Både panelene viser representant kraft-utvidelse kurver fra proteiner. De viser resultater fra en I91 polyprotein, mens bunnen viser I91 protein flankerer en protein steder, NI10C molekylet. Opptakene viser karakteristiske kraft I91 (200 pN) og kontur lengde økning (28 nm) som indikerer at justeringen og kalibrering av AFM var vellykket. Disse kurver i force-utvidelse kan deretter analyseres av ormen som kjeder (stiplet linje) som bidrar til å avgjøre kraft-uavhengig molekylet og Finn nummeret på brettet rester. Når analysert, kontur lengde intervaller (forskjell mellom etterfølgende kontur-lengder) og unfolding styrken kan brukes til å bestemme protein stabilitet, unfolding rate, og utfolder veien19.

Figure 1
Figur 1: plasmider kart over polyprotein. Denne polyprotein plasmider kart sekvens og fysiske DNA er tilgjengelig gjennom Addgene depotet (www.addgene.org/74888). Det viser den prototypiske polyprotein designen for AFM, der en polyprotein består av 8 identiske gjentar I91 protein (grå bokser) som flanke et protein av interesse (rød). Hver modul inneholder en unik begrensning nettsted som lar deg tilpasse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: representant SMFS resultater. A. representant kraft-utvidelse kurve for poly I91 protein. Mener omkrets intervall mellom toppene er ~ 28 nm og unfolding styrker er mellom 100-200 pN. B. representant kraft-utvidelse kurve for (I91)3-NI10C-(I91)3 protein. Mener omkrets intervall for ankyrin gjenta er ~10.5 nm unfolding styrker er mellom 8-25 pN. Vanlig saw-tooth mønsteret ankyrin gjentar etterfølges av I91 unfolding topper. Dra hastigheten for både (A) og (B) er 0.02 nm/ms. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En avgjørende skritt i protokollen er bruken av en polyprotein, beskrevet i trinn 1.1.2, som fungerer som en positiv kontroll å "fingeravtrykk" single-molekylet hendelser. Generelt, det må være Utfolding hendelsene i polyprotein proteiner (for I91, betyr dette en unfolding kraft av ca 200 pN og kontur lengde økning av ca 28 nm) å entydig konkludere med at protein av interesse er brettet. For eksempel når protein av interesse er flankert av tre I91 domener fra hver side, være må det minst fire I91 arrangementer til å konkludere med at det er positivt en enkelt-molekylet hendelse. Hvis det ikke er en positiv kontroll gjennom en polyprotein eller annen måte, så er alle data ansvarlig for feiltolkninger.

Kloning strategien for plasmider er avhengig av genet og plasmider rundt. Vi har gjort tilgjengelig en polyprotein plasmider som kan brukes i forbindelse med denne protokollen12. Plasmider er tilgjengelig for dette trinnet som inneholder unike begrensning områder for enkel kloning20,21. Disse plasmider krever bare et unikt sett av begrensning nettsteder lett klone i protein av interesse i plasmider. Det er også metoder til å opprette denne plasmider fra grunnen av Gibson montering22 som har fordelen av lett å endre avskallinger proteiner stund setter inn protein av interesse. Det er også plasmider med modulære polyproteins med codon stokket domener som gir en enkel måte å effektivt sekvens hele protein av interesse, hjelpe til å sikre kvalitet21.

Valg av gull eller glass, avhenger av om protein har bestemt vedlegg som er tilgjengelig. Gull underlag tillate danner Au-Cys bånd mellom polyprotein og overflaten. Hvis en Cys legges til slutten av polyprotein, kan da dette fungere som en måte å feste spesielt protein på overflaten. Glass underlag kan brukes selv, som er nyttig for noen proteiner som ikke adsorberes godt til gull og er også enklere å generere. Glass lysbilder kan også brukes som en forløper til å bruke bestemt tilknytning med spesiallaget polyproteins23. Glimmer underlag kan også brukes, som kan være nyttig for noen proteiner som har spesifikke restriksjoner for nettstedene som kan binde til negativt ladde overflaten.

AFM spektroskopi på proteiner har flere viktige begrensninger. Eksempel forberedelse kan mislykkes hvis protein ikke kan være skjøtes til en polyprotein. Proteiner som er for liten til å produsere målbare kontur lengde intervaller eller svak å motstå kraft også kan ikke løses av AFM. Typisk oppløsning AFM eksperimenter kan bare løse styrker så lavt som 10-15 pN på grunn av den typiske RMS støyen i AFM utkragning, selv om nylige fremskritt har gjort tilgjengelig bedre resolutions med avansert instrumentering24. Hastigheten for konstant hastighet eksperimenter er også begrenset til ca 4 nm/s25, og den beste oppløsningen oppnådde kan vanligvis oppdage tilstander kortere enn 10 µs24. Hvis proteiner er mindre mekanisk stabile, bedre kjennetegnes ved hjelp av optisk pinsett som har en lavere makt rekkevidde og vanligvis høyere timelige oppløsning. Det finnes fortsatt forbedringer i fremtiden AFM, som kombinerer med bånd26, bruker AFM imaging for å bestemme protein posisjoner27 og økende oppløsning med spesialdesignet utkragning28.

AFM teknikken er viktig når det gjelder eksisterende metoder fordi utpakking kinetic parametre, som etterfølgende rate og overgangen staten avstand på en enkelt molekyl nivå29. Mens andre tradisjonelle biokjemiske metoder (NRM, kjemiske rødsprit, stoppet-flow fluorescens) kan også få informasjon om kinetic parametere, er resultatene av disse metodene et protein ensemble og ikke et eneste molekyl-funksjonene. Dette gjør en viktig forskjell i tilfeller hvor det er forskjellige og distinkte ensembler en enkelt protein. AFM har vist seg for å kunne skille subpopulasjoner, i stedet for gjennomsnitt dem sammen30.

Detaljert forklaring av SMFS forsøket på protein molekyler over fortsatt forventer ikke mulige problemer som kan løses med erfaring. I følgende vi diskutere vanlige problemer og feilsøking som er knyttet til opererer en AFM for konstant hastighet eksperimenter.

Sinusoidal-formet force grunnlinjen. Sinusformet figuren er skadelig å bestemme riktig kraft toppverdien siden det er vanskelig å beregne grunnlinjen. Problemet er forårsaket av forstyrrelser av laser reflekteres fra hengende. For å avhjelpe problemet, kan plasseringen av laser spot på hengende forskyves litt som en god sum signalet fra photodiode har bevart den nye posisjonen. Hvis problemet vedvarer, kan du vurdere å flytte hengende i sonden holder cellen.

Photodiode signalet ikke mette i ettrinns når berøre overflaten første gang. Når berøre overflaten, hopper photodiode signalet i flere trinn før den når mettet verdien. Dette betyr at spissen ikke er det laveste punktet i AFM hodet og et annet sted på sonde chip kan berøre eksempel overflaten før spissen hengende. Problemet må løses for å fortsette SMFS målinger og få riktig kraft-filtype kurve. For å fikse problemet, prøv flytte hengende i sonden holder celle frem og tilbake og justere tettheten av kroken som fatter hengende på plass. Hvis dette ikke hjelper, prøv å bytte til en annen cantilever på samme brikke eller selv endre til en ny cantilever chip.

Mange arrangementer på retraksjon eller ingen hendelser wogole. Dette er relatert til å finne riktig protein konsentrasjonen for eksperimentet. Hvis det er alltid en enkelt stor kraft peak (> 500 pN) vises på strekker spor og ingen andre topper vises mens gjennomføre eksperimenter på gull belagt overflate, er hengende faktisk måle gull-gull samhandling siden eksempel molekyler på overflaten er for sparsom. I dette tilfellet bør konsentrasjonen av protein prøven avsatt på gull overflaten økes. Men hvis det er flere uregelmessig formet topper på alle strekker spor hver trekke syklus, indikerer at det er for mange molekyler absorberes til overflaten som dannet et lag eller et komplisert nettverk på overflaten. I dette tilfellet må prøven bli vasket av bufferen som brukes til å fjerne overflødig protein molekyler. Noen ganger forbereder et nytt utvalg med lavere konsentrasjon av protein er nødvendig å kvitte seg med dette problemet. Hvis nye utvalget også ikke kan løse problemet, kan du kontrollere frostet ringformede sporet på AFM holder cellen å se hvis væske inn i den. Sporet bør holde tørr under eksperimentet siden væske i sporet vil par vibrasjoner i prøven inn i holder-cellen og forårsake photodiode signalet å endre unormalt når hengende og overflaten er kontakten.

Falske modulering photodiode signalet, mellom ramper. Dette er et tegn på flyt som kan presse hengende frem og tilbake, som skyldes vanligvis en liten boble som er transitt gjennom væske kanaler. Denne type problem vil forstyrre målinger med stor signal øker eller minsker. For å løse dette problemet, heve hodet fra underlaget, slik at væske rundt hengende berører ikke lenger væske rundt underlaget. Deretter bringe dem tilbake sammen og bevege hodet tilbake til overflaten. Reformasjonen i kolonnen væske i AFM cellen er vanligvis nok til å forstyrre boblen til flytende kanalen, men hvis ikke, å gjenta er nødvendig.

Systematisk økning eller reduksjon i photodiode signalet. Drivende er et fenomen som finnes i hvert eksperiment, hvor utkragning og spissen vil alltid drive svært raskt ved å berøre flytende slipp på prøven overflaten. Drift kan være forårsaket av temperatur balanse, der temperaturen-indusert utvidelse eller sammentrekning hengende forårsaker vibrasjoner i signalet. Venter på mer enn 10 min før gjennomføre det første eksperimentet vil vesentlig redusere drivende hastighet. Når du utfører trekke eksperimenter, hvis strekking og avslappende spor ikke sammenfaller med hverandre, så det er en hysteresis mellom de to halvdelene av trekke syklusen, som tilsvarer en rask drivende rate og krever ekstra tid å nå likevekt. Hvis kraft grunnlinjen kan vippes opp med en liten vinkel, drivende hastigheten er raskere enn trekke hastighet og det er bedre å utsette å vente på mindre vibrasjoner i spissen.

Force-utvidelse kurve første regionen er ikke vertikal. Det er nyttig å se på kraft-utvidelse tomten av opptak etter at de har anskaffet fra en nylig kalibrert oppsett. Hvis disse innspillingene ikke viser et loddrett område når hengende trykker mot overflaten, deretter kalibreringen kan være et problem og det skal gjentas fra trinn 5.

Photodiode signalet forsvinner etter en tid. Dette kan skyldes fordampning av bufferen i væske cellen. Det er viktig for å rehydrate cellen ved å bruke mer buffer hver time eller så for å holde prøven fra uttørking og gjør den ubrukelig for videre eksperimenter.

Indre støy er høy (> 30 pN). En stor mengde støy (målt som RMS kalibrert photodiode svingninger) er et tegn på ekstern støy. AFM eksperimenter bør gjøres på en luft-tabellen for å redusere kopling til bygningen, men ekstern støy kan også forårsakes av usikre scenen, auditiv støy i nærheten, eller kobling av tabellen luft til nærliggende statiske objekter (f.eks en stol). Støy kan også komme fra elektronisk kontroll system av AFM (f.eks ustabil tilkobling i det elektroniske systemet).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation tilskudd kalt MCB-1244297 og kalt MCB-1517245 til PEM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM Specimen Discs, 15mm diameter Ted Pella, Inc. 16218 Serve as base for glass substrate
Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick Ted Pella, Inc. 26024 serve as glass substrate and base for gold coating
Adhesive Tabs Ted Pella, Inc. 16079 Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips
STD Multimode head assembly Bruker Nano Inc. 1B75C AFM head
Glass probe holder Bruker Nano Inc. MTFML-V2 Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM.  
Microlever AFM probes Bruker Nano Inc. MLCT Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes
AFM probes with Au coated tips Bruker Nano Inc. OBL-10 Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force
Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs National Instruments PCI-6259 Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators
LISA Linear Piezo Stage Actuators Physik Instrumente LP P-753.11C Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements
XY Piezo Stage Physik Instrumente LP P-541.2CD Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible Unfolding of Individual Titin Immunoglobulin Domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  2. Fisher, T. E., Oberhauser, A. F., Carrion-Vazquez, M., Marszalek, P. E., Fernandez, J. M. The study of protein mechanics with the atomic force microscope. Trends in Biochemical Sciences. 24 (10), 379-384 (1999).
  3. Ng, S., Rounsevell, R., Steward, A., Randles, L., Clarke, J. Single molecule studies of protein folding by atomic force microscopy(AFM). Abstracts of Papers of the American Chemical Society. 227, U545-U545 (2004).
  4. Rico, F., Chu, C., Moy, V. T. Methods in Molecular Biology. Braga, P. C., Ricci, D. 736, Humana Press. 331-353 (2011).
  5. Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nature Nanotechnology. 3 (5), 261-269 (2008).
  6. Lv, S., et al. Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles. Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).
  7. Kim, M., et al. Nanomechanics of Streptavidin Hubs for Molecular Materials. Advanced Materials. 23 (47), 5684-5688 (2011).
  8. Gonzalez, M. A., et al. Self-Adhesive Hydrogels from Intrinsically Unstructured Proteins. Advanced Materials. , (2017).
  9. Oberhauser, A. F., Hansma, P. K., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. M. Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (2), 468-472 (2001).
  10. Li, Q., Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. Capturing the Mechanical Unfolding Pathway of a Large Protein with Coiled-Coil Probes. Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13429-13433 (2014).
  11. Davis, L. Basic methods in molecular biology. , Elsevier. (2012).
  12. Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. A Modular, Non-Degenerate Polyprotein Scaffold for Atomic Force Spectroscopy. Biomacromolecules. , (2016).
  13. Scholl, Z. N. The (Un) Folding of Multidomain Proteins Through the Lens of Single-molecule Force-spectroscopy and Computer Simulation. , Duke University. (2016).
  14. Pawlak, K., Strzelecki, J. Nanopuller-open data acquisition platform for AFM force spectroscopy experiments. Ultramicroscopy. 164, 17-23 (2016).
  15. Nanopuller. , https://sourceforge.net/projects/nanopuller/ (2018).
  16. Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. Improving single molecule force spectroscopy through automated real-time data collection and quantification of experimental conditions. Ultramicroscopy. 136, 7-14 (2014).
  17. Bouchiat, C., et al. Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements. Biophysical journal. 76 (1), 409-413 (1999).
  18. Su, T., Purohit, P. K. Mechanics of forced unfolding of proteins. Acta. 5 (6), 1855-1863 (2009).
  19. Steward, A., Toca-Herrera, J. L., Clarke, J. Versatile cloning system for construction of multimeric proteins for use in atomic force microscopy. Protein science. 11 (9), 2179-2183 (2002).
  20. Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. Modular, Nondegenerate Polyprotein Scaffolds for Atomic Force Spectroscopy. Biomacromolecules. 17 (7), 2502-2505 (2016).
  21. Hoffmann, T., et al. Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of β-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains. ACS. 9 (9), 8811-8821 (2015).
  22. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
  23. Popa, I., Berkovich, R., Alegre-Cebollada, J., Rivas-Pardo, J. A., Fernandez, J. M. Halotag Tethers to Study Titin Folding at the Single Molecule Level. Biophysical journal. 106 (2), 391a (2014).
  24. Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), 945-950 (2017).
  25. Rico, F., Gonzalez, L., Casuso, I., Puig-Vidal, M., Scheuring, S. High-speed force spectroscopy unfolds titin at the velocity of molecular dynamics simulations. Science. 342 (6159), 741-743 (2013).
  26. He, Y., Lu, M., Cao, J., Lu, H. P. Manipulating protein conformations by single-molecule AFM-FRET nanoscopy. ACS nano. 6 (2), 1221-1229 (2012).
  27. Fotiadis, D., Scheuring, S., Müller, S. A., Engel, A., Müller, D. J. Imaging and manipulation of biological structures with the AFM. Micron. 33 (4), 385-397 (2002).
  28. Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. A., Perkins, T. T. Force Spectroscopy with 9-μs Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry. Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).
  29. Dudko, O. K., Mathe, J., Szabo, A., Meller, A., Hummer, G. Extracting kinetics from single-molecule force spectroscopy: Nanopore unzipping of DNA hairpins. Biophysical. 92 (12), 4188-4195 (2007).
  30. Scholl, Z. N., Li, Q., Yang, W., Marszalek, P. E. Single-molecule Force Spectroscopy Reveals the Calcium Dependence of the Alternative Conformations in the Native State of a βγ-Crystallin Protein. Journal of Biological Chemistry. 291 (35), 18263-18275 (2016).

Tags

Biokjemi problemet 144 Atomic force mikroskop polyprotein protein folding enkelt-molekylet force spektroskopi protein rensing
Tvinge spektroskopi enkelt Protein molekyler med en Atomic Force mikroskopet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scholl, Z. N., Li, Q., Josephs, E.,… More

Scholl, Z. N., Li, Q., Josephs, E., Apostolidou, D., Marszalek, P. E. Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope. J. Vis. Exp. (144), e55989, doi:10.3791/55989 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter